Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

نموذج التآكل الظهاري لدراسة التئام جروح القرنية

Published: December 29, 2021 doi: 10.3791/63112
Automatic Translation
1, 1, 2, 2,3, 1,2
1College of Optometry, University of Houston, 2Children’s Nutrition Research Center, Baylor College of Medicine, 3Center for Translational Research on Inflammatory Diseases (CTRID), Michael E. DeBakey Veterans Affairs Medical Center

Summary

هنا ، يتم وصف بروتوكول لإنشاء جرح تآكل ظهاري مركزي للقرنية في الفأر باستخدام تريفين وسبود نادي غولف حاد. نموذج التئام جروح القرنية هذا قابل للتكرار بشكل كبير ويتم استخدامه الآن لتقييم التئام جروح القرنية المعرضة للخطر في سياق الأمراض.

Abstract

القرنية أمر بالغ الأهمية للرؤية ، حيث تمثل حوالي ثلثي القوة الانكسارية للعين. من الأمور الحاسمة لدور القرنية في الرؤية شفافيتها. ومع ذلك ، نظرا لموقعها الخارجي ، فإن القرنية عرضة بشدة لمجموعة واسعة من الإصابات التي يمكن أن تؤدي إلى فقدان شفافية القرنية والعمى في نهاية المطاف. يعد التئام جروح القرنية الفعال استجابة لهذه الإصابات أمرا محوريا للحفاظ على توازن القرنية والحفاظ على شفافية القرنية وقدراتها الانكسارية. في حالات التئام جروح القرنية المعرضة للخطر ، تصبح القرنية عرضة للعدوى والتقرحات والندوب. نظرا للأهمية الأساسية لتئام جروح القرنية للحفاظ على شفافية القرنية ورؤيتها ، فإن الفهم الأفضل لعملية التئام جروح القرنية الطبيعية هو شرط أساسي لفهم ضعف التئام جروح القرنية المرتبط بالعدوى والمرض. ولتحقيق هذا الهدف، أثبتت نماذج الفئران لجرح القرنية فائدتها في تعزيز فهمنا لآليات التئام جروح القرنية التي تعمل في ظل الظروف الفسيولوجية العادية. هنا ، يتم وصف بروتوكول لإنشاء تآكل ظهاري القرنية المركزي في الفأر باستخدام تريفين و spud نادي الغولف حاد. في هذا النموذج، يتم استخدام تريفين دائري قطره 2 مم، يتمركز فوق القرنية، لترسيم منطقة الجرح. يستخدم سبود نادي الغولف بعناية لإزالة الظهارة وإنشاء جرح دائري دون الإضرار بالغشاء السفلي الظهاري للقرنية. تستمر الاستجابة الالتهابية الناتجة كسلسلة مميزة جيدا من الأحداث الخلوية والجزيئية التي تعتبر حاسمة لالتئام الجروح بكفاءة. هذا النموذج البسيط لالتئام جروح القرنية قابل للتكرار بشكل كبير ومنشور بشكل جيد ويتم استخدامه الآن لتقييم التئام جروح القرنية للخطر في سياق المرض.

Introduction

القرنية هي ثلث العين الأمامي الشفاف. تخدم القرنية العديد من الوظائف بما في ذلك حماية الهياكل الداخلية للعين وتشكيل حاجز هيكلي يحمي العين من العدوى1. الأهم من ذلك ، القرنية أمر بالغ الأهمية للرؤية ، حيث توفر حوالي ثلثي القوة الانكسارية للعين 2,3. من الأمور الحاسمة لدور القرنية في الرؤية شفافيتها. ومع ذلك ، بسبب موقعها الخارجي ، تتعرض القرنية لمجموعة واسعة من الإصابات على أساس يومي يمكن أن تؤدي إلى تعطيل وظيفة الحاجز ، وفقدان الشفافية ، والعمى في نهاية المطاف. فقدان شفافية القرنية هو السبب الرئيسي لضعف البصر في جميع أنحاء العالم 4,5. سحجات القرنية هي سبب شائع للزيارات إلى غرفة الطوارئ (ER) ، وهو ما يمثل نصف الحالات المتعلقة بالعين المقدمة في ER6. تشير التقديرات إلى أن أكثر من 1 مليون شخص يعانون من إصابات مرتبطة بالعين سنويا في الولايات المتحدة7. يعد التئام جروح القرنية بكفاءة استجابة لهذه الإصابات أمرا محوريا للحفاظ على توازن القرنية والحفاظ على شفافيتها وقدراتها الانكسارية. في حالات التئام جروح القرنية المعرضة للخطر ، تصبح القرنية عرضة للعدوى والتقرحات والندوب 8,9. أيضا ، فإن الشعبية المتزايدة للجراحات الانكسارية تضع تحديا صادما فريدا على القرنية10. نظرا للأهمية الأساسية لتئام جروح القرنية للحفاظ على شفافية القرنية ورؤيتها ، فإن الفهم الأفضل لعملية التئام جروح القرنية الطبيعية هو شرط أساسي لفهم ضعف التئام جروح القرنية المرتبط بالعدوى والمرض.

تحقيقا لهذه الغاية ، تم تطوير العديد من النماذج الحيوانية لتئام جروح القرنية11،12،13،14،15. أثبتت نماذج مورين لالتئام جروح القرنية فائدتها في تعزيز فهمنا لآليات التئام جروح القرنية التي تعمل في ظل ظروف فسيولوجية طبيعية. تم استخدام أنواع مختلفة من جروح القرنية في دراسة التئام جروح القرنية، كل منها مناسب للتحقيق في جوانب مختلفة من عملية التئام الجروح. الأنواع الأكثر شيوعا من نماذج الجروح المستخدمة في دراسات التئام جروح القرنية هي نماذج الجروح الميكانيكية والكيميائية. جروح القرنية الكيميائية ، التي تنطوي في الغالب على إنشاء حروق قلوية على القرنية ، مفيدة لدراسة قرحة القرنية ، والعتامة ، والأوعية الدموية الجديدة13. تشمل جروح القرنية الميكانيكية جروح التنضير (التآكل) وجروح استئصال القرنية14،15،16. يحدد الغشاء السفلي الظهاري للقرنية السليم أو المخترق جروح التنضير واستئصال القرنية ، على التوالي. في جروح التنضير ، يبقى الغشاء السفلي الظهاري سليما ، بينما في جروح استئصال القرنية ، يتم اختراق الغشاء السفلي مع الاختراق في الغالب في السدى الأمامي. جروح التنضير هي الأكثر فائدة لدراسة إعادة الظهارة ، وانتشار الخلايا الظهارية ، والاستجابة المناعية ، وتجديد الأعصاب بعد جرح القرنية. من ناحية أخرى ، فإن جروح استئصال القرنية هي الأكثر فائدة لدراسة تندب القرنية14,15.

