Summary
Здесь мы представляем стандартизированный протокол мониторинга подкисления кишечника у Drosophila melanogaster с оптимальной производительностью. Сначала мы используем этот протокол для мониторинга подкисления кишечника у Drosophila melanogaster , а затем демонстрируем его использование у немодельных видов Drosophila .
Abstract
Плодовая мошка состоит из нескольких областей, каждая из которых состоит из клеток, выполняющих уникальные физиологические функции, необходимые для правильного функционирования кишечника. Одна из таких областей, область медных ячеек (CCR), локализована в средней средней кишке и состоит, частично, из группы клеток, известных как медные клетки. Медные клетки участвуют в секреции желудочного сока, эволюционно сохраненном процессе, точная роль которого плохо изучена. В этой статье описываются улучшения в текущем протоколе, используемом для анализа на подкисление кишечника взрослой Drosophila melanogaster , и демонстрируется, что его можно использовать на других видах мух. В частности, эта статья демонстрирует, что подкисление кишечника зависит от питательного статуса мухи и представляет протокол, основанный на этом новом открытии. В целом, этот протокол демонстрирует потенциальную полезность изучения медных клеток дрозофилы для выявления общих принципов, лежащих в основе механизмов подкисления кишечника.
Introduction
В кишечнике насекомых медные клетки имеют клеточное и функциональное сходство с кислотообразующими желудочными париетальными клетками (также известными как оксинтические) желудка млекопитающих. Эта группа клеток высвобождает кислоту в просвет кишечника. Функция кислотной секреции и анатомии эволюционно сохраняется. Основными компонентами сбрасываемой кислоты являются соляная кислота и хлорид калия. Химический механизм кислотообразования в клетках зависит от карбоангидразы. Этот фермент генерирует бикарбонат-ион из CO2 и воды, который высвобождает гидроксильный ион, который затем выбрасывается в просвет через протонный насос в обмен на калий. Ионы хлорида и калия транспортируются в просвет по проводящим каналам, в результате чего образуются соляная кислота и хлорид калия, основной компонент желудочного сока1,2,3,4.
Хотя механизмы кислотообразования хорошо изучены, гораздо меньше известно о физиологических механизмах, регулирующих секрецию кислоты. Цель разработки этого метода состоит в том, чтобы помочь лучше очертить клеточные пути, которые координируют образование и секрецию кислоты и определить роль кислоты в опосредовании физиологии кишечника и гомеостаза. Обоснование разработки и использования этого метода заключается в обеспечении последовательного и надежного метода изучения процесса подкисления кишечника у дрозофил и немодельных организмов. Хотя стандартный протокол для определения подкисления средней кишки Drosophila в настоящее время существует 2,5,6, при использовании этого протокола для изучения функции медных клеток наблюдалась значительная вариабельность в степени подкисления у мух дикого типа (WT). Чтобы понять основу этой наблюдаемой изменчивости и получить последовательные результаты, несколько аспектов стандартного протокола были оптимизированы, как описано ниже.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ПРИМЕЧАНИЕ: Стандартная лабораторная линия Oregon R использовалась в качестве контроля WT. Все мухи выращивались на стандартной среде из кукурузной муки и патоки (содержащей патоку, агар, дрожжи, кукурузную муку, тегосепт, пропионовую кислоту и воду) комнатной температуры с 12/12 ч светло-темным циркадным ритмом.
1. Подготовка к анализу
- Соберите самок мух (0-2 дня, не девственницы) под анестезией CO2 и дайте им восстановиться на стандартной кукурузной муке в течение как минимум 3 дней до экспериментов.
- Голодайте мух в течение ~24 ч при комнатной температуре (~23 °C) во флаконах, содержащих лабораторную салфетку, пропитанную ~2 мл деионизированной воды.
- Приготовьте корм для мух с бромфеноловым синим (BPB) следующим образом:
- Растопить пищу для мух в микроволновой печи, а затем дать ей остыть, пока она не станет теплой.
- Добавьте 1 мл 4% BPB к 1 мл теплой пищи и хорошо перемешайте.
- Используя пипетку, добавьте пищу мухи, содержащую BPB, в одну точку (~ 200 мкл) в центре чашки Петри.
2. Анализ мониторинга подкисления кишечника
- Переложите голодающих мух в чашку Петри, содержащую одиночные точки (200 мкл) пищи мух, дополненную 2% бромфенолового синего (BPB). Дайте мухам кормиться в течение 4 часов при комнатной температуре при воздействии света.
- Через 4 ч собрать мух и обезболить их на льду; хирургически изолировать их кишки.
- Выполняют операцию в 1x фосфатно-буферном физиологическом растворе (PBS) щипцами под стереомикроскопом (см. Таблицу материалов). Изолируйте кишечник, удерживая грудную клетку парой щипцов и опуская брюшко второй парой, пока не будет виден CCR кишечника, заботясь о том, чтобы кишечник оставался прикрепленным с обоих концов.
- Определить подкисление кишечника, изучив цвет CCR кишечника (рисунок 1C; желтый указывает на подкисленный, а синий указывает на не подкисленный).
- Подсчитывайте только тех мух, которые показывают сильное окрашивание BPB в своих кишках.
- Рассчитайте процент, используя следующее уравнение:
Процент мух с подкисленными кишками = количество мух, подкисленных × 100 / (количество подкисленных мух + количество мух неподкисленных)
ПРИМЕЧАНИЕ: Процент 0 указывает на то, что ни одна муха не подкисила свой кишечник, тогда как процент 100 указывает на то, что все мухи подкисили свой кишечник.
3. Монтирование и получение образов
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг является дополнительным для получения и обработки изображений для соответствующих условий для дальнейшего анализа, поскольку образцы не могут быть сохранены в течение длительного времени. Эти изображения не используются для количественной оценки кислотности кишечника.
- После вскрытия установите образцы в PBS на стеклянный слайд.
- Получайте изображения под микроскопом с помощью программного обеспечения cellSens Entry (см. Таблицу материалов).
- Поместите подготовленный слайд под микроскоп и отрегулируйте образец с помощью окуляра.
- Отключите окуляр, чтобы открыть затвор камеры.
- Откройте программное обеспечение на подключенном компьютере.
- Выберите правильные объективы, нажмите кнопку live и выберите стандартную настройку с настройкой времени экспозиции.
- Сосредоточьтесь на регионе CCR и сделайте снимок.
- Щелкните правой кнопкой мыши на окне снимка и сохраните его в виде файла .tif.
- Выровняйте и обработайте изображения с помощью программного обеспечения Fiji.
- Импортируйте файл .tif в программное обеспечение Fiji и очистите несвязанный фон.
- Отрегулируйте интенсивность и контрастность, чтобы оптимизировать CCR и другие области кишечника.
- Добавьте шкалу масштабирования и сохраните в виде файла .tif.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Мы голодали самок орегонских R более 20 ч, а затем кормили их пищей, дополненной BPB (2%), в течение ~ 12 ч, как описано ранее7,8,9,10,11. Бромфенол синий (BPB) является pH-чувствительным красителем. Он изменяется от желтого при рН 3,0 до синего при рН 4,6 и выше. После рассечения кишечника, как сообщалось ранее, было обнаружено, что некоторые мухи производят кислоту, на что указывает желтый цвет в CCR кишечника (рисунок 1B). Удивительно, но в отличие от опубликованных результатов, кишечник некоторых мух был синим, предполагая, что они не смогли подкислить свои кишки. Эти противоречивые результаты указывают на то, что протокол необходимо модифицировать для оптимизации для получения последовательных и интерпретируемых результатов.
Для оптимизации протокола BPB были включены две новые модификации. Во-первых, чтобы лучше контролировать начало кормления, мух морили голодом, а затем помещали на пятна пищи с БПБ в центре тарелки (рисунок 1А). Во-вторых, мы начали анализ на подкисление кишечника в моменты времени, приближающиеся к началу кормления. Самок мух морили голодом в течение >20 ч, обеспечивали муху пищей BPB в небольшой арене с пластинами Петри (см. Рисунок 1А) и позволяли питаться в течение различных временных точек до 4 ч, рассекая кишки с интервалом в 1 ч. Было определено количество подкисленных кишок (желтый цвет) и неподкисленных кишок (синий цвет), а процент мух, показывающих подкисление кишечника, был рассчитан для каждой точки времени (рисунок 1B). В течение 30 минут ~ 20% мух подкисили кишечник. Через час ~ 40% кишок показали признаки подкисления, в то время как после 2 ч и 3 ч кормления процент подкисленных кишок увеличился до ~60% и ~70% соответственно (Рисунок 1B). Это указывает на то, что со временем наблюдается увеличение процента мух, демонстрирующих подкисление кишечника. Почти 90-95% кишок были подкислены, когда мух кормили в течение 4 ч (рисунок 1B). Мы использовали этот оптимизированный протокол 4-часового кормления для последующих экспериментов.
Помимо эффекта кормления, изучалось влияние температуры, при которой поднимались мухи, на подкисление кишечника. Мухи выращивались при 23 ° C и 30 ° C, а самки мух голодали в течение ~ 20 часов. Затем мух кормили кормом для мух, дополненным BPB в течение 4 часов, и процент подкисления кишечника определяли, как описано выше. Мы не наблюдали различий в подкислении кишечника для этих двух температур (рисунок 1C), предполагая, что температура, в отличие от кормления, не влияет на подкисление кишечника.
Демонстрация протокола подкисления кишечника для организмов, не относящихся к модели
Виды Drosophilae филогенетически разделены в течение миллионов лет (см. Рисунок 2A). За этот обширный период они адаптировались к различным местам обитания и диетам12, что повышает вероятность того, что некоторые виды могут не подкислять свой кишечник таким же образом, как D. melanogaster. Мы использовали D. melanogaster (фрукты), D. sechecllia (плод моринды), D. erecta (плоды пандануса), D. pseudoosubcura & D. virilis (растительный сок) и D. mojavensis (плоды кактуса) (рисунок 2B). Чтобы продемонстрировать, что этот протокол может быть использован для других видов дрозофил, эти виды кормили продуктами мух, дополненными BPB в течение 4 часов, и процент подкисления кишечника определяли, как описано выше. Сильное подкисление кишечника наблюдалось для всех протестированных видов (рисунок 2В). Этот результат говорит о том, что подкисление кишечника эволюционно сохраняется среди различных видов дрозофил и что этот протокол может быть легко реализован для других организмов.
Рисунок 1: Мониторинг подкисления кишечника. (А) Схематический рисунок кормовой арены. Синяя точка представляет пищу мух с бромфеноловым синим (краситель, указывающий на рН). Другие пятна представляют плодовых мушек. (B) Графическое представление процентной доли мух, показывающих подкисление кишечника в течение различных периодов свыше 4 ч. Репрезентативные изображения кишечника подкисленного кишечника и неподкисленного кишечника. Красная стрелка указывает на кислотное высвобождение в области медной ячейки средней кишки. n = 4 эксперимента, 25-30 самок мух за эксперимент. Шкала = 500 мкм каждая. Звездочки указывают на существенные отличия от контрольной группы (односторонняя ANOVA, за которой следует тест Бонферрони) *P < 0,05; **P < 0,01; P < 0,0001. (C) Мух кормили кормом для мух С БПБ в течение 4 ч при 23 °C или 30 °C. Процентное содержание (%) мух, демонстрирующих подкисление кишечника. n = 4 эксперимента, 25-30 самок мух за эксперимент (непарный t-тест с последующим непараметрическим тестом Манна-Уитни U и тестом Уилкоксона с ранговой суммой. Аббревиатура: ns = не значимый. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Филогения феномена подкисления кишечника. (А) Филогенетическая связь видов дрозофил вместе с их привычкой питания и средой обитания. 1 мм бар означает 1 миллион лет. (B) Процент мух (видов Drosophila ), показывающих подкисление кишечника, которых кормили кормом для мух BPB в течение 4 ч. n = 4 эксперимента, 25-30 самок мух за эксперимент (односторонний ANOVA, с последующим тестом Бонферрони). Аббревиатура: ns = не значимый. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Критическим шагом в этом протоколе является правильное рассечение кишечника для визуализации CCR для фенотипа подкисления. Кислота, высвобождаемая из медных клеток, ограничена CCR, когда кишечник неповрежден. Однако во время рассечения утечка, вызванная разрывом кишечника, может привести к диффузии кислоты из CCR и привести к тому, что кишечник ошибочно оценивается как отрицательный для подкисления. Кроме того, желтый цвет, указывающий на подкисление, исчезает в течение 5-10 мин после рассечения, подчеркивая важность оценки кишечника для фенотипа подкисления вскоре после выделения. Наконец, текущие протоколы7,8,9,10,11, которые анализируют состояние подкисления в кишечнике мухи, полагаются на добавление пищи мухи с BPB, без учета статуса кормления животных. Однако во время наших исследований мы обнаружили, что подкисление кишечника не было конститутивным, а скорее зависело от кормления после предшествующего голодания. Таким образом, точная оценка кислотного состояния кишечника с использованием BPB в качестве индикатора рН кишечника требует рассмотрения состояния питания мухи наряду с любыми другими рассматриваемыми переменными.
Подкисление кишечника сохраняется от низших многоклеточных к высшим организмам. Тем не менее, мало что известно о его функции у большинства животных и полной степени молекулярных и клеточных путей, которые его регулируют. У людей недостаток подкисления кишечника связан с мальабсорбцией питательных веществ, в то время как избыток кислоты в кишечнике может привести к язвам кишечника13. Таким образом, идеи, полученные в результате исследований подкисления кишечника, вероятно, дадут новое представление о лечении и излечении кишечных заболеваний, вызванных дефектами в регуляции секреции кислоты.
Дрозофила недавно стала мощной моделью для изучения подкисления кишечника2,5,6. Генетические исследования выявили гены, необходимые для создания кислотосекретирующих клеток и механизмов, участвующих в производстве кислоты. Также были проведены исследования лекарственных средств. Например, подкисление кишечника предотвращается, когда мухи получают ацетазоламид, ингибитор карбоангидразы (CAH)7, что согласуется с центральной ролью, которую CAH играет в производстве протонов, необходимых для производства кислоты. Мы ожидаем, что этот протокол поможет исследователям быстро и экономически эффективно обнаружить лекарственные ингибиторы или активаторы кислотности кишечника. Кроме того, применение этого метода в сочетании с генетическим и биохимическим подходами поможет раскрыть клеточные пути, участвующие в секреции кислоты, и точно определить роль подкисления кишечника в кишечном и организменном гомеостазе.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
У авторов нет конфликта интересов для раскрытия.
Acknowledgments
Авторы признают, что поддержку работе в авторской лаборатории оказывают премия HHMI Faculty Scholar Award и стартовые фонды Детского научно-исследовательского института при Юго-западном медицинском центре UT.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | B0126 | |
| cellSens software | Olympus | Image aqusition (https://www.olympus-lifescience.com/en/software/cellsens) | |
| D. simulans | Drosophila Species Stock Center at the University of California | Riverside California1 (https://www.drosophilaspecies.com/) | |
| D. erecta | Drosophila Species Stock Center at the University of California | Dere cy1(https://www.drosophilaspecies.com/) | |
| D. pseudoobscura | Drosophila Species Stock Center at the University of California | Eugene, Oregon(https://www.drosophilaspecies.com/) | |
| D. mojavensis | Drosophila Species Stock Center at the University of California | Chocolate Mountains, California (https://www.drosophilaspecies.com/) | |
| Forceps | Inox Biology | Catalog# 11252-20 | |
| Fuji | Fuji | Image processing (https://hpc.nih.gov/apps/Fiji.html) | |
| Glass slide | VWR | Catalog#16005-108 | |
| Kim wipes Tissue | Kimtech | ||
| Microscope and camera | Olympus SZ61 microscope equipped with an Olympus D-27 digital camera | Imaging | |
| Oregon R | Bloomington Drosophila Stock | (https://bdsc.indiana.edu/ # 2376) | |
| Petri dishes | Fisher Scientific | Catalog #FB0875713A | |
| Phosphate-buffered Saline (PBS) | HyClone | Catalog # SH30258.01 | |
| Stereomicroscope | Olympus SZ51 | Visual magnification |
References
- Hollander, F. The composition and mechanism of formation of gastric acid secretion. Science. 110 (2846), 57-63 (1949).
- Forte, J. G., Zhu, L. Apical recycling of the gastric parietal cell H, K-ATPase. Annual Review of Physiology. 72, 273-296 (2010).
- Samuelson, L. C., Hinkle, K. L. Insights into the regulation of gastric acid secretion through analysis of genetically engineered mice. Annual Review of Physiology. 65, 383-400 (2003).
- Yao, X., Forte, J. G. Cell biology of acid secretion by the parietal cell. Annual Review of Physiology. 65, 103-131 (2003).
- Driver, I., Ohlstein, B. Specification of regional intestinal stem cell identity during Drosophila metamorphosis. Development. 141 (9), 1848-1856 (2014).
- Overend,, et al. Molecular mechanism and functional significance of acid generation in the Drosophila midgut. Scientific Reports. 6, 27242 (2016).
- Shanbhag, S., Tripathi, S. Epithelial ultrastructure and cellular mechanisms of acid and base transport in the Drosophila midgut. Journal of Experimental Biology. 212, Pt 11 1731-1744 (2009).
- Dubreuil, R. R. Copper cells and stomach acid secretion in the Drosophila midgut. International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 36 (5), 745-752 (2004).
- Martorell,, et al. Conserved mechanisms of tumorigenesis in the Drosophila adult midgut. PLoS ONE. 9 (2), 88413 (2014).
- Strand, M., Micchelli, C. A. Regional control of Drosophila gut stem cell proliferation: EGF establishes GSSC proliferative set point & controls emergence from quiescence. PLoS One. 8 (11), 80608 (2013).
- Storelli, G., et al. Drosophila perpetuates nutritional mutualism by promoting the fitness of its intestinal symbiont Lactobacillus plantarum. Cell Metabolism. 27 (2), 362-377 (2018).
- Abu, F., et al. Communicating the nutritional value of sugar in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (12), 2829-2838 (2018).
- Blecker, U., Gold, B. D. Gastritis and ulcer disease in childhood. European Journal of Pediatrics. 158 (7), 541-546 (1999).
