Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Un modelo de abrasión epitelial para estudiar la cicatrización de heridas corneales

Published: December 29, 2021 doi: 10.3791/63112
Automatic Translation
1, 1, 2, 2,3, 1,2
1College of Optometry, University of Houston, 2Children’s Nutrition Research Center, Baylor College of Medicine, 3Center for Translational Research on Inflammatory Diseases (CTRID), Michael E. DeBakey Veterans Affairs Medical Center

Summary

Aquí, se describe un protocolo para crear una herida de abrasión epitelial corneal central en el ratón utilizando una trefina y un palo de golf romo. Este modelo de cicatrización de heridas corneales es altamente reproducible y ahora se está utilizando para evaluar la cicatrización de heridas corneales comprometidas en el contexto de enfermedades.

Abstract

La córnea es crítica para la visión, ya que representa aproximadamente dos tercios del poder refractivo del ojo. Crucial para el papel de la córnea en la visión es su transparencia. Sin embargo, debido a su posición externa, la córnea es altamente susceptible a una amplia variedad de lesiones que pueden conducir a la pérdida de transparencia corneal y eventual ceguera. La cicatrización eficiente de heridas corneales en respuesta a estas lesiones es fundamental para mantener la homeostasis corneal y preservar la transparencia corneal y las capacidades refractivas. En caso de cicatrización comprometida de la herida corneal, la córnea se vuelve vulnerable a infecciones, ulceraciones y cicatrices. Dada la importancia fundamental de la cicatrización de heridas corneales para la preservación de la transparencia y la visión corneales, una mejor comprensión del proceso normal de curación de heridas corneales es un requisito previo para comprender la cicatrización deficiente de heridas corneales asociadas con infecciones y enfermedades. Hacia este objetivo, los modelos murinos de heridas corneales han demostrado ser útiles para promover nuestra comprensión de los mecanismos de curación de heridas corneales que operan en condiciones fisiológicas normales. Aquí, se describe un protocolo para crear una abrasión epitelial corneal central en ratón utilizando una trefina y un palo de golf romo. En este modelo, se utiliza una trefina circular de 2 mm de diámetro, centrada sobre la córnea, para demarcar el área de la herida. El palo de golf se utiliza con cuidado para desbridar el epitelio y crear una herida circular sin dañar la membrana basal epitelial corneal. La respuesta inflamatoria resultante procede como una cascada bien caracterizada de eventos celulares y moleculares que son críticos para la curación eficiente de heridas. Este modelo simple de curación de heridas corneales es altamente reproducible y bien publicado y ahora se está utilizando para evaluar la cicatrización de heridas corneales comprometidas en el contexto de la enfermedad.

Introduction

La córnea es el tercio anterior transparente del ojo. La córnea cumple varias funciones, incluida la protección de las estructuras internas del ojo y la formación de una barrera estructural que protege el ojo contra las infecciones1. Más importante aún, la córnea es crítica para la visión, proporcionando aproximadamente dos tercios del poder refractivo del ojo 2,3. Crucial para el papel de la córnea en la visión es su transparencia. Sin embargo, debido a su posición hacia afuera, la córnea está expuesta a una amplia variedad de lesiones en el día a día que pueden conducir a la interrupción de su función de barrera, pérdida de transparencia y eventual ceguera. La pérdida de transparencia corneal es una de las principales causas de discapacidad visual en todo el mundo 4,5. Las abrasiones corneales son una razón común para las visitas a la sala de emergencias (ER), que representa la mitad de los casos relacionados con los ojos presentados en la ER6. Se estima que más de 1 millón de personas sufren lesiones relacionadas con los ojos anualmente en los Estados Unidos7. La cicatrización eficiente de heridas corneales en respuesta a estas lesiones es fundamental para mantener la homeostasis corneal y preservar su transparencia y capacidades refractivas. En caso de cicatrización comprometida de la herida corneal, la córnea se vuelve vulnerable a infecciones, ulceraciones y cicatrices 8,9. Además, la creciente popularidad de las cirugías refractivas coloca un desafío traumático único en la córnea10. Dada la importancia fundamental de la cicatrización de heridas corneales para la preservación de la transparencia y la visión corneales, una mejor comprensión del proceso normal de curación de heridas corneales es un requisito previo para comprender la cicatrización deficiente de heridas corneales asociadas con infecciones y enfermedades.

Con ese fin, se han desarrollado varios modelos animales de cicatrización de heridas corneales 11,12,13,14,15. Los modelos murinos de curación de heridas corneales han demostrado ser útiles para promover nuestra comprensión de los mecanismos de curación de heridas corneales que operan en condiciones fisiológicas normales. Se han empleado diferentes tipos de heridas corneales en el estudio de la cicatrización de heridas corneales, cada una adecuada para investigar diferentes aspectos del proceso de curación de heridas. Los tipos más comunes de modelos de heridas utilizados en los estudios de cicatrización de heridas corneales son los modelos de heridas mecánicas y químicas. Las heridas corneales químicas, que en su mayoría implican la creación de quemaduras alcalinas en la córnea, son útiles para estudiar las úlceras corneales, la opacificación y la neovascularización13. Las heridas corneales mecánicas implican heridas por desbridamiento (abrasión) y heridas por queratectomía 14,15,16. Una membrana basal epitelial corneal intacta o rota define las heridas de desbridamiento y queratectomía, respectivamente. En las heridas de desbridamiento, la membrana basal epitelial permanece intacta, mientras que en las heridas de queratectomía, la membrana basal se rompe con la penetración principalmente en el estroma anterior. Las heridas de desbridamiento son más útiles para estudiar la reepitelización, la proliferación de células epiteliales, la respuesta inmune y la regeneración nerviosa después de la herida corneal. Las heridas de queratectomía, por otro lado, son más útiles para estudiar la cicatrización corneal14,15.