هنا ، يتم وصف بروتوكول لإنشاء جرح تآكل ظهاري مركزي للقرنية في الفأر باستخدام تريفين وسبود نادي غولف حاد. هذا النموذج البسيط لالتئام جروح القرنية قابل للتكرار بشكل كبير ومنشور بشكل جيد ويتم استخدامه الآن لتقييم التئام جروح القرنية للخطر في سياق المرض17.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تمت الموافقة على جميع البروتوكولات الحيوانية من قبل اللجان المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها في جامعة هيوستن وكلية بايلور للطب. تم اتباع المبادئ التوجيهية الموضحة في بيان جمعية البحوث في الرؤية وطب العيون (ARVO) حول استخدام الحيوانات في أبحاث الرؤية والعيون في التعامل مع الفئران واستخدامها.

1. التحضير

  1. تحضير محلول الفلوريسين
    1. تحضير محلول الفلوريسين بنسبة 1٪ عن طريق إذابة 10 ملغ من ملح فلوريسين الصوديوم في 1 مل من محلول ملحي معقم أو محلول ملحي معقم 1x فوسفات مخزن مؤقتا (PBS).
      ملاحظة: تحضير محلول فلوريسين الصوديوم في يوم الاستخدام أو قبل يوم واحد لتجنب التلوث الميكروبي. عند تحضيره قبل يوم من الاستخدام ، قم بتخزين محلول الفلوريسين على بعد 4 درجات مئوية من الضوء. لف الأنابيب بورق الألومنيوم لمنع التبييض الضوئي.
    2. قسم الحل إلى أليكوتس مناسب للاستخدام في تجربة واحدة. يتم استخدام 1-1.5 ميكرولتر من محلول الفلوريسين لكل ماوس لكل نقطة زمنية. استخدم الصيغة التالية لحساب حجم aliquot المناسب لتجربة واحدة:
      Equation 1
      ملاحظة: على سبيل المثال، إذا تمت دراسة ستة فئران في تجربة واحدة مع مراقبة حجم الجرح في خمس نقاط زمنية، فإن حجم الأليكوت المناسب لتلك التجربة الواحدة سيكون:
      Equation 2
  2. تحضير كوكتيل الكيتامين / الزيلازين لتخدير الفئران.
    1. لتحضير 10 مل من الكوكتيل ، امزج 2.0 مل من الكيتامين (100 مجم / مل) مع 1.0 مل من الزيلازين (20 مجم / مل) ، وأضف 7.0 مل من PBS المعقم. تحضير كوكتيل الكيتامين / زيلازين قبل يوم واحد من أو في يوم الجراحة.
      ملاحظة: يجب استخدام جميع المحاليل في درجة حرارة الغرفة ما لم ينص على خلاف ذلك.

2. التخدير

  1. وزن الفأر (8-12 أسبوعا من C57BL/6 فئران من النوع البري) لتحديد الكمية المناسبة من المخدر لإدارتها. استخدم تقنية تقييد الماوس ذات اليدين لكبح جماح الفئران والتعامل معها لحقن المخدر18. إدارة كوكتيل الكيتامين / الزيلازين داخل الصفاق (i.p) بتركيز نهائي قدره 80 مجم / كجم من الكيتامين و 8 مجم / كجم من الزيلازين.
  2. انتظر حتى يتم تحقيق التخدير الكامل قبل إجراء جرح القرنية على الماوس. تقييم عمق التخدير عن طريق تقييم منعكس الدواسة بعد قرصة إصبع القدم. عندما يتم تحقيق التخدير الكافي ، يجب ألا يتحرك الماوس على قرصة إصبع القدم.
    ملاحظة: نظرا لأن الفئران تفقد حرارة الجسم بسرعة أثناء التخدير ، فمن المهم توفير مصدر للدفء للفئران لمنع انخفاض حرارة الجسم. ضع الفئران على مصدر حرارة (وسادة تدفئة) أثناء مراحل التخدير والتعافي.

3. خلق جرح القرنية

  1. جرح العين اليمنى أو اليسرى فقط. الحفاظ على الاتساق مع العين (أي اليسار أو اليمين) التي تصاب عند الانتقال من الماوس إلى الماوس.
    ملاحظة: نظرا لأن السحجات تتلف أعصاب القرنية وتقلل من حدتها، فإن جرح كلتا العينين يمكن أن يسبب إزعاجا وضعفا كبيرا. نظرا لأن المسكنات لديها القدرة على قمع الاستجابات الالتهابية ، فقد يكون استخدامها مربكا في بعض التجارب التي تهدف إلى فهم التهاب القرنية. تمت الموافقة على تجنب المسكنات في تجارب جرح القرنية من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوانات المؤسسية (IACUC).
  2. لإنشاء جرح القرنية الظهاري
    1. تحت مجهر تشريح ، استخدم التريفين الذي يبلغ قطره 2 مم (انظر الشكل 1) لتحديد مركز القرنية ، مع إبقاء العين مفتوحة على مصراعيها باستخدام الإبهام والسبابة لتثبيت الجفون. قم بتدوير التريفين بلطف لترك انطباع على ظهارة القرنية.
      ملاحظة: يجب الحرص على عدم الضغط المفرط عند استخدام التريفين لأن هذا يمكن أن يؤدي إلى ثقب القرنية. أيضا ، يجب توخي الحذر لوضع التريفين مركزيا. يمكن استخدام التلاميذ كمعلم لتحديد موقع مركز القرنية.
    2. تحت مجهر تشريح ، امسك سبود نادي الغولف الحاد (انظر الشكل 1) عند حوالي 45 درجة من سطح القرنية داخل المنطقة المحددة بالتريفين. كشط الظهارة بعناية وباستمرار داخل المنطقة المرسومة باستخدام البوغ لتعري الظهارة.
      ملاحظة: لا تستخدم القوة المفرطة في التنضير لأن ذلك يمكن أن يسبب أيضا ثقب القرنية. يمكن أن تجف عيون الفئران أثناء عملية الجرح ، مما يجعل التنضير صعبا. في مثل هذه الحالة ، ضع PBS معقما على سطح العين للحفاظ على الترطيب الأمثل.

