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JoVE Journal Bioengineering
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Bioengineering

Une puce microfluidique simple pour la croissance à long terme et l’imagerie de Caenorhabditis elegans

Published: April 11, 2022 doi: 10.3791/63136
Automatic Translation
1,2,3,4, 1,5, 2
1National Centre for Biological Sciences, TIFR, 2Department of Biological Sciences, TIFR, 3InSTEM, 4Manipal Academy of Higher Education, 5Department of Mechanical Engineering, The University of Texas at Austin

Summary

Le protocole décrit une conception simple de puces microfluidiques et une méthodologie de microfabrication utilisées pour cultiver C. elegans en présence d’un approvisionnement alimentaire continu jusqu’à 36 heures. Le dispositif de croissance et d’imagerie permet également une imagerie intermittente à haute résolution à long terme des processus cellulaires et sous-cellulaires pendant le développement pendant plusieurs jours.

Abstract

Caenorhabditis elegans (C. elegans) s’est avéré être un système modèle précieux pour l’étude des processus biologiques du développement et cellulaires. La compréhension de ces processus biologiques nécessite souvent une imagerie à long terme et répétée du même animal. Les longs temps de récupération associés aux méthodes d’immobilisation conventionnelles effectuées sur des tampons de gélose ont des effets néfastes sur la santé animale, ce qui rend inapproprié l’imagerie répétée du même animal sur de longues périodes. Cet article décrit une conception de puce microfluidique, une méthode de fabrication, un protocole de culture sur puce de C. elegans et trois exemples d’imagerie à long terme pour étudier les processus de développement chez des animaux individuels. La puce, fabriquée avec du polydiméthylsiloxane et collée sur un verre de couverture, immobilise les animaux sur un substrat de verre à l’aide d’une membrane élastomère déviée à l’aide d’azote gazeux. L’immobilisation complète de C. elegans permet une imagerie accélérée robuste des événements cellulaires et subcellulaires sans anesthésie. Une géométrie de canal avec une grande section transversale permet à l’animal de se déplacer librement dans deux membranes d’isolement partiellement scellées permettant la croissance dans le canal avec un approvisionnement continu en nourriture. À l’aide de cette puce simple, l’imagerie de phénomènes de développement tels que la croissance du processus neuronal, le développement vulvaire et l’arborisation dendritique dans les neurones sensoriels PVD, à mesure que l’animal grandit à l’intérieur du canal, peut être effectuée. La puce de croissance et d’imagerie à long terme fonctionne avec une seule conduite de pression, pas de vannes externes, des consommables fluidiques peu coûteux et utilise des protocoles standard de manipulation des vers qui peuvent facilement être adaptés par d’autres laboratoires utilisant C. elegans.

Introduction

Caenorhabditis elegans s’est avéré être un puissant organisme modèle pour étudier la biologie cellulaire, le vieillissement, la biologie du développement et la neurobiologie. Des avantages tels que son corps transparent, son cycle de vie court, son entretien facile, un nombre défini de cellules, son homologie avec plusieurs gènes humains et sa génétique bien étudiée ont permis à C. elegans de devenir un modèle populaire à la fois pour les découvertes en biologie fondamentale et la recherche appliquée 1,2. Comprendre les processus biologiques et développementaux des cellules à partir d’observations répétées à long terme d’animaux individuels peut s’avérer bénéfique. Classiquement, C. elegans est anesthésié sur des tampons de gélose et imagé au microscope. Les effets indésirables des anesthésiques sur la santé des animaux limitent l’utilisation d’animaux anesthésiés pour l’imagerie intermittente à long terme et répétée du même animal 3,4. Les progrès récents des technologies microfluidiques et leur adaptation au piégeage sans anesthésie de C. elegans présentant des risques négligeables pour la santé permettent d’obtenir une imagerie à haute résolution du même animal sur une courte et longue période.

Des puces microfluidiques ont été conçues pour le criblage à haut débit 6,7,8 de C. elegans'5, le piégeage et la distribution9, le criblage de médicaments 10,11, la stimulation neuronale avec imagerie à haute résolution 12 et l’imagerie haute résolution de l’animal 12,13,14. Des feuilles microfluidiques ultra-minces pour l’immobilisation sur lames ont également été développées15. Des études à long terme sur C. elegans ont été réalisées à l’aide d’images à faible résolution d’animaux en culture liquide pour observer la croissance, la dynamique du calcium, les effets des médicaments sur leur comportement16,17,18,19, leur longévité et leur vieillissement20. Des études à long terme utilisant la microscopie à haute résolution ont été menées pour évaluer le développement synaptique21, la régénération neuronale 22 et l’addition mitochondriale23. L’imagerie et le traçage à haute résolution à long terme du devenir et de la différenciation des cellules ont été réalisés dans des dispositifs multicanaux24,25. Plusieurs événements cellulaires et sous-cellulaires se produisent sur des échelles de temps de plusieurs heures et nécessitent de piéger le même individu à différents moments de leur développement pour caractériser toutes les étapes intermédiaires du processus de compréhension de la dynamique cellulaire in vivo. Pour imager des processus biologiques tels que l’organogenèse, le développement neuronal et la migration cellulaire, l’animal doit être immobilisé dans la même orientation à plusieurs moments. Nous avons déjà publié un protocole d’imagerie à haute résolution de C. elegans pendant plus de 36 heures afin de déterminer où les mitochondries sont ajoutées le long des neurones récepteurs tactiles (TRN)23.

Cet article fournit un protocole pour établir une méthodologie basée sur la microfluidique pour l’imagerie répétée à haute résolution. Ce dispositif, avec un seul canal d’écoulement, est le mieux adapté à l’imagerie répétée d’un seul animal par appareil. Pour améliorer le débit et imager plusieurs animaux à la fois, plusieurs appareils pourraient être connectés à la même ligne de pression, mais avec des connecteurs tridirectionnels séparés contrôlant un seul animal dans chaque appareil. La conception est utile pour les études qui nécessitent des images accélérées à haute résolution telles que les processus de développement post-embryonnaire, la migration cellulaire, le transport des organites, les études d’expression génique, etc. La technologie pourrait être limitative pour certaines applications telles que les études sur la durée de vie et le vieillissement qui nécessitent une croissance et une imagerie parallèles de nombreux animaux à un stade avancé. L’élastomère polydiméthylsiloxane (PDMS) a été utilisé pour la fabrication de ce dispositif en raison de sa biostabilité26, de sa biocompatibilité27,28, de sa perméabilité au gazde 29,30 et de son module élastique accordable 31. Ce dispositif à deux couches permet la croissance d’animaux avec un approvisionnement continu en nourriture dans un canal microfluidique et le piégeage de C. elegans individuels via compression membranaire PDMS à l’aide d’azote gazeux. Ce dispositif est une extension du dispositif précédemment publié avec l’avantage de cultiver et d’imager le même animal dans le microcanal sous un approvisionnement alimentaire continu3. Le réseau de membranes d’isolement supplémentaires et une membrane de piégeage de 2 mm de large permettent une immobilisation efficace des animaux en développement. L’appareil a été utilisé pour observer le développement neuronal, le développement vulvaire et l’arborisation dendritique dans les neurones PVD sensoriels. Les animaux grandissent sans effets néfastes sur la santé dans le dispositif et peuvent être immobilisés à plusieurs reprises pour faciliter l’imagerie des événements subcellulaires chez le même animal au cours de son développement.

L’ensemble du protocole est divisé en cinq parties. La partie 1 décrit la fabrication du dispositif pour la puce de croissance et d’imagerie. La partie 2 décrit comment mettre en place un système de pression pour la déviation de la membrane PDMS afin d’immobiliser et d’isoler les individus de C. elegans. La partie 3 décrit comment synchroniser C. elegans sur une plaque de milieu de croissance de nématodes (NGM) pour l’imagerie de dispositifs. La partie 4 décrit comment charger un seul animal dans le dispositif et faire grandir l’animal à l’intérieur du dispositif microfluidique pendant plusieurs jours. La partie 5 décrit comment immobiliser un animal individuel à plusieurs moments, capturer des images haute résolution en utilisant différents objectifs et analyser les images à l’aide de Fidji.

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Protocol

1. Fabrication d’un dispositif de croissance et d’imagerie

  1. Fabrication de moules SU8
    1. Concevez les modèles 1 (couche d’écoulement) et 2 (couche de contrôle) à l’aide de formes rectangulaires dans un logiciel de traitement de texte (ou un logiciel de CAO de conception assistée par ordinateur) et imprimez les photomasques à l’aide d’un traceur laser d’une taille minimale de 8 μm sur un film à base de polyester (Figure 1).
    2. Coupez les plaquettes de silicium en morceaux de 2,5 cm × 2,5 cm et nettoyez-les avec 20% de KOH pendant 1 min. Rincer les gaufrettes dans de l’eau désionisée (DI). Utilisez une plaquette pour le flux et la couche de contrôle.
      ATTENTION : KOH est corrosif et doit être manipulé avec précaution.
    3. Sécher les morceaux avec de l’azote gazeux comprimé de 14 psi suivi d’une déshydratation sur une plaque chauffante à 120 °C pendant 4 h. Avant de passer à l’étape suivante, refroidissez les deux morceaux à température ambiante.
    4. Prenez l’un des morceaux de silicium et placez-le sur le mandrin d’un enrobage et allumez l’aspirateur pour maintenir la plaquette en place. Sur la pièce de silicium, mettez ~20 μL d’hexaméthyldisilane (HMDS) et enduisez-la à l’aide de l’enrobage à 500 rotations par minute (tr/min) pendant 5 s suivies de 3 000 tr/min pendant 30 s.
      ATTENTION : Cette étape doit être effectuée à la lumière jaune. N’utilisez pas de lumière blanche dans la pièce.
    5. Pour obtenir une épaisseur de résine photosensible uniforme de ~40 μm (spécifique à la couche d’écoulement; adaptée à l’imagerie des animaux des premiers stades larvaires 1 à 3 (L1 - L3)), enduisez la plaquette de silicium de ~1,5 mL de photorésine négative-1 à l’aide d’un enduit de spin à 500 tr / min pendant 5 s suivi de 2 000 tr / min pendant 30 s.
    6. Répétez les étapes 1.1.4 et 1.1.5 avec la deuxième plaquette pour obtenir une épaisseur de résine photosensible uniforme de ~40 μm spécifique à la couche de contrôle.
    7. Alternativement, pour augmenter l’épaisseur de la couche d’écoulement à ~80 μm pour les animaux plus âgés, enduisez les plaquettes de silicium avec ~1,5 mL de photorésine négative-2 en utilisant l’enrobage de spin à 500 tr / min pendant 5 s suivi de 2 000 tr / min pendant 30 s. Cette épaisseur convient aux animaux du stade L3 à des animaux adultes.
      ATTENTION: Tenez les plaquettes de silicium par leurs côtés pour éviter d’endommager les couches enduites de spin. Gardez les lumières blanches éteintes pendant cette étape.
    8. Cuire les morceaux de silicium revêtus de résine photosensible (pour les couches d’écoulement et de contrôle) sur une plaque chauffante à 65 °C pendant 1 min, puis 95 °C pendant 10 min. Refroidir les morceaux cuits au four à température ambiante.
      REMARQUE: Les morceaux de silicium cuits peuvent être stockés pendant une journée avant de passer à l’étape suivante. Conserver dans l’obscurité et ne pas exposer à la lumière blanche.
    9. Placez des morceaux de silicium cuits mollement sur la platine d’exposition de l’illuminateur UV avec la surface revêtue de résine photosensible face à la lampe UV. Exposez les deux pièces séparément aux UV pendant 15 s, à l’aide d’une lampe de 200 W, à travers un photomasque avec les motifs 1 et 2 pour obtenir les couches de flux et de contrôle, respectivement.
      ATTENTION : Portez des lunettes de sécurité et évitez l’exposition directe aux rayons UV. N’allumez pas la lumière blanche dans la pièce pendant cette étape.
    10. Cuire les deux morceaux de silicium exposés avec la couche enduite vers le haut, à 65 °C suivie de 95 °C pendant 1 min et 10 min respectivement. Refroidissez les morceaux à température ambiante avant de passer à l’étape suivante.
    11. Développer les motifs en trempant les morceaux de silicium dans la solution de révélateur de résine photosensible (dilution 1:3 du révélateur dans l’isopropanol) pendant 20 min. Une fois le motif visible, rincez les morceaux avec de l’alcool isopropylique pur (IPA) et séchez-les doucement à l’azote gazeux (14 psi).
      ATTENTION : Utilisez un environnement bien ventilé pour ce traitement chimique afin d’éviter l’exposition humaine. Utilisez la lumière blanche uniquement après que les caractéristiques ont été développées et rincées avec de l’IPA.
    12. Gardez les morceaux de silicium dans un dessiccateur avec la surface revêtue vers le haut. Exposez les morceaux aux vapeurs de silane en versant 50 μL de trichloro pur (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane sur un petit gobelet en plastique ou une lame de verre. Placez la tasse / lame à l’intérieur d’un dessiccateur et incuber pendant 2 h.
      ATTENTION : Évitez l’exposition directe à la vapeur de silane. Utilisez toujours une chambre scellée pour le traitement de la vapeur de silane.
      REMARQUE: Si nécessaire, les morceaux de silicium développés peuvent être stockés pendant 1-2 jours avant de passer à l’étape suivante.
  2. Fabrication de puces PDMS
    1. Fabriquez le PDMS dans un gobelet en plastique en mélangeant la base en élastomère avec l’agent de durcissement dans un rapport de 10:1. Bien mélanger le contenu en remuant constamment pendant 3 min. Le mélange créera beaucoup de bulles d’air dans le mélange PDMS.
    2. Dégazez le mélange PDMS dans un dessiccateur pendant 30 minutes pour éliminer toutes les bulles d’air.
      ATTENTION : Assurez-vous que les bulles d’air sont retirées du mélange PDMS avant qu’il ne soit versé sur les fonctionnalités, car les bulles peuvent causer des dispositifs défectueux et non fonctionnels.
    3. Placez les plaquettes de silicium avec la couche de contrôle (motif 2) dans une boîte de Pétri. Versez doucement une couche de mélange PDMS de 5 mm d’épaisseur sur la pièce de silicium en évitant toute formation de bulles.
    4. Dégazez le mélange PDMS dans un dessiccateur pour éliminer les bulles supplémentaires qui se forment pendant le processus de coulée PDMS.
    5. Placez la plaquette de silicium avec couche d’écoulement (modèle 1) sur le mandrin de spinner en appliquant une pression de vide de 200 à 500 mTorr pour maintenir la plaquette. Versez ~1 mL de PDMS sur la plaquette de silicium et enduisez-la à l’aide d’un enrobage à 500 tr/min pendant 5 s suivi de 1 000 tr/min pendant 30 s pour obtenir une couche de ~80 μm d’épaisseur.
    6. Cuire les deux plaquettes de silicium avec le PDMS enduit d’essorage et verser les couches de PDMS à 50 °C dans un four à convection à air chaud pendant 6 h. Après la cuisson, attendez que les morceaux refroidissent à température ambiante.
    7. Coupez la couche PDMS de 5 mm d’épaisseur de la pièce de silicium autour de la couche de contrôle (modèle 2) à l’aide d’une lame tranchante et décollez-la du substrat de silicium.
    8. Poinçonner deux trous de ~1 mm de diamètre à l’aide d’un poinçonneur Harris au réservoir du bloc PDMS pour connecter le canal d’immobilisation et les entrées du canal d’isolement aux conduites de gaz pour les déviations de membrane PDMS.
    9. Placez la pièce de silicium avec la couche PDMS revêtue de spin sur le motif 1 (couche d’écoulement), avec la surface revêtue de PDMS vers le haut, sur un plateau en plastique. Gardez le bloc PDMS perforé avec le motif 2 (couche de contrôle) sur le plateau avec le côté moulé vers le haut.
    10. Gardez le plateau en plastique à l’intérieur d’un nettoyeur plasma et exposez les deux surfaces PDMS à un plasma d’air de 18 W pendant 2 min sous vide doux (200-600 mTorr). Appliquez le vide jusqu’à ce que la chambre devienne violet vif. Effectuez cette étape sous une faible luminosité pour voir la couleur du plasma changer.
    11. Retirez les deux blocs traités au plasma et liez-les doucement en pressant les surfaces traitées au plasma des motifs 1 et 2 ensemble. Cuire les motifs collés à 50 °C pendant 2 h dans un four à convection à air chaud.
    12. Sortez l’appareil collé du four. Découpez le dispositif collé dans une tranche de silicium avec les modèles 1 et 2, et percez des trous dans les réservoirs d’entrée et de sortie de la couche d’écoulement à l’aide du perforateur Harris.
    13. Placez le bloc PDMS collé avec la couche d’écoulement vers le haut sur un plateau en plastique. Gardez un verre de couverture propre (#1.5) sur le même plateau. Exposez les blocs et le verre de couverture à un plasma d’air de 18 W pendant 2 min. Ajustez la pression du vide pour voir une chambre violette.
      REMARQUE: Cette étape doit être effectuée en basse lumière pour voir la couleur du plasma changer. Pour nettoyer le verre de couverture, lavez-le avec de l’IPA et séchez-le à l’azote gazeux à 14 psi.
    14. Placer le bloc PDMS exposé au plasma sur le verre de couverture et cuire la structure collée dans une étuve à 50 °C pendant 2 h. Rangez l’appareil dans une chambre propre pour toute expérience future.

2. Amorçage de membrane PDMS

  1. Prenez l’appareil et mettez-le sur un stéréomicroscope et fixez les tubes. Connectez le tube micro flex (diamètre intérieur ~5 mm, diamètre extérieur ~8 mm) à une conduite d’azote gazeux comprimé à une extrémité. Connectez un connecteur à trois voies à l’autre extrémité. Les tubes 1 et 2 des connecteurs à trois voies seront connectés respectivement au piège et aux membranes isolantes.
  2. Connectez deux tubes micro flex (diamètre intérieur ~1,6 mm, diamètre extérieur ~5 mm) aux deux orifices de sortie du robinet d’arrêt à trois voies. Connectez l’autre extrémité des deux tubes à une aiguille de 18 G de 8 mm de long.
  3. Remplissez la couche d’écoulement avec un tampon M9 à l’aide d’une micropipette à travers l’orifice d’entrée. Remplissez les deux tubes avec de l’eau DI par l’extrémité reliée à l’aiguille. Insérez les deux aiguilles dans les trous perforés, en reliant respectivement la membrane d’isolement et la membrane de piégeage.
  4. Ouvrez le régulateur d’azote gazeux à 14 psi et tournez la vanne à trois voies du tube 1 pour pousser l’eau dans l’appareil à travers les canaux microfluidiques dans les couches de contrôle, à savoir le piège et les membranes d’isolement.
  5. Attendez que l’eau remplisse le canal sans la présence de gouttelettes d’air dans les deux canaux. Une fois que les canaux sont complètement remplis d’eau, les canaux sont considérés comme amorcés.
  6. Relâchez la pression à l’aide du robinet d’arrêt à trois voies une fois que les canaux sont remplis d’eau et amorcés. L’amorçage peut conduire à des bulles dans la couche d’écoulement, éliminer les bulles en faisant circuler des fluides supplémentaires à travers le canal d’écoulement.

3. Maintenance et synchronisation de C. elegans

NOTE: Souches de C. elegans: L’étude a utilisé les transgènes suivants PS3239 (dpy-20(e1282) syIs49 IV [MH86p(dpy-20(+) + pJB100(ZMP-1::GFP)]) pour le développement vulvaire 32, jsIs609 (mec7p::MLS(mitochondrial matrix localization signal)::GFP)33 pour le développement des neurones récepteurs tactiles (TRN) et l’imagerie du transport des mitochondries, et wdIs51(F49H12.4::GFP + unc-119(+)) pour suivre le développement PVD 34. Le protocole de culture et d’entretien standard de C. elegans a été suivi35.

  1. Cultiver C. elegans sur les plaques de Petri du milieu de croissance des nématodes (NGM) avec E. coli OP50 comme source de nourriture à 22 °C. Entretenez les souches de C. elegans en transférant à plusieurs reprises quelques hermaphrodites ou en morcelant une petite quantité de gélose avec quelques animaux dans une nouvelle plaque NGM avec une pelouse OP50.
  2. Après 3-5 jours, vérifiez la plaque NGM pour la croissance des animaux et les œufs de C. elegans. Recueillir et transférer environ 30 œufs d’une assiette vers une assiette NGM fraîche avec pelouse OP50.
  3. Pour synchroniser les animaux à des fins d’imagerie, transférer tous les œufs non éclos de l’assiette toutes les 2 heures dans une assiette fraîche et les maintenir à 22 °C. Environ 15 à 20 œufs éclosent dans chaque assiette.
  4. Cueillir les animaux entre 14-16 h et 28-30 h après l’éclosion pour les stades larvaire 2 (L2) et larvaire 3 (L3), respectivement. Transférer les animaux dans le dispositif microfluidique pour l’imagerie. Ajoutez de la nourriture comme décrit dans la section suivante pour maintenir l’animal à l’intérieur de l’appareil pour une croissance à long terme et des expériences d’imagerie.

4. Croissance de C. elegans à l’intérieur du dispositif microfluidique de croissance et d’imagerie

  1. Montez un dispositif microfluidique de croissance et d’imagerie sur un microscope inversé et observez le modèle 2, après avoir connecté les membranes d’isolement et la membrane d’immobilisation, à faible grossissement (4x ou 10x). Assurez-vous que les canaux sont remplis d’eau distillée propre.
  2. Préparer une solution fraîche de 1 L de milieu S en utilisant 10 mL de citrate de potassium 1 M pH 6,0, 10 mL de solution de métaux traces, 3 mL de 1 M CaCl2, 3 mL de 1 M MgSO4. Préparer la solution dans des conditions stériles. Ne pas autoclaver le milieu S.
  3. Remplir le canal d’écoulement avec un milieu de croissance (milieu S) 10 min avant l’expérience. Évitez les bulles d’air dans le canal d’écoulement. Écoulez du fluide supplémentaire si nécessaire pour éliminer les bulles d’air.
  4. Prélever un seul animal au stade de développement requis dans une plaque de NGM dans 10 μL de milieu S à l’aide d’une micropipette et pousser l’animal dans le canal d’écoulement à travers le trou d’entrée.
  5. Surveillez la position de l’animal dans le canal d’écoulement à l’aide d’un objectif de faible grossissement. Écoulez un fluide supplémentaire à travers l’entrée ou la sortie pour pousser l’animal et positionnez-le dans le canal d’écoulement restreint entre les deux membranes d’isolement.
  6. Ouvrez le robinet d’arrêt à trois voies pour appliquer une pression de 14 psi dans les canaux d’isolement et pousser les membranes vers le bas dans le canal d’écoulement.
    REMARQUE : La membrane scelle partiellement le canal d’écoulement et restreint le mouvement des animaux à la région située entre les deux membranes d’isolement.
  7. Utiliser une seule colonie d’E. coli OP50 dans une plaque striée pour inoculer 250 mL de bouillon L (2,5 g de bacto-tryptone, 1,25 g de levure bacto, 1,25 g de NaCl dansH2O). Cultiver la culture inoculée pendant la nuit à 37 °C.
  8. Aliquote 500 μL de culture OP50 dans des tubes centrifugés stériles de 1,5 mL et conserver le stock et l’aliquote pendant 2 semaines à 4 °C.
  9. Enduire la culture OP50 par centrifugation à 1,3 x g pendant 5 min. Dissoudre la pastille avec 1 mL de milieu S frais (dilution 0,5x) et la conserver à température ambiante pendant 3-4 jours. Utilisez cet OP50 dilué pour nourrir C. elegans à l’intérieur de dispositifs microfluidiques.
  10. Laisser une goutte de milieu S au-dessus des réservoirs d’entrée et de sortie pour réduire l’évaporation du milieu S dans le canal d’écoulement.
  11. Prendre la solution diluée d’OP50 dans une micropipette de 10 μL. Retirez la micropointe remplie de la solution OP50 de la pipette et appuyez sur l’embout dans le réservoir d’admission. Placez ensuite une autre pointe de micropipette avec 10 μL de solution alimentaire et insérez-la dans le réservoir de sortie.
  12. Scellez la tête de pointe en appliquant une pression à l’aide d’un doigt pour assurer la continuité des solutions alimentaires sans entrefer d’air. Changez l’embout de la micropipette avec la solution OP50 tous les jours qui ne datent pas de plus de 3-4 jours.
  13. Remplissez 20 à 30 μL supplémentaires de solution alimentaire dans les deux pointes. Ajouter ou retirer la solution alimentaire à l’extrémité de la micropipette pour ajuster le gradient pour pousser l’animal dans le canal d’écoulement et pour ajuster la position de l’animal sous la membrane de piégeage pour l’imagerie.
  14. Surveillez le flux de bactéries pour vous assurer qu’il est continu à travers les membranes d’isolement partiellement fermées dans le canal d’écoulement à l’aide d’images en fond clair.
    REMARQUE: En l’absence de flux de bactéries, les animaux peuvent manger les bactéries disponibles dans le canal d’écoulement entre les deux membranes d’isolement. En cas d’absence de bactéries ou d’écoulement dans le canal, remplacez les deux embouts de micropipette à l’entrée et à la sortie par de nouveaux embouts de pipette remplis de denrées fraîchement préparées.

5. Immobilisation et imagerie de C. elegans

  1. Immobilisation de C. elegans sous la membrane de piégeage
    1. Localisez un seul animal dans le canal de croissance à faible grossissement. Ajustez les hauteurs de la solution alimentaire dans les deux pointes de micropipettes reliées aux réservoirs d’entrée et de sortie. Poussez l’animal dans la direction requise en utilisant les différences de pression hydrostatique dans le canal d’écoulement.
    2. Placez l’animal au centre de la membrane de piégeage et surveillez son comportement de nage à l’aide d’un objectif de faible grossissement (4x).
    3. Tournez le robinet d’arrêt à trois voies pour augmenter lentement la pression dans le canal de piège. Immobiliser l’animal sous la membrane du piège dans une posture droite le long de la paroi du canal de croissance.
      ATTENTION : Évitez de piéger l’animal à travers le canal d’écoulement en position de courbure Z ou U. Cela provoque une pression accrue sur le corps de l’animal et provoque des dommages permanents à sa santé.
  2. Imagerie et libération de C. elegans à partir de la membrane
    1. Transportez et chargez l’appareil sur une platine de microscope. Installez un microscope inversé aux paramètres d’imagerie souhaités avec tous les composants optiques nécessaires (objectif, source lumineuse, filtres de fluorescence et détecteur) pour un champ lumineux à haute résolution, un contraste d’imagerie différentiel (DIC) ou une imagerie par fluorescence (Figure supplémentaire 1).
    2. Acquérir une ou plusieurs images de fluorescence time-lapse pour capturer les événements cellulaires et subcellulaires.
    3. Acquérir des images de fluorescence des neurones de C. elegans en fonction de leur développement à l’aide d’un objectif 60x, 1,4 ouverture numérique (NA), d’un laser de longueur d’onde de 488 nm avec une puissance laser de 7% à 10%, d’une caméra CCD, sur un microscope à disque rotatif. Effectuez des images accélérées à l’aide du logiciel fourni avec le microscope et obtenez des images à une vitesse de 4 images par seconde (Figure supplémentaire 1).
    4. Après l’acquisition des images, relâchez la pression de piégeage et surveillez la locomotion de l’animal à faible grossissement - 4x et 10x. Garder l’animal restreint dans la région définie par des membranes isolantes (maintenues en dessous de 14 psi tout au long de l’expérience).
    5. Ajustez le volume de solution alimentaire dans les deux pointes de micropipette pour poursuivre un flux alimentaire lent entraîné par gravité dans le canal de croissance. Ce flux alimentaire est obtenu en ajustant les niveaux des solutions alimentaires dans des micropipettes à l’entrée et à la sortie (généralement 1-5 mm de différence de hauteur).
    6. Visualisez l’écoulement sous un champ lumineux à partir du schéma d’écoulement des bactéries dans le canal de croissance.
      REMARQUE: En l’absence de flux, l’animal mange les bactéries OP50 disponibles, le canal semble dégagé et l’animal meurt de faim en quelques heures. Un animal affamé développe généralement une autofluorescence élevée, facilement observable lors de l’acquisition d’images de fluorescence accélérées. De tels événements ont des effets néfastes sur la physiologie animale et ont été évités dans les expériences.
    7. Répétez les étapes 5.2.1 à 5.2.3 après un intervalle de temps prédéterminé pour acquérir des images de fluorescence/CIV/champ clair du même individu à plusieurs points temporels.
    8. Une fois que les images sont acquises à plusieurs points temporels souhaités du même animal, relâchez la pression d’isolement et de piégeage. Rincez le canal avec un tampon M9 et poussez l’animal à travers le réservoir d’entrée. Récupérez l’animal du réservoir et placez-le sur une plaque NGM fraîche pour une surveillance plus poussée de la santé.
    9. Rincez le canal avec un tampon M9 plusieurs fois pour éliminer les bactéries. Rincer le canal d’écoulement avec de l’alcool éthylique à 70% (dilué dans de l’eau distillée). Sécher les canaux en poussant l’air à l’aide d’une seringue. Conservez l’appareil dans un endroit sec et exempt de poussière pour une utilisation répétée à l’avenir.
  3. Analyse d’images et statistiques
    1. Utilisez le logiciel FIJI ImageJ pour l’analyse d’images tiff. Ouvrez les images tiff des images accélérées PVD des animaux wdIs51 dans Fiji ImageJ. Extrayez les meilleurs plans de la pile de z-planes montrant les processus principaux en sélectionnant l’onglet Image > Stacks > Z project.
    2. Examinez toute la série d’images et trouvez des cadres d’images spécifiques qui couvrent avec succès l’ensemble des processus neuronaux en utilisant des sections qui se chevauchent des cadres d’images d’animaux. Sélectionnez Plugin > Analyze > Cell Counter dans la barre d’outils FIJI. Cela ouvrira une fenêtre pour numéroter les différentes branches et garder un compte de chaque neurone sélectionné.
    3. Sélectionnez Initialiser > compteurs > Type1, puis marquez les branches secondaires. Sélectionnez ensuite Type 2 et marquez Quaternaire, cliquez sur Fenêtre Résultats affichant le nombre de toutes les branches (Figure supplémentaire 2). Cette méthode affichera les branches déjà comptées.
    4. Ouvrez l’image qui se chevauche ensuite et comptez les branches restantes. Ce processus permettra d’éviter le double comptage et de s’assurer que chaque processus est compté. Identifier et compter le nombre total de branches primaires présentes dans les premiers stades larvaires de C. elegans. Effectuer une analyse similaire pour les images des processus secondaires et quaternaires chez les animaux plus âgés.
      REMARQUE: Les adultes montrent de nombreux processus qui innervent les muscles de la paroi corporelle et peuvent être difficiles à compter. Assurez-vous que chaque processus n’est compté qu’une seule fois.
    5. Calculer la distance entre les corps cellulaires PVD chez les animaux wdIs51 en traçant une ligne segmentée du corps cellulaire PVD (CB) au PVC CB. Pour les animaux au stade larvaire 4 (L4), les corps cellulaires sont éloignés les uns des autres et ne sont pas dans le même cadre lorsqu’ils sont imagés avec un objectif 60x.
    6. Sélectionnez les images qui se chevauchent dans la pile pour couvrir toute la longueur de l’animal de la tête à la queue à l’aide de l’onglet Image > du projet Piles > Z d’ImageJ. Tracez des lignes segmentées le long du processus neuronal entre les CB PVD et PVC.
    7. Mesurez les longueurs de toutes les lignes segmentées à l’aide d’ImageJ > Analyser > mesurer. Additionnez les longueurs de tous les segments pour calculer la distance totale entre PVD et PVC CB pour chaque point temporel.
    8. Pour la longueur des neurones des NRT chez les animaux jsIs609 , chargez les images aux Fidji. Tracez une ligne segmentée le long des microtubules latéraux postérieurs (PLM; visibles avec la GFP soluble) du corps cellulaire au centroïde de la première mitochondrie. Calculez la longueur de la ligne pour la première valeur de distance.
    9. Tracez une ligne segmentée du centre de la première à la deuxième mitochondrie. Répétez ce processus pour chaque paire de mitochondries jusqu’à la fin de la longueur du processus neuronal. Additionnez toutes les longueurs pour calculer la longueur totale du processus neuronal.
    10. Pour l’analyse de la lignée cellulaire, chargez toutes les images vulvaires aux Fidji et extrayez la meilleure image de mise au point des cellules à partir des images accélérées de plusieurs plans z.
    11. Représenter les données sous forme de moyenne ± d’erreur-type de la moyenne (MEB). Calculer la signification statistique à l’aide d’une ANOVA unidirectionnelle pour plus de deux échantillons ou d’un test t à deux échantillons pour une paire d’échantillons. Indiquer la signification par une valeur de p < 0,05 (*), une valeur de p < 0,005 (**) et une valeur de p > 0,05 (ns, non significatif).

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Representative Results

Caractérisation de l’appareil : Le dispositif de croissance et d’imagerie se compose de deux couches PDMS liées ensemble (Figure 1) à l’aide d’une liaison plasma irréversible. La couche d’écoulement (modèle 1) de 10 mm de longueur et de 40 μm ou 80 μm de hauteur nous permet de cultiver l’animal en culture liquide (Figure 1A). La couche de piégeage (motif 2) a une membrane de 2 mm de large (Figure 1B) pour immobiliser l’animal pour l’imagerie à haute résolution. Le masque pour la couche de piégeage crée également une paire de membranes d’isolement pour restreindre les mouvements des animaux dans une section du canal d’écoulement entre des points temporels d’imagerie successifs. La membrane de piégeage de l’appareil est adaptée de notre précédent appareil d’imagerie3. Le dispositif actuel (figure 1C,L) comprend l’ajout d’une membrane d’isolement et une augmentation de la largeur de la membrane de piégeage à 2 mm pour l’immobilisation efficace du même animal sur plusieurs points temporels.

Pour tester le dispositif, de l’eau distillée propre a été remplie dans les canaux microfluidiques reliant les membranes de piégeage (Figure 1D, E et Figure supplémentaire 3) et pressurisée à l’aide d’azote gazeux de 14 psi, également utilisé pour piéger un animal sous une membrane PDMS de 2 mm d’épaisseur (Figure 1H, K, L). Un seul animal a été prélevé sur une plaque NGM à l’aide d’une micropipette et chargé dans le canal d’écoulement (figure 1F). Le canal de croissance a été rempli de bactéries remises en suspension dans des milieux S (Figure 1F,G,I,J). Un débit constant a été maintenu pendant toute la durée de l’imagerie en ajustant les hauteurs des fluides dans les extrémités des pipettes reliées à l’entrée et à la sortie de l’appareil tout en surveillant l’animal dans le canal d’écoulement entre les deux membranes isolantes. Une solution d’OP50 fraîchement préparée a été remplie quotidiennement dans les pointes de micropipettes pour assurer une source de nourriture saine pour l’animal à l’intérieur du microcanal. La source d’aliments frais et le matériau PDMS perméable aux gaz assurent un apport suffisant en oxygène à l’intérieur du microcanal30,29. La croissance des animaux dans le dispositif a été suivie en utilisant des marqueurs spécifiques à la cellule ou des marqueurs qui montrent la lignée cellulaire ou des modèles d’expression cellulaire variables au cours du développement. Les animaux ont été immobilisés sous la membrane de piégeage à l’aide de 14 psi d’azote gazeux et en maintenant les vers en position droite le long de la paroi du canal. L’animal a grandi plus lentement à l’intérieur du canal microfluidique par rapport à une plaque NGM23.

Étude de la lignée cellulaire à l’aide du dispositif d’imagerie à long terme : Pour évaluer le développement de C. elegans à l’intérieur du dispositif microfluidique, nous avons cultivé la souche32 PS3239 (ZMP-1::GFP) avec un apport alimentaire constant pour suivre le développement de la vulve à différents moments de leur croissance. ZMP-1 code pour une métalloprotéase de zinc et s’exprime dans la cellule d’ancrage au stade L3, dans les cellules vulD et vulE au stade L4 et dans vulA chez les animaux adultes du jour 1 (1D) (Figure 2A). Les changements dans le modèle d’expression représentent un exemple de régulation génique temporelle où le même gène est exprimé dans différentes cellules à différents stades de développement. Pour observer le développement vulvaire, l’animal a d’abord été immobilisé et la région vulvaire a ensuite été imagée sur plusieurs plans z toutes les 8-10 heures à partir de L3 jusqu’aux stades adultes. ZMP-1::GFP est exprimé dans différentes cellules vulvaires selon le stade de développement (Figure 2B). Les images de fluorescence à haute résolution des cellules vulvaires des animaux poussant à l’intérieur du dispositif microfluidique démontrent un développement vulvaire normal et l’expression et la localisation de ZMP-1::GFP sont similaires aux rapports précédents32.

Suivi du développement des neurones à l’aide d’un dispositif de croissance et d’imagerie à long terme: Pour démontrer l’utilisation du dispositif pour l’imagerie sous-cellulaire d’un animal individuel, le développement de deux neurones mécanosensoriels PVD et TRN a été surveillé. La souche NC1686 exprimant wdIs51 qui exprime la GFP dans les deux neurones PVD a été utilisée34,36. Chaque neurone PVD présente une architecture dendritique ramifiée de type menorah comprenant des processus primaires (PP), secondaires (SP), tertiaires (TP) et quaternaires (QP) aux stades de développement L2 (14-16 h), L2 tardif (20-22 h), L3 (24-26 h) et L4 (36-42 h), respectivement (Figure 3). Le corps cellulaire PVD est présent postérieurement à la vulve. Il envoie un axone et deux processus dendritiques primaires qui donnent naissance à SP et TP, qui à leur tour donnent naissance à des branches dendritiques QP qui innervent les muscles de la paroi du corps. Les stades L3 et L4 tardifs montrent une arborisation élevée37,34. Nous avons élevé des animaux NC1686 uniques à l’intérieur du dispositif microfluidique et les avons nourris en continu avec de la nourriture bactérienne. Les animaux ont été immobilisés pendant la L2 jusqu’au stade de développement 1D et les neurones PVD ont été imagés à plusieurs reprises toutes les 8-12 heures en utilisant un objectif d’huile 60x, 1,3 NA pour compter le nombre de branches SP, TP et QP en trois dimensions. L’étendue de la ramification a augmenté au cours du développement, comme le montre la figure 3B. Le nombre de SP et de QP à différents stades de développement du ver augmentait avec l’âge (figure 4A), comme on l’a vu dans des études antérieures37. Les animaux L2 présentaient 10 ± 3,8 (n = 9) SP, mais aucun QP, lorsqu’ils étaient mesurés à l’aide du dispositif (figure 4A). Nous avons placé C. elegans dans une goutte de lévamisole de 3 mM, un anesthésique qui provoque la contraction des muscles de la paroi corporelle et la paralysie, afin de minimiser les effets néfastes sur le transport des organites tout en réduisant les mouvements des animaux et en provoquant une paralysie suffisante, nécessaire pour l’imagerie à haute résolution 3,4. Les valeurs SP (4 ± 1,6, n = 25, p = 0,15) n’étaient pas significativement différentes lorsqu’elles étaient mesurées à partir d’animaux stades similaires élevés sur des plaques de NGM et imagées à l’aide de lévamisole de 3 mM sur une lame de gélose (figure 4B). Les données suggèrent que l’immobilisation du dispositif permet une imagerie à haute résolution d’architectures neuronales complexes et n’affecte pas leur développement. Les animaux au stade L3 ont un petit nombre de QP dont le nombre augmente avec le développement. Les adultes 1D ont montré 67 ± 2,8 QP (n = 5) chez les animaux élevés dans le dispositif. Des études antérieures ont montré la formation ainsi qu’une rétraction des processus PVD au cours du développement connue sous le nom d’auto-évitement, où ils réduisent leurs numéros de branche38. La réduction du SP à 51 h (1D) après l’éclosion pourrait être le résultat de telles rétractions. Les animaux poussant sur des plaques NGM et photographiés à l’aide de lévamisole de 3 mM ont montré une tendance similaire du nombre de ramifications pour des stades de développement comparables (Figure 4A,B). De plus, la distance entre les deux corps cellulaires en PVC, l’un présent dans la queue et le second présent près de la vulve, augmente à mesure qu’ils s’éloignent chez les animaux élevés dans le dispositif ou ceux élevés sur des plaques NGM (Figure 4C,D). Tout au long du processus d’imagerie, les animaux sont restés en bonne santé et ont pu pondre des œufs même après avoir été immobilisés sous la membrane à plusieurs reprises au cours de cette longue période.

En utilisant ce dispositif, nous avons pu immobiliser l’animal dans la même orientation et imager le neurone identique et son architecture avec une haute résolution même avec une faible expression GFP. Pour démontrer l’utilité de notre technologie de croissance et d’immobilisation, le développement des TRN de L3 à adulte a été imagé en utilisant des animaux jsIs609 (mec-7p::MLS::GFP). Les NRT postérieurs sont présents sur le côté latéral du corps et sont nommés PLMR et PLML qui correspondent aux côtés droit et gauche de l’animal. Nous avons imagé les mêmes animaux poussant dans la puce microfluidique et les avons immobilisés à intervalles de 12 à 14 heures. Le montage représente l’ensemble du processus neuronal PLMR à des moments successifs mettant en évidence à la fois les mitochondries et le processus neuronal (Figure 5A). La longueur totale du processus neuronal a été calculée et s’est avérée augmenter avec une pente de 10,4 μm par h (Figure 5B). Ce taux d’augmentation de la longueur du processus neuronal concorde avec un rapport précédent de ~10 μm/h 18,31,39,40,41. Nous avons également observé l’ajout de nouvelles mitochondries dans le processus de croissance et le changement dans la position du point de branche synaptique par rapport au corps cellulaire, comme indiqué précédemment23.

Figure 1
Figure 1 : Une puce microfluidique simple pour la croissance à long terme et l’imagerie de C. elegans. (A) La couche d’écoulement est constituée d’un canal microfluidique de 10 mm de long (modèle 1) dans une fine couche PDMS. (B) La couche de piégeage se compose d’un canal d’immobilisation de 2 mm d’épaisseur et d’une paire de canaux d’isolement minces dans la couche PDMS en vrac. (C) Les deux couches PDMS sont collées ensemble avec un verre de couverture mince pour fabriquer l’appareil. (D, E) Les canaux de contrôle de piégeage et d’isolement sont remplis d’eau désionisée (DI), sous azote comprimé (N2) gazeux. (F) Les C. elegans synchronisés selon l’âge sont prélevés sur des plaques NGM et chargés à l’intérieur de la couche d’écoulement de l’appareil. (G) Les aliments sont fournis à l’aide de deux pointes de micropipettes situées aux réservoirs d’entrée et de sortie. (H) Les animaux sont libres de se déplacer à l’intérieur des deux canaux d’isolement et sont piégés sous la membrane d’immobilisation. (I) Image du dispositif de croissance et d’imagerie avec alimentation en nourriture à travers deux pointes de micropipettes. (J, K) Images d’un C. elegans immobilisé et se déplaçant librement à l’intérieur du canal microfluidique. La barre d’échelle est de 1 mm (I) et 200 μm (J, K). (L) Schéma de la coupe efficace du dispositif montrant les hauteurs du canal d’écoulement (FC), de la membrane PDMS (M) et du canal de commande (CC). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Suivi de l’expression d’un marqueur vulvaire chez C. elegans se développant à l’intérieur du dispositif. (A) Schéma des cellules vulvaires exprimant ZMP-1::GFP chez les animaux PS3239 au cours du développement. Le signal GFP apparaît dans la cellule d’ancrage au stade L3, dans les cellules vulD et vulE au stade L4 et dans les cellules vulA au stade 1D adulte. (B) Images de l’animal PS3239 poussant à l’intérieur de la puce microfluidique et immobilisé toutes les 8-10 heures pour capturer des images de fluorescence de l’expression ZMP-1::GFP pendant le développement vulvaire de L3, L4 et 1 jour (1D) adulte. Abréviations : AC = cellule d’ancrage, A = vulA, D = vulD, E = vulE. La barre d’échelle est de 10 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Imagerie de wdIs51 C. elegans individuel pour suivre le développement neuronal de la MVP. (A) Schéma de la croissance des neurones PVD et de l’arborisation dendritique du stade L2 au stade L4. Le cercle vert montre le corps cellulaire PVD (CB, flèche jaune). Les dendrites montrent l’émergence de processus primaires (PP) à L2 à la fois du côté antérieur et postérieur du CB, de processus secondaires (SP) à la fin de L2, de processus tertiaires (TP) en L3 et de processus quaternaires (QP) au cours des stades L4. (B) Images de neurones PVD provenant d’animaux poussant à l’intérieur d’un dispositif microfluidique. (C) Images de neurones PVD provenant d’animaux élevés sur une plaque NGM et immobilisés avec 3 mM de lévamisole (Lev). La barre d’échelle est de 10 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Comparaison du développement de la MVP chez les animaux cultivés dans des dispositifs et les animaux élevés sur des plaques NGM. (A) Le nombre moyen de processus secondaires (SP) et de processus quaternaires (QP) provenant des mêmes animaux poussant à l’intérieur du dispositif microfluidique. Les valeurs sont calculées à 16 h (L2), 24 h (L3), 36 h (L4 précoce), 42 h (L4 tardive) et 51 h (1D adulte). (B) Le nombre moyen de SP et de QP provenant d’un lot différent d’animaux élevés sur des plaques NGM et anesthésiés avec 3 mM de lévamisole. (C) Séparation moyenne entre les deux corps cellulaires neuronaux PVD du même animal poussant dans le dispositif microfluidique. (D) Séparation moyenne des différents groupes d’animaux poussant sur des plaques NGM et anesthésiés avec 3 mM de lévamisole. Données représentées sous forme de MEB ± moyenne (n ≥ 10 pour le lévamisole 3 mM et n ≥ 6 pour les animaux immobilisés par dispositif). Les significations statistiques sont calculées par ANOVA unidirectionnelle et notées p-value < 0,05 (*), p-value < 0,005 (**) et p-value > 0,05 (ns). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : Imagerie haute résolution des neurones récepteurs tactiles (TRN) provenant d’animaux se développant à l’intérieur du dispositif microfluidique. (A) Montage de processus neuronaux d’un seul animal imagé à différents moments. Le corps cellulaire (CB, flèche), le point de branche synaptique (BP, pointe de flèche) et l’extrémité du neurone (Tip, flèche vers le haut) sont étiquetés. Le processus neuronal et la position de chaque mitochondrie sont tracés manuellement à l’aide de Fidji. La barre d’échelle est de 10 μm. (B) Longueur moyenne du processus neuronal à différents points temporels d’imagerie. Données représentées sous forme de moyenne ± SEM (n = 8). La signification statistique est calculée à l’aide d’une ANOVA unidirectionnelle et notée p-value < 0,005 (**) et p-value > 0,05 (ns). Une équation de régression est ajustée avec une pente de 10,4 μm d’élongation du processus neuronal par heure, R2 = 0,9425. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure supplémentaire 1 : Captures d’écran des réglages du microscope pour l’imagerie par fluorescence de C. elegans. (A) Un panneau du logiciel d’analyse d’images montre les sections en surbrillance pour configurer la vitesse de numérisation, le jeu de filtres et l’objectif pour l’imagerie. (B) Le logiciel est ensuite utilisé pour choisir le laser 488 nm avec 7% de la pleine puissance laser. (C) Le logiciel d’analyse d’images peut prendre une seule image ou une série d’images time-lapse et les stocker pour une analyse ultérieure. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 2 : Captures d’écran du logiciel FIDJI montrant les étapes d’analyse pour compter les branches PVD chez les animaux wdIs51 . (A) Affiche l’image PVD ouverte dans le logiciel Fiji ImageJ et le lien vers le plug-in de compteur de cellules. (B) Fenêtre de compteur de cellules pour initialiser le compteur d’une image. (C) Sélection de compteurs pour marquer les branches incluses et éviter les comptages multiples. (D) Fenêtre Résultats indiquant le nombre total de succursales dans chaque catégorie. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 3 : Schéma du dispositif de croissance et d’imagerie. Deux pointes de micropipette, remplies de différents volumes de solution alimentaire bactérienne (jaune), sont insérées dans les poinçons d’entrée et de sortie du canal d’écoulement dans la couche inférieure. La différence de hauteur des solutions alimentaires dans les pointes fait que la solution s’écoule à l’intérieur du canal, ce qui fournit des bactéries à l’animal pour sa croissance. Les canaux de piégeage et d’isolement (bleu) sont remplis d’eau distillée et comprimés à l’aide d’un apport d’azote gazeux (réglé à 14 psi). Le canal d’isolation est toujours connecté à 14 psi. La pression sur la membrane de piégeage est commutée entre 0 (l’animal est libre de se déplacer et de se nourrir) et 14 psi (l’animal est immobilisé pour l’imagerie haute résolution) à l’aide d’un connecteur à trois voies. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

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Discussion

Dans cet article, un protocole pour la fabrication et l’utilisation d’un dispositif microfluidique simple pour la croissance de C. elegans avec un approvisionnement constant en nourriture et une imagerie à haute résolution d’un seul animal au cours de son développement a été décrit. Ce processus de fabrication est simple et peut être effectué dans un environnement non stérile. Un environnement sans poussière est essentiel pendant les étapes de fabrication. La présence de particules de poussière entraînerait un contact inadéquat entre les deux surfaces de liaison, ce qui entraînerait une mauvaise adhérence et une fuite de l’appareil pendant l’application à haute pression pendant que C. elegans est immobilisé. Sur l’ensemble des appareils fabriqués, 95% sont adaptés à des expériences. Un petit nombre d’appareils tombent en panne (5%) en raison d’un collage inapproprié lors de la fabrication ou de l’utilisation. Les défaillances de collage peuvent être réduites en effectuant le processus de fabrication dans une salle blanche sans poussière (> 1 000 degrés) disponible dans plusieurs établissements universitaires du monde entier. Pour nettoyer les aliments bactériens du canal d’écoulement et permettre la réutilisation de l’appareil, rincez l’appareil en y faisant couler de l’alcool après chaque expérience.

Le protocole démontre un procédé de fabrication lithographique avec une conception simple qui peut facilement être modifiée pour différents stades de développement et tailles de C. elegans. En outre, cette conception de dispositif peut être adaptée à d’autres organismes modèles comme le poisson zèbre et la drosophile, en augmentant les dimensions de l’écoulement et en piégeant les couches3 pour observer une variété de processus développementaux et subcellulaires. Dans ce protocole, deux hauteurs différentes du canal de la couche d’écoulement - 40 μm et 80 μm - ont été utilisées pour l’immobilisation complète et le suivi des caractéristiques cellulaires et subcellulaires à différents stades de développement de C. elegans, en fonction de leur taille corporelle. Par exemple, l’arborisation dendritique dans les neurones sensoriels PVD commence aux premiers stades L2 et se poursuit jusqu’au stade L4. Cela a été imagé dans un appareil avec une couche à haut débit de 40 μm. Comme les neurones PVD forment des dendrites qui innervent les muscles de la paroi corporelle, il faut une coupe optique pour quantifier les processus en 3D. L’analyse quantitative des tonnelles dendritiques nécessite une immobilisation complète des animaux dans l’appareil qui correspond au diamètre du corps. Cependant, pour surveiller le développement vulvaire, une hauteur de 80 μm de la couche d’écoulement a été utilisée pour suivre les lignées vulvaires. Pour l’imagerie de la longueur des NRT et des mitochondries, nous avons imagé les étages L2 à L4 à l’aide de dispositifs avec une épaisseur de couche d’écoulement de 40 μm. L’utilisation d’un appareil avec la mauvaise hauteur entraînera des difficultés d’immobilisation. Par exemple, les petits animaux (L2 ou premiers stades L3) à l’intérieur d’un dispositif de hauteur de couche d’écoulement de 80 μm permettront aux animaux de se retourner à l’intérieur du dispositif et montreront une immobilisation incomplète même après que la membrane de piégeage soit sous une pression de 14 psi. D’autre part, les animaux ayant un grand diamètre de corps (au-delà de la fin de L4) n’entrent pas facilement à l’intérieur d’un appareil avec une hauteur de couche d’écoulement de 40 μm. Le piégeage de gros animaux dans de petits appareils sous haute pression peut endommager leur corps. L’application du dispositif actuel avec une couche d’écoulement de 40 μm est limitée et ne convient pas à l’imagerie à haute résolution de très jeunes animaux au stade larvaire précoce (tels que les animaux au stade L1 moins de 10 h après l’éclosion) car ils ne sont pas complètement immobilisés sous la membrane. En raison de la petite taille du corps, les animaux larvaires de petite taille continuent de bouger et échappent parfois au piège lorsqu’ils sont excités par la lumière laser. Pour les animaux du stade L1, on peut effectuer une imagerie en champ clair ou en fluorescence à basse résolution en utilisant des objectifs 4x ou 10x et des temps d’exposition courts de la caméra. Comme approche alternative, un nouveau dispositif de couche d’écoulement d’une hauteur < 20 μm sera nécessaire pour immobiliser complètement les jeunes larves de stade C. elegans.

Le suivi des phénomènes de développement chez le même animal sur une longue période de temps à l’aide de l’imagerie par fluorescence à haute résolution peut entraîner une augmentation de l’autofluorescence. Chaque essai d’imagerie accéléré nécessite une optimisation de l’intensité d’excitation, du temps d’exposition, de l’intervalle de temps d’imagerie, du temps de récupération des animaux et de la qualité des aliments pour obtenir des informations physiologiquement pertinentes sur le développement provenant des études de C. elegans. Nous avons sélectionné >intervalle de temps de 3 heures pour les études de développement lors de l’utilisation d’animaux à partir des stades L4. L’appareil est capable d’acquérir des images plus fréquentes (toutes les 5-10 minutes pendant quelques heures) ou plusieurs images par seconde (pendant < 1 h) pour étudier d’autres processus dynamiques tels que le transport et la distribution des organites dans les neurones de C. elegans 3,23. Le piégeage et l’imagerie des stades précoces du développement nécessitent une observation plus attentive, car le piégeage répété avec de courts intervalles de temps sans récupération complète peut affecter leur santé. Au cours des expériences, il a été constaté que les animaux qui avaient besoin d’une pression élevée pour les déplacer dans la couche d’écoulement étaient en mauvaise santé et qu’ils étaient plus autofluorescents au fil du temps. Les animaux présentant une fluorescence corporelle élevée, connue pour être associée à un niveau de stress élevé, ont été évités pour les études d’imagerie. Pour maintenir une bonne physiologie, les animaux ont été piégés dans une position droite adjacente à la paroi du canal. L’immobilisation des animaux avec leur corps à travers la largeur du canal a été évitée car les animaux tombent malades après que leur corps est pressé sous une pression de 14 psi dans cette position. Pour maintenir un bon rapport signal/bruit lors d’une imagerie répétée avec des objectifs d’huile, la lamelle de couverture doit être nettoyée correctement après chaque point temporel. Après un soin particulier lors du processus de fabrication de l’appareil et de son application, les mêmes appareils pourraient être réutilisés au cours de plusieurs séances d’imagerie.

Ce dispositif pourrait être utile pour les études utilisant des mutants qui pourraient être sensibles aux anesthésiques. L’approche présentée peut éliminer les effets anesthésiques indésirables sur la croissance et la physiologie pour faciliter l’observation des défauts morphologiques, fonctionnels et comportementaux chez les animaux sur une longue période. Le dispositif est facile à fabriquer et peut être installé dans n’importe quel laboratoire pour répondre aux questions de développement / biologique cellulaire à long terme chez C. elegans qui nécessitent une imagerie intermittente à haute résolution.

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Disclosures

S.M. et S.P.K. sont les auteurs d’un brevet en instance sur le dispositif de croissance microfluidique et d’imagerie (demande numéro de brevet 640/CHE/2011).

Acknowledgments

Nous remercions le centre d’imagerie CIFF, NCBS pour l’utilisation des microscopes confocaux soutenus par le DST - Centre for Nanotechnology (No. SR/55/NM-36-2005). Nous remercions le financement de la recherche de DBT (SPK), CSIR-UGC (JD), DST (SM), DBT (SM), disque rotatif soutenu par DAE-PRISM 12-R&D-IMS-5.02.0202 (SPK et Gautam Menon), et HHMI-IECS grant number 55007425 (SPK). Les souches HB101, PS3239 et wdIs51 ont été fournies par le Caenorhabditis Genetics Center (CGC), financé par le NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440). S.P.K. a fabriqué jsIs609 dans le laboratoire de Mike Nonet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
18 G needles Sigma-Aldrich, Bangalore, India Gauge 18
3-way stopcock Cole-Parmer WW-30600-02 Masterflex fitting with luer lock
CCD camera Andor Technology EMCCD C9100-13no
Circuit board film Fine Line Imaging, Colorado, USA The designs are printed with 65,024 dots per inch (DPI)
Convection Oven Meta-Lab Scientific Industries, India MSI-5
Coverslips Blue stat microscopic cover glass 22mm x 10Gms
Ethanol Hi media
Harris uni-core puncher 1mm Qiagen Z708801
Hexamethyldisilazane Sigma-Aldrich, Bangalore, India 440191
Hot plate  IKA RCT B S 22
Isopropanol Fisher Scientific 26895
KOH Fisher Scientific
Laser Scanning Microscope ZEISS LSM 5 LIVE
Micropipette tips Tarsons 0.5-10 µL micropipette tips are used for food supply
Negative Photoresist-1 Microchem SU8-2025 http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm
Negative Photoresist-2 Microchem SU8-2050 http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm
Nitrogen gas Local Supplier Commercial nitrogen gas Cylinder volume of 7 cubic meter
PDMS (Curing solution) Dow Corning Corporation, MI, USA  Sylgard curing solution curing agent
Petri plates Praveen Scientific Corporation
Plasma cleaner Harrick Plasma, NY, USA  PDC-32G
Razor and blades Lister surgical Blade
Silicon Elastomer (Base) Dow Corning Corporation, MI, USA Sylgard 184 base elastomer base
Silicon tubes Fisher Scientific Plastic tubes with the inner diameter 1.59 mm and the outer diameter 3.18 mm
Silicon wafer University Wafer, MA, USA [100] orientation, 4-inch diameter Small pieces (2 mm × 2 mm) were cut from 100 mm diameter wafer
Spin Coater SPS-Europe B.V., The Netherlands SPIN 150
Spinning Disk microscope Perkin Elmer ultra-view VOX system CSU-X1-A3 N The system was equipped with four (405/488/561/640 nm) lasers and controlled with the Volocity software package.
SU8 developer Microchem, MA, USA SU8 Developer
Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane Sigma-Aldrich, Bangalore, India 448931 Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane vapor is toxic
UV lamp Oriel Instruments, Bangalore, India 200 Watt and collimated UV light source
Volocity software Perkin-Elmer Image analysis

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Bioengineering numéro 182 C. elegans puce microfluidique croissance sur puce imagerie à long terme imagerie neuronale lignée de cellules vulvaires
Une puce microfluidique simple pour la croissance à long terme et l’imagerie de <em>Caenorhabditis elegans</em>
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Dubey, J., Mondal, S., Koushika, S.… More

Dubey, J., Mondal, S., Koushika, S. P. A Simple Microfluidic Chip for Long-Term Growth and Imaging of Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (182), e63136, doi:10.3791/63136 (2022).

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