Aquí, se describe un protocolo para crear una herida de abrasión epitelial corneal central en el ratón utilizando una trefina y un palo de golf romo. Este modelo simple de curación de heridas corneales es altamente reproducible y bien publicado y ahora se está utilizando para evaluar la cicatrización de heridas corneales comprometidas en el contexto de la enfermedad17.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Todos los protocolos de animales fueron aprobados por los Comités Institucionales de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Houston y Baylor College of Medicine. Las pautas descritas en la declaración de la Asociación para la Investigación en Visión y Oftalmología (ARVO) sobre el uso de animales en la visión y la investigación oftálmica se siguieron en el manejo y uso de los ratones.

1. Preparación

  1. Preparación de la solución de fluoresceína
    1. Prepare una solución de fluoresceína al 1% disolviendo 10 mg de sal de fluoresceína sódica en 1 ml de solución salina estéril o solución salina tamponada con fosfato estéril (PBS) 1x.
      NOTA: Prepare la solución de fluoresceína sódica el día de uso o un día antes para evitar la contaminación microbiana. Cuando se prepare un día antes de su uso, guarde la solución de fluoresceína a 4 °C lejos de la luz. Envolver tubos con papel de aluminio para evitar el fotoblanqueo.
    2. Divida la solución en alícuotas adecuadas para su uso en un solo experimento. Se utiliza 1-1,5 μL de solución de fluoresceína por ratón por punto de tiempo. Utilice la siguiente fórmula para calcular el volumen de alícuota apropiado para un solo experimento:
      Equation 1
      NOTA: Por ejemplo, si se estudian seis ratones en un solo experimento con el tamaño de la herida monitoreado en cinco puntos de tiempo, el volumen de alícuota adecuado para ese solo experimento sería:
      Equation 2
  2. Preparación de cóctel de ketamina/xilazina para anestesia de ratones.
    1. Para preparar 10 ml de cóctel, mezcle 2,0 ml de ketamina (100 mg/ml) con 1,0 ml de xilazina (20 mg/ml) y agregue 7,0 ml de PBS estéril. Prepare el cóctel de ketamina/xilazina un día antes o el día de la cirugía.
      NOTA: Todas las soluciones deben usarse a temperatura ambiente a menos que se indique lo contrario.

2. Anestesia

  1. Pesar el ratón (ratones de tipo salvaje C57BL/6 de 8-12 semanas de edad) para determinar la cantidad adecuada de anestésico a administrar. Utilice la técnica de sujeción del ratón a dos manos para sujetar y manipular ratones para la inyección del anestésico18. Administrar el cóctel de ketamina/xilazina por vía intraperitoneal (p.i.) a una concentración final de 80 mg/kg de ketamina y 8 mg/kg de xilazina.
  2. Espere hasta que se logre la anestesia completa antes de realizar una herida corneal en el ratón. Evalúe la profundidad de la anestesia evaluando el reflejo del pedal después del pellizco del dedo del pie. Cuando se logra la anestesia adecuada, el ratón no debe moverse al pellizcar el dedo del pie.
    NOTA: Debido a que los ratones pierden rápidamente el calor corporal durante la anestesia, es importante proporcionar una fuente de calor para que los ratones prevengan la hipotermia. Coloque los ratones en una fuente de calor (almohadilla térmica) durante las etapas de anestesia y recuperación.

3. Creación de herida corneal

  1. Enrolle solo el ojo derecho o izquierdo. Mantener la consistencia con el ojo (es decir, izquierdo o derecho) que se lesiona al pasar del ratón al ratón.
    NOTA: Debido a que las abrasiones dañan los nervios corneales y reducen la agudeza, herir ambos ojos puede causar molestias y deterioro significativos. Dado que los analgésicos tienen el potencial de suprimir las respuestas inflamatorias, su uso puede ser un factor de confusión en ciertos experimentos destinados a comprender la inflamación corneal. Evitar los analgésicos en los experimentos de heridas corneales fue aprobado por nuestro Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC).
  2. Para crear la herida corneal epitelial
    1. Bajo un microscopio de disección, use la trefina de 2 mm de diámetro (ver Figura 1) para demarcar el centro de la córnea, manteniendo el ojo bien abierto usando el pulgar y el dedo índice para sostener los párpados. Gire suavemente la trefina para causar una impresión en el epitelio corneal.
      NOTA: Se debe tener cuidado de no aplicar una presión excesiva al usar la trefina, ya que esto puede provocar perforación corneal. Además, se debe tener cuidado de colocar la trefina centralmente. Las pupilas se pueden utilizar como un punto de referencia para localizar el centro de la córnea.
    2. Bajo un microscopio de disección, sostenga el palo de golf romo (ver Figura 1) a aproximadamente 45 ° de la superficie de la córnea dentro del área demarcada con la trefina. Raspar cuidadosa y continuamente el epitelio dentro del área demarcada con el spud para desbridar el epitelio.
      NOTA: No aplique fuerza excesiva en el desbridamiento, ya que también puede causar perforación corneal. Los ojos de los ratones pueden secarse durante el proceso de herida, lo que dificulta el desbridamiento. En tal caso, aplique PBS estéril en la superficie ocular para mantener una hidratación óptima.

Figure 1
Figura 1: 2 mm trephine y palo de golf romo spud. La trefina se utiliza para demarcar una región circular en el centro de la córnea, y el palo de golf spud se utiliza para eliminar el epitelio dentro de la región demarcada. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

4. Monitoreo del cierre de heridas y reepitelización

  1. Pipetear 1-1.5 μL de solución de fluoresceína al 1% sobre la superficie herida e imagen de la córnea utilizando un microscopio digital con una fuente de luz azul.
  2. Adquiera imágenes dentro del primer minuto de la adición de solución de fluoresceína para evitar que se propague al epitelio circundante, lo que lleva a una sobreestimación del tamaño de la herida. Las córneas heridas se toman imágenes en momentos específicos (es decir, 0 h, 12 h, 18 h, 24 h y 30 h) después de la herida.
    NOTA: En todos los puntos de tiempo, las imágenes se realizan bajo anestesia; La ketamina/xilazina se usa en el momento de la herida, mientras que el isoflurano se usa en puntos de tiempo posteriores. Los ratones se alojan individualmente en jaulas separadas durante la duración del monitoreo del cierre de la herida. Cuando se alojan juntos, los ratones tienden a lamer los ojos de los compañeros de camada, un comportamiento que se ha demostrado que afecta la cicatrización de heridas en diferentes tejidos19,20.
  3. Analice las imágenes capturadas, rastreando el área de la herida utilizando un software de análisis de imágenes. El área de la herida para cada punto de tiempo se expresa como un porcentaje del área original de la herida a 0 h.

5. Imágenes y análisis de inmunofluorescencia

  1. Sacrificar ratones por un método aprobado por IACUC (en este caso, sobredosis de dióxido de carbono seguido de dislocación cervical) en los puntos de tiempo deseados después de la herida.
  2. Cosecha los globos oculares presionando suavemente el canto lateral para desplazar el globo ocular usando una tijera curvada por el iris. Guíe las tijeras detrás del globo ocular para agarrar firmemente el nervio óptico y luego corte el nervio, lo que permite que se elimine el globo ocular.
  3. Fije cada globo ocular en 1 ml de 1 pb pbis que contenga paraformaldehído al 2% durante 1 h a temperatura ambiente, y luego lave tres veces en 1 ml de 1 pbs durante 5 minutos cada uno.
  4. Bajo un microscopio de disección, use una cuchilla quirúrgica para hacer una incisión en la esclerótica, aproximadamente 500 μm distales al limbo, y luego corte a través del globo. Usando fórceps, retire suavemente la materia del iris de la córnea y luego recorte cuidadosamente el tejido escleral, asegurándose de dejar el limbo intacto.
  5. Haga cuatro cortes radiales parciales, cada uno de aproximadamente 1 mm de longitud, que se extienden desde la córnea periférica y se detienen por debajo del centro para permitir que la córnea se aplane.
  6. Permeabilizar y bloquear córneas en 1 ml de albúmina sérica bovina (BSA) al 2% y TritonX -100 al 0,01% en 1x PBS durante 15 min, seguido de bloqueo en BSA al 2% en 1x PBS durante 45 min adicionales a temperatura ambiente.
  7. Incubar córneas durante la noche a 4 °C en un cóctel de anticuerpos conjugados fluorocromos únicos directamente etiquetados preparados en 1x PBS que contienen 2% de BSA.
    NOTA: Los anticuerpos están dirigidos a etiquetar células y tejidos específicos de interés. Por ejemplo, el endotelio, los neutrófilos y las plaquetas están marcados con anticuerpos anti-CD31 21,22, anti-Ly-6G 23,24 y anti-CD4125,26, respectivamente. 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) se añade al cóctel de anticuerpos para visualizar los núcleos.
  8. Después de la incubación, lave las córneas tres veces en 1x PBS durante 15 minutos cada una.
  9. Monte córneas en un portaobjetos de microscopio en una gota de medio de montaje de fluorescencia antidesvantilizante, cubra con un labio de cubierta e imagen con el aumento deseado (objetivo de 4x a 100x) usando un microscopio de luz de fluorescencia. Tome imágenes de espesor completo de la córnea a través de diferentes regiones como se ilustra en la Figura 2A.
    NOTA: El patrón de análisis microscópico ilustrado en la Figura 2A se utiliza para analizar cambios regionales específicos en la inflamación y la división celular. Tanto la tinción DAPI como la Ly-6G se utilizan para identificar los neutrófilos extravasculares. Con la tinción DAPI, los neutrófilos esféricos tienen un núcleo distinto en forma de herradura o rosquilla (Figura 2B).

Figure 2
Figura 2: Estrategia de imagen corneal e infiltración de neutrófilos después de la abrasión central. (A) Representación esquemática de un conjunto de córnea que muestra nueve campos microscópicos a lo largo del diámetro de la córnea. El área gris representa el área original de la herida. El ancho de cada región es de 500 μm. (B) Observe la forma distintiva de herradura o rosquilla de los núcleos de neutrófilos con tinción DAPI. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

La Figura 3 muestra una micrografía electrónica de transmisión de una herida corneal creada con el palo de golf romo spud, demostrando que la membrana basal epitelial está intacta después de la lesión.

Figure 3
Figura 3: La membrana basal epitelial permanece intacta después de la abrasión corneal. Micrografía electrónica de transmisión de una herida corneal creada con el palo de golf romo spud. Las puntas de flecha apuntan a la membrana basal debajo del epitelio restante que rodea la herida, mientras que las flechas apuntan a la membrana basal en el área desnuda. Esto muestra la continuidad de la membrana basal desde la membrana basal hasta las porciones desgastadas de la córnea, lo que demuestra que la membrana basal se deja intacta después del desbridamiento. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Este protocolo para la herida corneal se ha utilizado para caracterizar ampliamente la dinámica de cicatrización de heridas para una herida de abrasión epitelialde 2 mm 27,28,29,30,31,32,33. La capacidad de monitorear la tasa de cierre de heridas y reepitelización in vivo es una parte central de este modelo. Como se muestra en la Figura 4A, el uso de una solución de fluoresceína y un microscopio digital con una fuente de luz azul permite la visualización del tamaño de la herida. En este modelo, el monitoreo del cierre de la herida se realiza en el momento de la herida (0 h), 12 h, 18 h, 24 h y 30 h después de la herida. La Figura 4B muestra la cinética del cierre de la herida durante 30 h. En ratones de tipo salvaje C57BL/6 de 8-12 semanas de edad, el cierre de la herida y la reepitelización suelen completarse 24 horas después de la herida, como se ilustra en la Figura 4B, y una respuesta inflamatoria bien regulada es fundamental para la cicatrización eficiente de la herida 34,35,36.

Figure 4
Figura 4: El cierre de la herida epitelial se evaluó mediante tinción con fluoresceína. (A) Imágenes representativas de la tinción con fluoresceína de la herida corneal a las 0 h, 12 h, 18 h, 24 h y 30 h. En este modelo, el cierre de la herida generalmente se completa 24 horas después de la herida. Nótese la falta de tinción verde en la córnea central a las 24 h y 30 h. (B) Cinética de cierre de la herida que indica el cierre completo de la herida a las 24 h después de la herida. El valor en cada punto temporal se expresa como un porcentaje del área original de la herida (es decir, el área de la herida a 0 h) (n ≥ 6). Los datos se presentan como media ± desviación estándar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

La respuesta inflamatoria a las heridas en este modelo está bien caracterizada. La herida de abrasión epitelial provoca una rápida respuesta inflamatoria en la vasculatura limbal corneal caracterizada principalmente por vasodilatación, extravasación plaquetaria confinada al limbo 37,38,39 y extravasación de neutrófilos con migración hacia el centro de la córnea40. La Figura 5 muestra la vasculatura limbal de una córnea no enrollada con neutrófilos extravasculares (Figura 5A) y una córnea herida con plaquetas extravasculares y neutrófilos (Figura 5B).

Figure 5
Figura 5: Imágenes de células inflamatorias en el limbo. Fotomicrografía del limbo corneal que muestra tinción para los vasos sanguíneos limbales con anticuerpo anti-CD31 (mostrado en rojo), neutrófilos con anticuerpo anti-Ly-6G (mostrado en verde) y plaquetas con anticuerpo anti-CD41 (mostrado en azul). (A) sin abrasión y (B) 30 h después de la abrasión. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

En este modelo, la infiltración de neutrófilos en la córnea se evalúa en cinco regiones distintas, como se ilustra en la Figura 2A. Para determinar estas regiones distintas, se captura una imagen de la totalidad de la córnea completa, visualizando la vasculatura limbal con tinción anti-CD31. El borde más interno de la región limbal en cada pétalo se marca utilizando la vasculatura limbal como guía. La distancia desde el borde más interno de la región limbal de un pétalo a otro en la dirección horizontal (x) o vertical (y) se mide para cada tramo entero de córnea. Para ratones de tipo salvaje C57BL / 6 de 8 a 12 semanas de edad, esta distancia es de ~ 3.7 mm. Esta distancia cubre las regiones periféricas a periféricas. El centro del monte entero de la córnea se calcula entonces como el punto correspondiente a la mitad del diámetro horizontal o vertical del monte entero. La región paracentral es de 500 μm a la izquierda, derecha, arriba o abajo del centro calculado. Los otros campos son todos 500 μm del campo anterior. Tanto la tinción DAPI como la Ly-6G se utilizan para identificar los neutrófilos extravasculares. Los recuentos de neutrófilos en cada región corneal de los cuatro cuadrantes se promedian y expresan como neutrófilos por campo.

La evaluación plaquetaria en este modelo se realiza solo en el limbo; durante la cicatrización de la herida corneal, las plaquetas extravasan y se localizan en el limbo27,37. Se cuenta el número total de plaquetas en el limbo, y los recuentos se expresan como plaquetas/mm2 del área limbal. Los recuentos de los cuatro pétalos se pueden totalizar o promediar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

El propósito de este artículo de métodos fue describir un protocolo para crear una herida de abrasión epitelial corneal central en el ratón utilizando una trefina y un palo de golf romo. Este modelo murino se ha utilizado para estudiar la inflamación corneal y su contribución a la cicatrización de heridas. Este tipo de modelo se puede utilizar para estudiar los mecanismos de cicatrización de heridas corneales en condiciones fisiológicas normales y en patologías 17,28,29,41,42. El modelo se ha utilizado para investigar la cicatrización de heridas corneales en condiciones patológicas, como lo demuestra un estudio sobre la cicatrización de heridas corneales deterioradas en un modelo de ratón de obesidad inducida por la dieta17. Una clara ventaja de este modelo es que crea un tamaño exacto (2 mm) reproducible de la herida epitelial con una ubicación central precisa sin romper la membrana basal. Este modelo de heridas corneales es sencillo y rápido de realizar. Además del palo de golf romo spud 29,39,43,44,45, la rebaba giratoria (Algerbrush)38,46,47, y la hoja de diamante 32,37,40,48,49,50,51 ambos se pueden utilizar para crear la herida de abrasión en este modelo. En manos de un usuario experimentado, no hay una diferencia sustancial en la herida de abrasión creada por ninguna de las herramientas. Para fines de entrenamiento y en manos de un novato, a menudo es más fácil lograr resultados reproducibles con el palo de golf contundente en comparación con la rebaba giratoria y la hoja de diamante. La rebaba giratoria (Algerbrush) requiere un toque delicado, de lo contrario, la rebaba giratoria puede dañar la membrana basal epitelial. Esto también ha sido reportado por otros investigadores 52,53. Por otro lado, el palo de golf romo spud deja constantemente intacta la membrana basal epitelial.