Figure 1
الشكل 1: 2 مم تريفين ونادي غولف حاد. يستخدم التريفين لترسيم منطقة دائرية في مركز القرنية ، ويستخدم سبود نادي الغولف لإزالة الظهارة داخل المنطقة المرسومة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

4. مراقبة إغلاق الجرح وإعادة الظهارة

  1. ماصة 1-1.5 ميكرولتر من محلول الفلوريسين 1٪ على السطح المصاب وصورة القرنية باستخدام مجهر رقمي مع مصدر ضوء أزرق.
  2. الحصول على صور خلال الدقيقة الأولى من محلول الفلوريسين بالإضافة إلى تجنب الانتشار إلى الظهارة المحيطة مما يؤدي إلى المبالغة في تقدير حجم الجرح. يتم تصوير القرنيات المصابة في أوقات محددة (أي 0 ساعة و 12 ساعة و 18 ساعة و 24 ساعة و 30 ساعة) بعد الجرح.
    ملاحظة: في جميع النقاط الزمنية ، يتم إجراء التصوير تحت التخدير. يستخدم الكيتامين / الزيلازين في وقت الجرح بينما يستخدم الأيزوفلوران في نقاط زمنية لاحقة. يتم وضع الفئران بشكل فردي في أقفاص منفصلة طوال مدة مراقبة إغلاق الجرح. عندما توضع الفئران معا ، تميل إلى لعق عيون القمامة ، وهو سلوك ثبت أنه يؤثر على التئام الجروح في الأنسجة المختلفة19,20.
  3. تحليل الصور الملتقطة ، وتتبع منطقة الجرح باستخدام برنامج تحليل الصور. يتم التعبير عن منطقة الجرح لكل نقطة زمنية كنسبة مئوية من منطقة الجرح الأصلية عند 0 ساعة.

5. التصوير والتحليل المناعي

  1. القتل الرحيم للفئران بطريقة معتمدة من IACUC (في هذه الحالة ، جرعة زائدة من ثاني أكسيد الكربون تليها خلع عنق الرحم) في النقاط الزمنية المطلوبة بعد الإصابة.
  2. حصاد مقل العيون عن طريق الضغط بلطف على الكانثوس الجانبي لإزاحة مقلة العين باستخدام مقص منحني القزحية. قم بتوجيه المقص خلف مقلة العين للإمساك بالعصب البصري بإحكام ، ثم قطع العصب ، مما يسمح بإزالة مقلة العين.
  3. ثبت كل مقلة عين في 1 مل من 1x PBS تحتوي على 2٪ بارافورمالديهايد لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة ، ثم اغسلها ثلاث مرات في 1 مل من 1x PBS لمدة 5 دقائق لكل منهما.
  4. تحت المجهر تشريح ، استخدم شفرة جراحية لإجراء شق في الصلبة ، حوالي 500 ميكرومتر بعيدة إلى الطرف ، ثم قطع عبر العالم. باستخدام الملقط ، قم بإزالة مادة القزحية بلطف من القرنية ، ثم قم بتقليم الأنسجة الصلبة بعناية ، مع التأكد من ترك الطرف سليما.
  5. قم بإجراء أربعة جروح شعاعية جزئية، يبلغ طول كل منها حوالي 1 مم، والتي تمتد من القرنية الطرفية وتتوقف عن المركز للسماح للقرنية بالتسطيح.
  6. تخلل القرنيات وتمنعها في 1 مل من ألبومين مصل البقر بنسبة 2٪ (BSA) و 0.01٪ TritonX -100 في 1x PBS لمدة 15 دقيقة تليها كتلة في 2٪ BSA في 1x PBS لمدة 45 دقيقة إضافية في درجة حرارة الغرفة.
  7. احتضن القرنيات بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية في مزيج من الأجسام المضادة المترافقة الفريدة من نوعها التي تحمل علامات مباشرة على الفلوروكروم والتي يتم إعدادها في 1x PBS تحتوي على 2٪ BSA.
    ملاحظة: تستهدف الأجسام المضادة تسمية خلايا وأنسجة معينة ذات أهمية. على سبيل المثال ، يتم تصنيف البطانيات والعدلات والصفائح الدموية بالأجسام المضادة المضادة ل CD3121,22 و anti-Ly-6G 23,24 و Anti-CD4125,26 ، على التوالي. يضاف 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) إلى كوكتيل الأجسام المضادة لتصور النوى.
  8. بعد الحضانة ، اغسل القرنيات ثلاث مرات في 1x PBS لمدة 15 دقيقة لكل منهما.
  9. قم بتركيب القرنيات على شريحة مجهرية في قطرة من وسط تركيب التألق المضاد للتلاشي ، وقم بتغطيتها بغطاء ، وصورة مع التكبير المطلوب (هدف 4x إلى 100x) باستخدام مجهر ضوئي مشرق. التقط صورا كاملة السماكة للقرنية عبر مناطق مختلفة كما هو موضح في الشكل 2A.
    ملاحظة: يستخدم نمط التحليل المجهري الموضح في الشكل 2A لتحليل التغيرات الإقليمية المحددة في الالتهاب وانقسام الخلايا. يتم استخدام كل من تلطيخ DAPI و Ly-6G لتحديد العدلات خارج الأوعية الدموية. مع تلطيخ DAPI ، تحتوي العدلات الكروية على حدوة حصان مميزة أو نواة على شكل دونات (الشكل 2B).

Figure 2
الشكل 2: استراتيجية تصوير القرنية وتسلل العدلات بعد التآكل المركزي . (أ) تمثيل تخطيطي لجبل القرنية الكامل يظهر تسعة حقول مجهرية عبر قطر القرنية. تمثل المنطقة الرمادية منطقة الجرح الأصلية. عرض كل منطقة هو 500 ميكرومتر. (B) لاحظ شكل حدوة الحصان أو الدونات المميز لنوى العدلات مع تلطيخ DAPI. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ويبين الشكل 3 صورة مجهرية إلكترونية منقولة لجرح القرنية تم إنشاؤه باستخدام سبود نادي الغولف الحاد، مما يدل على أن الغشاء السفلي الظهاري سليم بالفعل بعد الإصابة.

Figure 3
الشكل 3: يبقى الغشاء السفلي الظهاري سليما بعد تآكل القرنية. نقل المجهر الإلكتروني لجرح القرنية الذي تم إنشاؤه باستخدام سبود نادي الغولف الحاد. تشير رؤوس الأسهم إلى الغشاء السفلي أسفل الظهارة المتبقية المحيطة بالجرح ، بينما تشير الأسهم إلى الغشاء السفلي في المنطقة العارية. هذا يدل على استمرارية الغشاء السفلي من الأجزاء غير المتآكلة إلى الأجزاء المتآكلة من القرنية ، مما يدل على أن الغشاء السفلي يترك سليما بعد التنضير. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

تم استخدام هذا البروتوكول لجرح القرنية لتوصيف ديناميكيات التئام الجروح على نطاق واسع لجرح التآكل الظهاري 2 مم27،28،29،30،31،32،33. القدرة على مراقبة معدل إغلاق الجرح وإعادة الظهارة في الجسم الحي هي جزء أساسي من هذا النموذج. كما هو موضح في الشكل 4A ، فإن استخدام محلول الفلوريسين والمجهر الرقمي مع مصدر الضوء الأزرق يتيح تصور حجم الجرح. في هذا النموذج ، يتم إجراء مراقبة إغلاق الجرح في وقت الجرح (0 ساعة) و 12 ساعة و 18 ساعة و 24 ساعة و 30 ساعة بعد الجرح. يوضح الشكل 4B حركية إغلاق الجرح على مدار 30 ساعة. في الفئران من النوع البري C57BL/6 التي يتراوح عمرها بين 8 و 12 أسبوعا ، عادة ما يكتمل إغلاق الجروح وإعادة الظهارة بعد 24 ساعة من الجرح كما هو موضح في الشكل 4B ، وتعد الاستجابة الالتهابية المنظمة تنظيما جيدا أمرا أساسيا لشفاء الجروح الفعال34،35،36.

Figure 4
الشكل 4: تم تقييم إغلاق الجرح الظهاري باستخدام تلطيخ الفلوريسين. (أ) صور تمثيلية لتلطيخ الفلوريسين لجرح القرنية عند 0 ساعة و 12 ساعة و 18 ساعة و 24 ساعة و 30 ساعة. في هذا النموذج، عادة ما يكتمل إغلاق الجرح بعد 24 ساعة من الإصابة. لاحظ عدم وجود تلطيخ أخضر في القرنية الوسطى عند 24 ساعة و 30 ساعة. (B) حركية إغلاق الجرح تشير إلى إغلاق الجرح بالكامل بمقدار 24 ساعة بعد الجرح. يتم التعبير عن القيمة في كل نقطة زمنية كنسبة مئوية من منطقة الجرح الأصلية (أي منطقة الجرح عند 0 ساعة) (n ≥ 6). البيانات المقدمة كمتوسط ± الانحراف المعياري. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

تتميز الاستجابة الالتهابية للجرح في هذا النموذج بشكل جيد. يثير جرح التآكل الظهاري استجابة التهابية سريعة في الأوعية الدموية لأطراف القرنية تتميز بشكل رئيسي بتوسع الأوعية الدموية ، وإسراف الصفائح الدموية المحصور في الطرف37،38،39 وإسراف العدلات مع الهجرة نحو مركز القرنية40. ويبين الشكل 5 الأوعية الدموية الطرفية لقرنية غير مصابة مع عدلات خارج الأوعية الدموية (الشكل 5 أ) وقرنية جريحة مع صفائح دموية وعدلات خارج الأوعية الدموية (الشكل 5 ب).

Figure 5
الشكل 5: تصوير الخلايا الالتهابية في الأطراف. صورة مجهرية لطرف القرنية تظهر تلطيخا للأوعية الدموية الطرفية بجسم مضاد CD31 (مبين باللون الأحمر)، والعدلات ذات الأجسام المضادة المضادة Ly-6G (الموضحة باللون الأخضر)، والصفائح الدموية ذات الأجسام المضادة CD41 (الموضحة باللون الأزرق). (أ) عدم التآكل و (ب) 30 ساعة بعد التآكل. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

في هذا النموذج، يتم تقييم تسلل العدلات إلى القرنية عبر خمس مناطق متميزة كما هو موضح في الشكل 2A. لتحديد هذه المناطق المتميزة ، يتم التقاط صورة للقرنية الكاملة الكاملة ، وتصور الأوعية الدموية الطرفية مع تلطيخ مضاد ل CD31. يتم وضع علامة على الحافة الأعمق لمنطقة الأطراف على كل بتلة باستخدام الأوعية الدموية الطرفية كدليل. يتم قياس المسافة من الحافة الأعمق لمنطقة الأطراف من بتلة إلى أخرى في الاتجاه الأفقي (x) أو الرأسي (y) لكل قرنية كاملة. بالنسبة للفئران من النوع البري C57BL / 6 التي يتراوح عمرها بين 8 و 12 أسبوعا ، تبلغ هذه المسافة حوالي 3.7 مم. تغطي هذه المسافة المناطق الطرفية إلى الطرفية. ثم يتم حساب مركز القرنية كنقطة مقابلة لنصف القطر الأفقي أو الرأسي للحامل الكامل. المنطقة شبه المركزية هي 500 ميكرومتر يسارا أو يمينا أو أعلى أو هبوطا من المركز المحسوب. الحقول الأخرى كلها 500 ميكرومتر من الحقل السابق. يتم استخدام كل من تلطيخ DAPI و Ly-6G لتحديد العدلات خارج الأوعية الدموية. يتم حساب العدلات في كل منطقة قرنية من الأرباع الأربعة في المتوسط ويتم التعبير عنها كعدلات لكل حقل.

يتم إجراء تقييم الصفائح الدموية في هذا النموذج في الطرف فقط. أثناء التئام جروح القرنية ، تتكاثر الصفائح الدموية وتوضع في الطرف27,37. يتم حساب العدد الإجمالي للصفائح الدموية في الطرف ، ويتم التعبير عن الأعداد على أنها صفائح دموية / مم2 من منطقة الأطراف. يمكن أن يتم تجميع الأعداد من بتلات الأربع أو متوسطها.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

كان الغرض من ورقة الأساليب هذه هو وصف بروتوكول لإنشاء جرح تآكل ظهاري مركزي للقرنية في الفأر باستخدام تريفين ونادي غولف حاد. تم استخدام نموذج الفئران هذا لدراسة التهاب القرنية ومساهمته في التئام الجروح. يمكن استخدام هذا النوع من النماذج لدراسة آليات التئام جروح القرنية في ظل الظروف الفسيولوجية العادية وفي الأمراض17،28،29،41،42. تم استخدام النموذج للتحقيق في التئام جروح القرنية في ظل ظروف مرضية كما يتضح من دراسة حول ضعف التئام جروح القرنية في نموذج الفئران للسمنة الناجمة عن النظام الغذائي17. ميزة مميزة لهذا النموذج هي أنه يخلق حجم جرح ظهاري دقيق (2 مم) قابل للتكرار مع موقع مركزي دقيق دون اختراق الغشاء السفلي. هذا النموذج من جرح القرنية مباشر وسريع الأداء. بالإضافة إلى نادي الغولف الحاد spud 29,39,43,44,45 ، لدغ دوار (Algerbrush) 38,46,47 ، وشفرة الماس 32,37,40,48,49,50,51 يمكن استخدام كلاهما لإنشاء جرح التآكل في هذا النموذج. في أيدي مستخدم متمرس ، لا يوجد فرق كبير في جرح التآكل الناتج عن أي من الأداتين. لأغراض التدريب وفي أيدي المبتدئ ، غالبا ما يكون من الأسهل تحقيق نتائج قابلة للتكرار باستخدام سبود نادي الغولف الحاد مقارنة باللدغ الدوار والشفرة الماسية. يتطلب اللدغ الدوار (Algerbrush) لمسة دقيقة وإلا فإن اللدغ الدوار يمكن أن يتلف الغشاء السفلي الظهاري. وقد أبلغ عن ذلك أيضا محققون آخرون52,53. من ناحية أخرى ، فإن سبود نادي الغولف الحاد يترك باستمرار الغشاء السفلي الظهاري سليما.

لإعادة إنتاج بروتوكول جرح القرنية هذا بنجاح ومراقبة ديناميكيات إعادة الظهارة والالتهاب اللاحقة ، يجب استخدام نفس السلالة والفئة العمرية للفأر ، ويجب إنشاء حجم وعمق الجرح كما هو موضح أعلاه. ديناميكيات التئام جروح القرنية والجداول الزمنية الموضحة في هذا البروتوكول هي لسلالة الماوس C57BL/6 وقد لا تتم مشاركتها إذا تم استخدام سلالة مختلفة من الماوس. أبلغ Pal-Ghosh et al.54 عن اختلافات في قدرة C57BL/6 و BALB/c على التئام جروح التنضير الظهاري القرنية. بالنسبة لنفس حجم جرح القرنية، يكون إغلاق جرح القرنية وإعادة الظهارة أبطأ في الفئران BALB/c. الجدول الزمني لاستكمال إغلاق الجرح والاستجابة الالتهابية المميزة الموضحة هنا هي لجرح دائري بحجم قطره 2 مم. ومن المتوقع أن يكون وقت إكمال إغلاق الجرح أطول لأقطار الجرح التي تزيد عن 2 مم بينما من المتوقع وقت أقصر لأقطار الجرح الأقل من 2 مم. أيضا ، من المتوقع أن تثير جروح القرنية الأكبر ، وخاصة تلك الأقرب إلى الطرف ، استجابة التهابية أكثر مبالغة ، حيث يتم تجنيد المزيد من الكريات البيض في القرنية16. الأهم من ذلك ، يجب أن يقتصر الجرح على ظهارة القرنية. تستغرق الجروح التي تخترق الغشاء السفلي الظهاري أو تخترق سدى القرنية وقتا أطول للشفاء. ترتبط هذه الجروح أيضا باستجابة التهابية متغيرة ، والأوعية الدموية الجديدة ، وتشكيل البلاستيدات العضلية ، والتندب55,56.

يجب توخي الحذر في كل خطوة لمنع العدوى الميكروبية للقرنية المتآكلة. العدوى الميكروبية تغير الاستجابة الالتهابية ويمكن أن تؤدي إلى تقرحات وتندب وفقدان البصر57. لمنع العدوى الميكروبية للجرح ، يجب دائما استخدام الأدوات والحلول المعقمة. إذا كانت هناك عدة فئران مصابة في وقت واحد ، فيجب استخدام تريفين معقم لكل فأر. بين الفئران ، يجب غسل سبود نادي الغولف في PBS معقمة تليها التطهير في 70 ٪ من الإيثانول وغسلها مرة أخرى في PBS معقمة. إذا تم إجراء الجرح على فئران إضافية على مدار عدة أيام ، فيجب إجراؤه في نفس الوقت من اليوم. هذا هو للسيطرة على تأثير الساعة البيولوجية على التئام الجروح والالتهابات. في الفئران C57BL/6 ، يؤثر الوقت من اليوم الذي يتم فيه إجراء الجرح على معدل وجودة التئام جروح القرنية. لوحظ إغلاق أسرع للجروح وزيادة انقسام الخلايا عندما تصاب الفئران في الصباح مقارنة بالجرح في فترة ما بعد الظهر أو المساء42. تم الإبلاغ عن تأثير الساعة البيولوجية على التئام الجروح في الأنسجة الأخرى بما في ذلك الجلد58,59. يتم إجراء الجرح في هذا النموذج دائما في الصباح.

تستمر الاستجابة الالتهابية الناتجة عن الجرح في هذا النموذج كسلسلة مميزة جيدا من الأحداث الخلوية والجزيئية التي تعتبر حاسمة لالتئام الجروح بكفاءة. أفضل اللاعبين الخلويين المميزين في الالتهاب الناجم عن التآكل في هذا النموذج هم العدلات والصفائح الدموية. العدلات هي أول المستجيبين لموقع تآكل القرنية. يتم الكشف عن مستويات كبيرة من العدلات في سدى القرنية في غضون 6 ساعات من الإصابة. العدلات هي المسؤولة عن إزالة حطام الخلايا ، وهي عملية متأصلة في الالتهاب وإصلاح الجروح60. بالإضافة إلى أنشطتها البلعمية، تحتوي العدلات على عوامل نمو مثل عوامل النمو البطانية الوعائية (VEGF)61. VEGF هو عامل عصبي متجدد حاسم لتجديد أعصاب القرنية بعد جرح 62,63 وهو مهم أيضا لانقسام الخلايا الظهارية القرنية 45,63. يحدث تسلل العدلات في الطرف في موجتين مع الذروة الأولى في 18 ساعة والذروة الثانية في 30 ساعة بعد إصابة40. باستخدام الفئران العدلية37,40 ، ثبت أن إسراف العدلات والهجرة اللاحقة إلى مركز القرنية أمر بالغ الأهمية لالتئام جروح القرنية. على الرغم من أنه من المعروف تقليديا أنها محورية في الحفاظ على الإرقاء وتخثر الدم ، إلا أن الصفائح الدموية لها أيضا دور رئيسي معترف به في التئام جروح القرنية37. تحتوي الصفائح الدموية على العديد من الوسطاء الذين يساهمون في الالتهاب ودقة الأنسجة64,65. في الفئران المصابة بنقص الصفيحات ، تم استخدام هذا النموذج لإظهار أن الصفائح الدموية مهمة لشفاء جروح القرنية بكفاءة37.

على الرغم من أن العدلات والصفائح الدموية هي أفضل الخلايا تميزا في هذا النموذج ، فقد ثبت أيضا أن الخلايا المناعية مثل خلايا غاما دلتا التائية والخلايا القاتلة الطبيعية والخلايا المتغصنة تشارك في الاستجابة المناعية للجروح باستخدام هذا النموذج 27,48. تم الإبلاغ عن إسراف الخلايا القاتلة الطبيعية في السدى28,29 وهجرة خلايا غاما دلتا تي إلى ظهارة الشفاء 27. وقد استخدم هذا النموذج أيضا لتحديد جزيئات الالتصاق الرئيسية لإسراف الخلايا المناعية أثناء التئام جروح القرنية. وقد ثبت أن مستضد وظيفة الخلايا الليمفاوية-1 (LFA-1)32 وCD18 51 وجزيء الالتصاق بين الخلايا -1 (ICAM-1)47,49 أمر بالغ الأهمية لإسراف العدلات والتئام جروح القرنية الفعال باستخدام هذا النموذج. انقسام الخلايا الظهارية استجابة للجرح ، وهو أمر بالغ الأهمية لإعادة التقسيم الطبقي الظهاري بعد إغلاق الجرح باستخدام الأشكال الانقسامية. التكثيف الكروموسومي خلال مراحل مختلفة من انقسام الخلايا يعطي النوى مظهرا مميزا يعرف باسم الشكل الانقسامي. يتيح تلطيخ النواة DAPI تصور هذه الأشكال الانقسامية.

أثبت نموذج جرح تآكل القرنية للفأر أنه قابل للتكرار بشكل ملحوظ وقدم نظرة ثاقبة كبيرة على الآليات الخلوية والجزيئية التي تسهم في التئام الجروح بكفاءة. ومع ذلك ، تجدر الإشارة إلى أن هناك قيودا على النموذج فيما يتعلق بتطبيقه السريري. لا ينطبق النموذج ونتائجه إلا على السحجات الظهارية البسيطة غير الاختراقية. كما ذكرنا سابقا ، فإن إصابات القرنية الناتجة عن الجروح المخترقة الناجمة عن الإهانة الفيزيائية أو الكيميائية ستثير حركية ونتائج مختلفة لالتئام الجروح ، خاصة إذا أصيب الجرح بالعدوى كما يحدث غالبا في حالة إصابات القرنية البشرية. ومع ذلك ، فإن نموذج جرح تآكل القرنية الفأر يوفر أساسا ممتازا لدراسة المبادئ الأساسية للالتهاب التي تعدل التئام جروح القرنية.

بروتوكول جرح القرنية الموصوف هنا مباشر ويمكن استنساخه بسهولة. يوفر أداة مفيدة للتحقيق في الأسئلة الأساسية حول عملية التئام جروح القرنية والاستجابة الالتهابية المرتبطة بها. قدرتها على المساعدة في فهم أمراض القرنية المرتبطة بمضاعفات التئام الجروح ليست سوى البداية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

التمويل: بدعم من: NIH EY018239 (A.R.B.، C.W.S.، و R.E.R.)، P30EY007551 (A.R.B.)، ومنحة سيغما شي لمساعدة البحوث (P.K.A). المحتوى هو مسؤولية المؤلفين وحدهم ولا يمثل وجهات النظر الرسمية للمعاهد الوطنية للصحة ، أو سيغما شي.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-CD31 antibody BD Bioscience, Pharmingen 550274
Anti-CD41 antibody BD Bioscience, Pharmingen 553847
Anti-Ly6G antibody BD Bioscience, Pharmingen 551459
Bovine serum albumin (BSA) ThermoFisher scientific B14
C57BL/6 mice Jackson Laboratories 664
DAPI Sigma Aldrich D8417
DeltaVision wide-field deconvolution fluorescence microscope GE Life Sciences
Dissecting microscope Leica microsystems
Electronic Toploading Balances (Weighing scale) Fisher Scientific
Ethanol ThermoFisher scientific T038181000CS
Golf-club spud Stephens instruments S2-1135
Iris curve scissors Fisher Scientific 31212
Isoflurane Patterson veterinary 07-893-1389
Ketamine Patterson veterinary 07-890-8598
Phospate buffered saline (PBS) ThermoFisher scientific AM9624
Sodium fluorescein salt Sigma Aldrich 46970
Surgical blade (scapel blade) Fine Science tools 10022-00
Trephine Integra Miltex 33-31
TritonX -100 Fisher Scientific 50-295-34
Forcep Fine Science tools 11923-13
Xylazine Patterson veterinary 07-808-1947

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. DelMonte, D. W., Kim, T. Anatomy and physiology of the cornea. Journal of Cataract and Refractive Surgery. 37 (3), 588-598 (2011).
  2. Meek, K. M., Knupp, C. Corneal structure and transparency. Progress in Retinal and Eye Research. 49, 1-16 (2015).
  3. Sridhar, M. S. Anatomy of cornea and ocular surface. Indian Journal of Ophthalmology. 66 (2), 190-194 (2018).
  4. Flaxman, S. R., et al. Global causes of blindness and distance vision impairment 1990-2020: a systematic review and meta-analysis. The Lancet Global Health. 5 (12), 1221-1234 (2017).
  5. Robaei, D., Watson, S. Corneal blindness: A global problem. Clinical & Experimental Ophthalmology. 42 (3), 213-214 (2014).
  6. McGwin, G., Owsley, C. Incidence of emergency department-treated eye injury in the United States. Archives of Ophthalmology. 123 (5), 662-666 (2005).
  7. Ljubimov, A. V., Saghizadeh, M. Progress in corneal wound healing. Progress in Retinal and Eye Research. 49, 17-45 (2015).
  8. Wilson, S. L., Haj, A. J. E., Yang, Y. Control of scar tissue formation in the cornea: Strategies in clinical and corneal tissue engineering. Journal of Functional Biomaterials. 3 (3), 642 (2012).
  9. Vaidyanathan, U., et al. Persistent corneal epithelial defects: A review article. Medical Hypothesis, Discovery and Innovation in Ophthalmology. 8 (3), 163-176 (2019).
  10. Netto, M., et al. Wound healing in the cornea: a review of refractive surgery complications and new prospects for therapy. Cornea. 24 (5), 509-522 (2005).
  11. Friedenwald, J. S., Buschke, W. Some factors concerned in the mitotic and wound-healing activities of the corneal epithelium. Transactions of the American Ophthalmological Society. 42, 371-383 (1944).
  12. Xu, K., Yu, F. -S. X. Impaired epithelial wound healing and EGFR signaling pathways in the corneas of diabetic rats. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (6), 3301-3308 (2011).
  13. Bai, J. Q., Qin, H. F., Zhao, S. H. Research on mouse model of grade II corneal alkali burn. International Journal of Ophthalmology. 9 (4), 487-490 (2016).
  14. Blanco-Mezquita, J. T., Hutcheon, A. E. K., Stepp, M. A., Zieske, J. D. αVβ6 integrin promotes corneal wound healing. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 52 (11), 8505-8513 (2011).
  15. Blanco-Mezquita, J. T., Hutcheon, A. E. K., Zieske, J. D. Role of thrombospondin-1 in repair of penetrating corneal wounds. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 54 (9), 6262-6268 (2013).
  16. Stepp, M. A., et al. Wounding the cornea to learn how it heals. Experimental Eye Research. 121, 178-193 (2014).
  17. Hargrave, A., et al. Corneal dysfunction precedes the onset of hyperglycemia in a mouse model of diet-induced obesity. PLoS ONE. 15, 0238750 (2020).
  18. Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (67), e2771 (2012).
  19. Bodner, L., Dayan, D. Effect of parotid submandibular and sublingual saliva on wound healing in rats. Comparative Biochemistry and Physiology. Part A, Physiology. 100 (4), 887-890 (1991).
  20. Abbasian, B., Azizi, S., Esmaeili, A. Effects of rat's licking behavior on cutaneous wound healing. Iranian Journal of Basic Medical Sciences. 13 (1), 242-247 (2010).
  21. DeLisser, H. M., et al. Involvement of endothelial PECAM-1/CD31 in angiogenesis. The American Journal of Pathology. 151 (3), 671-677 (1997).
  22. Piali, L., et al. CD31/PECAM-1 is a ligand for alpha v beta 3 integrin involved in adhesion of leukocytes to endothelium. The Journal of Cell Biology. 130 (2), 451-460 (1995).
  23. Fleming, T. J., Fleming, M. L., Malek, T. R. Selective expression of Ly-6G on myeloid lineage cells in mouse bone marrow. RB6-8C5 mAb to granulocyte-differentiation antigen (Gr-1) detects members of the Ly-6 family. The Journal of Immunology. 151 (5), 2399-2408 (1993).
  24. Fleming, T. J., Malek, T. R. Multiple glycosylphosphatidylinositol-anchored Ly-6 molecules and transmembrane Ly-6E mediate inhibition of IL-2 production. The Journal of Immunology. 153 (5), 1955-1962 (1994).
  25. Phillips, D. R., Charo, I. F., Scarborough, R. M. GPIIb-IIIa: the responsive integrin. Cell. 65 (3), 359-362 (1991).
  26. Nieswandt, B., et al. Acute systemic reaction and lung alterations induced by an antiplatelet integrin gpIIb/IIIa antibody in mice. Blood. 94 (2), 684-693 (1999).
  27. Li, Z., Burns, A. R., Rumbaut, R. E., Smith, C. W. γδ T cells are necessary for platelet and neutrophil accumulation in limbal vessels and efficient epithelial repair after corneal abrasion. American Journal of Pathology. 171 (3), 838-845 (2007).
  28. Liu, Q., Smith, C. W., Zhang, W., Burns, A. R., Li, Z. NK cells modulate the inflammatory response to corneal epithelial abrasion and thereby support wound healing. American Journal of Pathology. 181 (2), 452-462 (2012).
  29. Gao, Y., et al. NK cells are necessary for recovery of corneal CD11c+ dendritic cells after epithelial abrasion injury. Journal of Leukocyte Biology. 94 (2), 343-351 (2013).
  30. Xiao, C., et al. Acute tobacco smoke exposure exacerbates the inflammatory response to corneal wounds in mice via the sympathetic nervous system. Communications Biology. 2, 33 (2019).
  31. Wang, H., et al. Epothilone B speeds corneal nerve regrowth and functional recovery through microtubule stabilization and increased nerve beading. Scientific Reports. 8 (1), 2647 (2018).
  32. Li, Z., Burns, A. R., Smith, C. W. Lymphocyte function-associated Antigen-1-dependent inhibition of corneal wound healing. Cell Injury. 169, 1590-1600 (2006).
  33. Wu, M., et al. The neuroregenerative effects of topical decorin on the injured mouse cornea. Journal of Neuroinflammation. 17 (1), 1-14 (2020).
  34. Rodrigues, M., Kosaric, N., Bonham, C. A., Gurtner, G. C. Wound healing: A cellular perspective. Physiological Reviews. 99 (1), 665-706 (2019).
  35. Rennard, S. I. Inflammation and repair processes in chronic obstructive pulmonary disease. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 160 (5), Pt 2 12-16 (1999).
  36. Landén, N. X., Li, D., Ståhle, M. Transition from inflammation to proliferation: a critical step during wound healing. Cellular and Molecular Life Sciences. 73 (20), 3861-3885 (2016).
  37. Li, Z., Rumbaut, R. E., Burns, A. R., Smith, C. W. Platelet response to corneal abrasion is necessary for acute inflammation and efficient re-epithelialteation. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 47, 4794-4802 (2006).
  38. Lam, F. W., Burns, A. R., Smith, C. W., Rumbaut, R. E. Platelets enhance neutrophil transendothelial migration via P-selectin glycoprotein ligand-1. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 300 (2), 468-475 (2011).
  39. La Cruz, A. D., et al. Platelet and erythrocyte extravasation across inflamed corneal venules depend on CD18, neutrophils, and mast cell degranulation. International Journal of Molecular Sciences. 22 (14), 7360 (2021).
  40. Li, Z., Burns, A. R., Smith, C. W. Two waves of neutrophil emigration in response to corneal epithelial abrasion: Distinct adhesion molecule requirements. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 47 (5), 1947-1955 (2006).
  41. Li, Z., Burns, A. R., Han, L., Rumbaut, R. E., Smith, C. W. IL-17 and VEGF Are Necessary for Efficient Corneal Nerve Regeneration. The American Journal of Pathology. 178 (3), 1106-1116 (2011).
  42. Xue, Y., et al. Modulation of circadian rhythms affects corneal epithelium renewal and repair in mice. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 58 (3), 1865-1874 (2017).
  43. Zhang, W., Magadi, S., Li, Z., Smith, C. W., Burns, A. R. IL-20 promotes epithelial healing of the injured mouse cornea. Experimental Eye Research. 154, 22-29 (2017).
  44. Li, Z., Burns, A. R., Miller, S. B., Smith, C. W. CCL20, γδ T cells, and IL-22 in corneal epithelial healing. FASEB Journal. 25 (8), 2659-2668 (2011).
  45. Li, Z., Burns, A. R., Han, L., Rumbaut, R. E., Smith, C. W. IL-17 and VEGF are necessary for efficient corneal nerve regeneration. American Journal of Pathology. 178 (3), 1106-1116 (2011).
  46. Reins, R. Y., Hanlon, S. D., Magadi, S., McDermott, A. M. Effects of topically applied Vitamin D during corneal wound healing. PLoS ONE. 11 (4), 0152889 (2016).
  47. Gagen, D., et al. ICAM-1 mediates surface contact between neutrophils and keratocytes following corneal epithelial abrasion in the mouse. Experimental Eye Research. 91 (5), 676-684 (2010).
  48. Li, Z., Rivera, C. A., Burns, A. R., Smith, C. W. Hindlimb unloading depresses corneal epithelial wound healing in mice. Journal of Applied Physiology. 97 (2), 641-647 (2004).
  49. Byeseda, S. E., et al. ICAM-1 is necessary for epithelial recruitment of γδ T cells and efficient corneal wound healing. American Journal of Pathology. 175 (2), 571-579 (2009).
  50. Li, Z., Burns, A. R., Rumbaut, R. E., Smith, C. W. γδ T cells are necessary for platelet and neutrophil accumulation in limbal vessels and efficient epithelial repair after corneal abrasion. American Journal of Pathology. 171 (3), 838-845 (2007).
  51. Petrescu, M. S., et al. Neutrophil interactions with keratocytes during corneal epithelial wound healing: A role for CD18 integrins. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 48 (11), 5023-5029 (2007).
  52. Pal-Ghosh, S., Pajoohesh-Ganji, A., Tadvalkar, G., Stepp, M. A. Removal of the basement membrane enhances corneal wound healing. Experimental Eye Research. 93 (6), 927-936 (2011).
  53. Pal-Ghosh, S., et al. Cytokine deposition alters leukocyte morphology and initial recruitment of monocytes and γδT cells after corneal injury. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (4), 2757-2765 (2014).
  54. Pal-Ghosh, S., Tadvalkar, G., Jurjus, R. A., Zieske, J. D., Stepp, M. A. BALB/c and C57BL6 mouse strains vary in their ability to heal corneal epithelial debridement wounds. Experimental Eye Research. 87 (5), 478-486 (2008).
  55. Kato, T., Chang, J. H., Azar, D. T. Expression of type XVIII collagen during healing of corneal incisions and keratectomy wounds. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 44 (1), 78-85 (2003).
  56. Kure, T., et al. Corneal neovascularization after excimer keratectomy wounds in matrilysin-deficient mice. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 44 (1), 137-144 (2003).
  57. Lin, A., et al. Bacterial keratitis preferred practice pattern. Ophthalmology. 126 (1), 1-55 (2019).
  58. Cable, E. J., Onishi, K. G., Prendergast, B. J. Circadian rhythms accelerate wound healing in female Siberian hamsters. Physiology and Behavior. 171, 165-174 (2017).
  59. Lyons, A. B., Moy, L., Moy, R., Tung, R. Circadian rhythm and the skin: A review of the literature. Journal of Clinical and Aesthetic Dermatology. 12 (9), 42-45 (2019).
  60. Westman, J., Grinstein, S., Marques, P. E. Phagocytosis of Necrotic Debris at Sites of Injury and Inflammation. Frontiers in Immunology. 10, 3030 (2020).
  61. Gaudry, M., et al. Intracellular pool of vascular endothelial growth factor in human neutrophils. Blood. 90 (10), 4153-4161 (1997).
  62. Pan, Z., et al. Vascular endothelial growth factor promotes anatomical and functional recovery of injured peripheral nerves in the avascular cornea. FASEB Journal. 7, 2756-2767 (2013).
  63. Di, G., et al. VEGF-B promotes recovery of corneal innervations and trophic functions in diabetic mice. Scientific Reports. 7 (1), 1-13 (2017).
  64. Thomas, M. R., Storey, R. F. The role of platelets in inflammation. Thrombosis and Haemostasis. 114 (3), 449-458 (2015).
  65. Margraf, A., Zarbock, A. Platelets in inflammation and resolution. The Journal of Immunology. 203 (9), 2357-2367 (2019).

Tags

الطب، العدد 178، القرنية، التئام الجروح، التآكل، نادي الغولف spud، تريفين
نموذج التآكل الظهاري لدراسة التئام جروح القرنية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Akowuah, P. K., De La Cruz, A.,… More

Akowuah, P. K., De La Cruz, A., Smith, C. W., Rumbaut, R. E., Burns, A. R. An Epithelial Abrasion Model for Studying Corneal Wound Healing. J. Vis. Exp. (178), e63112, doi:10.3791/63112 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter