Summary
Ici, nous présentons un protocole standardisé pour surveiller l’acidification intestinale chez Drosophila melanogaster avec un rendement optimal. Nous utilisons d’abord ce protocole pour la surveillance de l’acidification intestinale chez Drosophila melanogaster , puis démontrons son utilisation chez les espèces de drosophila non modèles.
Abstract
L’intestin moyen de la mouche des fruits se compose de plusieurs régions, chacune composée de cellules qui remplissent des fonctions physiologiques uniques nécessaires au bon fonctionnement de l’intestin. L’une de ces régions, la région des cellules de cuivre (CCR), est localisée dans l’intestin moyen et se compose, en partie, d’un groupe de cellules appelées cellules de cuivre. Les cellules de cuivre sont impliquées dans la sécrétion d’acide gastrique, un processus conservé de manière évolutive dont le rôle précis est mal compris. Cet article décrit les améliorations apportées au protocole actuel utilisé pour tester l’acidification de l’intestin adulte de Drosophila melanogaster et démontre qu’il peut être utilisé sur d’autres espèces de mouches. En particulier, cet article démontre que l’acidification intestinale dépend de l’état nutritionnel de la mouche et présente un protocole basé sur cette nouvelle découverte. Dans l’ensemble, ce protocole démontre l’utilité potentielle de l’étude des cellules de cuivre de la drosophile pour découvrir les principes généraux sous-jacents aux mécanismes de l’acidification intestinale.
Introduction
Dans l’intestin de l’insecte, les cellules de cuivre partagent des similitudes cellulaires et fonctionnelles avec les cellules pariétales gastriques productrices d’acide (également appelées oxyntiques) de l’estomac des mammifères. Ce groupe de cellules libère de l’acide dans la lumière intestinale. La fonction de la sécrétion acide et de l’anatomie est conservée de manière évolutive. Les principaux composants de l’acide rejeté sont l’acide chlorhydrique et le chlorure de potassium. Le mécanisme chimique de formation d’acide dans les cellules dépend de l’anhydrase carbonique. Cette enzyme génère un ion bicarbonate à partir du CO2 et de l’eau, qui libère un ion hydroxyle qui est ensuite rejeté dans la lumière par une pompe à protons en échange de potassium. Les ions chlorure et potassium sont transportés dans la lumière par des canaux de conductance entraînant la formation d’acide chlorhydrique et de chlorure de potassium, le composant principal du suc gastrique1,2,3,4.
Bien que les mécanismes de formation d’acide soient bien compris, on en sait beaucoup moins sur les mécanismes physiologiques qui régulent la sécrétion d’acide. L’objectif du développement de cette méthode est d’aider à mieux délimiter les voies cellulaires qui coordonnent la formation et la sécrétion d’acide et de déterminer le rôle de l’acide dans la médiation de la physiologie intestinale et de l’homéostasie. La raison d’être du développement et de l’utilisation de cette technique est de fournir une méthode cohérente et fiable pour étudier le processus d’acidification intestinale chez la drosophile et les organismes non modèles. Bien qu’il existe actuellement un protocole standard pour déterminer l’acidification de l’intestin moyen de la drosophile2,5,6, une variabilité significative a été observée dans l’étendue de l’acidification chez les mouches de type sauvage (WT) lors de l’utilisation de ce protocole pour étudier la fonction des cellules de cuivre. Pour comprendre la base de cette variabilité observée et obtenir des résultats cohérents, plusieurs aspects du protocole standard ont été optimisés comme décrit ci-dessous.
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Protocol
REMARQUE: La ligne de laboratoire standard Oregon R a été utilisée comme contrôle WT. Toutes les mouches ont été élevées sur un milieu standard de semoule de maïs et de mélasse (contenant de la mélasse, de la gélose, de la levure, de la semoule de maïs, du tegosept, de l’acide propionique et de l’eau) à température ambiante avec un rythme circadien clair/foncé de 12/12 h.
1. Préparation au test
- Recueillir les mouches femelles (âgées de 0 à 2 jours, non vierges) sous anesthésie au CO2 et leur permettre de récupérer sur la semoule de maïs standard pendant au moins 3 jours avant les expériences.
- Affamer les mouches pendant environ 24 h à température ambiante (~ 23 ° C) dans des flacons contenant un tissu de lingette de laboratoire imbibé d’environ 2 mL d’eau désionisée.
- Préparez la nourriture pour mouches avec du bleu de bromophénol (BPB) comme suit:
- Faites fondre la nourriture pour mouches au micro-ondes, puis laissez-la refroidir jusqu’à ce qu’elle soit tiède.
- Ajouter 1 mL de BPB à 4 mL d’aliments tièdes et bien mélanger.
- À l’aide d’une pipette, ajoutez la nourriture pour mouches contenant du BPB en un seul point (~ 200 μL) au centre d’une boîte de Pétri.
2. Test de surveillance de l’acidification intestinale
- Transférer les mouches affamées dans une boîte de Pétri contenant des points simples (200 μL) de nourriture pour mouches complétée par 2% de bleu de bromophénol (BPB). Laissez les mouches se nourrir pendant 4 h à température ambiante lorsqu’elles sont exposées à la lumière.
- Après 4 h, ramasser les mouches et les anesthésier sur de la glace; isoler chirurgicalement leurs intestins.
- Effectuer la chirurgie dans 1x solution saline tamponnée au phosphate (PBS) avec pince sous stéréomicroscope (voir la table des matériaux). Isolez l’intestin en tenant le thorax avec une paire de pinces et en tirant vers le bas l’abdomen avec une deuxième paire jusqu’à ce que le CCR de l’intestin soit visible, en prenant soin de s’assurer que l’intestin reste attaché aux deux extrémités.
- Déterminer l’acidification de l’intestin en examinant la couleur du CCR de l’intestin (Figure 1C; jaune indique acidifié et bleu indique non acidifié).
- Ne comptez que les mouches qui présentent une coloration BPB robuste dans leurs intestins.
- Calculez le pourcentage à l’aide de l’équation suivante :
Pourcentage de mouches avec des intestins acidifiés = nombre de mouches acidifiées × 100 / (nombre de mouches acidifiées + nombre de mouches non acidifiées)
REMARQUE: Un pourcentage de 0 indique qu’aucune mouche n’a acidifié son intestin, tandis qu’un pourcentage de 100 indique que toutes les mouches ont acidifié leur intestin.
3. Montage et acquisition d’images
REMARQUE: Cette étape est supplémentaire pour acquérir et traiter des images pour les conditions respectives pour des analyses ultérieures car les échantillons ne peuvent pas être conservés longtemps. Ces images ne sont pas utilisées pour la quantification de l’acidité intestinale.
- Après la dissection, montez les échantillons en PBS sur une lame de verre.
- Acquérez les images au microscope à l’aide du logiciel cellSens Entry (voir le Tableau des matériaux).
- Placez la lame préparée sous le microscope et ajustez l’échantillon à l’aide de l’oculaire.
- Éteignez l’oculaire pour ouvrir l’obturateur de l’appareil photo.
- Ouvrez le logiciel sur l’ordinateur connecté.
- Choisissez les objectifs appropriés, cliquez sur le bouton en direct et sélectionnez le réglage standard avec réglage de l’heure de l’exposition.
- Concentrez-vous sur la région ccrculeuse et prenez l’instantané.
- Cliquez avec le bouton droit de la souris sur la fenêtre de l’image instantanée et enregistrez-la en tant que fichier .tif.
- Alignez et traitez les images à l’aide du logiciel Fidji.
- Importez le fichier .tif dans le logiciel Fidji et effacez l’arrière-plan non lié.
- Ajustez l’intensité et le contraste pour optimiser le CCR et d’autres régions intestinales.
- Ajoutez la barre d’échelle et enregistrez-la en tant que fichier .tif.
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Representative Results
Nous avons affamé les mouches femelles oregon R pendant plus de 20 heures, puis nous les avons nourries avec de la nourriture supplémentée en BPB (2%) pendant environ 12 heures, comme décrit précédemment7,8,9,10,11. Le bleu de bromophénol (BPB) est un colorant qui détecte le pH. Il passe du jaune à un pH de 3,0 au bleu à un pH de 4,6 et plus. Après la dissection intestinale, comme indiqué précédemment, certaines mouches ont produit de l’acide, comme l’indique la couleur jaune dans le CCR de l’intestin (figure 1B). Étonnamment, contrairement aux résultats publiés, les intestins de certaines mouches étaient bleus, ce qui suggère qu’elles n’avaient pas réussi à acidifier leurs intestins. Ces résultats incohérents indiquaient que le protocole devait être modifié pour optimiser les résultats de manière à ce qu’il soit cohérent et interprétable.
Pour optimiser le protocole BPB, deux nouvelles modifications ont été incorporées. Tout d’abord, pour mieux contrôler le début de l’alimentation, les mouches ont été affamées puis placées sur des taches de nourriture avec du BPB au centre d’une assiette (Figure 1A). Deuxièmement, nous avons commencé à tester l’acidification intestinale à des moments plus proches du début de l’alimentation. Les mouches femelles ont été affamées pendant >20 h, ont fourni de la nourriture pour mouches avec DU BPB dans une petite arène de plaques de Petri (voir la figure 1A) et ont été autorisées à se nourrir pendant divers points temporels jusqu’à 4 h tout en disséquant les intestins à des intervalles de 1 h. Le nombre d’intestins acidifiés (couleur jaune) et d’intestins non acidifiés (couleur bleue) a été déterminé, et le pourcentage de mouches présentant une acidification intestinale a été calculé pour chaque point temporel (figure 1B). Dans les 30 minutes, environ 20% des mouches avaient acidifié leur intestin. Après une heure, ~ 40% des intestins ont montré des signes d’acidification, tandis qu’après 2 h et 3 h d’alimentation, le pourcentage d’intestins acidifiés a augmenté à ~ 60% et ~ 70%, respectivement (Figure 1B). Cela indique qu’il y a une augmentation du pourcentage de mouches montrant une acidification intestinale avec le temps. Près de 90 à 95 % des intestins étaient acidifiés lorsque les mouches étaient nourries pendant 4 h (figure 1B). Nous avons utilisé ce protocole optimisé d’alimentation de 4 h pour des expériences ultérieures.
En plus de l’effet de l’alimentation, l’effet de la température à laquelle les mouches ont été élevées sur l’acidification intestinale a été examiné. Les mouches ont été élevées à 23 ° C et 30 ° C, et les mouches femelles ont été affamées pendant environ 20 heures. Les mouches ont ensuite été nourries avec de la nourriture pour mouches complétée par du BPB pendant 4 heures, et le pourcentage d’acidification intestinale a été déterminé comme décrit ci-dessus. Nous n’avons observé aucune différence dans l’acidification intestinale pour ces deux températures (Figure 1C), ce qui suggère que la température, contrairement à l’alimentation, n’affecte pas l’acidification intestinale.
Démonstration du protocole d’acidification intestinale pour les organismes non modèles
Les espèces de drosophiles sont séparées phylogénétiquement sur des millions d’années (voir la figure 2A). Au cours de cette vaste période, ils se sont adaptés à différents habitats et régimes alimentaires12, ce qui soulève la possibilité que certaines espèces n’acidifient pas leur intestin de la même manière que D. melanogaster. Nous avons utilisé D. melanogaster (fruit), D. sechecllia (fruit de morinda), D. erecta (fruit de pandanus), D. pseudoosubcura & D. virilis (sève végétale) et D. mojavensis (fruits de cactus) (Figure 2B). Pour démontrer que ce protocole pouvait être utilisé pour d’autres espèces de drosophiles , ces espèces ont été nourries avec des aliments pour mouches supplémentés en BPB pendant 4 h, et le pourcentage d’acidification intestinale a été déterminé comme décrit ci-dessus. Une acidification intestinale robuste a été observée pour toutes les espèces testées (figure 2B). Ce résultat suggère que l’acidification de l’intestin est conservée de manière évolutive parmi diverses espèces de drosophiles et que ce protocole peut facilement être mis en œuvre pour d’autres organismes.
Figure 1: Surveillance de l’acidification intestinale. (A) Dessin schématique de l’arène d’alimentation. Le point bleu représente la nourriture pour mouches avec du bleu de bromophénol (un colorant indiquant le pH). D’autres taches représentent des mouches des fruits. (B) Représentation graphique du pourcentage de mouches présentant une acidification intestinale nourries pendant différentes durées sur 4 h. Images intestinales représentatives d’un intestin acidifié et d’un intestin non acidifié. La flèche rouge indique une libération acide dans la région des cellules de cuivre de l’intestin moyen. n = 4 expériences, 25-30 mouches femelles par expérience. Barre d’échelle = 500 μm chacune. Les astérisques indiquent des différences significatives par rapport au groupe témoin (ANOVA unidirectionnelle, suivie d’un test de Bonferroni) *P < 0,05; **P < 0,01; P < 0,0001. (C) Les mouches ont été nourries avec du BPB avec de la nourriture pour mouches pendant 4 h à 23 °C ou 30 °C. Pourcentage (%) de mouches présentant une acidification intestinale. n = 4 expériences, 25 à 30 mouches femelles par expérience (test t non apparié suivi du test non paramétrique Mann-Whitney U et du test de wilcoxon rank-sum. Abréviation : ns = non significatif. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2: Phylogénie du phénomène d’acidification intestinale. (A) Relation phylogénétique des espèces de drosophiles avec leur habitude alimentaire et leur habitat. La barre de 1 mm indique 1 million d’années. (B) Pourcentage de mouches (espèces de drosophiles ) présentant une acidification intestinale, nourries avec du BPB pendant 4 h. n = 4 expériences, 25 à 30 mouches femelles par expérience (ANOVA unidirectionnelle, suivie d’un test de Bonferroni). Abréviation : ns = non significatif. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Une étape critique de ce protocole est la dissection appropriée de l’intestin pour visualiser le CCR pour le phénotype d’acidification. L’acide libéré par les cellules de cuivre est confiné au CCR lorsque l’intestin est intact. Cependant, lors de la dissection, une fuite causée par une rupture de l’intestin peut entraîner la diffusion de l’acide du CCR et entraîner un intestin marqué par erreur comme négatif pour l’acidification. En outre, la couleur jaune indicative de l’acidification s’estompe dans les 5 à 10 minutes suivant la dissection, soulignant l’importance de marquer les intestins pour le phénotype d’acidification peu de temps après l’isolement. Enfin, les protocoles actuels7,8,9,10,11 qui testent l’état d’acidification dans l’intestin des mouches dépendent de la supplémentation en ALIMENTS pour mouches en BPB, sans tenir compte du statut alimentaire des animaux. Cependant, au cours de nos études, nous avons constaté que l’acidification de l’intestin n’était pas constitutive mais dépendait plutôt de l’alimentation après une famine antérieure. En tant que tel, une évaluation précise de l’état acide de l’intestin en utilisant le BPB comme indicateur du pH intestinal nécessite la prise en compte de l’état nutritionnel de la mouche ainsi que de toute autre variable prise en compte.
L’acidification de l’intestin est conservée des organismes multicellulaires inférieurs aux organismes supérieurs. Cependant, on sait peu de choses sur sa fonction chez la plupart des animaux et sur toute l’étendue des voies moléculaires et cellulaires qui le régulent. Chez l’homme, le manque d’acidification intestinale est associé à la malabsorption des nutriments, tandis que l’excès d’acide dans l’intestin peut entraîner des ulcères intestinaux13. Ainsi, les connaissances acquises grâce à la recherche sur l’acidification intestinale sont susceptibles de fournir de nouvelles informations sur le traitement et la guérison des maladies intestinales causées par des défauts dans la régulation de la sécrétion acide.
La drosophile est récemment apparue comme un modèle puissant pour l’étude de l’acidification intestinale2,5,6. Des études génétiques ont identifié les gènes nécessaires à l’établissement des cellules sécrétrices d’acide et les machines impliquées dans la production d’acide. Des études sur les médicaments ont également été menées. Par exemple, l’acidification de l’intestin est évitée lorsque les mouches sont nourries avec de l’acétazolamide, un inhibiteur de l’anhydrase carbonique (CAH)7, ce qui correspond au rôle central que joue le CAH dans la production de protons nécessaires à la production d’acide. Nous nous attendons à ce que ce protocole aide les chercheurs à découvrir rapidement et de manière rentable des inhibiteurs de médicaments ou des activateurs de l’acidité intestinale. En outre, l’application de cette méthode en combinaison avec des approches génétiques et biochimiques aidera à découvrir les voies cellulaires impliquées dans la sécrétion d’acide et à identifier le rôle de l’acidification intestinale dans l’homéostasie intestinale et de l’organisme.
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Disclosures
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.
Acknowledgments
Les auteurs reconnaissent que le soutien au travail dans le laboratoire de l’auteur est fourni par un HHMI Faculty Scholar Award et des fonds de démarrage du Children’s Research Institute du UT Southwestern Medical Center.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | B0126 | |
| cellSens software | Olympus | Image aqusition (https://www.olympus-lifescience.com/en/software/cellsens) | |
| D. simulans | Drosophila Species Stock Center at the University of California | Riverside California1 (https://www.drosophilaspecies.com/) | |
| D. erecta | Drosophila Species Stock Center at the University of California | Dere cy1(https://www.drosophilaspecies.com/) | |
| D. pseudoobscura | Drosophila Species Stock Center at the University of California | Eugene, Oregon(https://www.drosophilaspecies.com/) | |
| D. mojavensis | Drosophila Species Stock Center at the University of California | Chocolate Mountains, California (https://www.drosophilaspecies.com/) | |
| Forceps | Inox Biology | Catalog# 11252-20 | |
| Fuji | Fuji | Image processing (https://hpc.nih.gov/apps/Fiji.html) | |
| Glass slide | VWR | Catalog#16005-108 | |
| Kim wipes Tissue | Kimtech | ||
| Microscope and camera | Olympus SZ61 microscope equipped with an Olympus D-27 digital camera | Imaging | |
| Oregon R | Bloomington Drosophila Stock | (https://bdsc.indiana.edu/ # 2376) | |
| Petri dishes | Fisher Scientific | Catalog #FB0875713A | |
| Phosphate-buffered Saline (PBS) | HyClone | Catalog # SH30258.01 | |
| Stereomicroscope | Olympus SZ51 | Visual magnification |
References
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