Para reproducir con éxito este protocolo de heridas corneales y observar la posterior dinámica de reepitelización e inflamación, se debe utilizar la misma cepa y rango de edad del ratón, y se debe crear el tamaño y la profundidad de la herida como se describió anteriormente. La dinámica de cicatrización de la herida corneal y los plazos descritos en este protocolo son para la cepa de ratón C57BL/6 y es posible que no se compartan si se utiliza una cepa de ratón diferente. Pal-Ghosh et al.54 reportaron variaciones en la capacidad de C57BL/6 y BALB/c para curar heridas de desbridamiento epitelial corneal. Para el mismo tamaño de la herida corneal, el cierre de la herida corneal y la reepitelización son más lentos en ratones BALB/c. La línea de tiempo para completar el cierre de la herida y la respuesta inflamatoria característica descrita aquí son para una herida circular de 2 mm de diámetro. Se espera un tiempo de finalización del cierre de la herida más largo para diámetros de herida superiores a 2 mm, mientras que se espera un tiempo más corto para diámetros de herida inferiores a 2 mm. Además, se espera que las heridas corneales más grandes, especialmente las más cercanas al limbo, provoquen una respuesta inflamatoria más exagerada, a medida que se reclutan más leucocitos en la córnea16. Más importante aún, la herida debe restringirse al epitelio corneal. Las heridas que rompen la membrana basal epitelial o penetran en el estroma corneal tardan más tiempo en sanar. Estas heridas también se asocian con una respuesta inflamatoria alterada, neovascularización, formación de miofibroblastos y cicatrización55,56.

Se debe tener cuidado en cada paso para prevenir la infección microbiana de la córnea desgastada. La infección microbiana altera la respuesta inflamatoria y puede provocar ulceraciones, cicatrices y pérdida de la visión57. Para prevenir la infección microbiana de la herida, siempre se deben usar herramientas y soluciones estériles. Si se hieren varios ratones a la vez, se debe usar una trefina estéril para cada ratón. Entre los ratones, el spud del palo de golf debe lavarse en PBS estéril seguido de desinfección en etanol al 70% y lavarse nuevamente en PBS estéril. Si la herida se realiza en ratones adicionales durante varios días, debe realizarse a la misma hora del día. Esto es para controlar el efecto circadiano sobre la cicatrización de heridas y la inflamación. En ratones C57BL / 6, la hora del día en que se realiza la herida afecta la velocidad y la calidad de la cicatrización de la herida corneal. Se observa un cierre más rápido de la herida y una mayor división celular cuando los ratones se lesionan por la mañana en comparación con las heridas por la tarde o por la noche42. El efecto circadiano sobre la cicatrización de heridas se ha reportado en otros tejidos, incluida la piel58,59. Las heridas en este modelo siempre se realizan por la mañana.

La respuesta inflamatoria resultante a la herida en este modelo procede como una cascada bien caracterizada de eventos celulares y moleculares que son críticos para la cicatrización eficiente de heridas. Los jugadores celulares mejor caracterizados en la inflamación inducida por abrasión en este modelo son los neutrófilos y las plaquetas. Los neutrófilos son los primeros en responder al sitio de la abrasión corneal; se detectan niveles significativos de neutrófilos en el estroma corneal dentro de las 6 h posteriores a la herida. Los neutrófilos son responsables de limpiar los restos celulares, un proceso intrínseco a la inflamación y la reparación de heridas60. Además de sus actividades fagocíticas, los neutrófilos contienen factores de crecimiento como los factores de crecimiento endotelial vascular (VEGF)61. El VEGF es un factor neurorregenerativo crucial para la regeneración de los nervios corneales después de la herida62,63 y también es importante para la división de células epiteliales corneales45,63. La infiltración de neutrófilos en el limbo ocurre en dos ondas con el primer pico a las 18 h y el segundo pico a las 30 h después de herir40. Usando ratones neutropénicos37,40, se ha demostrado que la extravasación de neutrófilos y la posterior migración al centro de la córnea son cruciales para la cicatrización de heridas corneales. Aunque tradicionalmente se sabe que son fundamentales en el mantenimiento de la hemostasia y la coagulación de la sangre, las plaquetas también tienen un papel clave reconocido en la curación de heridas corneales37. Las plaquetas contienen numerosos mediadores que contribuyen a la inflamación y resolución de los tejidos64,65. En ratones con trombocitopenia, este modelo se ha utilizado para demostrar que las plaquetas son importantes para la cicatrización eficiente de heridas corneales37.

Aunque los neutrófilos y las plaquetas son las células mejor caracterizadas en este modelo, también se ha demostrado que las células inmunes como las células T gamma delta, las células asesinas naturales y las células dendríticas están involucradas en la respuesta inmune a las heridas utilizando este modelo27,48. Se ha reportado extravasación de células asesinas naturales en el estroma 28,29 y migración de células T gamma delta al epitelio curativo27. Este modelo también se ha utilizado para identificar moléculas de adhesión clave para la extravasación de las células inmunes durante la cicatrización de heridas corneales. El antígeno-1 de la función linfocitaria (LFA-1)32, CD1851 y la molécula de adhesión intercelular-1 (ICAM-1)47,49 han demostrado ser cruciales para la extravasación de neutrófilos y la cicatrización eficiente de heridas corneales utilizando este modelo. La división celular epitelial en respuesta a la herida, que es crítica para la reestratificación epitelial después del cierre de la herida, se evalúa utilizando figuras mitóticas. La condensación cromosómica durante las diferentes etapas de la división celular da a los núcleos una apariencia característica conocida como figura mitótica. La tinción DAPI del núcleo permite la visualización de estas figuras mitóticas.

El modelo de herida por abrasión corneal de ratón ha demostrado ser notablemente reproducible y ha proporcionado una visión considerable de los mecanismos celulares y moleculares que contribuyen a la cicatrización eficiente de heridas. Sin embargo, vale la pena señalar que existen limitaciones para el modelo con respecto a su aplicabilidad clínica. El modelo y sus resultados solo son aplicables a abrasiones epiteliales simples y no penetrantes. Como se señaló anteriormente, las lesiones corneales resultantes de heridas penetrantes causadas por el insulto físico o químico provocarán diferentes cinéticas y resultados de curación de heridas, particularmente si la herida se infecta como ocurre a menudo en el caso de lesiones en la córnea humana. Dicho esto, el modelo de herida de abrasión corneal de ratón proporciona una excelente base para estudiar los principios fundamentales de la inflamación que modulan la cicatrización de la herida corneal.

El protocolo de heridas corneales descrito aquí es sencillo y fácil de reproducir. Proporciona una herramienta útil para investigar preguntas fundamentales sobre el proceso de curación de heridas corneales y su respuesta inflamatoria asociada. Su potencial para ayudar a comprender las patologías corneales asociadas con las complicaciones de la cicatrización de heridas es solo el comienzo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Financiamiento: Apoyado por: NIH EY018239 (A.R.B., C.W.S. y R.E.R.), P30EY007551 (A.R.B.), y Sigma Xi Grant in Aid of Research (P.K.A.). El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa las opiniones oficiales de los Institutos Nacionales de Salud, o Sigma Xi.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-CD31 antibody BD Bioscience, Pharmingen 550274
Anti-CD41 antibody BD Bioscience, Pharmingen 553847
Anti-Ly6G antibody BD Bioscience, Pharmingen 551459
Bovine serum albumin (BSA) ThermoFisher scientific B14
C57BL/6 mice Jackson Laboratories 664
DAPI Sigma Aldrich D8417
DeltaVision wide-field deconvolution fluorescence microscope GE Life Sciences
Dissecting microscope Leica microsystems
Electronic Toploading Balances (Weighing scale) Fisher Scientific
Ethanol ThermoFisher scientific T038181000CS
Golf-club spud Stephens instruments S2-1135
Iris curve scissors Fisher Scientific 31212
Isoflurane Patterson veterinary 07-893-1389
Ketamine Patterson veterinary 07-890-8598
Phospate buffered saline (PBS) ThermoFisher scientific AM9624
Sodium fluorescein salt Sigma Aldrich 46970
Surgical blade (scapel blade) Fine Science tools 10022-00
Trephine Integra Miltex 33-31
TritonX -100 Fisher Scientific 50-295-34
Forcep Fine Science tools 11923-13
Xylazine Patterson veterinary 07-808-1947

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. DelMonte, D. W., Kim, T. Anatomy and physiology of the cornea. Journal of Cataract and Refractive Surgery. 37 (3), 588-598 (2011).
  2. Meek, K. M., Knupp, C. Corneal structure and transparency. Progress in Retinal and Eye Research. 49, 1-16 (2015).
  3. Sridhar, M. S. Anatomy of cornea and ocular surface. Indian Journal of Ophthalmology. 66 (2), 190-194 (2018).
  4. Flaxman, S. R., et al. Global causes of blindness and distance vision impairment 1990-2020: a systematic review and meta-analysis. The Lancet Global Health. 5 (12), 1221-1234 (2017).
  5. Robaei, D., Watson, S. Corneal blindness: A global problem. Clinical & Experimental Ophthalmology. 42 (3), 213-214 (2014).
  6. McGwin, G., Owsley, C. Incidence of emergency department-treated eye injury in the United States. Archives of Ophthalmology. 123 (5), 662-666 (2005).
  7. Ljubimov, A. V., Saghizadeh, M. Progress in corneal wound healing. Progress in Retinal and Eye Research. 49, 17-45 (2015).
  8. Wilson, S. L., Haj, A. J. E., Yang, Y. Control of scar tissue formation in the cornea: Strategies in clinical and corneal tissue engineering. Journal of Functional Biomaterials. 3 (3), 642 (2012).
  9. Vaidyanathan, U., et al. Persistent corneal epithelial defects: A review article. Medical Hypothesis, Discovery and Innovation in Ophthalmology. 8 (3), 163-176 (2019).
  10. Netto, M., et al. Wound healing in the cornea: a review of refractive surgery complications and new prospects for therapy. Cornea. 24 (5), 509-522 (2005).
  11. Friedenwald, J. S., Buschke, W. Some factors concerned in the mitotic and wound-healing activities of the corneal epithelium. Transactions of the American Ophthalmological Society. 42, 371-383 (1944).
  12. Xu, K., Yu, F. -S. X. Impaired epithelial wound healing and EGFR signaling pathways in the corneas of diabetic rats. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (6), 3301-3308 (2011).
  13. Bai, J. Q., Qin, H. F., Zhao, S. H. Research on mouse model of grade II corneal alkali burn. International Journal of Ophthalmology. 9 (4), 487-490 (2016).
  14. Blanco-Mezquita, J. T., Hutcheon, A. E. K., Stepp, M. A., Zieske, J. D. αVβ6 integrin promotes corneal wound healing. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 52 (11), 8505-8513 (2011).
  15. Blanco-Mezquita, J. T., Hutcheon, A. E. K., Zieske, J. D. Role of thrombospondin-1 in repair of penetrating corneal wounds. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 54 (9), 6262-6268 (2013).
  16. Stepp, M. A., et al. Wounding the cornea to learn how it heals. Experimental Eye Research. 121, 178-193 (2014).
  17. Hargrave, A., et al. Corneal dysfunction precedes the onset of hyperglycemia in a mouse model of diet-induced obesity. PLoS ONE. 15, 0238750 (2020).
  18. Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (67), e2771 (2012).
  19. Bodner, L., Dayan, D. Effect of parotid submandibular and sublingual saliva on wound healing in rats. Comparative Biochemistry and Physiology. Part A, Physiology. 100 (4), 887-890 (1991).
  20. Abbasian, B., Azizi, S., Esmaeili, A. Effects of rat's licking behavior on cutaneous wound healing. Iranian Journal of Basic Medical Sciences. 13 (1), 242-247 (2010).
  21. DeLisser, H. M., et al. Involvement of endothelial PECAM-1/CD31 in angiogenesis. The American Journal of Pathology. 151 (3), 671-677 (1997).
  22. Piali, L., et al. CD31/PECAM-1 is a ligand for alpha v beta 3 integrin involved in adhesion of leukocytes to endothelium. The Journal of Cell Biology. 130 (2), 451-460 (1995).
  23. Fleming, T. J., Fleming, M. L., Malek, T. R. Selective expression of Ly-6G on myeloid lineage cells in mouse bone marrow. RB6-8C5 mAb to granulocyte-differentiation antigen (Gr-1) detects members of the Ly-6 family. The Journal of Immunology. 151 (5), 2399-2408 (1993).
  24. Fleming, T. J., Malek, T. R. Multiple glycosylphosphatidylinositol-anchored Ly-6 molecules and transmembrane Ly-6E mediate inhibition of IL-2 production. The Journal of Immunology. 153 (5), 1955-1962 (1994).
  25. Phillips, D. R., Charo, I. F., Scarborough, R. M. GPIIb-IIIa: the responsive integrin. Cell. 65 (3), 359-362 (1991).
  26. Nieswandt, B., et al. Acute systemic reaction and lung alterations induced by an antiplatelet integrin gpIIb/IIIa antibody in mice. Blood. 94 (2), 684-693 (1999).
  27. Li, Z., Burns, A. R., Rumbaut, R. E., Smith, C. W. γδ T cells are necessary for platelet and neutrophil accumulation in limbal vessels and efficient epithelial repair after corneal abrasion. American Journal of Pathology. 171 (3), 838-845 (2007).
  28. Liu, Q., Smith, C. W., Zhang, W., Burns, A. R., Li, Z. NK cells modulate the inflammatory response to corneal epithelial abrasion and thereby support wound healing. American Journal of Pathology. 181 (2), 452-462 (2012).
  29. Gao, Y., et al. NK cells are necessary for recovery of corneal CD11c+ dendritic cells after epithelial abrasion injury. Journal of Leukocyte Biology. 94 (2), 343-351 (2013).
  30. Xiao, C., et al. Acute tobacco smoke exposure exacerbates the inflammatory response to corneal wounds in mice via the sympathetic nervous system. Communications Biology. 2, 33 (2019).
  31. Wang, H., et al. Epothilone B speeds corneal nerve regrowth and functional recovery through microtubule stabilization and increased nerve beading. Scientific Reports. 8 (1), 2647 (2018).
  32. Li, Z., Burns, A. R., Smith, C. W. Lymphocyte function-associated Antigen-1-dependent inhibition of corneal wound healing. Cell Injury. 169, 1590-1600 (2006).
  33. Wu, M., et al. The neuroregenerative effects of topical decorin on the injured mouse cornea. Journal of Neuroinflammation. 17 (1), 1-14 (2020).
  34. Rodrigues, M., Kosaric, N., Bonham, C. A., Gurtner, G. C. Wound healing: A cellular perspective. Physiological Reviews. 99 (1), 665-706 (2019).
  35. Rennard, S. I. Inflammation and repair processes in chronic obstructive pulmonary disease. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 160 (5), Pt 2 12-16 (1999).
  36. Landén, N. X., Li, D., Ståhle, M. Transition from inflammation to proliferation: a critical step during wound healing. Cellular and Molecular Life Sciences. 73 (20), 3861-3885 (2016).
  37. Li, Z., Rumbaut, R. E., Burns, A. R., Smith, C. W. Platelet response to corneal abrasion is necessary for acute inflammation and efficient re-epithelialteation. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 47, 4794-4802 (2006).
  38. Lam, F. W., Burns, A. R., Smith, C. W., Rumbaut, R. E. Platelets enhance neutrophil transendothelial migration via P-selectin glycoprotein ligand-1. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 300 (2), 468-475 (2011).
  39. La Cruz, A. D., et al. Platelet and erythrocyte extravasation across inflamed corneal venules depend on CD18, neutrophils, and mast cell degranulation. International Journal of Molecular Sciences. 22 (14), 7360 (2021).
  40. Li, Z., Burns, A. R., Smith, C. W. Two waves of neutrophil emigration in response to corneal epithelial abrasion: Distinct adhesion molecule requirements. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 47 (5), 1947-1955 (2006).
  41. Li, Z., Burns, A. R., Han, L., Rumbaut, R. E., Smith, C. W. IL-17 and VEGF Are Necessary for Efficient Corneal Nerve Regeneration. The American Journal of Pathology. 178 (3), 1106-1116 (2011).
  42. Xue, Y., et al. Modulation of circadian rhythms affects corneal epithelium renewal and repair in mice. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 58 (3), 1865-1874 (2017).
  43. Zhang, W., Magadi, S., Li, Z., Smith, C. W., Burns, A. R. IL-20 promotes epithelial healing of the injured mouse cornea. Experimental Eye Research. 154, 22-29 (2017).
  44. Li, Z., Burns, A. R., Miller, S. B., Smith, C. W. CCL20, γδ T cells, and IL-22 in corneal epithelial healing. FASEB Journal. 25 (8), 2659-2668 (2011).
  45. Li, Z., Burns, A. R., Han, L., Rumbaut, R. E., Smith, C. W. IL-17 and VEGF are necessary for efficient corneal nerve regeneration. American Journal of Pathology. 178 (3), 1106-1116 (2011).
  46. Reins, R. Y., Hanlon, S. D., Magadi, S., McDermott, A. M. Effects of topically applied Vitamin D during corneal wound healing. PLoS ONE. 11 (4), 0152889 (2016).
  47. Gagen, D., et al. ICAM-1 mediates surface contact between neutrophils and keratocytes following corneal epithelial abrasion in the mouse. Experimental Eye Research. 91 (5), 676-684 (2010).
  48. Li, Z., Rivera, C. A., Burns, A. R., Smith, C. W. Hindlimb unloading depresses corneal epithelial wound healing in mice. Journal of Applied Physiology. 97 (2), 641-647 (2004).
  49. Byeseda, S. E., et al. ICAM-1 is necessary for epithelial recruitment of γδ T cells and efficient corneal wound healing. American Journal of Pathology. 175 (2), 571-579 (2009).
  50. Li, Z., Burns, A. R., Rumbaut, R. E., Smith, C. W. γδ T cells are necessary for platelet and neutrophil accumulation in limbal vessels and efficient epithelial repair after corneal abrasion. American Journal of Pathology. 171 (3), 838-845 (2007).
  51. Petrescu, M. S., et al. Neutrophil interactions with keratocytes during corneal epithelial wound healing: A role for CD18 integrins. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 48 (11), 5023-5029 (2007).
  52. Pal-Ghosh, S., Pajoohesh-Ganji, A., Tadvalkar, G., Stepp, M. A. Removal of the basement membrane enhances corneal wound healing. Experimental Eye Research. 93 (6), 927-936 (2011).
  53. Pal-Ghosh, S., et al. Cytokine deposition alters leukocyte morphology and initial recruitment of monocytes and γδT cells after corneal injury. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (4), 2757-2765 (2014).
  54. Pal-Ghosh, S., Tadvalkar, G., Jurjus, R. A., Zieske, J. D., Stepp, M. A. BALB/c and C57BL6 mouse strains vary in their ability to heal corneal epithelial debridement wounds. Experimental Eye Research. 87 (5), 478-486 (2008).
  55. Kato, T., Chang, J. H., Azar, D. T. Expression of type XVIII collagen during healing of corneal incisions and keratectomy wounds. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 44 (1), 78-85 (2003).
  56. Kure, T., et al. Corneal neovascularization after excimer keratectomy wounds in matrilysin-deficient mice. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 44 (1), 137-144 (2003).
  57. Lin, A., et al. Bacterial keratitis preferred practice pattern. Ophthalmology. 126 (1), 1-55 (2019).
  58. Cable, E. J., Onishi, K. G., Prendergast, B. J. Circadian rhythms accelerate wound healing in female Siberian hamsters. Physiology and Behavior. 171, 165-174 (2017).
  59. Lyons, A. B., Moy, L., Moy, R., Tung, R. Circadian rhythm and the skin: A review of the literature. Journal of Clinical and Aesthetic Dermatology. 12 (9), 42-45 (2019).
  60. Westman, J., Grinstein, S., Marques, P. E. Phagocytosis of Necrotic Debris at Sites of Injury and Inflammation. Frontiers in Immunology. 10, 3030 (2020).
  61. Gaudry, M., et al. Intracellular pool of vascular endothelial growth factor in human neutrophils. Blood. 90 (10), 4153-4161 (1997).
  62. Pan, Z., et al. Vascular endothelial growth factor promotes anatomical and functional recovery of injured peripheral nerves in the avascular cornea. FASEB Journal. 7, 2756-2767 (2013).
  63. Di, G., et al. VEGF-B promotes recovery of corneal innervations and trophic functions in diabetic mice. Scientific Reports. 7 (1), 1-13 (2017).
  64. Thomas, M. R., Storey, R. F. The role of platelets in inflammation. Thrombosis and Haemostasis. 114 (3), 449-458 (2015).
  65. Margraf, A., Zarbock, A. Platelets in inflammation and resolution. The Journal of Immunology. 203 (9), 2357-2367 (2019).

Tags

Medicina Número 178 córnea cicatrización de heridas abrasión spud de palo de golf trefina
Un modelo de abrasión epitelial para estudiar la cicatrización de heridas corneales
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Akowuah, P. K., De La Cruz, A.,… More

Akowuah, P. K., De La Cruz, A., Smith, C. W., Rumbaut, R. E., Burns, A. R. An Epithelial Abrasion Model for Studying Corneal Wound Healing. J. Vis. Exp. (178), e63112, doi:10.3791/63112 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter