Summary
Nära UV-litografi och dragkraftmikroskopi kombineras för att mäta cellulära krafter på mikromönsterförsedda hydrogeler. Den riktade ljusinducerade frisättningen av enstaka celler möjliggör ett stort antal mätningar på samma prov.
Abstract
Traction force microscopy (TFM) är den huvudsakliga metoden som används i mekanobiologi för att mäta cellkrafter. Vanligtvis används detta för celler som följer platta mjuka substrat som deformeras under celldragkraft (2D-TFM). TFM förlitar sig på användning av linjära elastiska material, såsom polydimethylsiloxan (PDMS) eller polyakrylamid (PA). För 2D-TFM på PA är svårigheten att uppnå högt genomströmning främst från den stora variationen av cellformer och dragkrafter, vilket kräver standardisering. Vi presenterar ett protokoll för att snabbt och effektivt tillverka micropatterned PA hydrogels för 2D-TFM studier. Mikropatternerna skapas först av masklös fotolitografi med hjälp av nära UV-ljus där extracellulära matrisproteiner endast binder till de mikropatternerade regionerna, medan resten av ytan förblir icke-lim för celler. Mikropatterning av extracellulära matrisproteiner beror på närvaron av aktiva aldehydgrupper, vilket resulterar i självhäftande regioner av olika former för att rymma antingen enstaka celler eller grupper av celler. För TFM-mätningar använder vi PA-hydrogeler med olika elasticitet genom att variera mängden akrylamid och bis-akrylamid och spåra förskjutningen av inbäddade fluorescerande pärlor för att rekonstruera celldragfält med legaliserad Fourier Transform Traction Cytometry (FTTC).
För att ytterligare uppnå exakt registrering av cellkrafter beskriver vi användningen av en kontrollerad dos av mönstrat ljus för att frigöra celldragkrafter i definierade regioner för enstaka celler eller grupper av celler. Vi kallar denna metod lokal UV-belysning dragkraft mikroskopi (LUVI-TFM). Med enzymatisk behandling lossnar alla celler från provet samtidigt, medan luvi-TFM dragkraftskrafter hos celler i olika delar av provet kan registreras i följd. Vi visar tillämpligheten av detta protokoll (i) att studera cellen dragkraft krafter som en funktion av kontrollerad vidhäftning till substratet, och (ii) att uppnå ett större antal experimentella observationer från samma prov.
Introduction
När de interagerar med sin extracellulära miljö utövar vidhäftande celler krafter som huvudsakligen förmedlas av integrinbaserade fokala vidhäftningar som förbinder den extracellulära matrisen (ECM) med aktin cytoskeleton. Fokala vidhäftningar är multiproteinenheter som är centrerade kring bindning av integriner till ECM-proteiner som fibronectin och kollagen. Integrin klustring och tillväxt av fokala vidhäftningar är avgörande inte bara för upprättandet av en mekaniskt stabil anslutning, men också för rekrytering av andra fokala vidhäftningsproteiner, inklusive de som aktiverar RhoA-vägen för reglering av cellulär kontraktilitet1. Den RhoA-beroende kontraktiliteten hos aktin cytoskeleton gör det möjligt för celler att sprida sig och migrera på den underliggande ECM, och även att känna dess styvhet2. Fördelningen av dragkraftskrafter beror starkt på cellernas spridningsområde och form, som båda förlitar sig på matrisegenskaper och därmed påverkar cytoskeletal organisation, så småningom bildar en sluten återkopplingsslinga mellan matrismekanik och cytoskeletal organisation3,4.
Ytmikropapperstekniker möjliggör en definierad kontroll av cellformen genom att skapa mikronstora regioner som presenterar ECM-limproteiner. beroende på storleken på dessa regioner, enstaka celler eller grupper av celler som håller sig till mikropattern5. ECM-proteiner kan mönstras på glassubstrat genom olika metoder som mikrokontakttryck, fotomönster eller lasermönster6. Användningen av UV-ljus (λ = 185 eller 375 nm) i kombination med ytfoulningsstrategier ger flexibiliteten för att utforma olika former och storlekar och immobilisering av flera proteintyper med hög precision nära ytkanter7,8. De regioner som är belagda med proteinavvisande kemikalier som polyetylenglykol (PEG) skyddas med antingen en kromfotomask eller ett DMD-baserat maskfritt litografisystem(Digital Mirror Device). Mönstren i maskerna möjliggör exponering för UV-ljus i regioner som sedan kommer att mönstras med ECM-proteiner. Mönstra av hydrogelytor med ECM-proteiner kräver ett överföringssteg för att avlägsna proteiner från glasytan och korsa dem till mönstren. Alternativt kan mönstring på mjuka material uppnås genom att först täcka fotomasken med ett repellent protein, följt av att bränna de omaskerade regionerna med djup UV-belysning. Eftersom djup UV genererar ozon och gör ytan reaktiv för proteinbindning, är de omaskerade regionerna belagda med ECM-proteiner och slutligen polymeriseras gelén direkt ovanpå de omaskerade regionerna9,10.
De mönstrade hydrogelerna kan användas för att utföra TFM, en teknik som mäter cellkrafter vid cellmaterialets gränssnitt11. I 2D-TFM använder man den plana ytan av en tjock polymerfilm, där markörpärlor har bäddats in för att spåra deformationer12,13,14,15. För att extrahera deplacementvektorer är det viktigt att kombinera två bilder, en av deformerade tillstånd och en referensbild utan deformationer. De två bilderna mappas sedan till varandra med bildbehandling. Vid hög markördensitet görs detta vanligtvis med Particle Image Velocimetry (PIV), som är en väletablerad metod för att rekonstruera hydrodynamiskt flöde. Vid låg markördensitet och i 3D-TFM görs detta vanligtvis med partikelspårningsvelocimetri (PTV), som innehåller specifika egenskaper hos den experimentella datauppsättningen. Ett exempel på ett beräkningsmässigt billigare alternativ är optiskt flöde, till exempel Kanade-Lucas-Tomasi (KLT) algoritm16. När det gäller hydrogelsubstrat bäddas fluorescerande pärlor vanligtvis in med hög densitet under materialets polymerisation, och bilder spelas in före och efter cellutlösning vid enzymatisk avskildhet. Enzymatisk avlossning av vidhäftande celler, t.ex. genom trypsinisering, leder till samtidig frisättning av cellulära dragkrafter från alla celler på hydrogelerna, vilket gör det svårt att få en detaljerad analys från ett stort antal celler.
Här presenterar vi ett protokoll för att förbereda mikropatternerade hydrogeler för att kontrollera cellform och lokalisering och en metod för att effektivt mäta dragkrafter i följd med hjälp av UV för att lossa enskilda celler från substratet. För dragkraftsmätningar presenterar vi en teknik för att producera pa-hydrogeler med dubbla lager, där fluorescerande pärlor endast är inbäddade i det övre lagret, vilket ökar deras densitet och minskar deras vertikala spridning. Genom att kombinera UV-medierad frisättning av cellulära dragkrafter med mikropapper gör det möjligt att få rumslig kontroll över cellavlossning (t.ex. av enskilda celler utan att påverka vidhäftningen av andra celler i den intresseregion), förutsatt att det finns ett tillräckligt avstånd mellan mönstrade celler. Cellulär dragkraft rekonstrueras sedan med den mest effektiva och tillförlitliga metoden för 2D-TFM, nämligen Fourier Transform Traction Cytometry (FTTC) med legalisering17,18.
Protocol
1. Beredning av metakrysserade täcksläck
OBS: Glasöverdrag är metakrysserade för att kovalent länka PA-hydrogeler och förhindra därför deras avlossning under inkubationen med celler. Mikroskopglasöverdrag används för att uppnå hög bildkvalitet.
- För att förbereda en 300 ml-lösning, ta en ren 400 ml glasbägare och placera den i en rökhuv.
- Tillsätt 10 ml dubbeldestillerat vatten (ddH2O) i bägaren. Tillsätt 18,75 ml ättiksyra (≥99,8% proanalys, s.a.), 18,75 ml 3-(Trimetoxisilyl)propylmetarylat och 252,5 ml etanol (≥99,8% p.a.) med en serologisk pipett. Häll lösningen i en kristalliserande maträtt.
- Rengör 24 mm runda glasöverdrag med precisionsservetter. Placera täcksläparna i ett specialtillverkat polytetrafluorethylenställ.
- Sänk ner racket i lösningen och inkubera i 15 minuter vid rumstemperatur (RT).
- Ta racket och skölj alla täcken med etanol (99,8% p.a.). Torka täcksläparna under luftflödet.
OBS: Methacrylated täcken kan förvaras i upp till 1 månad på RT.
2. Mikropapperning av extracellulära matrisproteiner på glasomslagsslipar
OBS: Glasöverdrag är först belagda med ett lager av molekyler, bestående av protein och cellavstötningsmedel. Detta skikt avlägsnas sedan med hjälp av en fotopatterningsteknik, för att möjliggöra efterföljande deponering av extracellulära matrisproteiner i mikropatternerade regioner.
- Ta ett 15 mm runt glasöverdrag och placera det på en Petri-skål. Använd en diamantpenna för att markera täckslipets övre sida. Fortsätt sedan till rengöring via syreplasmabehandling vid 0,4 mbar och 200 W i 2 min.
- Pipett 100 μL 0,01% poly-L-lysinlösning på ytan av varje täckslip. Inkubera i 30 minuter vid RT. Tvätta täckbenen med 10 mM 4-(2-hydroxietyl)-1-piperazineetanesulfonsyra (HEPES) pH 8,5. Ta bort överflödig vätska men håll ytan våt.
- Pipett 100 μL 50 mg/ml poly(etylenglykol) metyleter succinimidyl valeric acid (mPEG-SVA) i 10 mM HEPES pH 8,5 på ytan av varje täckslip. Inkubera i 1 h vid RT. Skölj täcksläparna med 10 mM HEPES pH 8,5 och torka av under luftflödet.
- Tillsätt 2 μL UV-känslig fotoinitiator (t.ex. PLPP-gel) följt av 40 μL etanol (≥99,8% p.a.) på ytan. För att få en homogen fördelning av gelén och etanolen på ytan, luta petriskålen försiktigt fram och tillbaka. Vänta i 5 min tills lösningen polymeriseras.
- Placera ett enda täcksläp inuti en 35 mm Petri-skål med ett 20 mm hål i botten. Detta gör att laserstrålen som kommer underifrån kan nå glasytan direkt.
- Slå på mikroskopet och en ljusmönstratmodul (det är endast tillåtet att arbeta med den här enheten efter en säkerhetsintroduktion från lasersäkerhetsombuden). Kalibrera UV-A-lasern på 20x luftmålet. Sätt provet med fotoinitiatorn på scenen. Justera fokus på glasets yta och slå på fokuskontrollen. Ladda och lås det förritade mönstret.
- Förbered mönstret med hjälp av en grafikprogramvara som Inkscape. Se till att mönsterfilen inte överskrider DMD-måtten (1824 x 1140 px, vilket motsvarar 552 x 325 μm på 20 x lins (0,28 μm/px)).
OBS: Vi rekommenderar att du använder DMD-storleken (1824 x 1140 pixlar) som mönsterfilstorlek, eftersom detta inte säkerställer något fel under mönstraring. Skapa till exempel inte en mönsterfil med dimensionen 1830 x 1 130 pixlar. - För mönsteröverföring till polyakrylamid, se till att mönstraring endast görs upp till 60-70 % av radien från glasets centrum till kanten.
- För mönstra en enda cell, använd en diameter på 50-100 μm med ett avstånd på 100 μm mellan mönster och en diameter på 150-300 μm för en cellgrupp. Lämplig mönsterstorlek beror i hög grad på den typiska cellstorleken, och den måste vara tillräckligt stor för att cellerna ska kunna klibba.
- Förbered mönstret med hjälp av en grafikprogramvara som Inkscape. Se till att mönsterfilen inte överskrider DMD-måtten (1824 x 1140 px, vilket motsvarar 552 x 325 μm på 20 x lins (0,28 μm/px)).
- Starta mönstrar med UV-dos på 30 mJ/mm2. Mönstra varaktigheten beror på antalet mönster. Att göra ett enda mönster tar ungefär 1 s.
- Skölj ytan med fosfatbuffrad saltlösning (PBS) tre gånger efter att ha slutfört mönstrasteget. Inkubera provet med 100 μL 25 μg/ml fibronectin upplöst i 1x PBS och 25 μg/ml fibrinogen Alexa488 konjugat i PBS för 1 h vid RT. För andra ECM-proteiner, hitta de optimala koncentrationerna som helt täcker de mönstrade regionerna.
- Skölj ytan med 1x PBS tre gånger. Se till att det mönstrade glaset omedelbart används för överföring av glas-PA. Förvara det mönstrade glaset i PBS på RT under hydrogelberedningen.
3. Tillverkning av mönstrade polyakrylamidhydrogeler
OBS: Polyakrylamidhydrogeler bereds, inklusive oxiderad N-hydroxietylakryamid (HEA) för att presentera reaktiva aldehydgrupper för kovalent bindning av matrisproteiner på ytan. Dessutom används en dubbelskiktsmetod för att bädda in fluorescerande pärlor endast på hydrogelens översta lager för att förbättra registreringen av pärlförskjutning under traktionskraftmikroskopiexperiment.
- Lägg de methacrylerade glasöverdragen i en Petri-maträtt.
- För att förbereda färsk oxiderad HEA-lösning, tillsätt 9,55 ml dubbeldestillerat vatten i ett 15 ml centrifugrör. Tillsätt sedan 0,5 ml HEA och 42 mg natrium(meta)periodat för att få 10 ml av lösningen. Rör kontinuerligt om lösningen i mörkret i 4 timmar.
- Blanda akrylamid, bis-akrylamid och dubbeldestillerat vatten enligt tabell 1, för att få 10 ml lagerlösning hydrogel (gör det under rökhuven, monomerer är neurotoxiska). Degas och stäng locket till en lufttät tätning.
OBS: Stamlösningen kan förvaras i alikvoter i upp till 1 år vid 4 °C. Karaktärisera alltid Youngs modulus av hydrogelen före användning. - Förbered en pa-hydrogel med dubbla lager (gör det under rökhuven, monomerer är neurotoxiska).
- Börja med bottenskiktet genom att försiktigt blanda 99,3 μL lagerlösning, 0,5 μL 1% ammoniumpersulfat (APS) och 0,2 μL tetrametylletylendiamin (TEMED) i ett 1,5 ml rör. Ta 10 μL från lösningen och pipetten den droppvis på mitten av det methacrylerade täckslipet.
- Placera försiktigt ett 15 mm runt täckslip på droppen och vänta i 45 minuter på polymerisation. Lossa försiktigt det övre täcket med en skalpell.
- För det översta lagret blandar du försiktigt 93,3 μLof-stamlösningen med 1 μL färsk oxiderad HEA-lösning, 5 μL fluorescerande pärlor (motsvarande tre pärlor per kvadratmikron för pärlor av 200 nm stora pärlor), 0,5 μL 1% APS och 0,2 μL TEMED i ett 1,5 ml rör. Ta 5 μL från lösningen och pipetten den droppvis på mitten av det redan polymeriserade bottenskiktet.
- Placera försiktigt det mikropatternerade täckslipet på droppen. Vänta i 45 minuter på RT tills droppen polymeriseras. Se till att den mönstrade sidan vidrör droppen. Lossa försiktigt täckslipet med en skalpell.
- Limma fast 24 mm täcksläparna på botten av specialborrade 6-brunnsplattor med tvåkomponents silikonlim. Efter 5 min, lägg till PBS till brunnarna.
- Karakterisera Youngs modulus av polyakrylamidhydrogelproverna med atomkraftmikroskopi (AFM).
- Montera en sfärisk spetsbehållare på AFM-hållaren.
- Kalibrera varje cantilever genom att förvärva en kraftavståndskurva (3-4 V börvärde) på ett hårt substrat (t.ex. glas eller glimmer), extrapolera cantileverkänsligheten, dra sig tillbaka från ytan och utför en termisk melodi för att få sin fjäderkonstant.
- Placera de kalibrerade cantilevererna över hydrogelprovet och köp kraftkurvor i PBS-bufferten med följande parametrar: 20–30 nN kraftvärdevärde, 5 eller 10 μm/s inflygnings- och upprullningshastighet, 5 μm rampstorlek.
OBS: Ett inverterat optiskt mikroskop, utrustat med ett luft 40x-mål och ett grönt fluorescerande proteinfilter (GFP) användes för att visualisera och rikta in sig på ECM-mikromönsterområden inom PA-hydrogelproverna. - Rita de förvärvade kraft kontra avståndskurvorna med AFM-analysprogramvaran.
- Hitta kontaktpunkten och konvertera kraft kontra avståndskurvor till kraft kontra indragskurvor.
- Montera indragsdelen av kurvan med Hertz-modellen (eller en lämplig mekanikmodell i spetsens funktion), med hjälp av ett Poisson-förhållande mellan 0,2 och 0,5.
4. Lokal frisättning av celldragkrafter genom UV-A-laserbelysning (LUVI-TFM)
OBS: UV-A-laser appliceras för att frigöra dragkraftskrafter i celler lokaliserade i definierade regioner av hydrogelerna. UV-A-lasern (dvs. λ = 375 nm solid state laser, <15 mW) är en klass 3B-laser. Den oskärmade laserstrålen är farlig för ögonen och ofta för huden. Reflekterat och spridda ljus och strålning kan vara farligt. Dessutom kan UV-strålning orsaka hudcancer. Det är endast tillåtet att arbeta med enheter efter säkerhetsintroduktion från lasersäkerhetsombuden.
- Aspirera PBS från brunnarna.
- Frö 3 x 106 celler per 6-brunnsplatta i tillväxtmedium. För fibroblaster, använd hög glukos Dulbeccos modifierade eagle medium (DMEM) som innehåller L-glutamin och kompletteras med 10% fosterbovin serum (FBS) och 1% penicillin/streptomycin. Inkubera cellerna över natten vid 37 °C/5% CO2. Tvätta prover för att ta bort flytande celler innan du påbörjar mikroskopi.
- Slå på mikroskopets inkubationskammare och gastillförsel för att erhålla en temperatur på 37 °C och 5% CO2-atmosfär .
- Slå på mikroskopet och lasermönstermodulen. Kalibrera om UV-A-lasern på 20x luftmålet om det behövs med hjälp av Leonardo-programvaran. Placera den specialtillverkade 6-brunnsplattan med proverna på scenen. Justera fokus på PA:s yta.
- Ställ in belysningsmönstret och markera de intressanta cellerna. Fokusera om på hydrogelens yta. Skaffa bilden av cellerna i brightfield-kanalen. Byt till Cy5-kanalen (långt rött filter, 650 nm excitation, 670 nm emission) och ta en bild av pärlor i deformerat tillstånd.
- Skifta till laserkanalen. Slå på lasern i 3 minuter. I vår speciella installation motsvarade detta en lätt dos på 6 000 mJ/mm2.
- Byt till Cy5-kanalen och skaffa en bild av pärlorna i oformaterat tillstånd.
OBS: För experiment med mus embryonala fibroblaster, vänta i 15 minuter efter exponering för att spela in referensen/odeformerade bilden (se avsnittet Representativa resultat ). Det kan vara annorlunda för andra typer av celler. Upprepa steg 4.5-4.7 igen för en annan eller flera celler av intresse. - För att mäta den förhöjda oxidativa stressen efter UV-A-belysning, använd det kommersiellt tillgängliga reagenset (CellRox). CellRox är icke-fluorescerande i reducerat tillstånd och, när oxideras av reaktiva syrearter, fluorescerar med ett utsläpp på ~ 665 nm.
- Enligt det angivna protokollet tillsätt 5 μM reagens i bildmediet och inkubera i 30 min vid 37 °C/5% CO2. Tvätta sedan cellerna 3x med varm 1x PBS och byt ut bildmediet. Registrera Cy5-signalen genom fluorescensavbildning före och efter UV-A-belysning med en liknande ljusexponering.
5. Bildbehandling, partikelbildsvelocimetri och beräkning av dragkrafter
OBS: Celldragkraftkrafter registreras genom att analysera förskjutning av fluorescerande pärlor och beräknas med hjälp av bildanalysverktyg baserade på partikelbildsvelocimetri.
- Öppna fluorescerande pärlor bilder, före (dvs deformerade) och efter laser (dvs. odeformerade) med Fiji. Sammanfoga två bilder som en stapel (bild | Staplar | Bilder till Stack).
- Korrigera lateral drift mellan de två bilderna med StackReg plugin (P. Thévenaz, Swiss Federal Institute of Technology Lausanne). Ändra bilder till 8 bitar (bild | Skriv | 8 bitar) och skala om till 1024 x 1024 pix (bild | Skala). Spara som en bildsekvens (TIFF-format) med referensbilden alltid i början.
- Hämta förskjutningsvektorfältet med hjälp av en korskorrelationsteknik19 från PIV-fältet som implementerats i OpenPIV-projektet.
- Se till att den avslappnade (oformade) bilden och den deformerade bilden är täckta med sökfönster av storlek wR och wD i pixlar. För varje sökfönster definierar du en tvärkorrelationsfunktion med följande formel:
Här beskriver R(i,j) och D(i,j) intensitetsfälten för de två bilderna som trunkerats till det valda sökfönstret och därefter speglar vadderade.
och 
beskriva deras medelvärde. Fönsterstorlekarna väljs till wR = 32 och wD = 32 och en överlappning på 70% används mellan de närliggande sökfönstren. - För varje sökfönster bestämmer du en förskjutningsvektor
som optimerar funktionen korskorrelation och tilldelar sökfönstrets mittposition. Subpixelnoggrannhet erhålls med en Gaussisk passform runt maxima-regionen enligt beskrivningen20. - Hitta och ta bort tvetydiga förskjutningsvektorer. Förskjutningsvektorer som motsvarar sökfönster där förhållandet mellan två högsta lokala maxima för tvärkorrelationsfunktionen under ett tröskelvärde på 1,5 anses vara tvetydigt21.
- Kassera deplacementvektorer som inte klarar det normaliserade mediantestet för ett resttröskelvärde på 1,522.
- (Frivillig uppgift) Korrigera den återstående laterala avdriften genom att subtrahera en fast vektor
från alla förskjutningar. Detta görs eftersom förskjutningen i ett markerat område långt borta från cellen försvinner. - Interpolera det resulterande förskjutningsvektorfältet till ett vanligt rutnät med ett avstånd på 4 px av indatabilderna med hjälp av en kubisk polynominterpolation. Datapunkter som saknas fylls med hjälp av en jämn bivariat spline extrapolering. En deplacementvektor i pixlar är relaterad till en lokal deformation av bildens pixelförhållande (0,33 μm/px för 20x luftlins).
- (Frivillig uppgift) Spegla bilden för att minska ringande artefakter i den efterföljande analysen.
- Multiplicera deformationsfältet med en Tukey-fönsterfunktion för att eliminera kanteffekten på grund av driftkorrigeringen, med en parameter på 0,2-0,3. I detta experiment är det mikropatternerade området som ligger i centrum av FOV av intresse.
- Se till att den avslappnade (oformade) bilden och den deformerade bilden är täckta med sökfönster av storlek wR och wD i pixlar. För varje sökfönster definierar du en tvärkorrelationsfunktion med följande formel:
- Rekonstruera dragkraften med legaliserad Fourier Transform Traction Cytometry (FTTC)18. Som legalisering använder vi det enklaste rimliga valet, nämligen 0: e ordningen Tikhonov (L2) regularization23,24,25. En optimal regulariseringsparameter λ väljs så att den minimerar funktionen Generaliserad korsvalidering (GCV) som definieras av26:
Här är τλ en staplad vektor som innehåller x- och y-komponenterna i det rekonstruerade traktionsfältet för det angivna värdet λ för alla Fourier-samplingslägen och G är den linjära operatören som kartlägger dragkraftsfält till motsvarande förskjutningsfält, enligt definitionen för FTTC. Summan körs över vektorkomponenter. ui är x- och y-komponenterna i deplacementfältet för alla Fourier-provtagningslägen. GCV används ofta inom området för illa poserade omvända problem och är ett bra alternativ till L-kurvkriteriet som ofta används i TFM. Ett Lanzcos-filter används för att minska artefakter på grund av det begränsade frekvensutrymmet och förskjutningsfältets uppsampling. Dragkraftsberäkningen beror på Youngs modulus av PA (t.ex. 11,3 kPa) och Poissons förhållande (t.ex. för PA i intervallet mellan 0,2 och 0,5 beroende på tvärlänkskoncentration).
och 
beskriva deras medelvärde. Fönsterstorlekarna väljs till wR = 32 och wD = 32 och en överlappning på 70% används mellan de närliggande sökfönstren.
som optimerar funktionen korskorrelation och tilldelar sökfönstrets mittposition. Subpixelnoggrannhet erhålls med en Gaussisk passform runt maxima-regionen enligt beskrivningen20.
från alla förskjutningar. Detta görs eftersom förskjutningen i ett markerat område långt borta från cellen försvinner.
Representative Results
PA hydrogels polymeriserades på methacrylated glas coverslips, som presenterar reaktiva grupper för kovalent länkning av PA. På detta sätt förhindrades deras avlossning från substratet när hydrogelerna placerades i en vattenlösning (figur 1A-D). För att få en hög densitet av fiducial markörer nära hydrogel ytan, utvecklade vi beredningen av en dual-layered PA hydrogel. Bottenskiktet, utan några fluorescerande pärlor, polymeriserades på det methacrylerade täckslipet. Därefter polymeriserades ett annat lager som innehåller pärlor ovanpå bottenskiktet (figur 1E-H), vilket ersätter behovet av sedimentering, som ofta används för att uppnå pärlfördelning i ett enda fokalplan och öka pärltätheten. För att uppnå kontroll över cellformen under TFM-mätningar producerade vi mikropatrerade PA-hydrogeler via direkt överföring av fibronectinmönstrade mikrostrukturer från ett glasöverdrag till den förpolymeriserade PA (figur 1F-F'). Tillsatsen av 1% icke-konventionell tvärlänk (oxiderad HEA) i den övre hydrogelskiktets lösning ger aldehydgrupper som kovalent binder till amingrupper av fibronectin.
Vi förberedde PA hydrogeler, som är cirka 60 μm i tjocklek och begränsade fluorescerande pärlor i det övre lagret nära hydrogelytan. Denna typ av hydrogel är ett lämpligt substrat för avbildning av cellulära dragkrafter med inverterade mikroskop och tillräckligt tjock (minsta tjocklek för att utföra TFM har rapporterats vara 20-30 μm)18 för att förhindra påverkan av glassubstratet. Lokalisering av fluorescerande pärlor avbildades av konfokal mikroskopi (figur 1I). För att visualisera proteinöverföring på hydrogelen använde vi fluorescerande märkta ECM-proteiner och avbildade dem genom epifluorescensmikroskopi (figur 1J). Vi förberedde mikropatterned cirklar av fibronectin med en diameter av 100 μm (vänster sida) och 50 μm (höger sida) för att tillåta vidhäftning av grupper av celler eller enstaka celler, som visas i överlägget av ljusa fält bilder av vidhäftande celler, och fluorescerande märkta fiducial pärlor och fibronectin micropatterns. På ett annat prov validerades vidhäftning av enstaka celler på mikropatternerat fibronectin genom indirekt immunofluorescensmikroskopi för att avbilda lokalisering av fokala vidhäftning proteiner såsom paxillin (figur 1K).
Både ECM-proteinbeläggning och hydrogelstelhet är avgörande parametrar för cell vidhäftning26. För att karakterisera de mekaniska egenskaperna hos våra PA-hydrogeler utförde vi nanoindentationsexperiment av AFM27, tillsammans med ett epifluorescensmikroskop. Hydrogelsubstrat med tre olika styvheter förbereddes och testades med vår inställning (figur 2 och tabell 1). Sphere-formade AFM cantilevers var cykliskt närmade sig och dras tillbaka från unpatterned PA hydrogels och fibrinogen konjugerade till Alexa488-micropatterned områden, medan inspelning kraft-avstånd kurvor. Därefter gjorde kontaktpunktsutvärdering och tillämpning av Hertz-modellen det möjligt för oss att uppskatta Youngs modulus (E) för varje prov. ECM micropatterning ändrade inte Youngs modulus, som förblev jämförbar med var och en av de icke-sända PA-hydrogelerna.
För att mäta dragkrafter som utövas av vidhäftande celler på substratet utvecklade vi en experimentell installation för referensbaserad TFM som utförs på ett widefield epifluorescensmikroskop utrustat med nära UV-lasermodul (UV-A 6000 mJ/mm2) för att frigöra celldragkrafter (figur 3A). Eftersom laserstrålebelysningen kan spatio-tidskontrolleras är det inte bara möjligt att selektivt exponera en enda cell eller ett cellkluster med en hög laserdos, utan också och ännu viktigare, det störande mellansteget för cellborttagning från hela provet med hjälp av ett matsmältningsenzym som trypsin är inte längre nödvändigt. Belysande celler med en så hög laserdos inducerade en förhöjd oxidativ stress som leder till celldöd (figur 3B). Celldöden gav frisättning av dragkrafter från substratet, vilket framgår av pärlförskjutningen (illustrerad i figur 3A). Vi kombinerade UV-A-belysningen med en ljusmönstraturmodul för att selektivt belysa mikronstora regioner i PA-hydrogelerna (figur 3B-C). På detta sätt är det möjligt att frigöra dragkrafterna hos mikropatternerade cellkluster (figur 3C, F) eller enstaka celler (figur 3B). Viktigt är att de mekaniska egenskaperna hos ECM-mönstrade hydrogeler vid vår tid inte påverkades nämnvärt av UV-exponering (figur 2C). Ökning av oxidativ stress visas i figur 3D,E. Dragkraftkrafterna rekonstruerades med hjälp av legaliserad FTTC med en regulariseringsparameter som valts av Generalized Cross Validation (figur 3B, F). Frisättningen av krafter för enstaka celler inträffade under en period av 15 min, och resultatet av LUVI-TFM är jämförbart med trypsinbaserade TFM (figur 3G-H).
Figur 1: Schema för mönstrad fibronectin-substratberedning för TFM. (A) Lösningen för bottenskiktet är pipetted på en methacrylerad yta. (B) Ett mindre rent täckslip placeras försiktigt på droppen. (C) Geleringstiden är 45 min. (D) Det övre täcket lossnar. Det nedre lagret är klart. (E) Lösningen för det översta lagret är pipetted på hydrogelen. F) Det mönstrade täcket placeras försiktigt på droppen. (F') Mikromålning av självhäftande proteiner på glas produceras genom masklös nära UV-litografi och överförs sedan från glas till PA-hydrogel. De fria amingrupperna av självhäftande proteiner, t.ex. fibronectin, binder kovalent till aldehydgrupper på PA-ytan. (G) Geleringstiden är 45 min. Den mönstrade PA-hydrogelen är klar. (I) En 3D-representation av en konfokal xyz-mikrograf som visar en hög densitet av fiducialpärlor nära ytan. (J) En mikrograf av fluorescerande märkt fibronectin (magenta) på ytan av PA med inbäddade fluorescerande pärlor (gröna), överskiktade med en ljus fältbild av celler. (K) Indirekt immunofluorescensmikroskopi avbildning av en enda cell som följer en cirkelformad fibronectinmikruttern (100 μm). Kärna (blå), paxillin (röd). Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Bild 2: Karakterisering av provmekaniska egenskaper av AFM. A) Experiment setup för afm nanoindentation. En sfärformad cantilever används för att undersöka ECM-mikromönster före eller efter UV-behandling och de icke-mönstrade regionerna i dubbla skiktade PA(5% akrylamid, 0,3% Bis-akrylamid) områden. B) Representativ kraft kontra indragskurva för ECM-mikromönster (svart). Hertz passform (röd) används för att beräkna Youngs modulus (E) av provet. C) Mekaniska mätningar för icke-mönstrade pa-områden med dubbla skikt (ingen ECM), ECM-mikromönster och ECM-mikromönster efter UV-A-exponering. Staplarna visar medelvärde ± S.E.M. (Brown-Forsythe och Welch ANOVA test). Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 3. Lokal UV-A-belysning TFM (LUVI-TFM) möjliggör lokala dragkraftsmätningar inom ett stort synfält. A) System för lokal UV-A-belysning TFM. Cellerna behandlas med en hög dos UV-A-laser för att få den odeformerade (referensbilden). (B) Brightfield-bilden av en enda cell före UV-A-laserbelysning. Mitten: Brightfield bilden av en enda cell efter UV-A laser belysning. Höger: Dragkraft hos en enda MEF som följer en fibronectinbelagd PA-hydrogel (E = 5,74 kPa) belyst med en UV-ljusstråle med 50 μm diameter (röd streckad linje). C) Vänster: Registrering av dragkraftskrafter hos ett kluster av mus embryonala fibroblaster (MEF) som håller fast vid mikropatrerat fibronectin (cirkel, diameter på 100 μm). Klustret belystes med en UV-ljusstråle med 200 μm diameter (röd streckad linje). Höger: Registrering av dragkraftskrafter i ett kluster av mus embryonala fibroblaster (MEF) som håller sig till mikropatrerat fibrokectin (cirkel, 300 μm diameter). Klustret belystes med en UV-ljusstråle med diametern 300 μm (röd streckad linje). Skalstång = 200 μm. (D,E) En ökning av oxidativ stress i celler som indikeras av den ökade Cy5-signalintensiteten efter att en hög UV-A-laserdos detekteras genom fluorescensmikroskopi. Den oxidativa stressen leder till celldöd. Skalstång = 200 μm. (F) Vänster: Stressvärmekartan från ett kluster av mus embryonala fibroblaster (MEF) som håller fast vid mikropatrerat fibrokectin (cirkel, 100 μm diameter). Höger: Stressvärmekartan från ett kluster av mus embryonala fibroblaster (MEF) som håller sig till mikropatrerat fibrokectin (cirkel, 300 μm diameter). G) MEF-celler som håller sig till 100 μm fibronectinmikromönster släpper långsamt ut sina dragkrafter efter UV-A-exponering. Full release uppnås efter 15 min (referensbilden togs sedan 15 min efter exponering). (H) En jämförelse med konventionella trypsinbaserade TFM för MEF-celler som håller sig till 300 μm diameter mönstrad fibronectin. Resultatet av UV-A-belysning (6 000 mJ/mm2) följt av 15 minuters väntan skiljer sig inte signifikant från den konventionella trypsinbehandlingen (dvs. 0,05% i 20 min). Staplarna visar medelvärde S.E.M. (tvåsidig student t-test, ****P < 0.0001, * P < 0.05, ns P ≤0.5). Klicka här för att se en större version av den här figuren.
| Akrylamid (%) | Bis-akrylamid (%) | Akrylamid från 40 % lagerlösning (ml) | Bis-akrylamid från 2 % stamlösning (ml) | Vatten (ml) | Youngs modulus (kPa) |
| 4 | 0.1 | 1 | 0.5 | 8.5 | 5,74 ± 0,53 |
| 5 | 0.15 | 1.25 | 0.75 | 8 | 9,69 ± 0,68 |
| 5 | 0.3 | 1.25 | 1.5 | 7.25 | 11,33 ± 1,06 |
Tabell 1: Blandningar av hydrogellagerlösning och resulterande elasticitet
Alla data deponeras i Open Access Data Repository of The Max Planck Society (Edmond) och kan nås via följande adress: https://edmond.mpdl.mpg.de/imeji/collection/JTu8PlWqpbymN9Qf
Discussion
I detta protokoll beskriver vi beredningen av micropatterned PA hydrogels som innehåller fluorescerande pärlor, som används som fiducial markörer för TFM studier. Vårt tillvägagångssätt bygger på tre steg: 1) beredning av tvåskiktade PA-hydrogeler; 2) Mikropapperning av ECM-proteiner och överföring av dem till hydrogelytan. 3) användning av mönstrat nära UV-ljus för TFM. Den experimentella inställningen för att analysera celldragkrafter till substratet kräver användning av linjära elastiska material med kända styvhetsvärden för att beräkna krafterna relaterade till förskjutning av fluorescerande pärlor26. PA-hydrogeler är lätta att förbereda, styvheten kan enkelt justeras och de används ofta för styvhetsavkänning och TFM18,28. För att uppnå reproducerbara polymerisationstider och homogen polymerisation av hela hydrogelen bör man dock ägna uppmärksamhet åt lagring av förhållanden och tid för reagenserna, t.ex. bör APS hållas i en desiccator för att undvika att förlora sin aktivitet. TEMED bör skyddas mot direkt ljus. Användningen av oxiderad HEA möjliggör kovalent bindning av matrisproteiner på hydrogelytan, vilket kan vara fördelaktigt för att uppnå bildandet av ett komplett och stabilt proteinskikt. Den oxiderade HEA-lösningen ska beredas färsk varje gång PA-hydrogeler tillverkas. Den tvåskiktade PA-hydrogelen erbjuder tre huvudfördelar: 1) det ger ett alternativt sätt att reproducerbart få en homogen fördelning av fiducialpärlor nära hydrogelytan, utan att gelén behöver göra gelén extremt tunn (dvs. <20 μm). Kontroll över hydrogeltjockleken är avgörande för att få exakta mätningar med TFM. När det elastiska substratet är för tunt kan starka vidhäftande celler som fibroblaster känna av och mekaniskt reagera på det underliggande styva glassubstratet29,30. Tjocka hydrogeler gör bildförvärvet för kraftrekonstruktionen mer utmanande. Dessutom kommer många mikroskop inte att ha tillräckligt med utrymme för att rymma dem, med tanke på den extra tjockleken på det glassubstrat som används för att fästa hydrogelen, såvida inte ultrathinmikroskopir används. 2) I den tvåskiktade PA-hydrogelen uppnås den homogena fördelningen av fiducialpärlor nära ytan av PA-hydrogelen utan att använda en centrifug, utan snarare med en enkel inkubation av exakta mängder hydrogellösningar och fluorescerande pärlor. Hög pärltäthet är till stor fördel när PIV-analysen utförs eftersom den ökar upplösningen av dragkrafterna och signal-till-brus-förhållandet utan behov av konfokal mikroskopi. 3) Att begränsa pärlor i ett tunt skikt nära cellmaterialgränssnittet möjliggör avbildning av dragkrafter med epifluorescensmikroskop samt konfokala mikroskop. Vid beredning av hydrogelen bör användaren se till att den klibbar fast vid bottenglaset innan du fortsätter med de efterföljande stegen i protokollet. Vi rekommenderar att du följer inkubationstiden som anges för polymerisationen av hydrogelskikten, eftersom det kan vara svårt att ta bort glaset ovanpå ytan utan att skada hydrogelytan.
De mest kända teknikerna för att mäta elastiska egenskaper är AFM, nanoindentation, dragtester och rheometri. Nanoindentation inducerar dock mycket höga stammar på materialen som kan påverka bestämningen av elastiska egenskaper. Dragtester och rheometri är å andra sidan makroskopiska mättekniker, medan celler interagerar på mikroskopisk skala31,32. AFM möjliggör mätningar på mikroskalan med minskade stammar under fysiologiska förhållanden. Afm-mätningarnas tillförlitlighet kan påverkas negativt om experimentella detaljer saknas (t.ex. indragskraft och hastighet) eller om otillräckliga data registreras27. beskriver en algoritm för att extrahera Youngs moduli från AFM-data, som betonar att hålla mätdetaljer konstant27. Denna algoritm erbjuder en exakt och tillförlitlig bestämning av Youngs moduli och användes för våra experiment. Dessutom mätte vi många kurvor på prover tillverkade på olika dagar och fick mycket liknande resultat (variation av medelvärden på ca. 1-2 kPa). Detta visar att styvheten hos våra geler kan förutsägas på ett tillförlitligt sätt.
I det här protokollet använder vi en fotopatteringmodul för att skapa mikromönster på glas, som sedan överförs till hydrogelytorna. Mikropapperet som visas i detta protokoll är baserat på DMD (digital mikrospegelenhet)-baserad masklös nära UV-litografi (λ = 375 nm)7. En DMD består av ett stort antal mikromirrorer på ett chip. En enda pixel motsvarar en enda mikrospegel. Den pixelerade mönsterbildfilen från en dator projiceras via DMD och fokuseras på ytan med hjälp av en objektivlins. För mikropatterning av proteiner används det fokuserade laserljuset för att klyva repellent polymerborstar med hjälp av en fotoinitiator. Därefter fylls de exponerade regionerna med ECM-proteiner. Denna masklösa ablationsmetod erbjuder stor flexibilitet vid utformningen av nya mönster, eftersom den inte förlitar sig på användningen av en fotomask. Att designa och tillämpa ett mönster är mycket enkelt eftersom det bara tar flera minuter med hjälp av ett freeware som Inkscape. Antalet mönster och prover som produceras på kort tid är dock en stor nackdel, eftersom denna metod endast kan användas för att mönstra ett enda substrat varje gång. Fotopappersmodulen använder en nära UV-solid state-laserkälla som avger flera milliwatt. Den oskärmade laserstrålen är farlig för ögon och hud. Reflekterat och spridda ljus och strålning kan också vara farligt. Hanteringen måste åtföljas av en säkerhetsinstruktion från laserombud. Det mest kritiska steget i protokollet när du använder en fotopatteringmodul är att se till att lasern är ordentligt fokuserad på ytan under mikropatterningen och ablationen. En konsekvent belysningsdos (intensitet multiplicerad med tid) av UV-ljus under mönstrad är beroende av hur lasern är fokuserad på ytan. En svag intensitet på ytan på grund av dåligt fokus kan leda till att ECM överförs till hydrogelytan vilket resulterar i att inga celler fastnar på hydrogelen.
I TFM experiment, efter den första avbildningen av vidhäftande celler och fiducial markörer, cellerna släpps från PA hydrogel genom trypsin behandling för att registrera deras avslappnade tillstånd. En nackdel med att utföra detta steg är att hantera provet på mikroskopistadiet. Utan en perfusionskammare utgör det en utmaning för nybörjare och erfarna användare att öppna locket på skålen, aspirera på mediet, sköljning och pipettering trypsinlösning. Faktum är att dessa förfaranden är en viktig källa till avdriften i xyz-axlar , vilket resulterar i förlust av position och fokus. Vårt lokal-UV-belysningsprotokoll gör TFM till en mer tillgänglig teknik för nybörjare. Det bör noteras att vi använde en kommersiellt tillgänglig mikroskopibaserad masklös fotopappersmodul, men i princip kunde alla UV-A-belysningssystem användas, så småningom i kombination med en mask för att skydda regioner i substratet, där celldragkraftkrafter inte bör registreras. Att exponera celler med en betydande dos av lågt våglängds synligt ljus (t.ex. det violetta ljuset som exciterar DAPI-utsläpp) kommer att leda till ökad oxidativ stress, vilket kan leda till fototoxicitet och celldöd. Därför kan denna teknik appliceras även i ett epifluorescensmikroskop utan en UV-lasermodul. Men eftersom intensiteten är mycket svagare, kommer det att bli mycket lättare att uppnå TFM med den enzymatiska behandlingen i detta fall.
Med LUVI-TFM är det möjligt att använda samma prov för flera mätningar på grund av den lokala avlossningen av enstaka celler eller små grupper av celler. Uppmärksamhet bör dock ägnas åt valet av celler för att lossa, för att undvika att registrera krafter från närliggande celler. För encelliga mätningar i avsaknad av mikromönster bör därför trånga regioner undvikas. För mätningar på enstaka mikromönster bör mönstren utformas så att avståndet mellan enskilda strukturer är minst dubbelt så stor som diametern på det mönstrade området. Vi rekommenderar också att du inte använder celler från intilliggande mönster i följd, utan snarare tar prover på dem från avlägsna regioner på substratet. Vår mätning sker väl på ett epifluorescensmikroskop utrustat med en fokuskontrollfunktion och en 40 x luft NA = 0,9-lins, där linsens arbetsavstånd är tillräckligt långt och den snabba rörelsen från en brunn till en annan är mycket tunable. Den riktade lösgöringen av celler för TFM-tillämpningar är effektiv för att mäta cellkraften i en enskild cell eller i ett helt litet cellkluster (t.ex. upp till 300 μm i diameter). Med hjälp av vår setup observerade vi cell avrundning och avskildhet för UV-behandling av enstaka celler (figur 3A), medan detachement sällan inträffade för små cell kluster. Detta kan leda till en underskattning av celldragkraftkrafter. För större cellkluster rekommenderas enzymatisk lösgöring, eftersom användarna bör använda ett 20x luftmål för att avbilda hela klustret och en fokus kontroll funktion behövs. Eftersom fokusdjupet för 20x luftlinsen är mycket längre, kommer hanteringen inte att vara lika kritisk som det högre förstoringsmålet. Användaren bör se till att fokus är korrekt inställt för ablation av celler, eftersom belysningsdosen är beroende av laserfokus på ytan. Medan vi är medvetna om de möjliga begränsningarna i användning av LUVI-TFM i cellkollektiv på grund av möjliga mekaniska interaktioner med närliggande obehandlade celler, kan denna aspekt faktiskt visa sig vara användbar för studier om mekaniken för riktad cellprofilering, t.ex. från epitelial monolayers.
Sammanfattningsvis, med vår TFM strategi i kombination med ljus inducerad frisättning av micropatterned celler, vi ger en robust och hög-genomströmning protokoll för att mäta cell vidhäftning krafter. Mångsidigheten hos denna metod kan utnyttjas ytterligare med hjälp av mikroskopi och bildframställning som syftar till att förbättra upplösning och känslighet.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar Rebecca Alvarado för stödet i protokollets videoproduktion och Mr Stephen Casale för konstruktiv kritik mot manuskriptet. Vi tackar kollegorna från institutionen för cellulär biofysik, Max Planck Institute for Medical Research för de hjälpsamma diskussionerna. Det ekonomiska stödet från Max-Planck-Gesellschaft till E.A.C.-A. och Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG SFB1129, Projektnummer 240245660, P15 till E.A.C.-A. och P4 till USA; DFG EXC 2082/1-390761711 till USA) är också mycket erkänt. J.B. tackar Carl Zeiss Foundation för ekonomiskt stöd. E.A.C.-A., C.S. och U.S.S. bekräftar finansiering genom Max Planck School Matter to Life som stöds av det tyska federala ministeriet för utbildning och forskning (BMBF). C.S. stöds av Europeiska forskningsrådet (Consolidator Grant PHOTOMECH, nr.101001797).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate | #440159 | Sigma Aldrich | |
| Acetic acid | #33209 | Honeywell | |
| Acrylamide 40 % | #1610140 | Bio-Rad | CAUTION : toxic, work under a fume hood |
| AFM cantilever | #CP-CONT-BSG-A-G | NanoAndMore | 5 μm spherical tip |
| AFM system | #NanoWizard3 | JPK | Coupled to optical microscope equipped with 40x air objective and GFP filter |
| Ammonium persulfate | #A3678 | Sigma | |
| Bis-acrylamide 2 % | #1610142 | Bio-Rad | CAUTION : toxic, work under a fume hood |
| Camera sCMOS | #C11440-42U30 | Hamamatsu | |
| Camera sCMOS | #ANDORZYLA4.2 | Oxford Instrument | |
| CellRox | #C10422 | Thermo Fisher | |
| Custom incubator chamber | EMBLEM | ||
| Dental glue | #1300 100 | Picodent | |
| DMEM | #41965 | Thermo Fisher | |
| Epifluorescence microscope | #Eclipse Ti2E | Nikon | |
| Epifluorescence microscope | #Axiovert200 | Zeiss | |
| Ethanol | #9065.3 | Carl Roth | |
| FBS South America | #S181T | Thermo Fisher | |
| Fibrinogen | #F13191 | Invitrogen | Alexa488 conjugate |
| Fibronectin | #F1141 | Sigma | |
| Fluorescent beads 200 nm | #F8805 | Invitrogen | Carboxylated (365/415) |
| Fluorescent beads 200 nm | #F8848 | Invitrogen | Carboxylated (505/515) |
| Fluorescent beads 200 nm | #F8810 | Invitrogen | Carboxylated (580/605) |
| Fluorescent beads 200 nm | #F8807 | Invitrogen | Carboxylated (660/680) |
| Glass coverslip 15 mm round | #41001115 | Assistent | |
| Glass coverslip 24 mm round | #41001124 | Assistent | |
| Microscope Objective | #MRH08230 | Nikon | 20x air NA 0.45 |
| Mouse Embryonic Fibroblasts | #CRL-2991 | ATCC | |
| mPEG-SVA | #MPEG-SVA-5000 | Laysan Bio | |
| N-Hydroxyethyl acrylamide | #697931 | Aldrich | |
| Plasma cleaner | #100-E | TePla | |
| PLPP gel | #PLPPgel | Alveole | |
| Poly-L-lysine | #P4823 | Sigma Aldrich | |
| Poly(L-lysine)-graft-poly(ethylene glycol) | #PLL(20-g[3.5]-PEG(2) | SuSoS | |
| Sodium(meta) periodate | #S1878 | Sigma Aldrich | |
| TEMED | #17919 | Thermo Scientific | |
| UV Patterning module | #PRIMO | Alveole | |
| UVO cleaner | #342-220 | Jelight |
References
- Geiger, B., Bershadsky, A. Exploring the neighborhood: adhesion-coupled cell mechanosensors. Cell. 110 (2), 139-142 (2002).
- Beningo, K. A., Hamao, K., Dembo, M., Wang, Y. -l, Hosoya, H. Traction forces of fibroblasts are regulated by the Rho-dependent kinase but not by the myosin light chain kinase. Archives of Biochemistry and Biophysics. 456 (2), 7 (2006).
- Rape, A. D., Guo, W. H., Wang, Y. L. The regulation of traction force in relation to cell shape and focal adhesions. Biomaterials. 32 (8), 2043-2051 (2011).
- Kumar, R., Saha, S., Sinha, B. Cell spread area and traction forces determine myosin-II-based cortex thickness regulation. Biochimica Biophysica Acta. Molecular Cell Research. 1866 (12), 118516 (2019).
- Chen, C. S., Mrksich, M., Huang, S., Whitesides, G. M., Ingber, D. E. Geometric control of cell life and death. Science. 276 (5317), 1425-1428 (1997).
- Thery, M. Micropatterning as a tool to decipher cell morphogenesis and functions. Journal of Cell Science. 123, 4201-4213 (2010).
- Strale, P. O., et al. Multiprotein printing by light-induced molecular adsorption. Advanced Materials. 28 (10), 2024-2029 (2016).
- Azioune, A., Carpi, N., Tseng, Q., Théry, M., Piel, M. Microtubules: in vivo Methods in Cell Biology. , 133-146 (2010).
- Tseng, Q., et al. A new micropatterning method of soft substrates reveals that different tumorigenic signals can promote or reduce cell contraction levels. Lab on a Chip. 11 (13), 2231-2240 (2011).
- Vignaud, T., Ennomani, H., Thery, M.
- Munevar, S., Wang, Y., Dembo, M. Traction force microscopy of migrating normal and H-ras transformed 3T3 fibroblasts. Biophysical Journal. 80 (4), 1744-1757 (2001).
- Style, R. W., et al. Traction force microscopy in physics and biology. Soft Matter. 10 (23), 4047-4055 (2014).
- Polacheck, W. J., Chen, C. S. Measuring cell-generated forces: a guide to the available tools. Nature Methods. 13 (5), 415-423 (2016).
- Schwarz, U. S., Soine, J. R. Traction force microscopy on soft elastic substrates: A guide to recent computational advances. Biochimica Biophysica Acta. 1853, 3095-3104 (2015).
- Roca-Cusachs, P., Conte, V., Trepat, X.
- Hanke, J., Probst, D., Zemel, A., Schwarz, U. S., Koster, S. Dynamics of force generation by spreading platelets. Soft Matter. 14 (31), 6571-6581 (2018).
- Butler, J. P., Tolic-Norrelykke, I. M., Fabry, B., Fredberg, J. J. Traction fields, moments, and strain energy that cells exert on their surroundings. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 282 (3), 595-605 (2002).
- Sabass, B., Gardel, M. L., Waterman, C. M., Schwarz, U. S. High resolution traction force microscopy based on experimental and computational advances. Biophysical Journal. 94 (1), 207-220 (2008).
- Willert, C. E., Gharib, M.
- Lourenco, L., Krothapalli, A. On the accuracy of velocity and corticity measurements with PIV. Experiments in Fluids. 18, 421-428 (1995).
- Adrian, R. J., Westerweel, J. Particle Image Velocimetry. , Cambridge University Press. (2011).
- Westerweel, J., Scarano, F. Universal outlier detection for PIV data. Experiments in Fluids. 39 (6), 1096-1100 (2005).
- Dembo, M., Wang, Y. Stresses at the cell-to-substrate interface during locomotion of fibroblasts. Biophysical Journal. 76 (4), 2307-2316 (1999).
- Schwarz, U. S., et al. Calculation of forces at focal adhesions from elastic substrate data: the effect of localized force and the need for regularization. Biophysical Journal. 83 (3), 1380-1394 (2002).
- Huang, Y., Gompper, G., Sabass, B. A Bayesian traction force microscopy method with automated denoising in a user-friendly software package. Computer Physics Communications. 256, 107313 (2020).
- Vedadghavami, A., et al. Manufacturing of hydrogel biomaterials with controlled mechanical properties for tissue engineering applications. Acta Biomaterialia. 62, 42-63 (2017).
- Huth, S., Sindt, S., Selhuber-Unkel, C. Automated analysis of soft hydrogel microindentation: Impact of various indentation parameters on the measurement of Young's modulus. PLoS One. 14 (8), 0220281 (2019).
- Oria, R., et al. Force loading explains spatial sensing of ligands by cells. Nature. 552 (7684), 219-224 (2017).
- Buxboim, A., Rajagopal, K., Brown, A. E., Discher, D. E. How deeply cells feel: methods for thin gels. Journal of Physics. Condensed Matter. 22 (19), 194116 (2010).
- Sen, S., Engler, A. J., Discher, D. E. Matrix strains induced by cells: Computing how far cells can feel. Cell and Molecular Bioengineering. 2 (1), 39-48 (2009).
- Arnold, M., et al. Induction of cell polarization and migration by a gradient of nanoscale variations in adhesive ligand spacing. Nano Letters. 8 (7), 2063-2069 (2008).
- Galluzzi, M., et al. Atomic force microscopy methodology and AFMech Suite software for nanomechanics on heterogeneous soft materials. Nat Communications. 9 (1), 3584 (2018).
