Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Простой микрофлюидный чип для долгосрочного роста и визуализации Caenorhabditis elegans

Published: April 11, 2022 doi: 10.3791/63136
Automatic Translation
1,2,3,4, 1,5, 2
1National Centre for Biological Sciences, TIFR, 2Department of Biological Sciences, TIFR, 3InSTEM, 4Manipal Academy of Higher Education, 5Department of Mechanical Engineering, The University of Texas at Austin

Summary

Протокол описывает простую микрофлюидную конструкцию чипа и методологию микрофабрикации, используемую для выращивания C. elegans в присутствии непрерывного питания в течение 36 ч. Устройство для роста и визуализации также обеспечивает прерывистую долгосрочную визуализацию клеточных и субклеточных процессов с высоким разрешением в течение нескольких дней.

Abstract

Caenorhabditis elegans (C. elegans) оказался ценной модельной системой для изучения биологических процессов развития и клеток. Понимание этих биологических процессов часто требует длительной и повторной визуализации одного и того же животного. Длительное время восстановления, связанное с обычными методами иммобилизации, выполняемыми на агаровых прокладках, оказывает пагубное влияние на здоровье животных, что делает неуместным повторное изображение одного и того же животного в течение длительных периодов времени. В этой статье описывается конструкция микрофлюидного чипа, метод изготовления, протокол культивирования C. elegans на чипе и три примера долгосрочной визуализации для изучения процессов развития у отдельных животных. Чип, изготовленный из полидиметилсилоксана и склеенный на покровном стекле, обездвиживает животных на стеклянной подложке с помощью эластомерной мембраны, которая отклоняется с помощью газообразного азота. Полная иммобилизация C. elegans обеспечивает надежную покадровую визуализацию клеточных и субклеточных событий без анестезии. Геометрия канала с большим поперечным сечением позволяет животному свободно перемещаться в пределах двух частично герметичных изоляционных мембран, позволяющих расти в канале с непрерывной подачей пищи. Используя этот простой чип, можно выполнить визуализацию явлений развития, таких как рост нейронного процесса, развитие вульвы и дендритная арборизация в сенсорных нейронах PVD, когда животное растет внутри канала. Долговременный чип роста и визуализации работает с одной линией давления, без внешних клапанов, недорогими жидкими расходными материалами и использует стандартные протоколы обработки червей, которые могут быть легко адаптированы другими лабораториями с использованием C. elegans.

Introduction

Caenorhabditis elegans оказался мощным модельным организмом для изучения клеточной биологии, старения, биологии развития и нейробиологии. Такие преимущества, как прозрачное тело, короткий жизненный цикл, простота обслуживания, определенное количество клеток, гомология с несколькими человеческими генами и хорошо изученная генетика, привели к тому, что C. elegans стал популярной моделью как для открытий фундаментальной биологии, так и для прикладных исследований 1,2. Понимание биологических и эволюционных процессов клетки из повторяющихся долгосрочных наблюдений за отдельными животными может оказаться полезным. Условно C. elegans обезболивают на агаровых подушечках и визуализируют под микроскопом. Неблагоприятное воздействие анестетиков на здоровье животных ограничивают применение анестезируемых животных для длительной и повторной прерывистой визуализации одного и того же животного 3,4. Последние достижения в области микрофлюидных технологий и их адаптация к безанестезному отлову C. elegans с незначительной опасностью для здоровья позволяют получать изображения одного и того же животного с высоким разрешением в течение короткого и длительного периода времени.

Микрофлюидные чипы были разработаны для высокопроизводительного скрининга C. elegans'5 6,7,8, улавливания и дозирования 9, скрининга лекарств10,11, стимуляции нейронов с помощью визуализации высокого разрешения12 и визуализации животного с высоким разрешением 12,13,14. Также разработаны ультратонкие микрофлюидные листы для иммобилизации на слайдах15. Долгосрочные исследования C. elegans были выполнены с использованием изображений животных с низким разрешением, растущих в жидкой культуре, для наблюдения за ростом, динамикой кальция, влиянием лекарств на их поведение 16,17,18,19, их долголетием и старением 20. Долгосрочные исследования с использованием микроскопии высокого разрешения были проведены для оценки синаптического развития21, регенерации нейронов22 и митохондриального добавления23. Долгосрочная визуализация высокого разрешения и отслеживание судьбы и дифференцировки клеток были выполнены в многоканальных устройствах24,25. Несколько клеточных и субклеточных событий происходят в течение нескольких часов и требуют захвата одного и того же человека в разные моменты времени во время их развития, чтобы охарактеризовать все промежуточные этапы процесса для понимания клеточной динамики in vivo. Чтобы изобразить биологический процесс, такой как органогенез, развитие нейронов и миграция клеток, животное должно быть обездвижено в одной и той же ориентации в нескольких точках времени. Ранее мы опубликовали протокол для визуализации C. elegans с высоким разрешением в течение более 36 ч, чтобы определить, где митохондрии добавляются вдоль нейронов сенсорных рецепторов (TRNs)23.

В этой статье представлен протокол для создания методологии на основе микрофлюидики для повторного изображения с высоким разрешением. Это устройство с одним каналом потока лучше всего подходит для повторной визуализации одного животного на устройство. Чтобы улучшить пропускную способность и изображение многих животных одновременно, несколько устройств могут быть подключены к одной и той же линии давления, но с отдельными трехсторонними разъемами, управляющими одним животным в каждом устройстве. Дизайн полезен для исследований, которые требуют покадровых изображений с высоким разрешением, таких как постэмбриональные процессы развития, миграция клеток, транспорт органелл, исследования экспрессии генов и т. Д. Технология может быть ограниченной для некоторых применений, таких как исследования продолжительности жизни и старения, которые требуют параллельного роста и визуализации многих животных на поздней стадии. Для изготовления этого устройства использовался эластомер полидиметилсилоксана (PDMS) из-за его биостабильности26, биосовместимости 27,28, газопроницаемости 29,30 и перестраиваемого модуля упругости31. Это двухслойное устройство позволяет выращивать животных с непрерывной подачей пищи в микрофлюидном канале и улавливать отдельных C. elegans через мембранное сжатие PDMS с использованием газообразного азота. Это устройство является расширением ранее опубликованного устройства с преимуществом выращивания и визуализации одного и того же животного в микроканале под непрерывной подачей пищи3. Дополнительная изоляционная мембранная сеть и улавливающая мембрана шириной 2 мм обеспечивают эффективную иммобилизацию развивающихся животных. Устройство использовалось для наблюдения за развитием нейронов, развитием вульвы и дендритной арборизацией в сенсорных нейронах PVD. Животные растут без неблагоприятных последствий для здоровья в устройстве и могут быть многократно обездвижены, чтобы облегчить визуализацию субклеточных событий у одного и того же животного во время его развития.

Весь протокол разделен на пять частей. Часть 1 описывает изготовление устройства для чипа роста и визуализации. В части 2 описывается, как настроить систему давления для отклонения мембраны PDMS для иммобилизации и изоляции отдельных C. elegans. Часть 3 описывает, как синхронизировать C. elegans на пластине среды роста нематод (NGM) для визуализации устройства. Часть 4 описывает, как загрузить одно животное в устройство и вырастить животное внутри микрофлюидного устройства в течение нескольких дней. Часть 5 описывает, как обездвижить отдельное животное в нескольких точках времени, захватить изображения с высоким разрешением с использованием различных целей и проанализировать изображения с помощью Фиджи.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Изготовление устройства роста и визуализации

  1. Изготовление пресс-форм SU8
    1. Проектирование шаблонов 1 (проточный слой) и 2 (контрольный слой) с использованием прямоугольных форм в программном обеспечении для обработки текстов (или программном обеспечении автоматизированного проектирования САПР) и печать фотомаск с помощью лазерного плоттера с минимальным размером объекта 8 мкм на пленке на основе полиэстера (рисунок 1).
    2. Кремниевые пластины нарезать кусочками по 2,5 см × 2,5 см и очистить их 20% KOH в течение 1 мин. Промыть пластины в деионизированной (DI) воде. Используйте по одной пластине для потока и регулирующего слоя.
      ВНИМАНИЕ: KOH является коррозионным и должен обрабатываться с осторожностью.
    3. Высушите кусочки сжатым газообразным азотом 14 фунтов на квадратный дюйм с последующим обезвоживанием на конфорке при 120 °C в течение 4 часов. Прежде чем перейти к следующему шагу, охладите две части до комнатной температуры.
    4. Возьмите один из кусочков кремния и положите его на патрон спин-коатера и включите вакуум, чтобы удерживать пластину на месте. На кусок кремния нанесите ~ 20 мкл гексаметилдисилана (HMDS) и покройте его с помощью спин-коатера со скоростью 500 оборотов в минуту (об/мин) в течение 5 с последующим 3000 оборотами в минуту в течение 30 с.
      ВНИМАНИЕ: Этот шаг должен быть выполнен при желтом свете. Не используйте белый свет в комнате.
    5. Чтобы получить однородную толщину фоторезиста ~ 40 мкм (специфичную для слоя потока; подходит для визуализации животных ранней личиночной стадии 1 до стадии 3 (L1 - L3), покройте кремниевую пластину ~ 1,5 мл отрицательного фоторезиста-1 с использованием спин-коатера при 500 об/мин в течение 5 с последующим 2000 оборотами в минуту в течение 30 с.
    6. Повторите шаги 1.1.4 и 1.1.5 со второй пластиной для получения однородной толщины фоторезиста ~40 мкм, специфичной для контрольного слоя.
    7. Альтернативно, чтобы увеличить толщину проточного слоя до ~80 мкм для пожилых животных, покрывайте кремниевые пластины ~1,5 мл отрицательного фоторезиста-2 с помощью спин-коатера при 500 об/мин в течение 5 с последующим 2000 об/мин в течение 30 с. Такая толщина подходит для стадии L3 для взрослых животных.
      ВНИМАНИЕ: Держите кремниевые пластины по бокам, чтобы избежать повреждения слоев со спин-покрытием. Держите белый свет выключенным во время этого шага.
    8. Выпекайте кремниевые кусочки с фоторезистическим покрытием (для проточных и контрольных слоев) на конфорке при 65 °C в течение 1 мин, а затем 95 °C в течение 10 мин. Охладить запеченные кусочки до комнатной температуры.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обожженные кусочки кремния можно хранить в течение одного дня, прежде чем перейти к следующему шагу. Хранить в темноте и не подвергать воздействию белого света.
    9. Поместите мягкие обожженные кусочки кремния на стадию экспозиции УФ-осветителя с поверхностью с фоторезистическим покрытием, обращенной к УФ-лампе. Подвергайте две части отдельно воздействию ультрафиолета в течение 15 с, используя лампу мощностью 200 Вт, через фотомаску с узорами 1 и 2, чтобы получить слои потока и управления соответственно.
      ВНИМАНИЕ: Носите защитные очки и избегайте прямого воздействия ультрафиолетового излучения. Не включайте белый свет в комнате на этом этапе.
    10. Выпекайте два открытых кусочка кремния с покрытием, обращенным вверх, при 65 °C, а затем 95 °C в течение 1 мин и 10 мин соответственно. Охладите кусочки до комнатной температуры, прежде чем перейти к следующему шагу.
    11. Разработайте паттерны, замочив кусочки кремния в растворе разработчика фоторезиста (разбавление разработчика 1:3 в изопропаноле) в течение 20 мин. Как только рисунок будет виден, промойте кусочки чистым изопропиловым спиртом (IPA) и осторожно высушите феном с использованием газообразного азота (14 фунтов на квадратный дюйм).
      ВНИМАНИЕ: Используйте хорошо проветриваемую среду для этой химической обработки, чтобы избежать воздействия на человека. Используйте белый свет только после того, как будут разработаны и промыты IPA.
    12. Храните кусочки кремния в осушителе с покрытой поверхностью вверх. Подвергайте кусочки воздействию паров силана, наливая 50 мкл чистого трихлора (1H, 1H, 2H, 2H-перфтороктил) силана на небольшой пластиковый стаканчик или стеклянную горку. Поместите чашку/горку внутрь осушителя и инкубируйте в течение 2 ч.
      ВНИМАНИЕ: Избегайте прямого воздействия паров силана. Всегда используйте герметичную камеру для обработки паров силана.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При необходимости разработанные кремниевые кусочки можно хранить в течение 1-2 дней, прежде чем перейти к следующему этапу.
  2. Изготовление чипов PDMS
    1. Сделайте PDMS в пластиковом стаканчике, смешав эластомерную основу с отверждающим агентом в соотношении 10:1. Хорошо перемешайте содержимое, постоянно помешивая в течение 3 мин. Смешивание создаст много пузырьков воздуха в смеси PDMS.
    2. Дегазируйте смесь PDMS в осушителе в течение 30 минут, чтобы удалить все пузырьки воздуха.
      ВНИМАНИЕ: Убедитесь, что пузырьки воздуха удалены из смеси PDMS, прежде чем она будет вылита на объекты, так как пузырьки могут привести к дефектным и нефункциональным устройствам.
    3. Поместите кремниевые пластины с контрольным слоем (рисунок 2) в чашку Петри. Аккуратно налейте слой смеси PDMS толщиной 5 мм на кусок кремния, избегая образования пузырьков.
    4. Дегазируйте смесь PDMS в осушителе для удаления дополнительных пузырьков, которые образуются в процессе заливки PDMS.
    5. Поместите кремниевую пластину с проточным слоем (рисунок 1) на спиннер-патрон, применяя вакуумное давление 200-500 мТорр для удержания пластины. Налейте ~ 1 мл PDMS на кремниевую пластину и покройте ее с помощью спин-коатера при 500 об/мин в течение 5 с, а затем 1000 об/мин в течение 30 с, чтобы получить слой толщиной ~ 80 мкм.
    6. Выпекайте две кремниевые пластины с отжимным покрытием PDMS и налитыми слоями PDMS при 50 °C в конвекционной печи горячего воздуха в течение 6 ч. После выпечки подождите, пока кусочки остынут при комнатной температуре.
    7. Вырежьте слой PDMS толщиной 5 мм из кремниевого куска вокруг контрольного слоя (рисунок 2) с помощью острого лезвия и отклейте его от кремниевой подложки.
    8. Пробивайте два отверстия диаметром ~1 мм с помощью перфоратора Harris в резервуаре блока PDMS для подключения иммобилизационного канала и входов изоляционного канала к газовым линиям для прогибов мембраны PDMS.
    9. Поместите кремниевый кусок со слоем PDMS со спиновым покрытием на рисунок 1 (слой потока), с поверхностью, покрытой PDMS, обращенной вверх, на пластиковый лоток. Держите перфорированный блок PDMS с рисунком 2 (контрольный слой) на лотке с формованной стороной вверх.
    10. Держите пластиковый лоток внутри плазмоочистителя и подвергайте две поверхности PDMS воздействию воздушной плазмы мощностью 18 Вт в течение 2 мин при низком вакууме (200-600 мТорр). Применяйте вакуум до тех пор, пока камера не станет ярко-фиолетовой. Выполните этот шаг при слабом освещении, чтобы увидеть изменение цвета плазмы.
    11. Выньте два блока, обработанных плазмой, и осторожно свяжите блоки, прижав обработанные плазмой поверхности узоров 1 и 2 вместе. Выпекать склеенные узоры при 50 °C в течение 2 ч в конвекционной печи горячего воздуха.
    12. Выньте склеенное устройство из духовки. Вырежьте склеенное устройство из кремниевой пластины с рисунком 1 и рисунком 2 и пробьете отверстия во входном и выходном резервуарах проточного слоя с помощью перфоратора Harris.
    13. Поместите склеенный блок PDMS с проточным слоем вверх на пластиковый лоток. Держите чистое покровное стекло (#1.5) на том же лотке. Подвергайте блоки и покровное стекло воздействию воздушной плазмы 18 Вт в течение 2 мин. Отрегулируйте вакуумное давление, чтобы увидеть фиолетовую камеру.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг должен быть выполнен при слабом освещении, чтобы увидеть изменение цвета плазмы. Чтобы очистить покровное стекло, вымойте его IPA и высушите феном, используя газообразный азот при 14 фунтах на квадратный дюйм.
    14. Поместите плазменный блок PDMS поверх покровного стекла и выпекайте склеенную структуру в духовке при температуре 50 °C в течение 2 ч. Храните устройство в чистой камере для любого будущего эксперимента.

2. Мембранная грунтовка PDMS

  1. Возьмите прибор и поставьте его на стереомикроскоп и прикрепите трубки. Подключите микрогибную трубку (внутренний диаметр ~5 мм, наружный диаметр ~8 мм) к газовой линии сжатого азота на одном конце. Подключите трехсторонний разъем на другом конце. Трубки 1 и 2 трехходовых соединителей будут соединены с ловушкой и изолирующей мембранами соответственно.
  2. Подключите две микрогибные трубки (внутренний диаметр ~1,6 мм, наружный диаметр ~5 мм) к двум выходным портам трехстороннего запорного крана. Соедините другой конец двух трубок с иглой длиной 18 г длиной 8 мм.
  3. Заполните слой потока буфером M9 с помощью микропипетки через входной порт. Заполните обе трубки водой DI через конец, соединенный с иглой. Вставьте две иглы в перфорированные отверстия, соединив изолирующую и улавливающую мембрану соответственно.
  4. Откройте регулятор газообразного азота при 14 фунтах на квадратный дюйм и поверните трехсторонний клапан из трубки 1, чтобы протолкнуть воду в устройство через микрофлюидные каналы в слоях управления, а именно, ловушку и изоляционные мембраны.
  5. Подождите, пока вода не заполнит канал без присутствия каких-либо капель воздуха в обоих каналах. Как только каналы полностью заполнены водой, каналы считаются загрунтованными.
  6. Снимите давление с помощью трехстороннего запорного крана, как только каналы будут заполнены водой и загрунтованы. Грунтовка может привести к образованию пузырьков в проточном слое, удалить пузырьки путем протекания дополнительной среды через канал потока.

3. Обслуживание и синхронизация C. elegans

ПРИМЕЧАНИЕ: Штаммы C. elegans : В исследовании использовались следующие трансгены PS3239 (dpy-20(e1282) syIs49 IV [MH86p(dpy-20(+) + pJB100(ZMP-1::GFP)]) для развития вульвы32, jsIs609 (mec7p::MLS(сигнал локализации митохондриальной матрицы)::GFP)33 для развития нейронов сенсорных рецепторов (TRN) и визуализации транспорта митохондрий и wdIs51(F49H12.4::GFP + unc-119(+)) для отслеживания развития PVD34. Стандарт C. elegans культуры и протокола поддержания былсоблюден 35.

  1. Выращивайте C. elegans на пластинах Петри из среды роста нематод (NGM) с E. coli OP50 в качестве источника пищи при 22 °C. Поддерживайте штаммы C. elegans , многократно перенося несколько гермафродитов или разбивая небольшое количество агара с несколькими животными на новую пластину NGM с газоном OP50.
  2. Через 3-5 дней проверьте пластину NGM на наличие роста животных и яиц C. elegans . Соберите и переложите около 30 яиц с тарелки на свежую тарелку NGM с газоном OP50.
  3. Чтобы синхронизировать животных для визуализации, переносите все невылупившиеся яйца с тарелки каждые 2 ч на свежую тарелку и поддерживайте их при 22 °C. Примерно 15-20 яиц вылупятся на каждой тарелке.
  4. Подберите животных между 14-16 ч и 28-30 ч после вылупления на стадии личинок 2 (L2) и личинки 3 (L3) соответственно. Перенесите животных на микрофлюидное устройство для визуализации. Добавьте запас пищи, как описано в следующем разделе, чтобы поддерживать животное внутри устройства для долгосрочного роста и экспериментов с визуализацией.

4. Рост C. elegans внутри микрофлюидного устройства роста и визуализации

  1. Установите микрофлюидное устройство для роста и визуализации на перевернутом микроскопе и просмотрите рисунок 2 после соединения изоляционных мембран и иммобилизационной мембраны при низком увеличении (4x или 10x). Убедитесь, что каналы заполнены чистой дистиллированной водой.
  2. Готовят свежий 1 л растворА S-среды, используя 10 мл 1 М калия цитрата рН 6,0, 10 мл раствора следовых металлов, 3 мл 1 МCaCl2, 3 мл 1 М МгСО4. Готовят раствор в стерильных условиях. Не автоклавируйте S-среду.
  3. Заполните канал потока питательными средами (S-средой) за 10 мин до начала эксперимента. Избегайте пузырьков воздуха в канале потока. При необходимости пропустите дополнительную среду для удаления пузырьков воздуха.
  4. Выберите одно животное из требуемой стадии развития из пластины NGM в 10 мкл S-среды с помощью микропипетки и протолкните животное в канал потока через входное отверстие.
  5. Контролируйте положение животного в канале потока, используя объектив с низким увеличением. Пропустите дополнительную среду через входное или выходное отверстие, чтобы подтолкнуть животное и расположить его в канале потока, ограниченном между двумя изоляционными мембранами.
  6. Откройте трехсторонний запорный кран, чтобы применить давление 14 фунтов на квадратный дюйм в изоляционных каналах и протолкнуть мембраны вниз в канал потока.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мембрана частично герметизирует канал потока и ограничивает движение животных в области между двумя изоляционными мембранами.
  7. Используйте одну колонию E. coli OP50 из полосатой пластины для прививки 250 мл L Бульона (2,5 г бакто-триптона, 1,25 г бакто-дрожжей, 1,25 г NaCl вH2O). Выращивайте привитую культуру в течение ночи при 37 °C.
  8. Aliquot 500 мкл культуры OP50 в 1,5 мл стерильных центрифужных трубок и хранить запас и аликвоту в течение 2 недель при 4 °C.
  9. Гранулированная культура OP50 методом центрифугирования при 1,3 х г в течение 5 мин. Растворить гранулу с 1 мл свежей S-среды (0,5-кратное разведение) и хранить при комнатной температуре в течение 3-4 дней. Используйте этот разбавленный OP50 для кормления C. elegans внутри микрофлюидных устройств.
  10. Оставьте каплю S-среды поверх впускного и выпускного резервуаров, чтобы уменьшить испарение S-среды в канале потока.
  11. Принимают разбавленный раствор OP50 в микропипетке объемом 10 мкл. Извлеките микрокончик, заполненный раствором OP50, из пипетки и вставьте наконечник во входной резервуар. Затем поместите еще один наконечник микропипетки с 10 мкл пищевого раствора и вставьте его в выходной резервуар.
  12. Запечатайте головку наконечника, применяя давление пальцем, чтобы обеспечить непрерывность пищевых растворов без какого-либо воздушного зазора. Меняйте наконечник микропипетки раствором OP50 каждый день, который не старше 3-4 дней.
  13. Заполните дополнительно 20-30 мкл пищевого раствора в обоих кончиках. Добавьте или удалите пищевой раствор на кончик микропипетки и с него, чтобы отрегулировать градиент, чтобы подтолкнуть животное в канал потока и отрегулировать положение животного под улавливающей мембраной для визуализации.
  14. Контролируйте поток бактерий, чтобы обеспечить его непрерывность через частично закрытые изоляционные мембраны в канале потока, используя изображения яркого поля.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При отсутствии потока бактерий животные могут съесть доступные бактерии в канале потока между двумя изоляционными мембранами. В случае отсутствия бактерий или потока в канале замените два наконечника микропипетки на входе и выходе новыми наконечниками пипетки, заполненными свежеприготовленными продуктами питания.

5. Иммобилизация и визуализация C. elegans

  1. Иммобилизация C. elegans под улавливающей мембраной
    1. Найдите одно животное в канале роста при небольшом увеличении. Отрегулируйте высоту пищевого раствора в двух наконечниках микропипетки, соединенных с входным и выходным резервуарами. Толкайте животное в нужном направлении, используя перепады гидростатического давления в проточном канале.
    2. Расположите животное в центре улавливающей мембраны и контролируйте его поведение при плавании с помощью объектива с низким увеличением (4x).
    3. Поворачивайте трехсторонний запорный кран, чтобы медленно увеличивать давление в канале ловушки. Обездвиживают животное под мембраной ловушки в прямой позе вдоль пограничной стенки канала роста.
      ВНИМАНИЕ: Избегайте захвата животного через канал потока в положении Z или U изгиба. Это заставляет тело животного сжиматься с большим давлением и наносит непоправимый ущерб его здоровью.
  2. C. визуализация элеганса и высвобождение из мембраны
    1. Переносите и загружайте устройство на ступень микроскопа. Настройте инвертированный микроскоп на требуемых настройках изображения со всеми необходимыми оптическими компонентами (объектив, источник света, флуоресцентные фильтры и детектор) для яркого поля высокого разрешения, дифференциального контраста изображения (DIC) или флуоресцентной визуализации (дополнительный рисунок 1).
    2. Получение одного или нескольких покадровых флуоресцентных изображений для захвата клеточных и субклеточных событий.
    3. Получение флуоресцентных изображений нейронов C. elegans в зависимости от их развития с помощью объектива 60x, 1,4 числовой апертуры (NA), лазера с длиной волны 488 нм с мощностью лазера 7%-10%, ПЗС-камеры на вращающемся дисковом микроскопе. Выполняйте покадровую визуализацию с помощью программного обеспечения, поставляемого с микроскопом, и получайте изображения со скоростью 4 кадра в секунду (дополнительный рисунок 1).
    4. После получения снимков отпустите давление отлова и следите за передвижением животного при малых увеличениях – 4х и 10х. Держите животное ограниченным в пределах области, определенной изолирующими мембранами (держали под 14 фунтов на квадратный дюйм на протяжении всего эксперимента).
    5. Отрегулируйте объем пищевого раствора в двух наконечниках микропипетки, чтобы продолжить медленный гравитационный поток пищи в канале роста. Этот пищевой поток получают путем регулировки уровней пищевых растворов в микропипетках на входе и выходе (обычно разница высот 1-5 мм).
    6. Визуализируйте поток под ярким полем от структуры потока бактерий в канале роста.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При отсутствии потока животное съедает имеющиеся бактерии OP50, канал кажется прозрачным, и животное голодает в течение нескольких часов. У голодающего животного обычно развивается высокая автофлуоресценция, которую легко наблюдать при получении покадровых флуоресцентных изображений. Такие события оказывают пагубное влияние на физиологию животных и избегались в экспериментах.
    7. Повторите шаги 5.2.1-5.2.3 через заданный интервал времени для получения флуоресцентных/ОВС/ярко-полевых изображений одного и того же человека в нескольких точках времени.
    8. После того, как изображения получены в несколько желаемых временных точек от одного и того же отдельного животного, освободите давление изоляции и захвата. Промыть канал буфером М9 и протолкнуть животное через входной резервуар. Извлеките животное из резервуара и поместите его на свежую пластину NGM для дальнейшего мониторинга здоровья.
    9. Промывайте канал буфером M9 несколько раз, чтобы удалить бактерии. Промыть проточный канал 70% этиловым спиртом (разведенным в дистиллированной воде). Высушите каналы, протолкнув воздух с помощью шприца. Храните устройство в сухом беспыльном месте для повторного использования в будущем.
  3. Анализ изображений и статистика
    1. Используйте программное обеспечение FIJI ImageJ для анализа изображений tiff. Откройте tiff изображения PVD-покадровых изображений животных wdIs51 в Fiji ImageJ. Извлеките лучшие плоскости из стека z-плоскостей, показывающих основные процессы, выбрав вкладку Изображение > Стеки > проекта Z.
    2. Просмотрите всю серию изображений и найдите конкретные кадры изображения, которые успешно охватывают все нейронные процессы, используя перекрывающиеся участки рамок изображения животных. Выберите Плагин > Анализировать счетчик ячеек > на панели инструментов FIJI. Это откроет окно для нумерации различных ветвей и подсчета каждого выбранного нейрона.
    3. Выберите Инициализировать счетчики > > Type1, затем отметьте дополнительные ветви. Затем выберите Тип 2 и отметьте Четвертичный, нажмите окно Результаты, показывающее количество всех ветвей (Дополнительный рисунок 2). Этот метод отобразит ветви, которые уже подсчитаны.
    4. Откройте следующее перекрывающееся изображение и подсчитайте оставшиеся ветви. Этот процесс предотвратит двойной учет и обеспечит подсчет каждого процесса. Определите и подсчитайте общее количество первичных ветвей, присутствующих на ранних личиночных стадиях C. elegans. Выполните аналогичный анализ для изображений вторичных и четвертичных процессов у пожилых животных.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Взрослые показывают много процессов, которые иннервируют в мышцах стенки тела и могут быть трудными для подсчета. Убедитесь, что каждый процесс учитывается только один раз.
    5. Рассчитайте расстояние между телами pvD-клеток у животных wdIs51 , проведя сегментированную линию от тела PVD-клетки (CB) до PVC CB. Для животных стадии 4 (L4) клеточные тела находятся далеко друг от друга и не находятся в одном кадре при изображении с 60-кратным объективом.
    6. Выберите перекрывающиеся изображения из стека, чтобы покрыть всю длину животного от головы до хвоста, используя вкладку «Изображение» > проекта «Стеки > Z » из ImageJ. Нарисуйте сегментированные линии вдоль нейронного процесса между PVD и PVC CB.
    7. Измерьте длины для всех сегментированных линий с помощью ImageJ > Analyze > Measure. Добавьте длины для всех сегментов, чтобы рассчитать общее расстояние между PVD и PVC CB для каждой точки времени.
    8. Для длины нейронов TRN у животных jsIs609 загрузите изображения на Фиджи. Проведите сегментированную линию вдоль задних боковых микротрубочек (PLM; видимых с растворимым GFP) от тела клетки до центроида первой митохондрии. Вычислите длину линии для первого значения расстояния.
    9. Нарисуйте сегментированную линию от центра первой до второй митохондрии. Повторяйте этот процесс для каждой пары митохондрий до конца длины нейронного процесса. Сложите все длины, чтобы рассчитать общую длину нейронного процесса.
    10. Для анализа клеточной линии загрузите все изображения вульвы на Фиджи и извлеките наилучшее фокусное изображение клеток из покадровых изображений нескольких z-плоскостей.
    11. Представьте данные как среднее ± стандартной погрешности среднего значения (SEM). Рассчитайте статистическую значимость, используя одностороннюю ANOVA для более чем двух выборок или t-тест с двумя выборками для пары образцов. Обозначьте значимость p-значением < 0,05 (*), p-значением < 0,005 (**) и p-значением > 0,05 (ns, незначимое).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Характеристика устройства: Устройство роста и визуализации состоит из двух слоев PDMS, связанных вместе (рисунок 1) с использованием необратимой плазменной связи. Слой потока (рисунок 1), который составляет 10 мм в длину и 40 мкм или 80 мкм в высоту, позволяет выращивать животное в жидкой культуре (рисунок 1А). Улавливающий слой (рисунок 2) имеет мембрану шириной 2 мм (рисунок 1B) для иммобилизации животного для визуализации с высоким разрешением. Маска для улавливающего слоя также создает пару изоляционных мембран для ограничения движения животных в пределах участка канала потока между последовательными точками времени визуализации. Улавливающая мембрана устройства адаптирована от нашего предыдущего устройства визуализации3. Современное устройство (фиг.1С,Л) включает в себя добавление изоляционной мембраны и увеличение ширины улавливающей мембраны до 2 мм для эффективной иммобилизации одного и того же животного в течение нескольких временных точек.

Для тестирования устройства чистую дистиллированную воду заполняли в микрофлюидные каналы, соединяющие улавливающие мембраны (рисунок 1D, E и дополнительный рисунок 3) и находили под давлением с использованием газообразного азота 14 фунтов на квадратный дюйм, также используемого для отлова животного под мембраной PDMS толщиной 2 мм (рисунок 1H, K, L). Одно животное было выбрано из пластины NGM с помощью микропипетки и загружено в канал потока (рисунок 1F). Канал роста был заполнен бактериями, повторно суспендированными в среде S (рисунок 1F,G,I,J). Постоянный поток поддерживался на протяжении всего периода визуализации путем регулировки высоты среды в наконечниках пипеток, подключенных к входному и выходному отверстию устройства, при одновременном мониторинге животного в канале потока между двумя изоляционными мембранами. Свежеприготовленный раствор OP50 ежедневно заполняли наконечниками микропипетки, чтобы обеспечить здоровый источник пищи для животного внутри микроканала. Свежий источник пищи и газопроницаемый материал PDMS обеспечивают достаточную подачу кислорода внутрь микроканала30,29. Рост животных в устройстве отслеживался с помощью клеточных маркеров или маркеров, которые показывают клеточную линию или переменные паттерны клеточной экспрессии во время развития. Животные были обездвижены под улавливающей мембраной с использованием газообразного азота 14 фунтов на квадратный дюйм и удерживали червей в прямом положении вдоль стенки канала. Животное росло медленнее внутри микрофлюидного канала по сравнению с NGM пластиной23.

Исследование клеточной линии с использованием устройства долгосрочной визуализации: Чтобы оценить развитие C. elegans внутри микрофлюидного устройства, мы вырастили штамм PS3239 (ZMP-1::GFP)32 с постоянным запасом пищи для отслеживания развития вульвы в разные моменты их роста. ZMP-1 кодирует металлопротеазу цинка и экспрессируется в якорной клетке на стадии L3, в клетках vulD и vulE на стадии L4 и в vulA в 1 (1D) день взрослых животных (рисунок 2A). Изменения в паттерне экспрессии представляют собой пример регуляции временных генов, где один и тот же ген экспрессируется в разных клетках на разных стадиях развития. Чтобы наблюдать за развитием вульвы, животное сначала обездвиживали, а затем вульвальную область визуализировали в нескольких плоскостях z каждые 8-10 часов от L3 и далее до взрослых стадий. ZMP-1::GFP экспрессируется в различных клетках вульвы в зависимости от стадии развития (рисунок 2B). Флуоресцентные изображения клеток вульвы с высоким разрешением животных, растущих внутри микрофлюидного устройства, демонстрируют нормальное развитие вульвы, а экспрессия и локализация ZMP-1::GFP аналогичны предыдущим отчетам32.

Отслеживание развития нейронов с помощью устройства долгосрочного роста и визуализации: Чтобы продемонстрировать использование устройства для субклеточной визуализации от отдельного животного, контролировали развитие двух механосенсорных нейронов PVD и TRNs. Штамм NC1686, экспрессирующий wdIs51, который экспрессирует GFP в двух нейронах PVD, был использован34,36. Каждый нейрон PVD показывает менорообразную разветвленную дендритную архитектуру, состоящую из первичных (PP), вторичных (SP), третичных (TP) и четвертичных (QP) процессов на стадиях развития L2 (14-16 ч), поздних L2 (20-22 ч), L3 (24-26 ч) и L4 (36-42 ч) соответственно (рисунок 3). Тело клетки PVD присутствует сзади от вульвы. Он посылает один аксон и два первичных дендритных процесса, которые приводят к SP и TP, которые, в свою очередь, дают начало дендритным ветвям QP, которые иннервируют мышцы стенки тела. Поздние стадии L3 и L4 показывают высокую арборизацию37,34. Мы выращивали одиночных животных NC1686 внутри микрофлюидного устройства и непрерывно кормили их бактериальной пищей. Животные были обездвижены во время L2 до стадии развития 1D, а нейроны PVD неоднократно визуализировались каждые 8-12 ч с использованием 60x, 1,3 NA масляного объектива для подсчета количества ветвей SP, TP и QP в трех измерениях. Степень ветвления увеличивалась во время разработки, как показано на рисунке 3B. Количество SP и QP на разных стадиях развития червя увеличивалось с возрастом (рисунок 4A), как было видно в предыдущих исследованиях37. Животные L2 показали 10 ± 3,8 (n = 9) SP, но без QP при измерении с помощью устройства (рисунок 4A). Мы поместили C. elegans в каплю левамизола 3 мМ, анестетика, который вызывает сокращение мышц стенки тела и паралич, чтобы свести к минимуму неблагоприятное воздействие на транспорт органелл при одновременном уменьшении движений животных и вызывая достаточный паралич, необходимый для визуализации с высоким разрешением 3,4. Значения SP (4 ± 1,6, n = 25, p = 0,15) существенно не отличались при измерении у аналогичных стадийных животных, выращенных на пластинах NGM и изображенных с использованием 3 мМ левамизола на агаровом слайде (рисунок 4B). Данные свидетельствуют о том, что иммобилизация устройства позволяет получать изображения с высоким разрешением сложных нейронных архитектур и не влияет на их развитие. Животные стадии L3 имеют небольшое количество QP, которое увеличивается в количестве с развитием. Взрослые 1D показали 67 ± 2,8 QP (n = 5) у животных, выращенных в устройстве. Предыдущие исследования показали образование, а также втягивание процессов PVD во время развития, известных как самоизбежение, где они уменьшают свои ветви38. Снижение SP через 51 ч (1D) после вылупления может быть результатом таких втягиваний. Животные, растущие на пластинах NGM и изображенные с использованием левамизола 3 мМ, показали аналогичную тенденцию ветвления для сопоставимых стадий развития (рисунок 4A, B). Кроме того, расстояние между двумя телами клеток ПВХ, одно из которых присутствует в хвосте, а второе вблизи вульвы, увеличивается по мере их разъединения у животных, выращенных в устройстве, или животных, выращенных на пластинах NGM (рисунок 4C, D). На протяжении всего процесса визуализации животные оставались здоровыми и могли откладывать яйца даже после того, как животные были многократно обездвижены под мембраной в течение этого длительного периода.

Используя это устройство, мы смогли обездвижить животное в той же ориентации и изобразить идентичный нейрон и его архитектуру с высоким разрешением даже при слабой экспрессии GFP. Чтобы продемонстрировать полезность нашей технологии роста и иммобилизации, развитие TRN от L3 до взрослой особи было сфотографировано с использованием животных jsIs609 (mec-7p::MLS::GFP). Задние ТРН присутствуют на боковой стороне тела и называются PLMR и PLML, что соответствует правой и левой сторонам животного. Мы изобразили тех же животных, растущих в микрофлюидном чипе, и обездвижили их с интервалом 12-14 часов. Монтаж представляет весь нейронный процесс PLMR в последовательных точках времени, выделяя как митохондрии, так и нейронный процесс (рисунок 5A). Общая длина нейронального процесса была рассчитана и обнаружила, что она увеличивается с наклоном 10,4 мкм в час (рисунок 5B). Эта скорость увеличения длины нейронного процесса согласуется с предыдущим отчетом ~10 мкм/ч 18,31,39,40,41. Мы также наблюдали добавление новых митохондрий в процессе роста и изменение положения синаптической точки ветви по отношению к телу клетки, как сообщалось ранее23.

Figure 1
Рисунок 1: Простой микрофлюидный чип для долгосрочного роста и визуализации C. elegans. (A) Проточный слой состоит из микрофлюидного канала длиной 10 мм (рисунок 1) в тонком слое PDMS. (B) Улавливающий слой состоит из иммобилизационного канала толщиной 2 мм и пары тонких изоляционных каналов в объемном слое PDMS. (C) Два слоя PDMS соединены вместе вместе с тонким покровным стеклом для изготовления устройства. (Д, Д) Каналы улавливания и изоляции заполняются деионизированной (DI) водой под сжатым азотом (N2) газом. (F) Синхронизированные по возрасту C. elegans выбираются из пластин NGM и загружаются внутрь проточного слоя устройства. (G) Питание подается с использованием двух наконечников микропипетки на входном и выходном резервуарах. (H) Животные могут свободно перемещаться в пределах двух изоляционных каналов и попадают в ловушку под иммобилизационной мембраной. (I) Изображение устройства роста и визуализации с подачей пищи через два наконечника микропипетки. (Дж, К) Изображения свободно движущегося и обездвиженного C. elegans внутри микрофлюидного канала. Шкала шкалы составляет 1 мм (I) и 200 мкм (J, K). (L) Схема поперечного сечения устройства, показывающая высоту проточного канала (FC), мембраны PDMS (M) и канала управления (CC). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Отслеживание экспрессии маркера вульвы у C. elegans , развивающегося внутри устройства. (A) Схема клеток вульвы, экспрессирующих ZMP-1::GFP у животных PS3239 во время развития. Сигнал GFP появляется в якорной клетке на стадии L3, в клетках vulD и vulE на стадии L4 и в клетках vulA на взрослой стадии 1D. (B) Изображения животных PS3239, растущих внутри микрофлюидного чипа и иммобилизованных каждые 8-10 ч для захвата флуоресцентных изображений экспрессии ZMP-1::GFP во время развития вульвы у взрослого человека L3, L4 и 1 дня (1D). Сокращения: AC = якорная ячейка, A = vulA, D = vulD, E = vulE. Шкала составляет 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Визуализация отдельных wdIs51 C. elegans для отслеживания развития нейронов PVD. (A) Схема роста нейронов PVD и дендритной арборизации от стадии L2 до L4. Зеленым кругом показано тело PVD-ячейки (CB, желтая стрелка). Дендриты показывают возникновение первичных процессов (PP) в L2 как с передней, так и с задней стороны CB, вторичных процессов (SP) во время позднего L2, третичных процессов (TP) в L3 и четвертичных процессов (QP) на стадиях L4. (B) Изображения PVD-нейронов животных, растущих внутри микрофлюидного устройства. (C) Изображения PVD-нейронов животных, выращенных на пластине NGM и обездвиженных левамизолом 3 мМ (Lev). Шкала составляет 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4: Сравнение развития PVD у животных, выращенных в устройстве, и животных, выращенных на пластинах NGM. (A) Среднее количество вторичных процессов (SP) и четвертичных процессов (QP) от одних и тех же животных, растущих внутри микрофлюидного устройства. Значения рассчитываются через 16 ч (L2), 24 ч (L3), 36 ч (ранний L4), 42 ч (поздний L4) и 51 ч (1D взрослый). (B) Среднее количество SP и QP от другой партии животных, растущих на пластинах NGM и обезболенных 3 мМ левамизола. (C) Среднее расстояние между двумя телами нейрональных клеток PVD от одного и того же животного, растущего в микрофлюидном устройстве. (D) Среднее отделение от различных групп животных, растущих на плитах NGM и обезболенных левамизолом 3 мМ. Данные представлены в виде среднего ± SEM (n ≥ 10 для левамизола 3 мМ и n ≥ 6 для устройства иммобилизованных животных). Статистическая значимость рассчитывается односторонним ANOVA и обозначается как p-значение < 0,05 (*), p-значение < 0,005 (**) и p-значение > 0,05 (ns). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 5
Рисунок 5: Визуализация нейронов сенсорных рецепторов (TRN) с высоким разрешением от животных, растущих внутри микрофлюидного устройства. (A) Монтаж нейронных процессов от одного животного, изображенного в разное время. Тело клетки (CB, стрелка), точка синаптического ветвления (BP, наконечник стрелки) и наконечник нейрона (tip, стрелка вверх) помечены. Нейронный процесс и положение каждой митохондрии отслеживаются вручную с помощью Фиджи. Шкала шкалы составляет 10 мкм. (B) Средняя длина нейронального процесса в разных точках времени визуализации. Данные, представленные в виде среднего ± SEM (n = 8). Статистическая значимость рассчитывается с использованием одностороннего ANOVA и обозначается как p-значение < 0,005 (**) и p-значение > 0,05 (ns). Уравнение регрессии соответствует наклону 10,4 мкм удлинения нейронального процесса в час,R2=0,9425. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Дополнительный рисунок 1: Скриншоты настроек микроскопа для флуоресцентной визуализации C. elegans. (A) Панель программного обеспечения для анализа изображений показывает выделенные участки для настройки скорости сканирования, набора фильтров и цели для изображения. (B) Затем программное обеспечение используется для выбора лазера 488 нм с 7% полной мощности лазера. (C) Программное обеспечение для анализа изображений может брать один кадр изображения или серию покадровых изображений и сохранять их для будущего анализа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок 2: Скриншоты программного обеспечения FIJI, показывающие этапы анализа для подсчета PVD-ветвей у животных wdIs51 . (A) Показывает PVD-изображение, открытое в программном обеспечении Fiji ImageJ, и ссылку на плагин счетчика ячеек. (B) Окно счетчика ячеек для инициализации счетчика для изображения. (C) Выбор счетчиков для обозначения включенных ветвей и во избежание многократного подсчета. D) окно результатов, показывающее общее число отделений по каждой категории. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок 3: Схема устройства роста и визуализации. Два наконечника микропипетки, заполненные различными объемами пищевого раствора бактерий (желтого цвета), вставляются во впускные и выпускные перфораторы проточного канала в нижнем слое. Разница в высоте пищевых растворов в наконечниках заставляет раствор течь внутри канала, который, в свою очередь, поставляет бактерии животному для его роста. Каналы улавливания и изоляции (синие) заполняются дистиллированной водой и сжимаются с использованием газообразного азота (установленного на 14 фунтов на квадратный дюйм). Изоляционный канал всегда подключен к 14 psi. Давление на улавливающую мембрану переключается между 0 (животное свободно передвигается и кормится) и 14 фунтов на квадратный дюйм (животное иммобилизуется для визуализации с высоким разрешением) с помощью трехстороннего разъема. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

В данной работе описан протокол изготовления и использования простого микрофлюидного устройства для выращивания C. elegans с постоянным питанием и визуализацией высокого разрешения одного животного во время его развития. Этот процесс изготовления прост и может быть выполнен в нестерильной среде. Беспыльная среда имеет решающее значение на этапах изготовления. Присутствие частиц пыли приведет к неправильному контакту между двумя скрепляющими поверхностями, что приведет к плохому склеиванию и утечке устройства во время применения под высоким давлением, в то время как C. elegans обездвижены . Из всех изготовленных устройств 95% устройств пригодны для экспериментов. Небольшое количество устройств выходит из строя (5%) из-за неправильного склеивания во время изготовления или использования. Отказ в склеивании может быть уменьшен путем проведения процесса изготовления внутри беспыльной (> чистой комнаты на 1000 градусов), доступной в нескольких академических учреждениях по всему миру. Чтобы очистить бактериальную пищу от проточного канала и обеспечить повторное использование устройства, промывайте устройство, пропуская через него спирт после каждого эксперимента.

Протокол демонстрирует процесс изготовления литографии с простой конструкцией, которая может быть легко изменена для различных стадий развития и размеров C. elegans. Кроме того, эта конструкция устройства может быть адаптирована для других модельных организмов, таких как рыбки данио и дрозофилы, путем увеличения размеров потока и захвата слоев3 для наблюдения за различными процессами развития и субклеточными процессами. В этом протоколе две различные высоты канала проточного слоя - 40 мкм и 80 мкм - были использованы для полной иммобилизации и отслеживания клеточных и субклеточных особенностей на разных стадиях развития C. elegans в соответствии с их размерами тела. Например, дендритная арборизация в сенсорных нейронах PVD начинается на ранних стадиях L2 и продолжается до стадии L4. Это было сфотографировано в устройстве с слоем потока высотой 40 мкм. Поскольку нейроны PVD образуют дендриты, которые иннервируют мышцы стенки тела, требуется оптическое сечение для количественной оценки процессов в 3D. Количественный анализ дендритных беседок требует полной иммобилизации животных внутри устройства, соответствующего диаметру тела. Однако для мониторинга развития вульвы для отслеживания линий вульвы использовалась высота слоя потока 80 мкм. Для визуализации длины TRN и митохондрий мы визуализировали стадии от L2 до L4 с помощью устройств с толщиной слоя потока 40 мкм. Использование устройства с неправильной высотой вызовет трудности в иммобилизации. Например, мелкие животные (L2 или ранние стадии L3) внутри устройства высотой слоя потока 80 мкм позволят животным переворачиваться внутри устройства и покажут неполную иммобилизацию даже после того, как улавливающая мембрана находится под давлением 14 фунтов на квадратный дюйм. С другой стороны, животные с большим диаметром тела (за пределами позднего L4) не легко входят внутрь устройства с высотой слоя потока 40 мкм. Отлов крупных животных в небольших устройствах под высоким давлением может повредить их тело. Применение текущего устройства с проточным слоем 40 мкм ограничено и не подходит для визуализации высокого разрешения очень молодых животных ранней личиночной стадии (таких как животные стадии L1 моложе 10 ч после вылупления), поскольку они не полностью обездвижены под мембраной. Из-за небольших размеров тела личиночные животные небольшого размера продолжают двигаться и иногда покидают ловушку, когда они возбуждаются лазерным светом. Для животных стадии L1 можно выполнять яркое полевое или флуоресцентное изображение с низким разрешением, используя объективы 4x или 10x и короткое время экспозиции камеры. В качестве альтернативного подхода потребуется новое устройство проточного слоя высотой < 20 мкм для полной иммобилизации молодых личинок стадии C. elegans.

Отслеживание явлений развития у одного и того же животного в течение длительного периода времени с использованием флуоресцентной визуализации с высоким разрешением может привести к увеличению автофлуоресценции. Каждый покадровый анализ требует оптимизации интенсивности возбуждения, времени воздействия, временного интервала визуализации, времени восстановления животных и качества пищи для физиологически значимой информации о развитии из исследований C. elegans. Мы выбрали > 3-часового временного интервала для исследований развития при использовании животных от стадий L4 и далее. Устройство способно получать более частые изображения (каждые 5-10 мин в течение нескольких часов) или несколько кадров в секунду (в течение < 1 ч) для изучения других динамических процессов, таких как перенос и распределение органелл в нейронах C. elegans 3,23. Улавливание и визуализация ранних стадий развития требуют более тщательного наблюдения, так как повторный отлов с короткими временными интервалами без полного выздоровления может повлиять на их здоровье. В ходе экспериментов было обнаружено, что животные, которым требовалось высокое давление, чтобы переместить их в слой потока, показывают плохое здоровье и большую автофлуоресценцию с течением времени. Животных с высокой флуоресценцией тела, которая, как известно, связана с высоким уровнем стресса, избегали для исследований визуализации. Для поддержания хорошей физиологии животных отлавливали в прямом положении, прилегающем к стенке канала. Обездвиживания животных телом по ширине канала было предотвращено, так как животные заболевают после того, как их тело сжимается под давлением 14 фунтов на квадратный дюйм в этом положении. Чтобы поддерживать хорошее соотношение сигнал/шум во время повторного изображения с масляными объективами, крышка должна быть правильно очищена после каждого момента времени. После особой осторожности в процессе изготовления устройства и его применения одни и те же устройства могут быть повторно использованы в течение нескольких сеансов визуализации.

Это устройство может быть полезно для исследований с использованием мутантов, которые могут быть чувствительны к анестетикам. Представленный подход может устранить неблагоприятное анестезирующее воздействие на рост и физиологию, чтобы облегчить наблюдение морфологических, функциональных и поведенческих дефектов у животных в течение длительного периода. Устройство легко изготавливается и может быть установлено в любой лаборатории для решения долгосрочных биологических вопросов развития / клеток у C. elegans , которые требуют прерывистой визуализации с высоким разрешением.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

S.M. и S.P.K. являются авторами патента на микрофлюидное устройство для роста и визуализации (патентная заявка No 640/CHE/2011).

Acknowledgments

Мы благодарим центр визуализации CIFF, NCBS за использование конфокальных микроскопов, поддерживаемых DST - Центром нанотехнологий (No. SR/55/NM-36-2005). Мы благодарим финансирование исследований от DBT (SPK), CSIR-UGC (JD), DST (SM), DBT (SM), вращающийся диск при поддержке DAE-PRISM 12-R&D-IMS-5.02.0202 (SPK и Gautam Menon) и грант HHMI-IECS номер 55007425 (SPK). Штаммы HB101, PS3239 и wdIs51 были предоставлены Центром генетики Caenorhabditis (CGC), который финансируется Управлением исследовательских инфраструктурных программ NIH (P40 OD010440). S.P.K. сделал jsIs609 в лаборатории Майка Нонета.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
18 G needles Sigma-Aldrich, Bangalore, India Gauge 18
3-way stopcock Cole-Parmer WW-30600-02 Masterflex fitting with luer lock
CCD camera Andor Technology EMCCD C9100-13no
Circuit board film Fine Line Imaging, Colorado, USA The designs are printed with 65,024 dots per inch (DPI)
Convection Oven Meta-Lab Scientific Industries, India MSI-5
Coverslips Blue stat microscopic cover glass 22mm x 10Gms
Ethanol Hi media
Harris uni-core puncher 1mm Qiagen Z708801
Hexamethyldisilazane Sigma-Aldrich, Bangalore, India 440191
Hot plate  IKA RCT B S 22
Isopropanol Fisher Scientific 26895
KOH Fisher Scientific
Laser Scanning Microscope ZEISS LSM 5 LIVE
Micropipette tips Tarsons 0.5-10 µL micropipette tips are used for food supply
Negative Photoresist-1 Microchem SU8-2025 http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm
Negative Photoresist-2 Microchem SU8-2050 http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm
Nitrogen gas Local Supplier Commercial nitrogen gas Cylinder volume of 7 cubic meter
PDMS (Curing solution) Dow Corning Corporation, MI, USA  Sylgard curing solution curing agent
Petri plates Praveen Scientific Corporation
Plasma cleaner Harrick Plasma, NY, USA  PDC-32G
Razor and blades Lister surgical Blade
Silicon Elastomer (Base) Dow Corning Corporation, MI, USA Sylgard 184 base elastomer base
Silicon tubes Fisher Scientific Plastic tubes with the inner diameter 1.59 mm and the outer diameter 3.18 mm
Silicon wafer University Wafer, MA, USA [100] orientation, 4-inch diameter Small pieces (2 mm × 2 mm) were cut from 100 mm diameter wafer
Spin Coater SPS-Europe B.V., The Netherlands SPIN 150
Spinning Disk microscope Perkin Elmer ultra-view VOX system CSU-X1-A3 N The system was equipped with four (405/488/561/640 nm) lasers and controlled with the Volocity software package.
SU8 developer Microchem, MA, USA SU8 Developer
Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane Sigma-Aldrich, Bangalore, India 448931 Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane vapor is toxic
UV lamp Oriel Instruments, Bangalore, India 200 Watt and collimated UV light source
Volocity software Perkin-Elmer Image analysis

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Doitsidou, M., Poole, R. J., Sarin, S., Bigelow, H., Hobert, O. C. elegans Mutant Identification with a One-Step Whole-Genome-Sequencing and SNP Mapping Strategy. PloS One. 5 (11), 15435 (2010).
  2. Hobert, O. Neurogenesis in the nematode Caenorhabditis elegans. WormBook. The C. elegans. Research Community, WormBook. , (2010).
  3. Mondal, S., Ahlawat, S., Rau, K., Venkataraman, V., Koushika, S. P. Imaging in vivo neuronal transport in genetic model organisms using microfluidic devices. Traffic. 12 (4), Copenhagen, Denmark. 372-385 (2011).
  4. Steele, L. M., Sedensky, M. M. Approaches to Anesthetic Mechanisms: The C. elegans Model. Methods in Enzymology. 602, 133-151 (2018).
  5. San-Miguel, A., Lu, H. Microfluidics as a tool for C. elegans research. WormBook. The C. elegans. Research Community, WormBook. , (2013).
  6. Cáceres, I. C., Valmas, N., Hilliard, M. A., Lu, H. Laterally orienting C. elegans using geometry at microscale for high-throughput visual screens in neurodegeneration and neuronal development studies. PloS One. 7 (4), 35037 (2012).
  7. Ai, X., Zhuo, W., Liang, Q., McGrath, P. T., Lu, H. A high-throughput device for size based separation of C. elegans developmental stages. Lab on a Chip. 14 (10), 1746-1752 (2014).
  8. Chung, K., Crane, M. M., Lu, H. Automated on-chip rapid microscopy, phenotyping and sorting of C. elegans. Nature Methods. 5 (7), 637-643 (2008).
  9. Desta, I. T., et al. Detecting and Trapping of a Single C. elegans Worm in a Microfluidic Chip for Automated Microplate Dispensing. SLAS Technology. 22 (4), 431-436 (2017).
  10. Ben-Yakar, A. High-Content and High-Throughput In Vivo Drug Screening Platforms Using Microfluidics. Assay and Drug Development Technologies. 17 (1), 8-13 (2019).
  11. Mondal, S., et al. Large-scale microfluidics providing high-resolution and high-throughput screening of Caenorhabditis elegans poly-glutamine aggregation model. Nature Communications. 7, 13023 (2016).
  12. Fehlauer, H., et al. Using a Microfluidics Device for Mechanical Stimulation and High Resolution Imaging of C. Elegant. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e56530 (2018).
  13. Saberi-Bosari, S., Huayta, J., San-Miguel, A. A microfluidic platform for lifelong high-resolution and high throughput imaging of subtle aging phenotypes in C. elegans. Lab on a Chip. 18 (20), 3090-3100 (2018).
  14. Cornaglia, M., et al. An automated microfluidic platform for C. elegans embryo arraying, phenotyping, and long-term live imaging. Scientific Reports. 5, 10192 (2015).
  15. Suzuki, M., et al. Development of ultra-thin chips for immobilization of Caenorhabditis elegans in microfluidic channels during irradiation and selection of buffer solution to prevent dehydration. Journal of Neuroscience Methods. 306, 32-37 (2018).
  16. Hulme, S. E., et al. Lifespan-on-a-chip: microfluidic chambers for performing lifelong observation of C. elegans. Lab on a Chip. 10 (5), 589-597 (2010).
  17. Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans. Nature Methods. 4 (9), 727-731 (2007).
  18. Lagoy, R. C., Albrecht, D. R. Microfluidic Devices for Behavioral Analysis, Microscopy, and Neuronal Imaging in Caenorhabditis Elegans. Methods in Molecular Biology. 1327, Clifton, N.J. 159-179 (2015).
  19. Levine, E., Lee, K. S. Microfluidic approaches for Caenorhabditis elegans research. Animal Cells and Systems. 24 (6), 311-320 (2020).
  20. Rahman, M., et al. NemaLife chip: a micropillar-based microfluidic culture device optimized for aging studies in crawling C. elegans. Scientific Reports. 10 (1), 16190 (2020).
  21. Allen, P. B., et al. Single-synapse ablation and long-term imaging in live C. elegans. Journal of Neuroscience Methods. 173 (1), 20-26 (2008).
  22. Guo, S. X., et al. Femtosecond laser nanoaxotomy lab-on-a-chip for in vivo nerve regeneration studies. Nature Methods. 5 (6), 531-533 (2008).
  23. Mondal, S., et al. Tracking Mitochondrial Density and Positioning along a Growing Neuronal Process in Individual C. elegans Neuron Using a Long-Term Growth and Imaging Microfluidic Device. eNeuro. 8 (4), (2021).
  24. Keil, W., Kutscher, L. M., Shaham, S., Siggia, E. D. Long-Term High-Resolution Imaging of Developing C. elegans Larvae with Microfluidics. Developmental Cell. 40 (2), 202-214 (2017).
  25. Gritti, N., Kienle, S., Filina, O., Van Zon, J. S. Long-term time-lapse microscopy of C. Elegans post-embryonic development. Nature Communications. 7, 12500 (2016).
  26. Kim, S., et al. A biostable, anti-fouling zwitterionic polyurethane-urea based on PDMS for use in blood-contacting medical devices. Journal of materials chemistry B. 8 (36), 8305-8314 (2020).
  27. Peterson, S. L., McDonald, A., Gourley, P. L., Sasaki, D. Y. Poly(dimethylsiloxane) thin films as biocompatible coatings for microfluidic devices: cell culture and flow studies with glial cells. Journal of Biomedical Materials ResearchPart A. 72 (1), 10-18 (2005).
  28. Folch, A., Toner, M. Cellular micropatterns on biocompatible materials. Biotechnology Progress. 14 (3), 388-392 (1998).
  29. Leclerc, E., Sakai, Y., Fujii, T. Microfluidic PDMS (polydimethylsiloxane) bioreactor for large-scale culture of hepatocytes. Biotechnology Progress. 20 (3), 750-755 (2004).
  30. Mehta, G., et al. Quantitative measurement and control of oxygen levels in microfluidic poly(dimethylsiloxane) bioreactors during cell culture. Biomedical Microdevices. 9 (2), 123-134 (2007).
  31. Palchesko, R. N., Zhang, L., Sun, Y., Feinberg, A. W. Development of polydimethylsiloxane substrates with tunable elastic modulus to study cell mechanobiology in muscle and nerve. PloS One. 7 (12), 51499 (2012).
  32. Inoue, T., et al. Gene expression markers for Caenorhabditis elegans vulval cells. Mechanisms of Development. 119, Suppl 1 203-209 (2002).
  33. Fatouros, C., et al. Inhibition of Tau aggregation in a novel caenorhabditis elegans model of tauopathy mitigates proteotoxicity. Human Molecular Genetics. 21 (16), 3587-3603 (2012).
  34. Smith, C. J., et al. Time-lapse imaging and cell-speci fi c expression pro fi ling reveal dynamic branching and molecular determinants of a multi-dendritic nociceptor in C. elegans. Developmental Biology. 345 (1), 18-33 (2010).
  35. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
  36. Oren-Suissa, M., Hall, D. H., Treinin, M., Shemer, G., Podbilewicz, B. The fusogen EFF-I controls sculpting of mechanosensory dendrites. Science. 328 (5983), New York, N.Y. 1285-1288 (2010).
  37. Smith, C. J., et al. Sensory neuron fates are distinguished by a transcriptional switch that regulates dendrite branch stabilization. Neuron. 79 (2), 266-280 (2013).
  38. Shrestha, B. R., Grueber, W. B. Neuronal morphogenesis: worms get an EFF in dendritic arborization. Current Biology: CB. 20 (16), 673-675 (2010).
  39. Rao, G. N., Kulkarni, S. S., Koushika, S. P., Rau, K. R. In vivo nanosecond laser axotomy: cavitation dynamics and vesicle transport. Optics Express. 16 (13), 9884-9894 (2008).
  40. Sure, G. R., et al. UNC-16/JIP3 and UNC-76/FEZ1 limit the density of mitochondria in C. elegans neurons by maintaining the balance of anterograde and retrograde mitochondrial transport. Scientific Reports. 8 (1), 8938 (2018).
  41. Awasthi, A., et al. Regulated distribution of mitochondria in touch receptor neurons of C. elegans influences touch response. bioRxiv. , (2020).

Tags

Биоинженерия выпуск 182 C. elegans микрофлюидный чип рост на чипе долгосрочная визуализация нейронная визуализация клеточная линия вульвы
Простой микрофлюидный чип для долгосрочного роста и визуализации <em>Caenorhabditis elegans</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dubey, J., Mondal, S., Koushika, S.… More

Dubey, J., Mondal, S., Koushika, S. P. A Simple Microfluidic Chip for Long-Term Growth and Imaging of Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (182), e63136, doi:10.3791/63136 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter