Summary
여기에서, 우리는 최적의 출력 으로 Drosophila 멜라노가스터 에서 창자 산성화를 감시하기 위한 표준화된 프로토콜을 제시합니다. 먼저 Drosophila 멜라노가스터 에서 장 산성화 모니터링을 위해이 프로토콜을 사용한 다음 비 모델 드로소필라 종에서 의 사용을 입증합니다.
Abstract
과일 플라이 미드구트는 여러 영역으로 구성되어 있으며, 각 영역은 장의 적절한 기능에 필요한 독특한 생리적 기능을 수행하는 세포로 구성됩니다. 이러한 영역 중 하나, 구리 세포 영역(CCR)은 중간 중간구에 국한되고, 부분적으로, 구리 세포로 알려진 세포의 그룹의 구성이다. 구리 세포는 위산 분비, 정확한 역할이 제대로 이해되지 않은 진화적으로 보존된 과정에 관여합니다. 이 논문은 성인 Drosophila 멜라노가스터 장의 산성화를 위해 분석하는 데 사용되는 현재 프로토콜의 개선을 설명하고 파리의 다른 종에 사용할 수 있음을 보여줍니다. 특히, 이 논문은 장내 산성화가 플라이의 영양 상태에 달려 있음을 보여주고 이 새로운 발견에 기초한 프로토콜을 제시한다. 전반적으로, 이 프로토콜은 창자 산성화의 기계장치의 근본적인 일반적인 원리를 밝히기 위하여 Drosophila 구리 세포를 공부의 잠재적인 유용성을 보여줍니다.
Introduction
곤충 창자에서 구리 세포는 포유류 위장의 산 생성 위 정수리 세포 (옥시안틱이라고도 함)와 세포 및 기능적 유사성을 공유합니다. 세포의이 그룹은 장 루멘으로 산을 방출한다. 산 분 비 및 해부학의 기능은 진화적으로 보존됩니다. 배출된 산의 주요 성분은 염산염산과 염화칼륨입니다. 세포에서 산 형성의 화학 메커니즘은 탄산 수화물에 따라 달라집니다. 이 효소는 CO2와 물에서 중탄산염 이온을 생성하여 칼륨을 대가로 양성자 펌프를 통해 루멘으로 배출되는 하이드록실 이온을 해방시합니다. 염화물 및 칼륨 이온은 위 주스의 주요 성분인 염산 및 염화칼륨의 형성을 초래하는 전도성 채널에 의해 루멘으로 운반된다1,2,3,4.
산 형성의 메커니즘은 잘 이해되지만, 산 분비를 조절하는 생리적 메커니즘에 대해서는 훨씬 적습니다. 이 방법을 개발하는 목표는 산 형성과 분비를 조정하고 장 생리학 및 항상성을 중재하는 산의 역할을 결정하는 세포 경로를 더 잘 묘사하는 것입니다. 이 기술의 개발 및 사용 의 근거는 Drosophila 및 비 모델 유기체에서 창자 산성화 과정을 연구하는 일관되고 신뢰할 수있는 방법을 제공하는 것입니다. Drosophila midgut 산성화를 결정하기 위한 표준 프로토콜은 현재 존재하지만2,5,6, 구리 세포 기능을 연구하기 위한 이 프로토콜을 사용하는 동안 야생형(WT)에서 산성화의 범위에서 상당한 가변성이 관찰되었다. 이러한 관찰된 가변성에 대한 기초를 이해하고 일관된 결과를 얻기 위해 표준 프로토콜의 여러 측면이 아래에 설명된 대로 최적화되었습니다.
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Protocol
참고: 표준 실험실 라인 오리건 R은 WT 제어로 사용되었습니다. 모든 파리는 12/12h 빛/다크 서카디아 리듬이 있는 실온에서 표준 옥수수밀 당밀 매체(당밀, 한천, 효모, 옥수수밀, 테고프, 프로피오닉산 및 물을 함유)로 사육했습니다.
1. 분석 준비
- CO2 마취하에 암컷 파리(0-2일, 비처녀)를 수집하고 실험 전에 최소 3일 동안 표준 옥수수가루 식품에서 회수할 수 있도록 합니다.
- 실온에서 ~24시간 동안 날아다니는 것을 ~ 23°C로 살짝 닦아 실험실 닦아 조직을 함유하고 있다.
- 다음과 같이 브로모페놀 블루(BPB)로 플라이 푸드를 준비합니다.
- 플라이 푸드를 전자레인지에 녹인 다음 미지근할 때까지 식힙니다.
- 미지근한 음식 의 1 mL에 4 % BPB의 1 mL을 추가하고 잘 섞습니다.
- 파이프를 사용하여 BPB가 함유 된 플라이 푸드를 페트리 접시 의 중앙에 있는 단일 점 (~200 μL)에 추가합니다.
2. 장내 산성화 모니터링 분석
- 굶주림을 페트리 접시에 2% 브로모페놀 블루(BPB)로 보충한 플라이 푸드의 단일 점(200 μL)이 들어 있는 페트리 접시로 날아갑니다. 파리가 빛에 노출되는 동안 실온에서 4시간 동안 사료를 사료하도록 허용합니다.
- 4 시간 후, 파리를 수집하고 얼음에 마취; 외과적으로 그들의 창 자를 격리.
- 입체 현미경( 재료표 참조)으로 집게를 가진 1x 인산염 완충식염(PBS)에서 수술을 수행합니다. 흉부한 을 집게한 후 두 번째 쌍으로 복부를 당기고 창자의 CCR이 보일 때까지 두 번째 쌍으로 복부를 당기어 창자를 분리하여 창자가 양쪽 끝에 부착되어 있는지 확인하십시오.
- 창자의 CCR의 색상을 검사하여 장의 산성화를 결정합니다(도 1C; 노란색은 산성화된 것을 나타내고, 파란색은 산성화되지 않음을 나타낸다).
- 그들의 창자에 얼룩을 보여주는 그 파리만 계산합니다.
- 다음 방정식을 사용하여 백분율을 계산합니다.
산성화된 내장을 가진 파리의 백분율 = 산성화 된 파리 의 수 × 100 / (산성화 된 파리 수 + 산성화 되지 않은 파리 수)
참고: 0의 백분율은 파리가 장내 산성화되지 않았다는 것을 나타내지만, 100의 백분율은 모든 파리가 자신의 창자를 산성화했음을 나타냅니다.
3. 마운팅 및 이미지 수집
참고: 이 단계는 샘플을 오랫동안 보존할 수 없으므로 추가 분석을 위해 해당 조건에 대한 이미지를 획득하고 처리하는 추가 단계입니다. 이러한 이미지는 장산도 정량화에 사용되지 않습니다.
- 해부에 따라 PBS의 샘플을 유리 슬라이드에 장착합니다.
- 셀센스 엔트리 소프트웨어를 사용하여 현미경으로 이미지를 획득합니다( 재료표 참조).
- 준비된 슬라이드를 현미경 아래에 놓고 접실을 사용하여 샘플을 조정합니다.
- 접피스를 차단하여 카메라의 셔터를 엽니다.
- 연결된 컴퓨터에서 소프트웨어를 엽니다.
- 올바른 목표 렌즈를 선택하고 라이브 버튼을 클릭하고 노출기 시간 조정으로 표준 설정을 선택합니다.
- CCR 영역에 초점을 맞추고 스냅샷을 찍습니다.
- 스냅샷 이미지 창을 마우스 오른쪽 단추로 클릭하고 .tif 파일로 저장합니다.
- 피지 소프트웨어를 사용하여 이미지를 더 정렬하고 처리합니다.
- 피지 소프트웨어에서 .tif 파일을 가져오고 관련이없는 배경을 지웁다.
- 강도와 대비를 조정하여 CCR 및 기타 창자 영역을 최적화합니다.
- 축척 막대를 추가하고 .tif 파일로 저장합니다.
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Representative Results
우리는 오리건 R 여성 파리를 20 시간 이상 굶주린 다음 이전에 설명 한 대로 ~ 12 h의 BPB (2 %)로 보충 된 음식을 먹였습니다7,8,9,10,11. 브로모페놀 블루(BPB)는 pH 감지 염료입니다. pH 3.0에서 파란색으로 pH 4.6 이상으로 변경됩니다. 이전에 보고된 바와 같이, 일부 파리는 창자의 CCR에서 황색으로 표시된 산을 생성하는 것으로 나타났습니다(도 1B). 놀랍게도, 발표 된 결과와는 달리, 일부 파리의 장은 파란색이었다, 그들은 자신의 내장을 산성화하는 데 실패했다는 것을 시사. 이러한 일관되지 않은 결과는 일관되고 해석 가능한 결과를 최적화하기 위해 프로토콜을 수정해야 한다는 것을 나타냈습니다.
BPB 프로토콜을 최적화하기 위해 두 가지 새로운 수정 사항이 통합되었습니다. 첫째, 먹이주기의 발병을 더 잘 제어하기 위해 파리는 굶주린 다음 접시 중앙에 BPB가있는 음식 의 반점에 배치되었습니다 (그림 1A). 둘째, 우리는 먹이주기의 개시에 가까운 시점에서 창자 산성화를 위해 말하기 시작했습니다. 암컷 파리는 >20h에 굶주려 작은 페트리 플레이트 경기장에서 BPB와 함께 플라이 푸드를 제공했으며( 그림 1A 참조), 1시간 간격으로 배짱을 해부하면서 4시간까지 다양한 시간 포인트를 먹을 수 있었습니다. 산성화 용기(노란색) 및 비산성 내장(blue color)의 수가 결정되었고, 장산성화를 나타내는 파리의 비율이 각 시점에 대해 계산되었다(도 1B). 30분 이내에 ~ 20%의 파리가 내장을 산성화했습니다. 한 시간 후, ~40%의 용기는 산성화의 증거를 보였으며, 2h 및 3 h의 먹이 후 산성화된 용기의 비율이 각각 ~60% 및 ~70%로 증가했습니다(그림 1B). 이것은 시간이 지남에 따라 창자 산성화를 보여주는 파리의 비율에 있는 증가가 있다는 것을 나타냅니다. 거의 90-95%의 내장은 파리가 4시간 동안 공급되었을 때 산성화되었습니다(그림 1B). 우리는 후속 실험을 위해 4 h 급유의 최적화 된 프로토콜을 사용했습니다.
먹이기의 효과 외에도, 파리가 장내 산성화에 대해 상승한 온도의 효과를 조사했다. 파리는 23°C 및 30°C에서 사육되었고 암컷 파리는 ~20시간 동안 굶어졌다. 파리는 4시간 동안 BPB로 보충된 플라이 푸드를 공급받았고, 상기와 같이 장내 산성화의 백분율이 결정되었다. 우리는 이 두 온도 (그림 1C)에 대한 장산성화에 차이가 없음을 관찰했으며, 이는 먹이와 달리 온도가 장산성화에 영향을 미치지 않는다는 것을 시사합니다.
비모델 유기체에 대한 장산성화 프로토콜 데모
Drosophilae 종은 식물유전학적으로 수백만 년 동안 분리됩니다 ( 그림 2A 참조). 이 광대 한 기간 동안, 그들은 다른 서식지와 다이어트에 적응 12, 일부 종 D. 멜라노가스터와 같은 방식으로 그들의 창 자를 산성 화 하지 않을 수 있습니다 가능성을 제기. 우리는 D. 멜라노가스터 (과일), D. sechecllia (모린다 과일), D. 발기 (판다누스 과일), D. pseudoosubcura & D. virilis (식물 수액), D . 모자벤시스 (선인장 과일) (그림 2B)를 사용했습니다. 이 프로토콜이 다른 Drosophila 종에 사용할 수 있다는 것을 보여주기 위하여는, 이 종은 4 시간 동안 BPB로 보충된 플라이 음식을 공급하고, 창자 산성화의 백분율은 위에서 설명한 것과 같이 결정되었습니다. 강력한 창자 산성화는 모든 종에 대해 관찰되었다 (그림 2B). 이 결과는 창자의 산성화가 다양한 Drosophila 종 사이에서 진화적으로 보존되고 이 프로토콜이 그밖 유기체를 위해 쉽게 실행될 수 있다는 것을 건의합니다.
그림 1: 배자 산성화 모니터링. (A) 먹이 경기장의 회로도. 파란색 점은 브로모페놀 블루(pH-indicating 염료)가 있는 플라이 푸드를 나타냅니다. 다른 반점은 과일 파리를 나타냅니다. (B) 4시간 이상 다른 지속 시간 동안 직감산화를 나타내는 파리의 비율의 그래픽 표현. 산성화 장과 비산성 창자의 대표적인 창자 이미지. 적색 화살표는 미드구트의 구리 세포 영역에서 산성 방출을 나타냅니다. n = 실험 당 25-30 개의 암컷 파리 4 실험. 스케일 바 = 각각 500 μm. 별표는 대조군(단방향 ANOVA, 본페로니 테스트 다음)*P < 0.05와 는 상당한 차이를 나타낸다. **P < 0.01; P < 0.0001. (C) 파리는 23°C 또는 30°C에서 4시간 동안 BPB로 플라이 푸드를 공급하였다. 장 내 산성화를 나타내는 파리의 백분율(%). n = 4 실험, 실험 당 25-30 여성 파리 (비 파라메트릭 Mann-Whitney U 테스트 및 윌콕슨 랭크 섬 테스트 다음 쌍이 없는 t-테스트. 약어: ns = 중요하지 않습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 장산성화 현상의 필로겐증. (A) 드로소필라 종의 필로유전학적 관계와 그들의 먹이 습관과 서식지. 1mm 막대는 100만 년을 나타냅니다. (B) 장내 산성화를 보여주는 파리(Drosophila 종)의 백분율, BPB로 플라이 푸드를 4시간 n = 4회 실험, 실험당 25-30마리의 암컷 파리(단방향 ANOVA, 본페로니 테스트). 약어: ns = 중요하지 않습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 프로토콜의 중요한 단계는 산성화 표현형에 대한 CCR을 시각화하는 장의 적절한 해부입니다. 구리 세포에서 방출되는 산은 창자가 손상되지 않은 경우 CCR에 국한됩니다. 그러나, 해부 도중, 장의 파열에 기인한 누설은 CCR에서 산의 확산으로 이끌어 내고 산성화를 위한 부정적으로 실수로 득점된 창자 귀착될 수 있습니다. 또한, 산성화를 나타내는 황색은 절제 후 5-10분 이내에 퇴색하며, 격리 직후 산성화 표현형에 대한 장 점수의 중요성을 강조한다. 마지막으로, 현재 의정서7,8,9,10,11플라이 장내 산성화 상태를 분석하는 것은 동물의 먹이 상태를 고려하지 않고 BPB를 가진 플라이 푸드의 보충에 의존한다. 그러나, 우리의 연구 기간 동안, 우리는 창 자의 산성화가 구성되지 않고 오히려 이전 기아 다음 먹이에 의존한다는 것을 것을을 발견했습니다. 이와 같이, BPB를 장 pH의 지표로 사용하여 장의 산 상태를 정확하게 평가하려면 다른 변수와 함께 플라이의 영양 상태를 고려해야 합니다.
창자의 산성화는 더 높은 유기체에 더 낮은 다세포에서 보존됩니다. 그러나, 거의 대부분의 동물에서 그것의 기능 및 그것을 조절 하는 분자 및 세포 경로의 전체 범위에 대 한 알려져 있다. 인간에서, 창 자 산 성화의 부족은 영양소의 흡수 불량과 관련 된, 창 자에 초과 산 장 궤 양 귀 착될 수 있는 동안 13. 따라서, 창 자 산 성 화에 대 한 연구에서 얻은 통찰력 은 산 분 비의 규칙에 결함에 의해 발생 하는 장 질환의 치료 와 치료에 새로운 통찰력을 제공할 가능성이 높습니다.
드로소필라는 최근 장 내 산성화 연구를 위한 강력한 모델로 떠올랐다2,5,6. 유전 연구는 산 분비 세포및 산의 생산에 관여하는 기계의 설치에 필요한 유전자를 확인했습니다. 약물 연구도 수행되었습니다. 예를 들어, 파리가 아세타졸라미드를 공급할 때 장의 산성화가 방지되며, 산성 생산에 필요한 양성자 생산에 CAH가 수행하는 중심적 역할과 일치한다. 우리는 연구원이 신속하고 비용 효율적으로 창자 산도의 약물 억제제 또는 활성화제를 발견 할 수 있도록이 프로토콜을 기대합니다. 또한, 유전적 및 생화학적 접근법과 함께 이 방법의 적용은 산분비에 관여하는 세포 통로를 밝히고 장 및 유기체 항상성에서 장산성화의 역할을 정확히 찾아내는 데 도움이 될 것이다.
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Disclosures
저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
저자는 저자의 실험실에서 작업에 대한 지원이 UT 사우스 웨스턴 의료 센터에서 아동 연구소의 HHMI 교수 학자 상과 시작 기금에 의해 제공된다는 것을 인정합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | B0126 | |
| cellSens software | Olympus | Image aqusition (https://www.olympus-lifescience.com/en/software/cellsens) | |
| D. simulans | Drosophila Species Stock Center at the University of California | Riverside California1 (https://www.drosophilaspecies.com/) | |
| D. erecta | Drosophila Species Stock Center at the University of California | Dere cy1(https://www.drosophilaspecies.com/) | |
| D. pseudoobscura | Drosophila Species Stock Center at the University of California | Eugene, Oregon(https://www.drosophilaspecies.com/) | |
| D. mojavensis | Drosophila Species Stock Center at the University of California | Chocolate Mountains, California (https://www.drosophilaspecies.com/) | |
| Forceps | Inox Biology | Catalog# 11252-20 | |
| Fuji | Fuji | Image processing (https://hpc.nih.gov/apps/Fiji.html) | |
| Glass slide | VWR | Catalog#16005-108 | |
| Kim wipes Tissue | Kimtech | ||
| Microscope and camera | Olympus SZ61 microscope equipped with an Olympus D-27 digital camera | Imaging | |
| Oregon R | Bloomington Drosophila Stock | (https://bdsc.indiana.edu/ # 2376) | |
| Petri dishes | Fisher Scientific | Catalog #FB0875713A | |
| Phosphate-buffered Saline (PBS) | HyClone | Catalog # SH30258.01 | |
| Stereomicroscope | Olympus SZ51 | Visual magnification |
References
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