Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Um modelo de abrasão epitelial para estudar a cicatrização da ferida córnea

Published: December 29, 2021 doi: 10.3791/63112
Automatic Translation
1, 1, 2, 2,3, 1,2
1College of Optometry, University of Houston, 2Children’s Nutrition Research Center, Baylor College of Medicine, 3Center for Translational Research on Inflammatory Diseases (CTRID), Michael E. DeBakey Veterans Affairs Medical Center

Summary

Aqui, um protocolo para criar uma ferida de abrasão epitelial córnea central no rato usando uma trefina e um taco de golfe sem corte é descrito. Este modelo de cura de feridas na córnea é altamente reprodutível e agora está sendo usado para avaliar a cicatrização comprometida da ferida córnea no contexto das doenças.

Abstract

A córnea é fundamental para a visão, representando cerca de dois terços do poder refrativo do olho. Crucial para o papel da córnea na visão é a sua transparência. No entanto, devido à sua posição externa, a córnea é altamente suscetível a uma grande variedade de lesões que podem levar à perda de transparência corneal e eventual cegueira. A cicatrização eficiente da ferida corneal em resposta a essas lesões é fundamental para a manutenção da homeostase da córnea e preservação da transparência corneal e capacidades de refração. Em eventos de cicatrização comprometida da ferida córnea, a córnea torna-se vulnerável a infecções, ulcerações e cicatrizes. Dada a importância fundamental da cicatrização da ferida córnea para a preservação da transparência e visão da córnea, uma melhor compreensão do processo normal de cicatrização da ferida córnea é um pré-requisito para a compreensão da cicatrização prejudicada da ferida córnea associada à infecção e doença. Em direção a este objetivo, modelos de murina de woundarás córneas têm se mostrado úteis para promover nossa compreensão dos mecanismos de cura da ferida córnea que operam sob condições fisiológicas normais. Aqui, um protocolo para criar uma abrasão epitelial córnea central em rato usando uma trefina e um taco de golfe sem cortes é descrito. Neste modelo, uma trefina circular de 2 mm de diâmetro, centrada sobre a córnea, é usada para demarcar a área da ferida. O taco de golfe spud é usado com cuidado para debridar o epitélio e criar uma ferida circular sem danificar a membrana do porão epitelial da córnea. A resposta inflamatória resultante prossegue como uma cascata bem caracterizada de eventos celulares e moleculares que são críticos para a cicatrização eficiente das feridas. Este modelo simples de cura de feridas na córnea é altamente reprodutível e bem publicado e agora está sendo usado para avaliar a cicatrização comprometida da ferida córnea no contexto da doença.

Introduction

A córnea é o anterior transparente um terço do olho. A córnea serve várias funções, incluindo proteger as estruturas internas do olho e formar uma barreira estrutural que protege o olho contra infecções1. Mais importante, a córnea é fundamental para a visão, fornecendo cerca de dois terços do poder refrativo do olho 2,3. Crucial para o papel da córnea na visão é a sua transparência. No entanto, devido à sua posição externa, a córnea é exposta a uma grande variedade de lesões no dia-a-dia que podem levar à interrupção de sua função de barreira, perda de transparência e eventual cegueira. A perda de transparência da córnea é uma das principais causas de deficiência visual em todo o mundo, 4,5. As abrasões corneais são um motivo comum para as visitas ao pronto-socorro (PS), respondendo por metade dos casos relacionados aos olhos apresentados no PS6. Estima-se que mais de 1 milhão de indivíduos sofra de lesões relacionadas aos olhos anualmente nos Estados Unidos7. A cura eficiente da ferida córnea em resposta a essas lesões é fundamental para manter a homeostase da córnea e a preservação de suas capacidades de transparência e refração. Em eventos de cicatrização comprometida da córnea, a córnea torna-se vulnerável a infecções, ulcerações e cicatrizesde 8,9. Além disso, a crescente popularidade das cirurgias refrativas coloca um desafio traumático único na córnea10. Dada a importância fundamental da cicatrização da ferida córnea para a preservação da transparência e visão da córnea, uma melhor compreensão do processo normal de cicatrização da ferida córnea é um pré-requisito para a compreensão da cicatrização prejudicada da ferida córnea associada à infecção e doença.

Para isso, foram desenvolvidos diversos modelos animais de cicatrização de feridas córneas, 11,12,13,14,15. Modelos de murina de cicatrização de feridas córneas têm se mostrado úteis para promover nossa compreensão dos mecanismos de cura da ferida córnea que operam sob condições fisiológicas normais. Diferentes tipos de feridas córneas têm sido empregados no estudo da cicatrização de feridas córneas, cada uma adequada para investigar diferentes aspectos do processo de cicatrização da ferida. Os modelos de feridas mais comuns usados em estudos de cicatrização de feridas córneas são os modelos mecânicos e químicos de feridas. As feridas córneas químicas, principalmente envolvendo a criação de queimaduras alcalinas na córnea, são úteis para o estudo de úlceras córneas, opificação e neovascularização13. As feridas mecânicas da córnea envolvem ferimentos de desbridamento (abrasão) e ferimentos de ceratectomia 14,15,16. Uma membrana de porão epitelial de córnea intacta ou rompida define feridas de debridamento e ceratectomia, respectivamente. Nas feridas de desbridamento, a membrana do porão epitelial permanece intacta, enquanto nas feridas da querotetomia, a membrana do porão é rompida com penetração principalmente no estroma anterior. As feridas de desbridamento são mais úteis para estudar a re-epitelialização, a proliferação de células epiteliais, a resposta imune e a regeneração nervosa após o ferimento na córnea. As feridas de ceratectomia, por outro lado, são mais úteis para estudar cicatrizes na córnea 14,15.

Aqui, um protocolo para criar uma ferida de abrasão epitelial córnea central no rato usando uma trefina e um taco de golfe sem corte é descrito. Este modelo simples de cura de feridas na córnea é altamente reprodutível e bem publicado e agora está sendo usado para avaliar a cicatrização comprometida da ferida córnea no contexto da doença17.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Todos os protocolos de animais foram aprovados pelos Comitês Institucionais de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Houston e baylor College of Medicine. As diretrizes descritas na declaração da Associação de Pesquisa em Visão e Oftalmologia (ARVO) sobre o uso de animais na visão e pesquisa oftalmológica foram seguidas no manuseio e utilização dos camundongos.

1. Preparação

  1. Preparação da solução fluoresceína
    1. Prepare 1% de solução de fluoresceína dissolvendo 10 mg de sal de fluoresceína de sódio em 1 mL de soro fisiológico estéril ou salina tamponada de fosfato 1x (PBS).
      NOTA: Prepare a solução de fluoresceína de sódio no dia do uso ou um dia antes para evitar contaminação microbiana. Quando preparado um dia antes do uso, armazene a solução de fluoresceína a 4 °C de distância da luz. Enrole tubos com papel alumínio para evitar fotobleaching.
    2. Divida a solução em alíquotas adequadas para uso em um único experimento. 1-1,5 μL de solução de fluoresceína é usado por mouse por ponto de tempo. Use a seguinte fórmula para calcular o volume de alíquota apropriada para um único experimento:
      Equation 1
      NOTA: Por exemplo, se seis camundongos forem estudados em um único experimento com o tamanho da ferida monitorado em cinco pontos de tempo, o volume de alíquota adequada para esse único experimento seria:
      Equation 2
  2. Preparação de coquetel de cetamina/xilazina para anestesia de camundongos.
    1. Para preparar 10 mL de coquetel, misture 2,0 mL de cetamina (100 mg/mL) com 1,0 mL de xilazina (20 mg/mL) e adicione 7,0 mL de PBS estéril. Prepare o coquetel de cetamina/xilazina um dia antes ou no dia da cirurgia.
      NOTA: Todas as soluções devem ser usadas à temperatura ambiente, a menos que seja indicado o contrário.

2. Anestesia

  1. Pese o mouse (8-12 semanas de idade C57BL/6 wildtype ratos) para determinar a quantidade apropriada de anestésico para administrar. Use a técnica de contenção do rato de duas mãos para conter e manusear camundongos para a injeção do anestésico18. Administre o coquetel de cetamina/xilazina intraperitoneally (i.p.) em uma concentração final de 80 mg/kg de cetamina e 8 mg/kg de xilazina.
  2. Aguarde até que a anestesia completa seja alcançada antes de realizar ferimentos na córnea no camundongo. Avalie a profundidade da anestesia avaliando o reflexo do pedal após o aperto do dedo do pé. Quando a anestesia adequada é alcançada, o rato não deve mover-se sobre a beliscar o dedo do dedo do sol.
    NOTA: Como os camundongos perdem rapidamente o calor corporal durante a anestesia, é importante fornecer uma fonte de calor para os camundongos para prevenir a hipotermia. Coloque os ratos em uma fonte de calor (almofada de aquecimento) durante os estágios de anestesia e recuperação.

3. Criação de ferida córnea

  1. Feri o olho direito ou esquerdo apenas. Mantenha a consistência com o olho (ou seja, esquerda ou direita) que é ferido ao se mover de mouse para mouse.
    NOTA: Como as escoriações danificam os nervos da córnea e reduzem a acuidade, ferir ambos os olhos pode causar desconforto e comprometimento significativos. Uma vez que os analgésicos têm o potencial de suprimir respostas inflamatórias, seu uso pode ser um confundimento em certos experimentos que visam compreender a inflamação da córnea. Evitar analgésicos em experimentos de feridas na córnea foi aprovado pelo Nosso Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC).
  2. Para criar a ferida córnea epitelial
    1. Sob um microscópio dissecando, use a trefina de 2 mm de diâmetro (ver Figura 1) para demarcar o centro da córnea, mantendo o olho aberto usando o polegar e o dedo indicador para segurar as pálpebras. Gire suavemente a trefina para causar uma impressão no epitélio da córnea.
      NOTA: Deve-se tomar cuidado para não aplicar pressão excessiva ao usar a trefina, pois isso pode resultar em perfuração corneal. Além disso, deve-se tomar cuidado para posicionar a trefina centralmente. As pupilas podem ser usadas como um marco para localizar o centro da córnea.
    2. Sob um microscópio dissecando, segure o spud do taco de golfe contundente (ver Figura 1) a aproximadamente 45° da superfície da córnea dentro da área demarcada com a trefina. Raspe cuidadosamente e continuamente o epitélio dentro da área demarcada com o spud para debridar o epitélio.
      NOTA: Não aplique força excessiva no desbridamento, pois isso também pode causar perfuração corneana. Os olhos dos ratos podem secar durante o processo de ferida, dificultando o debridamento. Nesse caso, aplique PBS estéril na superfície ocular para manter a hidratação ideal.

Figure 1
Figura 1: trephine de 2 mm e spud taco de golfe sem corte. A trefina é usada para demarcar uma região circular no centro da córnea, e a espiada do clube de golfe é usada para remover o epitélio dentro da região demarcada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

4. Monitoramento do fechamento de feridas e re-epitelialização

  1. Pipeta 1-1,5 μL de solução de fluoresceína de 1% sobre a superfície ferida e córnea de imagem usando um microscópio digital com uma fonte de luz azul.
  2. Adquira imagens no primeiro minuto da adição da solução de fluoresceína para evitar a propagação para o epitélio circundante levando à superestimação do tamanho da ferida. Córneas feridas são imagens em horários específicos (ou seja, 0h, 12h, 18h, 24h e 30h) após ferimentos.
    NOTA: Em todos os pontos de tempo, a imagem é realizada sob anestesia; cetamina/xilazina é usada no momento da ferida enquanto isoflurano é usado em pontos de tempo subsequentes. Os camundongos são alojados individualmente em gaiolas separadas durante o monitoramento do fechamento de feridas. Quando alojados juntos, os ratos tendem a lamber os olhos do companheiro de ninhada, um comportamento que tem sido mostrado para afetar a cicatrização de feridas em diferentes tecidos19,20.
  3. Analise imagens capturadas, rastreando a área da ferida usando um software de análise de imagem. A área da ferida para cada ponto de tempo é expressa como uma porcentagem da área original da ferida em 0h.

5. Imagem e análise de imunofluorescência

  1. Eutanize os camundongos por um método aprovado pela IACUC (neste caso, overdose de dióxido de carbono seguido de luxação cervical) nos pontos de tempo desejados após o ferimento.
  2. Colher os globos oculares pressionando suavemente o canthus lateral para deslocar o globo ocular usando uma tesoura curva de íris. Guie a tesoura atrás do globo ocular para segurar firmemente o nervo óptico e, em seguida, corte o nervo, o que permite que o globo ocular seja removido.
  3. Fixar cada globo ocular em 1 mL de 1x PBS contendo 2% de paraformaldeído por 1h em temperatura ambiente e, em seguida, lavar três vezes em 1 mL de 1x PBS por 5 min cada.
  4. Sob um microscópio dissecando, use uma lâmina cirúrgica para fazer uma incisão na esclera, cerca de 500 μm distal para o limbus, e depois cortar através do globo. Usando fórceps, remova suavemente a matéria de íris da córnea e, em seguida, corte cuidadosamente o tecido escleral, certificando-se de deixar o limbus intacto.
  5. Faça quatro cortes radiais parciais, cada um com aproximadamente 1 mm de comprimento, que se estendem da córnea periférica e param aquém do centro para permitir que a córnea se achate.
  6. Permeabilize e bloqueie córneas em 1 mL de 2% de albumina de soro bovino (BSA) e 0,01% TritonX -100 em 1x PBS por 15 min seguido por bloqueio em 2% BSA em 1x PBS para um adicional de 45 min a temperatura ambiente.
  7. Incubar córneas durante a noite a 4 °C em um coquetel de anticorpos conjugados fluorocromo exclusivos diretamente rotulados preparados em 1x PBS contendo 2% de BSA.
    NOTA: Os anticorpos são direcionados para rotular células específicas e tecidos de interesse. Por exemplo, endotélio, neutrófilos e plaquetas são rotulados com anticorpos anti-CD3121,22, anti-Ly-6G23,24 e anticorpos anti-CD4125,26, respectivamente. 4',6-diamidino-2-fenilômdeo (DAPI) é adicionado ao coquetel de anticorpos para visualizar núcleos.
  8. Após a incubação, lave as córneas três vezes em 1x PBS por 15 min cada.
  9. Monte córneas em um slide de microscópio em uma gota de meio de montagem de fluorescência anti-fade, cubra com um deslizamento de tampa e imagem com a ampliação desejada (objetivo de 4x a 100x) usando um microscópio de luz de fluorescência. Tire imagens de espessura total da córnea em diferentes regiões, conforme ilustrado na Figura 2A.
    NOTA: O padrão de análise microscópica ilustrado na Figura 2A é utilizado para analisar alterações regionais específicas na inflamação e divisão celular. Tanto as manchas de DAPI quanto ly-6G são usadas para identificar os neutrófilos extravasculares. Com a coloração da DAPI, os neutrófilos esféricos têm uma ferradura ou núcleo em forma de donut distinto (Figura 2B).

Figure 2
Figura 2: Estratégia de imagem córnea e infiltração de neutrófilos após abrasão central. (A) Representação esquemática de uma integral de córnea mostrando nove campos microscópicos em todo o diâmetro da córnea. A área cinza representa a área original da ferida. A largura de cada região é de 500 μm. (B) Note a forma de ferradura ou donut distinto de núcleos neutrófilos com coloração DAPI. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

A Figura 3 mostra um micrografo eletrônico de transmissão de uma ferida córnea criada com o taco de golfe sem corte, demonstrando que a membrana do porão epitelial está de fato intacta após a lesão.

Figure 3
Figura 3: A membrana do porão epitelial permanece intacta após a abrasão da córnea. Micrografia eletrônica de transmissão de uma ferida córnea criada com o taco de golfe sem corte spud. As pontas das flechas apontam para a membrana do porão sob o epitélio restante em torno da ferida, enquanto as flechas apontam para a membrana do porão na área desnudada. Isso mostra a continuidade da membrana do porão desde as porções não abradas da córnea, demonstrando que a membrana do porão é deixada intacta após o debridamento. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Este protocolo de ferimentos na córnea tem sido usado para caracterizar extensivamente a dinâmica de cicatrização da ferida para uma ferida de abrasão epitelialde 2 mm 27,28,29,30,31,32,33. A capacidade de monitorar a taxa de fechamento de feridas e re-epitelialização in vivo é uma parte central deste modelo. Como mostrado na Figura 4A, o uso de solução de fluoresceína e um microscópio digital com uma fonte de luz azul permite a visualização do tamanho da ferida. Neste modelo, o monitoramento do fechamento da ferida é realizado no momento do ferimento (0h), 12h, 18h, 24h e 30h após ferimento. A Figura 4B mostra a cinética do fechamento da ferida mais de 30 h. Em camundongos C57BL/6 de 8-12 semanas de idade, o fechamento da ferida e a re-epitelialização são tipicamente completos 24 horas após o ferimento ilustrado na Figura 4B e uma resposta inflamatória bem regulamentada é fundamental para uma cicatrização eficiente da ferida 34,35,36.

Figure 4
Figura 4: O fechamento da ferida epitelial foi avaliado utilizando-se a coloração de fluoresceína. (A) Imagens representativas da coloração da ferida da córnea às 0h, 12h, 18h, 24 h e 30h. Neste modelo, o fechamento da ferida é tipicamente completo 24 horas após o ferimento. Note a falta de manchas verdes na córnea central às 24h e 30 h. (B) Cinética de fechamento da ferida indicando fechamento completo da ferida em 24h após o ferimento. O valor em cada ponto de tempo é expresso em percentagem da área original da ferida (ou seja, área de ferida a 0h) (n ≥ 6). Os dados apresentados como média ± desvio padrão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

A resposta inflamatória ao ferimento neste modelo é bem caracterizada. A ferida de abrasão epitelial provoca uma rápida resposta inflamatória na vasculatura limbal da córnea caracterizada principalmente pela vasodilatação, extravasação plaqueta confinada ao limbus 37,38,39 e extravasão de neutrófilos com migração para o centro da córnea40. A Figura 5 mostra a vasculatura limbal de uma córnea não ferida com neutrófilos extravasculares (Figura 5A) e uma córnea ferida com plaquetas extravasculares e neutrófilos (Figura 5B).

Figure 5
Figura 5: Imagem de célula inflamatória no limbus. Fotomicrograph do limbus da córnea mostrando coloração para os vasos sanguíneos limbais com anticorpo anti-CD31 (mostrado em vermelho), neutrófilos com anticorpo anti-Ly-6G (mostrado em verde) e plaquetas com anticorpo anti-CD41 (mostrado em azul). (A) sem abrasão e (B) 30 h após a abrasão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Neste modelo, a infiltração de neutrófilo na córnea é avaliada em cinco regiões distintas como ilustrado na Figura 2A. Para determinar essas regiões distintas, captura-se uma imagem da totalidade da córnea, visualizando a vasculatura limbal com coloração anti-CD31. A borda mais interna da região limbal em cada pétala é marcada usando a vasculatura limbal como guia. A distância da borda mais interna da região limbal de uma pétala para outra na direção horizontal (x) ou vertical (y) é medida para cada cornea integral. Para ratos de 8-12 semanas de idade C57BL/6 wild-type, esta distância é de ~3,7 mm. Essa distância abrange as regiões periféricas para periféricas. O centro da cornea é então calculado como o ponto correspondente a metade do diâmetro horizontal ou vertical de toda a quantidade. A região paracentral é de 500 μm esquerda, direita, para cima ou para baixo do centro calculado. Os outros campos estão todos a 500 μm do campo anterior. Tanto as manchas de DAPI quanto ly-6G são usadas para identificar os neutrófilos extravasculares. As contagens de neutrófilos em cada região córnea dos quatro quadrantes são medianas e expressas como neutrófilos por campo.

A avaliação plaqueta neste modelo é realizada apenas no limbus; durante a cicatrização da ferida corneca, as plaquetas extravasam e localizam-se no limbus27,37. O número total de plaquetas no limbus é contado, e as contagens são expressas como plaquetas/mm2 de área limbal. As contagens das quatro pétalas podem ser totalizadas ou médias.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

O objetivo deste artigo de métodos era descrever um protocolo para a criação de uma ferida de abrasão epitelial córnea central no rato usando uma trefina e um taco de golfe sem corte. Este modelo de murina tem sido usado para estudar inflamação córnea e sua contribuição para a cicatrização de feridas. Esse tipo de modelo pode ser usado para estudar mecanismos de cicatrização de feridas córneas em condições fisiológicas normais e em patologias 17,28,29,41,42. O modelo tem sido usado para investigar a cicatrização de feridas na córnea em condições patológicas, como evidenciado por um estudo sobre a cicatrização de feridas córneas prejudicadas em um modelo de obesidade induzida pela dieta17. Uma vantagem distinta deste modelo é que ele cria um tamanho de ferida epitelial reprodutível (2 mm) com uma localização central precisa sem romper a membrana do porão. Este modelo de woundamento córnea é simples e rápido de executar. Além do clube de golfe contundentespud 29,39,43,44,45, o rebarba rotativo (Algerbrush)38,46,47, e a lâmina de diamante 32,37,40,48,49,50,51 ambos podem ser usados para criar a ferida de abrasão neste modelo. Nas mãos de um usuário experiente, não há diferença substancial na ferida de abrasão criada por qualquer ferramenta. Para fins de treinamento e nas mãos de um novato, muitas vezes é mais fácil alcançar resultados reprodutíveis com o spud do clube de golfe sem corte em comparação com a rebarba rotativa e lâmina de diamante. A rebarba rotativa (Algerbrush) requer um toque delicado caso contrário a rebarba giratória pode danificar a membrana do porão epitelial. Isso também foi relatado por outros investigadores 52,53. Por outro lado, o taco de golfe sem cortes deixa a membrana do porão epitelial intacta.

Para reproduzir com sucesso este protocolo de woundamento corneia e observar a dinâmica subsequente de re-epitelialização e inflamação, a mesma cepa e faixa etária do camundongo devem ser utilizadas, e o tamanho e a profundidade da ferida devem ser criados conforme descrito acima. A dinâmica de cicatrização da ferida córnea e as linhas do tempo descritas neste protocolo são para a cepa de camundongo c57BL/6 e podem não ser compartilhadas se uma variedade diferente de mouse for usada. Pal-Ghosh et al.54 relataram variações na capacidade de C57BL/6 e BALB/c de curar feridas de debridamento epitelial córnea. Para o mesmo tamanho da ferida corneal, o fechamento da ferida corneal e a re-epitelialização são mais lentos em camundongos BALB/c. O cronograma para a conclusão do fechamento da ferida e a resposta inflamatória característica descrita aqui são para uma ferida circular de tamanho de 2 mm de diâmetro. Espera-se um tempo de conclusão da ferida maior que 2 mm, enquanto um tempo mais curto é esperado para diâmetros de feridas inferiores a 2 mm. Além disso, feridas córneas maiores, especialmente aquelas mais próximas do limbus, devem provocar uma resposta inflamatória mais exagerada, à medida que mais leucócitos são recrutados para a córnea16. Mais importante, a ferida deve ser restrita ao epitélio córnea. Feridas que rompem a membrana do porão epitelial ou penetram no estroma córnea levam mais tempo para cicatrizar. Essas feridas também estão associadas a uma resposta inflamatória alterada, neovascularização, formação de miofibroblast e cicatrizes 55,56.

Deve-se tomar cuidado em todas as etapas para prevenir a infecção microbiana da córnea abrasada. A infecção microbiana altera a resposta inflamatória e pode levar a ulcerações, cicatrizes e perda de visão57. Para prevenir a infecção microbiana da ferida, devem ser sempre utilizadas ferramentas e soluções estéreis. Se vários ratos estiverem sendo feridos ao mesmo tempo, uma trefina estéril deve ser usada para cada rato. Entre os ratos, o taco de golfe deve ser lavado em PBS estéril seguido de desinfecção em 70% de etanol e lavado novamente em PBS estéril. Se o ferimento for realizado em camundongos adicionais durante vários dias, deve ser realizado na mesma hora do dia. Isto é para controlar o efeito circadiano na cicatrização da ferida e inflamação. Em camundongos C57BL/6, a hora do dia em que a ferida é feita afeta a taxa e a qualidade da cicatrização da ferida córnea. O fechamento mais rápido da ferida e a maior divisão celular são observados quando os ratos são feridos pela manhã em comparação com o ferimento à tarde ou à noite42. O efeito circadiano na cicatrização de feridas foi relatado em outros tecidos, incluindo a pele58,59. O wounding neste modelo é sempre realizado pela manhã.

A resposta inflamatória resultante ao ferimento neste modelo prossegue como uma cascata bem caracterizada de eventos celulares e moleculares que são críticos para a cicatrização eficiente da ferida. Os jogadores celulares mais bem caracterizados na inflamação induzida pela abrasão neste modelo são neutrófilos e plaquetas. Neutrófilos são os primeiros a chegar ao local da abrasão da córnea; níveis significativos de neutrófilos são detectados no estroma córnea dentro de 6 h de ferimentos. Os neutrófilos são responsáveis pela limpeza de detritos celulares, um processo intrínseco à inflamação e reparação deferidas 60. Além de suas atividades fagocíticas, os neutrófilos contêm fatores de crescimento, como fatores de crescimento endotelial vascular (VEGF)61. O VEGF é um fator neuro regenerativo crucial para a regeneração dos nervos da córnea após o ferimentode 62,63 e também é importante para a divisão de células epiteliaiscórneas 45,63. A infiltração de neutrófilo no limbus ocorre em duas ondas com o primeiro pico às 18 h e o segundo pico às 30 h após ferir40. Usando camundongos neutropenicos37,40, extravasação de neutrófilos e migração subsequente para o centro da córnea têm se mostrado cruciais para a cicatrização da ferida corneal. Embora tradicionalmente conhecidas como cruciais na manutenção da hemostasia e coagulação sanguínea, as plaquetas também têm um papel fundamental reconhecido na cicatrização de feridas córneas37. As plaquetas contêm inúmeros mediadores que contribuem para inflamação e resolução tecidual64,65. Em camundongos com trombocitopenia, este modelo tem sido usado para mostrar que plaquetas são importantes para a cura eficiente da ferida corneal37.

Embora os neutrófilos e plaquetas sejam as células mais caracterizadas neste modelo, células imunes como células T gamma delta, células assassinas naturais e células dendríticas também têm se mostrado envolvidas na resposta imune ao ferimento usando este modelo27,48. Extravasação celular assassina natural no estroma28,29 e migração de células Gamma delta T para o epitélio27 curativo foram relatadas. Este modelo também tem sido usado para identificar moléculas de adesão chave para a extravasão de células imunes durante a cicatrização de feridas córneas. Antígeno de função linfócito-1 (LFA-1)32, CD1851 e molécula de adesão intercelular-1 (ICAM-1)47,49 têm sido todos considerados cruciais para extravasão de neutrófilos e cura eficiente da ferida corneal usando este modelo. Divisão de células epiteliais em resposta ao ferimento, o que é fundamental para a reeserção epitelial após o fechamento da ferida é avaliado usando figuras mitóticas. A condensação cromossômica durante diferentes estágios da divisão celular dá aos núcleos uma aparência característica conhecida como figura mitótica. A coloração da DAPI do núcleo permite a visualização dessas figuras mitóticas.

O modelo de ferida de abrasão da córnea do camundongo provou ser notavelmente reprodutível e forneceu considerável visão dos mecanismos celulares e moleculares que contribuem para a cura eficiente da ferida. No entanto, vale ressaltar que existem limitações ao modelo no que diz respeito à sua aplicabilidade clínica. O modelo e seus desfechos só são aplicáveis a escoriações epiteliais simples e não penetrantes. Como observado anteriormente, lesões na córnea resultantes de feridas penetrantes causadas por insulto físico ou químico provocarão cinéticas e desfechos de cura de feridas diferentes, particularmente se a ferida for infectada como ocorre frequentemente no caso de lesões na córnea humana. Dito isto, o modelo de ferida de abrasão da córnea do camundongo fornece uma excelente base para estudar princípios fundamentais de inflamação que modulam a cicatrização da ferida córnea.

O protocolo de ferimentos na córnea descrito aqui é simples e facilmente reproduzido. Fornece uma ferramenta útil para investigar questões fundamentais sobre o processo de cicatrização da ferida córnea e sua resposta inflamatória associada. Seu potencial para ajudar na compreensão de patologias córneas associadas a complicações de cicatrização de feridas é apenas o começo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgments

Financiamento: Apoiado por: NIH EY018239 (A.R.B., C.W.S., e R.E.R.), P30EY007551 (A.R.B.), e Sigma Xi Grant em Aid of Research (P.K.A.). O conteúdo é de responsabilidade exclusiva dos autores e não representa as opiniões oficiais dos Institutos Nacionais de Saúde, ou Sigma Xi.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-CD31 antibody BD Bioscience, Pharmingen 550274
Anti-CD41 antibody BD Bioscience, Pharmingen 553847
Anti-Ly6G antibody BD Bioscience, Pharmingen 551459
Bovine serum albumin (BSA) ThermoFisher scientific B14
C57BL/6 mice Jackson Laboratories 664
DAPI Sigma Aldrich D8417
DeltaVision wide-field deconvolution fluorescence microscope GE Life Sciences
Dissecting microscope Leica microsystems
Electronic Toploading Balances (Weighing scale) Fisher Scientific
Ethanol ThermoFisher scientific T038181000CS
Golf-club spud Stephens instruments S2-1135
Iris curve scissors Fisher Scientific 31212
Isoflurane Patterson veterinary 07-893-1389
Ketamine Patterson veterinary 07-890-8598
Phospate buffered saline (PBS) ThermoFisher scientific AM9624
Sodium fluorescein salt Sigma Aldrich 46970
Surgical blade (scapel blade) Fine Science tools 10022-00
Trephine Integra Miltex 33-31
TritonX -100 Fisher Scientific 50-295-34
Forcep Fine Science tools 11923-13
Xylazine Patterson veterinary 07-808-1947

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. DelMonte, D. W., Kim, T. Anatomy and physiology of the cornea. Journal of Cataract and Refractive Surgery. 37 (3), 588-598 (2011).
  2. Meek, K. M., Knupp, C. Corneal structure and transparency. Progress in Retinal and Eye Research. 49, 1-16 (2015).
  3. Sridhar, M. S. Anatomy of cornea and ocular surface. Indian Journal of Ophthalmology. 66 (2), 190-194 (2018).
  4. Flaxman, S. R., et al. Global causes of blindness and distance vision impairment 1990-2020: a systematic review and meta-analysis. The Lancet Global Health. 5 (12), 1221-1234 (2017).
  5. Robaei, D., Watson, S. Corneal blindness: A global problem. Clinical & Experimental Ophthalmology. 42 (3), 213-214 (2014).
  6. McGwin, G., Owsley, C. Incidence of emergency department-treated eye injury in the United States. Archives of Ophthalmology. 123 (5), 662-666 (2005).
  7. Ljubimov, A. V., Saghizadeh, M. Progress in corneal wound healing. Progress in Retinal and Eye Research. 49, 17-45 (2015).
  8. Wilson, S. L., Haj, A. J. E., Yang, Y. Control of scar tissue formation in the cornea: Strategies in clinical and corneal tissue engineering. Journal of Functional Biomaterials. 3 (3), 642 (2012).
  9. Vaidyanathan, U., et al. Persistent corneal epithelial defects: A review article. Medical Hypothesis, Discovery and Innovation in Ophthalmology. 8 (3), 163-176 (2019).
  10. Netto, M., et al. Wound healing in the cornea: a review of refractive surgery complications and new prospects for therapy. Cornea. 24 (5), 509-522 (2005).
  11. Friedenwald, J. S., Buschke, W. Some factors concerned in the mitotic and wound-healing activities of the corneal epithelium. Transactions of the American Ophthalmological Society. 42, 371-383 (1944).
  12. Xu, K., Yu, F. -S. X. Impaired epithelial wound healing and EGFR signaling pathways in the corneas of diabetic rats. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (6), 3301-3308 (2011).
  13. Bai, J. Q., Qin, H. F., Zhao, S. H. Research on mouse model of grade II corneal alkali burn. International Journal of Ophthalmology. 9 (4), 487-490 (2016).
  14. Blanco-Mezquita, J. T., Hutcheon, A. E. K., Stepp, M. A., Zieske, J. D. αVβ6 integrin promotes corneal wound healing. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 52 (11), 8505-8513 (2011).
  15. Blanco-Mezquita, J. T., Hutcheon, A. E. K., Zieske, J. D. Role of thrombospondin-1 in repair of penetrating corneal wounds. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 54 (9), 6262-6268 (2013).
  16. Stepp, M. A., et al. Wounding the cornea to learn how it heals. Experimental Eye Research. 121, 178-193 (2014).
  17. Hargrave, A., et al. Corneal dysfunction precedes the onset of hyperglycemia in a mouse model of diet-induced obesity. PLoS ONE. 15, 0238750 (2020).
  18. Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (67), e2771 (2012).
  19. Bodner, L., Dayan, D. Effect of parotid submandibular and sublingual saliva on wound healing in rats. Comparative Biochemistry and Physiology. Part A, Physiology. 100 (4), 887-890 (1991).
  20. Abbasian, B., Azizi, S., Esmaeili, A. Effects of rat's licking behavior on cutaneous wound healing. Iranian Journal of Basic Medical Sciences. 13 (1), 242-247 (2010).
  21. DeLisser, H. M., et al. Involvement of endothelial PECAM-1/CD31 in angiogenesis. The American Journal of Pathology. 151 (3), 671-677 (1997).
  22. Piali, L., et al. CD31/PECAM-1 is a ligand for alpha v beta 3 integrin involved in adhesion of leukocytes to endothelium. The Journal of Cell Biology. 130 (2), 451-460 (1995).
  23. Fleming, T. J., Fleming, M. L., Malek, T. R. Selective expression of Ly-6G on myeloid lineage cells in mouse bone marrow. RB6-8C5 mAb to granulocyte-differentiation antigen (Gr-1) detects members of the Ly-6 family. The Journal of Immunology. 151 (5), 2399-2408 (1993).
  24. Fleming, T. J., Malek, T. R. Multiple glycosylphosphatidylinositol-anchored Ly-6 molecules and transmembrane Ly-6E mediate inhibition of IL-2 production. The Journal of Immunology. 153 (5), 1955-1962 (1994).
  25. Phillips, D. R., Charo, I. F., Scarborough, R. M. GPIIb-IIIa: the responsive integrin. Cell. 65 (3), 359-362 (1991).
  26. Nieswandt, B., et al. Acute systemic reaction and lung alterations induced by an antiplatelet integrin gpIIb/IIIa antibody in mice. Blood. 94 (2), 684-693 (1999).
  27. Li, Z., Burns, A. R., Rumbaut, R. E., Smith, C. W. γδ T cells are necessary for platelet and neutrophil accumulation in limbal vessels and efficient epithelial repair after corneal abrasion. American Journal of Pathology. 171 (3), 838-845 (2007).
  28. Liu, Q., Smith, C. W., Zhang, W., Burns, A. R., Li, Z. NK cells modulate the inflammatory response to corneal epithelial abrasion and thereby support wound healing. American Journal of Pathology. 181 (2), 452-462 (2012).
  29. Gao, Y., et al. NK cells are necessary for recovery of corneal CD11c+ dendritic cells after epithelial abrasion injury. Journal of Leukocyte Biology. 94 (2), 343-351 (2013).
  30. Xiao, C., et al. Acute tobacco smoke exposure exacerbates the inflammatory response to corneal wounds in mice via the sympathetic nervous system. Communications Biology. 2, 33 (2019).
  31. Wang, H., et al. Epothilone B speeds corneal nerve regrowth and functional recovery through microtubule stabilization and increased nerve beading. Scientific Reports. 8 (1), 2647 (2018).
  32. Li, Z., Burns, A. R., Smith, C. W. Lymphocyte function-associated Antigen-1-dependent inhibition of corneal wound healing. Cell Injury. 169, 1590-1600 (2006).
  33. Wu, M., et al. The neuroregenerative effects of topical decorin on the injured mouse cornea. Journal of Neuroinflammation. 17 (1), 1-14 (2020).
  34. Rodrigues, M., Kosaric, N., Bonham, C. A., Gurtner, G. C. Wound healing: A cellular perspective. Physiological Reviews. 99 (1), 665-706 (2019).
  35. Rennard, S. I. Inflammation and repair processes in chronic obstructive pulmonary disease. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 160 (5), Pt 2 12-16 (1999).
  36. Landén, N. X., Li, D., Ståhle, M. Transition from inflammation to proliferation: a critical step during wound healing. Cellular and Molecular Life Sciences. 73 (20), 3861-3885 (2016).
  37. Li, Z., Rumbaut, R. E., Burns, A. R., Smith, C. W. Platelet response to corneal abrasion is necessary for acute inflammation and efficient re-epithelialteation. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 47, 4794-4802 (2006).
  38. Lam, F. W., Burns, A. R., Smith, C. W., Rumbaut, R. E. Platelets enhance neutrophil transendothelial migration via P-selectin glycoprotein ligand-1. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 300 (2), 468-475 (2011).
  39. La Cruz, A. D., et al. Platelet and erythrocyte extravasation across inflamed corneal venules depend on CD18, neutrophils, and mast cell degranulation. International Journal of Molecular Sciences. 22 (14), 7360 (2021).
  40. Li, Z., Burns, A. R., Smith, C. W. Two waves of neutrophil emigration in response to corneal epithelial abrasion: Distinct adhesion molecule requirements. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 47 (5), 1947-1955 (2006).
  41. Li, Z., Burns, A. R., Han, L., Rumbaut, R. E., Smith, C. W. IL-17 and VEGF Are Necessary for Efficient Corneal Nerve Regeneration. The American Journal of Pathology. 178 (3), 1106-1116 (2011).
  42. Xue, Y., et al. Modulation of circadian rhythms affects corneal epithelium renewal and repair in mice. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 58 (3), 1865-1874 (2017).
  43. Zhang, W., Magadi, S., Li, Z., Smith, C. W., Burns, A. R. IL-20 promotes epithelial healing of the injured mouse cornea. Experimental Eye Research. 154, 22-29 (2017).
  44. Li, Z., Burns, A. R., Miller, S. B., Smith, C. W. CCL20, γδ T cells, and IL-22 in corneal epithelial healing. FASEB Journal. 25 (8), 2659-2668 (2011).
  45. Li, Z., Burns, A. R., Han, L., Rumbaut, R. E., Smith, C. W. IL-17 and VEGF are necessary for efficient corneal nerve regeneration. American Journal of Pathology. 178 (3), 1106-1116 (2011).
  46. Reins, R. Y., Hanlon, S. D., Magadi, S., McDermott, A. M. Effects of topically applied Vitamin D during corneal wound healing. PLoS ONE. 11 (4), 0152889 (2016).
  47. Gagen, D., et al. ICAM-1 mediates surface contact between neutrophils and keratocytes following corneal epithelial abrasion in the mouse. Experimental Eye Research. 91 (5), 676-684 (2010).
  48. Li, Z., Rivera, C. A., Burns, A. R., Smith, C. W. Hindlimb unloading depresses corneal epithelial wound healing in mice. Journal of Applied Physiology. 97 (2), 641-647 (2004).
  49. Byeseda, S. E., et al. ICAM-1 is necessary for epithelial recruitment of γδ T cells and efficient corneal wound healing. American Journal of Pathology. 175 (2), 571-579 (2009).
  50. Li, Z., Burns, A. R., Rumbaut, R. E., Smith, C. W. γδ T cells are necessary for platelet and neutrophil accumulation in limbal vessels and efficient epithelial repair after corneal abrasion. American Journal of Pathology. 171 (3), 838-845 (2007).
  51. Petrescu, M. S., et al. Neutrophil interactions with keratocytes during corneal epithelial wound healing: A role for CD18 integrins. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 48 (11), 5023-5029 (2007).
  52. Pal-Ghosh, S., Pajoohesh-Ganji, A., Tadvalkar, G., Stepp, M. A. Removal of the basement membrane enhances corneal wound healing. Experimental Eye Research. 93 (6), 927-936 (2011).
  53. Pal-Ghosh, S., et al. Cytokine deposition alters leukocyte morphology and initial recruitment of monocytes and γδT cells after corneal injury. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (4), 2757-2765 (2014).
  54. Pal-Ghosh, S., Tadvalkar, G., Jurjus, R. A., Zieske, J. D., Stepp, M. A. BALB/c and C57BL6 mouse strains vary in their ability to heal corneal epithelial debridement wounds. Experimental Eye Research. 87 (5), 478-486 (2008).
  55. Kato, T., Chang, J. H., Azar, D. T. Expression of type XVIII collagen during healing of corneal incisions and keratectomy wounds. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 44 (1), 78-85 (2003).
  56. Kure, T., et al. Corneal neovascularization after excimer keratectomy wounds in matrilysin-deficient mice. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 44 (1), 137-144 (2003).
  57. Lin, A., et al. Bacterial keratitis preferred practice pattern. Ophthalmology. 126 (1), 1-55 (2019).
  58. Cable, E. J., Onishi, K. G., Prendergast, B. J. Circadian rhythms accelerate wound healing in female Siberian hamsters. Physiology and Behavior. 171, 165-174 (2017).
  59. Lyons, A. B., Moy, L., Moy, R., Tung, R. Circadian rhythm and the skin: A review of the literature. Journal of Clinical and Aesthetic Dermatology. 12 (9), 42-45 (2019).
  60. Westman, J., Grinstein, S., Marques, P. E. Phagocytosis of Necrotic Debris at Sites of Injury and Inflammation. Frontiers in Immunology. 10, 3030 (2020).
  61. Gaudry, M., et al. Intracellular pool of vascular endothelial growth factor in human neutrophils. Blood. 90 (10), 4153-4161 (1997).
  62. Pan, Z., et al. Vascular endothelial growth factor promotes anatomical and functional recovery of injured peripheral nerves in the avascular cornea. FASEB Journal. 7, 2756-2767 (2013).
  63. Di, G., et al. VEGF-B promotes recovery of corneal innervations and trophic functions in diabetic mice. Scientific Reports. 7 (1), 1-13 (2017).
  64. Thomas, M. R., Storey, R. F. The role of platelets in inflammation. Thrombosis and Haemostasis. 114 (3), 449-458 (2015).
  65. Margraf, A., Zarbock, A. Platelets in inflammation and resolution. The Journal of Immunology. 203 (9), 2357-2367 (2019).

Tags

Medicina Questão 178 córnea cicatrização de feridas abrasão taco de golfe spud trephine
Um modelo de abrasão epitelial para estudar a cicatrização da ferida córnea
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Akowuah, P. K., De La Cruz, A.,… More

Akowuah, P. K., De La Cruz, A., Smith, C. W., Rumbaut, R. E., Burns, A. R. An Epithelial Abrasion Model for Studying Corneal Wound Healing. J. Vis. Exp. (178), e63112, doi:10.3791/63112 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter