Summary
הפרוטוקול מתאר שיטה פשוטה לכריתת כבד עכבר שלם למחקרים מטבוליים באמצעות זלוף ורידים פורטלי.
Abstract
מחלות מטבוליות כגון סוכרת, טרום סוכרת, מחלת כבד שומני שאינה אלכוהולית (NAFLD) וסטאטוהפטיטיס לא אלכוהולית (NASH) הופכות נפוצות יותר ויותר. פרפוזיות כבד Ex vivo מאפשרות ניתוח מקיף של חילוף החומרים בכבד באמצעות תהודה מגנטית גרעינית (NMR), בתנאים תזונתיים שניתן לשלוט בהם בקפדנות. מכיוון שבסימולציות סיליקו נותרות אמצעי תיאורטי בעיקר להערכת פעולות הורמונים וההשפעות של התערבות תרופתית, הכבד החדור נותר אחת ממיטות הבדיקה החשובות ביותר להבנת חילוף החומרים בכבד. מכיוון שמחקרים אלה מנחים תובנות בסיסיות על פיזיולוגיה של הכבד, התוצאות חייבות להיות מדויקות וניתנות לשחזור. הגורם הגדול ביותר בשכפול של זלוף כבד ex vivo הוא איכות הניתוח. לכן, הצגנו שיטה מאורגנת ויעילה לביצוע זלופיות כבד של עכברי ex vivo בהקשר של ניסויי NMR באתרם . כמו כן, אנו מתארים יישום ייחודי ודנים בסוגיות נפוצות בהן נתקלנו במחקרים אלה. המטרה הכוללת היא לספק מדריך לא מסובך לטכניקה ששכללנו במשך מספר שנים שאנו רואים בה את תקן הזהב להשגת תוצאות הניתנות לשחזור בניתוחים בכבד ובעיבויים בהקשר של ניסויי NMR באתרם . המרחק למרכז השדה של המגנט, כמו גם חוסר הנגישות של הרקמה להתערבות במהלך ניסוי NMR, הופכים את השיטות שלנו לרדומות.
Introduction
זלוף Ex vivo הוא חיוני בחקר חילוף החומרים בכבד, וזלוף דרך וריד הפורטל הוא הסטנדרט למחקרים אלה. על מנת לחקור את חילוף החומרים בכבד בבידוד, יש לכרות את הכבד מהגוף כדי למנוע סיבוכים הנובעים מחילוף חומרים באיברים אחרים (כלומר, חילוף חומרים בכל הגוף) ולהפעיל שליטה על זמינות ההורמונים (אינסולין, גלוקגון וכו '). גישה זו יכולה להיות חיונית להבנת ההשפעות של מחלות כגון סוכרת, NAFLD ו- NASH על חילוף החומרים בכבד, כמו גם מנגנונים של פעולה תרופתית. מאמר זה משמש כמדריך לכריתה וזליעה של הכבד. פיתחנו הליך יעיל לביצוע מחקרי כבד מטבוליים אלה בקפדנות ובשכפול מספיקים. אם הניתוח אינו מבוצע כראוי, יש שונות בולטת בנתונים המטבוליים המתקבלים. אנו מתארים שיטה מאורגנת לביצוע צנתור ורידים פורטליים וכריתת כבד בהקשר של מחקרים מטבוליים באתרם בספקטרומטר תהודה מגנטית גרעינית (NMR), כמתואר בספרות 1,2,3,4,5.
נכון לעכשיו, אין ספרות המתארת פרפוזיה של כבד ex vivo באמצעות עמוד זכוכית בתוך NMR. כמו כן, אין סרטון או פרסום טקסט המספק דוגמה ברורה כיצד לבצע את ההליך עם כבד העכבר, במיוחד, המדגים כיצד לצנתר את וריד הפורטל, לכרות כבד, להעביר ולתלות את הכבד על עמוד זכוכית. מכיוון שהעכבר המהונדס גנטית משמש בכל מקום לחקר חילוף החומרים בכבד, זהו הליך חיוני הראוי לתיאור מלא. ניתוחי זלוף בכבד אינם חדשים, אך מאמר זה הוא שיטת תקן זהב המלווה בסרטון המדגים את המצוינות הטכנית המתוארת במאמר זה כדי לסייע לכל מי שמעוניין בהליך זה. השיטה המוצגת כאן תיושם בצורה הטובה ביותר על חילוף חומרים בזמן אמת כדי לזהות את התפקוד והמחזור של מטבוליטים במודלים של מחלות.
שיטה זו משתמשת בעמוד זכוכית מצופה מים בקוטר 100 ס"מ, המאפשר לכבד להיתלות בתחתית הצינורית עטופה על ידי תפרחת בתוך צינור NMR. מים מחוממים במעיל הזכוכית משמשים לשליטה בטמפרטורה המחלחלת. מחמצן שכבה דקה בלחץ עם 95%/5% O2/CO2 לשליטה ב-pH. על ידי שימוש בשלוש משאבות נפרדות, נקבע גובה העמוד המחורץ, המספק לחץ מתמיד לכבד. קצבי הזרימה אינם נשלטים מעבר ליישום של לחץ קבוע (איור 1). כדי לוודא שהכבד מתפקד כראוי, מדידות חמצן נלקחות יחד עם קצבי זרימה. בידינו, קבוצה זו של תנאים מוקדמים מובילה לניסויי NMR הניתנים לחזרה חוזרת על עצמה להערכת התפקוד המטבולי של הכבד.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ניסויים בהם היו מעורבים עכברים טופלו בהתאם לוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת פלורידה (פרוטוקול מספר #201909320). זן העכבר שבו נעשה שימוש היה C57BL/6J; כל העכברים היו זכרים. שיטה זו ישימה בדרך כלל גם למחקרים המשתמשים בזני עכבר סטנדרטיים אחרים. ניתוח זה מבוצע בצורה אופטימלית על ידי שני אנשים העובדים יחד.
1. הגדרה ראשונית
- פרפוזה כבדים עם פרפוזט המכיל קרבס-הנסלייט אלקטרוליטים6(25 mM NaHCO3, 112 mM NaCl, 4.7 mM KCl, 1.2 mM כל אחד של MgSO4, KH2PO4, ו-0.5 mM נתרן-EDTA, 1.25 mM CaCl2), 6 mM נתרן לקטט, 0.6 mM נתרן פירובט, 0.2 mM [U-13C] נתרן פרופיונאט, 10% (v/v) D2O, ו-0.63 מ"מ חומצות שומן מעורבות (המכילות חומצה פלמיטית (22.1% מכלל החומצה), חומצה פלמיטולאית (5.2%), חומצה סטארית (2.7%), חומצה אולאית (27%), חומצה לינולאית (37.7%), חומצה γ-לינולנית (2.4%) וחומצה דקוסהקסנואית (2.8%)) יחד עם 2% (w/v) אלבומין בסרום בקר. הגדר את ה-pH הסופי של perfusate ל-7.3 באמצעות HCl (ו-NaOH, במידת הצורך).
2. הקמה לפני ניתוח
- הרכיבו שני מזרקים בגודל 1 מ"ל עם מחט 23G באורך 19.05 מ"מ. מלאו מזרק אחד ב-0.01 מ"ל של 1000 יחידות/מ"ל הפרין ו-0.19 מ"ל של מלח (0.9% (w/v) NaCl במים; טבלה 1).
- מלאו את המזרק השני ב-0.2 מ"ל של 2% לידוקאין ו-0.6 מ"ל של 0.9% מלוחים (טבלה 1). במזרק נוסף של 1 מ"ל עם מחט 27 G 38.1 מ"מ, למלא עם perfusate ולשמור על 37 °C (66 °F).
3. הגדרת עמודה מפורטת
- הכניסו את בקבוק הזכוכית המכיל 500 מ"ל של פרפוזה לתוך אמבט המים (איור 1B). הפעילו את אמבט המים והגדירו את הטמפרטורה ל-42 מעלות צלזיוס. הטמפרטורה הגבוהה יותר באמבט המים מאפשרת שמירה על 37 מעלות צלזיוס בעמודת הזלוף.
- לאחר שהמים מתחממים עד 42 מעלות צלזיוס, הפעילו את שתי המשאבות כדי להזרים את השקע מהבקבוק לאורך כל מחמצן הסרט הדק ואת עמוד הזכוכית בקוטר 100 ס"מ (איור 1A-E).
- הפעילו את הגז המחמצן (95% חמצן ו-5% פחמן דו-חמצני) כדי ללחוץ על המחמצן7 (איור 1C). התאם את גובה העמודה כדי להשיג קצב זרימה של 8 מ"ל/דקה עם הצנתר המצורף (ראה שלב 9 למדידת קצב זרימה)5,8,9.
הערה: קצב הזרימה מתייחס לקצב שבו פרפוסאט מגורש על ידי הכבד.
4. הרדמה של העכבר
- דון PPE כנדרש על פי פרוטוקול IACUC והנחיות בטיחות מתאימות אחרות.
הערה: השלבים הבאים הותאמו לעכברים בני 9 - 13 שבועות. - מניחים את העכבר בתא האיזופלורן. הופכים את גז האספקה ל-100% חמצן, קצב זרימה של 1 ליטר לדקה, ואת האיזופלורן ל-2%10. המתן עד שהאשימה תאט ותהיה יציבה.
הערה: כדי שהעכבר יגיע למישור כירורגי יציב, כפי שמעידים קצב נשימה איטי ויציב והיעדר רפלקס צביטה בבוהן, ניתן לכוונן את קצב זרימת החמצן ל~1.5 ליטר לדקה ל~3 ליטר לדקה ואת ריכוז האיזופלורן מ-1- 3%. קצב האספקה של גז נשא וריכוז איזופלורן תלוי בגיל ובמשקל של החיה ובגורמים כגון רעש ואור. - יש לחטא את הבטן ב-70% אלכוהול. מתן הפרין באמצעות הזרקה תת עורית עמוקה בשכבת השומן הבטני (איור 2). מניחים את העכבר בחזרה לתא ההרדמה למשך 10 דקות.
הערה: הגילוח אינו נדרש מכיוון שהליך זה הוא סופני.
5. סליטומיה
- העבירו את העכבר מתא ההרדמה אל פלטפורמת הניתוח והניחו אותו בתנוחת השכיבה (איור 3).
- מניחים את אפו של העכבר לתוך חרוט אף ומדביקים את כפות הרגליים כלפי מטה. הקפידו לא להפעיל עומס על הצוואר שעלול להוביל לחנק.
- מתן לידוקאין באמצעות הזרקה תת-עורית באופן דו-צדדי באזור הפסגה האיליאקהקדמית 11 (איור 3). בצע בדיקת צביטה בבוהן כדי לאשר את היעדרם של כל רפלקסי הכאב.
- בצע קליוטומיה כדי לחשוף את האיברים הפנימיים (איור 4). בצע חתך ברוחב 3 ס"מ (רוחב כל הבטן של העכבר).
הערה: הרוחב ישתנה עם הגיל והתזונה של העכבר. - הרחב את החתך על-ידי שימוש בהמוסטאט המושך אחיזה על-ידי הידוק התהליך ה-xiphoid (איור 4).
6. תותח של וריד הפורטל
- השתמשו באפליקטור עם קצה כותנה כדי לנקות את המעי הדק והמעיים הגסים המכסים את וריד הפורטל. מקמו תפר משי מתחת לקשת של וריד הפורטל הפרוקסימלי לכבד (איור 4A).
- בהתאם למבנה האנטומי, הניחו את תפר המשי השני פרוקסימלי או דיסטלי של הדיסטלי של הווריד המזנטרי הנחות מהכבד (איור 4A)12,13. השתמש בתפר 2-0 עבור שני התפרים.
- לאחר שהתפרים נמצאים במקומם, ניתן להשתמש בווריד הפורטל באמצעות צנתר 22G14 (איור 4B). בעת החדרת הקטטר, שמור על השיפוע מכוון כלפי מעלה. הזן את וריד הפורטל בזווית של לא יותר מ- 15°.
- קשרו את התפר הראשון על פני טאפר הצנתר. לאחר שווריד הפורטל משומר, עגנו את הצנתר בקוטר 2-3 מ"מ דיסטלי מענף וריד הפורטל עם תפר המשי (איור 4B).
הערה: על העוזר לגלגל כתפיים ופרקי ידיים כדי למנוע פריקה של הצנתר או קריעת וריד הפורטל. כל תפר דורש שני קשרים. - לאחר מכן, אבטח את החלק התחתון של הצנתר עם התפר השני. בעזרת העוזר הכירורגי, קשרו קשר עם התפר כדי לאבטח את הצנתר לחלק הדיסטלי של וריד הפורטל והרקמה שמסביב.
7. כריתה של שימורי ורידים בפורטל פוסט כבד
- לאחר אבטחת הצנתר, יש להחדיר מזרק 1 מ"ל עם מחט 27G שאורכו 38.1 מ"מ לתוך הצנתר כדי לשטוף בועות דם ואוויר.
הערה: בדרך כלל יש זרימה אחורית של דם מתוך הצנתר מהלחץ. - השתמשו בצינור סיליקון בגודל 1 מ"מ I.D. x 5 מ"מ עם סטופקוק קבוע כדי להצמיד את עמודת הזלוף (איור 1A) לצנתר המאפשרת זרימה של החיץ לתוך הכבד המסמנת את תחילת הזלוף. הפעל טיימר בנקודה זו כדי לסמן את תחילת הזלוף.
- להקל על לחץ כלי הדם מוגבר על ידי ביצוע חתך, באמצעות מספריים, לתוך הווריד קאווה נחות.
- אשרו את זרימת ההדבקה דרך הכבד על ידי התבוננות בשינוי הומוגני בצבע הכבד מוורוד/אדום לצהוב חיוור. לאחר אישור הזרימה, יש לבלות את הקיבה, המעי הדק, המעי הגס והכליה הימנית מהרקמה הסובבת.
- בעזרת העוזר הכירורגי, תמרן את הכבד סביב חלל הבטן ובית החזה כאשר המנתח חותך דרך הצפק הקודקודי ורקמת בית החזה כדי לכרות את הכבד
- לבסוף, הרימו את הכבד כלפי מעלה וחתכו את רקמות החיבור הנותרות המחזיקות את הכבד במקומו עם מספריים. לאט לאט לתמרן את הכבד כדי להקל על הראייה. יש להסיר כל פרווה שנדבקת לכבד על ידי שטיפה עם פרפוזט לפני שתעטוף אותה בתוך צינור ה-NMR.
הערה: בהליך זה, רק הכבד מוסר. כל האיברים האחרים נשארים בגוף החיה. ניתן להסיר את צינור המרה על סמך פרוטוקול הניסוי. אמנם לניסוי זה, הוא הושאר במקומו.
8. תליית הכבד מהטור
- לאחר שהמנתח מוסר את הכבד והצינורות לעוזר, העוזר מנתק את הצינורות מהקטטר והעמוד.
- ממלאים את הצנתר בטפטוף עד שנוצר מניסקוס על החלק העליון של הצנתר. חברו את הצנתר לעמוד כדי שהכבד יתלה וינקב.
הערה: החרוז של perfusate על הצנתר מספק נפח מספיק עבור הכבד לתפקד עד לחיבורו. הצנתר המחובר לכבד מותאם לתחתית העמוד. - הברגו צינור NMR בקוטר 20 מ"מ לעמוד הזכוכית בקוטר 100 ס"מ כדי לתמצת את הכבד (איור 5). כדי למנוע פיתול של הכבד ואת וריד הפורטל, לאט לאט לדפוק על צינור NMR. אם מתרחש פיתול והזרימה נעצרת, פתח את הצווח ויצור מחדש את צינור ה- NMR. זה יתקן את החסימה והזרימה תחזור.
- מכניסים את הכבד למשך 30-60 דקות על סמך פרטי המחקר.
הערה: הזמן מבוסס על ניסוי הזלוף. עבור ניסוי זה נמדד המחזור המטבולי תוך 30 דקות. זלוף הכבד יכול לקחת עד 10 דקות כדי להגיע למצב יציב. הזמן למצב יציב מתחיל ברגע שהווריד הנבוב התחתון נחתך וזרימת הכבד נקבעת.
9. מדידת זרימה
- הניחו סירת שקילה על איזון העמסה עליון ואפסו את האיזון. מניחים את הצינורות ממשאבת הרולר ומושכת את הצינורות מה-NMR לתוך סירת השקילה ומפעילים את הטיימר.
- שקלו את מסת הנוזל שהצטברה במשך דקה אחת, מה שמניב את קצב הזרימה של הכבד. מניחים את הצינור בחזרה למיכל הפסולת/איסוף.
10. מדידת חמצן
הערה: מדידות מד חמצן הוגדרו על פי הוראות היצרן15.
- הניחו את האלקטרודה המכילה 20 μL של תמיסה רוויית KCl של 50% על כיפת הפלטינה והניחו חמש טיפות של 10 μL סביב טבעת הפלטינה התחתונה של האלקטרודה.
- מסירים את הדבק מנייר הסיגריות. הניחו פיסת קרום של פוליאטטרפלואורואתילן מעל נייר הסיגריה.
- מניחים את שני החלקים על גבי האלקטרודה. התאם טבעת O קטנה סביב החלק העליון של האלקטרודה. חתכו את הנייר כדי להניח שטוח על טבעת הפלטינה התחתונה על האלקטרודה.
הערה: חלק מההתעלות מקובלת. חיוני לכסות את הכסף של האלקטרודה. - הניחו את טבעת ה-O הגדולה יותר על האלקטרודה. הצמידו את האלקטרודה לתא המים והידקו את הבסיס כדי להחזיק את האלקטרודה במקומה. הפעילו את אמבט המים ואפשרו לחמם עד 37 מעלות צלזיוס.
- תוכנת מד חמצן פתוחה. לחץ על כיול > מים רוויי אוויר. הגדר את מהירות המערבל ל -75 ואת הטמפרטורה ל -37 °C (84 °F).
- ממלאים בקבוקון 50 מ"ל באמצע הדרך במים ורועדים במרץ במשך 2 דקות. מדובר במים רוויי אוויר, השתמשו בהם כסטנדרט של 100%. מלאו את תא מד החמצן בכ-2 מ"ל מים והניחו את הפקק בעל שני החלקים.
- לחץ על אוקיי על המסך ואפשר לאות לעלות. לאחר שהאות הגיע למישור, לחץ על אוקיי. להשליך את הנוזל בתא ולייבש עם נייר טישו.
- חזור על שלבים 10.6-10.7 אך עם 200 mM נתרן סולפיט (0% סטנדרטי). לחץ על שמור כיול.
הערה: אין צורך ברעידות נמרצות עבור תקן 0%. - במהלך זלוף, השתמש בשני מזרקים 5 מ"ל. מזרק אחד למחזור פרפוזט (חמצן פנימה) והשני עבור פרפוזט מצינור NMR (חמצן החוצה).
- בעת ציור perfusate עבור מדידות פנימה והחוצה, לצייר 3-4 מ"ל בכל פעם.
הערה: עמודה זו כוללת צינורות זכוכית כדי לאפשר גישה לצינור NMR כדי למשוך את הפרפוסאט שזרם דרך הכבד. - מודדים את התפשטות הדם, תחילה בדיוק כמו מים בשלב 10.6 ומסלקים בשלב 10.7. חזור על אותם שלבים עבור ההזנחה המזיקה.
- בצע מדידות חמצן כל 10 דקות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
תפקודי הכבד מוערכים בעיקר על ידי צריכת חמצן וקצב זרימה. קצב זרימה של 4-8 מ"ל לדקה וצריכת חמצן של 1 מיקרומול/min.g הוא אופייני. מדדים אלה ישתנו בהתאם לתנאי הניסוי הספציפיים ולהבדלים הביולוגיים.
הכמות המדויקת של איזופלורן בשימוש תהיה תלויה בסוג מערכת ההרדמה בה נעשה שימוש, כמו גם בסביבה ובגיל/משקל של העכבר. במהלך הניתוח, האיזופלורן וגז הלידה אינם משתנים, אם כי ייתכן שיהיה צורך בשינויים מסוימים בהתאם לפרטי האזור הניתוחי (למשל, רעשי רקע)10. כאשר הפרין מוזרק עמוק תת עורית, תחילת הפעולה עלולה להתעכב עד 20-40 דקות. תקופת המתנה של 10 דקות לאחר מתן הפרין מבטיחה את תחילת הפעולה16. לידוקאין יש 2 דקות התחלה של פעולה11.
בעת החדרת הצנתר, שמור על השיפוי מכוון כלפי מעלה, והזן בזווית של לא יותר מ-15° מווריד הפורטל. לשני התפרים יש שני קשרים. יש לקשור את התפר הראשון מעבר לטאפר הצנתר. אם תותח של וריד הפורטל מוצלח, הכבד מלבין מן הסומק. כאשר המנתח מנתח את הכבד, העוזר מנקה את התכולה המנותקת באמצעות אפליקטור בעל קצה כותנה. כדי למנוע זיהום הכבד ולמנוע ניקים לאונות, אין לחתוך דרך הבטן. אין למרוח מתח רב מדי על וריד הפורטל או הכבד בעת החזקת הצנתר כדי למנוע פריקה או קריעה של וריד הפורטל.
הגדרת החומרה של זלוף דורשת תשומת לב נרחבת לפרטים (איור 1). זריקות הפרין (איור 2) חיוניות לניסוי. אם הדם נקרע, הוא יחסום את הצנתר המוחדר לווריד הפורטל, וימנע זרימה. הזרקת הלידוקאין (איור 3) נועדה לסייע בהסרת הרגישות של האזור להקלה על כאבים. טבלה 1 מספקת תרשים מינון פשוט להפרין ולידוקאין עם מלח. הקליאוטומיה והתפירה (איור 4) חיוניות לצנתור מוצלח של ורידים בפורטל, לכריתת כבד ולהעברה מוצלחת לאסדת הזלוף. מדידות קצב זרימה וצריכת חמצן חיוניות לניטור בריאותו ותפקודו של הכבד (איור 6). לעתים קרובות יש הבדל קל בצריכת O2 בין כבדים ניזונים לבין כבדים בצום, אותו אנו מייחסים לדרישות אנרגיה מוגברות המוטלות על ידי גלוקונאוגנזה בכבד הצום.
איור 1. עמוד זלוף ומשאבות. A. עמוד זכוכית בקוטר 100 ס"מ עם מעיל מים שבו הכבד תלוי בתחתית. B. משאבת המים מזרימה מים דרך עמוד הזכוכית ומחממת את המנקב. ג. מחמצן השכבה הדקה מזכוכית בלחץ עם 95%/5% O2/CO2 המחמצן את הפרפוסאט. ד. משאבת נושאת הכדורים מזרימה מתוך אמבט המים אל מחמצן השכבה הדקה ואל עמוד הזכוכית. E. המשאבה נושאת הכדורים מזרימה פרפוזט המועבר לתוך העמודה ממשאבת האספקה תוך שמירה על חמצון פרפוסאט ושמירה על זרימה של 8 מ"ל לדקה. המשאבה נושאת הכדור מסירה את השקע התזזיתי מצינור ה-NMR. ז. סולם שקילה לשקילה מתפשט מצינור NMR כדי להשיג את קצב הזרימה של הכבד. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2. הזרקת הפרין. הזרקה תת עורית עמוקה של הפרין ניתנת בשכבת השומן בבטן התחתונה של העכבר. חשוב כאשר מרימים את העכבר, למשוך את העור חזק כדי לאפשר למחט לחדור לעור בקלות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3. הזרקת לידוקאין. העכבר ממוקם בתנוחת השכיבה על הפלטפורמה הכירורגית כאשר כפותיו מודבקות כלפי מטה והאף בקונוס האף. לידוקאין ניתן באופן תת עורי באזור הפסגה האיליאק. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
תרשים 4. קליטומיה ותפר. הצליוטומיה חושפת את האיברים הפנימיים, והמוסטאט מושך אחיזה בתהליך ה-xiphoid כדי לסייע בפתיחת החתך עוד יותר. שני תפרים ממוקמים סביב וריד הפורטל, הצנתר מוכנס, והתפרים קשורים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 5. צינור NMR. הכבד הוסר מהגוף יחד עם הצנתר המחובר לאחר מכן לצינורות הסיליקון המחוברים לעמוד הזכוכית. הכבד נתלה מהעמוד ומעטוף על ידי צינור NMR. לאחר מכן, צינור NMR בקוטר 20 מ"מ מוברג בקפידה על העמוד שעוטף את הכבד. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 6. צריכת חמצן וקצב זרימה. נתונים מייצגים מהשוואת צריכת חמצן בכבד ומדידות קצב זרימה בין כבדים ניזונים לצום. N = 3 ופסי שגיאה הם סטיית תקן. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
| הפרין 1000 יחידות/מ"ל | מלוחים 0.9% | סך |
| 0.01 מ"ל | 0.19 מ"ל | 0.2 מ"ל |
| לידוקאין 2% | מלוחים 0.9% | סך |
| 0.2 מ"ל | 0.6 מ"ל | 0.8 מ"ל |
טבלה 1. הפרין ומינון לידוקאין עם מי מלח. הטבלה מציגה את הריכוז של הפרין ולידוקאין ואת המינון של כל תרופה עם מלח.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הליך כירורגי זה הוא מאתגר ודורש תרגול נרחב כדי להשיג תוצאות הניתנות לשחזור. יש להתאים את איזופלורן וגז המוביל לפי הצורך כדי לשמור על הכדאיות של החיה במהלך כמה שיותר מההליך הכירורגי. סביבה, שעה ביום, גיל, משקל ומספר גורמים נוספים ישפיעו על ההרדמה. משקל, תזונה, זן של עכברים וגיל עשויים להשפיע על הניתוח מכיוון שהצטברות שומן עלולה להפריע להדמיה של וריד הפורטל. כאשר מקישים על כפות הרגליים כלפי מטה, יש להקפיד שלא להפעיל עומס כלשהו על הצוואר שעלול לגרום לחנק. יתר על כן, ככל שהעכבר שמן יותר, כך התפירה תצטרך להיות הדוקה יותר סביב הצנתר כדי לנטרל את מקדם החיכוך הפוחת בין הצנתר לווריד המושרה על ידי השומנים. תחילת זמן הפעולה של הפרין חיונית שכן חשיפה מוגזמת לאיזופלורן מייצרת ממצאים באיברים17. מתן זריקות הפרין ולידוקאין דורש מחט 23G באורך 19.05 מ"מ, מה שמבטיח שאין טראומה לאיברים פנימיים במהלך ההזרקה. לולאת התפר חייבת להיות מעל המחדד של הצנתר, או שהיא תחסום את הווריד כאשר היא מהודקת. ברגע שהחדירו את הצנתר יש בדרך כלל זרימה אחורית של דם מתוך הצנתר מהלחץ, וזה סימן חיובי למיקום נכון. ניתן למשוך את הצנתר כלפי מעלה כדי לקבל אישור חזותי לכך שקצה הצנתר רחוק מספיק מעבר לתפר הראשון. גלגול פרקי הידיים והכתפיים יבטיח שהתפר לא יחליק מהקצה המחודד כאשר העוזר קושר את התפר. בעת העברת הכבד מצינורות זלוף הסיליקון לעמודה נותר חרוז של פרפוזט על גבי הצנתר. החרוז המחורץ ימנע מבועות אוויר להיכנס לצנתר ולהיכנס לכבד. המניסקוס של הנקב על גבי הצנתר מספק נפח מספיק כדי שהכבד יתפקד עד לחיבורו. כדי למנוע פיתול של הכבד ואת וריד הפורטל, צינור NMR מוברג לאט. בנוסף, מערכת הזלוף המשמשת בניסוי זה אינה דורשת שסתום לחץ. קצבי הזרימה של המשאבות נשמרים כך שעמוד זלעפות זכוכית מכיל נקב בגובה של כ-12 ס"מ. הכבד תופס את כריתת קרבס בכוח הכבידה, ושולל כל הפרש לחץ בין שתי המשאבות ללא השפעה על קצב הזרימה של הכבד. מכיוון שהכבד מחלחל דרך כוח הכבידה, כמות הפרפוזט שנלקחת על ידי הכבד נקבעת על ידי הפעילות הביולוגית הטבעית של הכבד. לא נאספו נתונים עבור לחץ זלעפות מכיוון שלחץ ורידים בפורטל אינו ניתן למדידה במערכת זו.
החתך הראשון של הצליטומיה הוא רדוד כדי ליצור פתח, והחתכים הבאים עמוקים יותר כדי למנוע ניקיעה של אונות הכבד. האורך הכולל של החתך עבור הצליטומיה הוא 3 ס"מ עבור עכברים בגיל ובגודל זה, אך ישתנה בהתאם למאמץ, לגיל ולמשקל. למרות שהמחקר המתואר משתמש בעכברים בגילאי 9-13 שבועות, ניתן לחקור עכברים מבוגרים יותר או צעירים יותר כמו גם חולדות. יהיה צורך לשנות את גודל צינור ה- NMR ואת צנתר הווריד הפורטלי בהתבסס על הגודל האנטומי של הכבד וריד הפורטל לחקר הדאגה. אם וריד הפורטל אינו ישר, אפליקטור בעל קצה כותנה יכול לסייע במניפולציה של הווריד בעת החדרת הצנתר. למרות שצינור המרה אינו מוסר, אם יש צורך ניסיוני בהיעדרו ניתן להסיר את הצינור עם פינצטה עדינה. מניפולציה מוגזמת של וריד הפורטל בעת הצבת תפרים תגרום להתכווצות מה שהופך את מיקום הצנתר לקשה יותר. כל פרווה שנדבקת לכבד נשטפת עם פרפוזה לפני לחיצה על התאמת הצנתר לעמוד ועטיפתו בתוך צינור ה-NMR. ניתן לשנות את מסגרת הזמן של 30 דקות עבור פרפוזיה מ -20 דקות ל -60 דקות, אך כל הנתונים האמינים ייאספו לאחר 10 הדקות הראשונות של זלוף.
סמן של כריתה מוצלחת של רקמת הכבד הוא לאחר הזלוף הכבד אין עיוותים או בעיות שלמות אחרות. הוא צהוב חיוור באופן הומוגני לכל אורכו. אם הרקמה נפגעה במהלך ניתוח כמו ניק היו לה כתמים צהובים כהים סביבה. כמו כן, אם הכבד נפגע מן הזלוף, זה לא היה perfuse. אם הרקמה הייתה חווה זלוף לקוי של חיץ קרבס, היו פסים צהובים כהים בכל האיבר כתוצאה מרעב שהוביל למוות ברקמות. שיטה נוספת לניטור בריאות הכבד היא צריכת חמצן בכבד (איור 6). הוכח כי כבדי עכברים מכילים כמויות גבוהות יותר של שומנים וגליקוגן, אך יש להם כמויות חלבון כוללות דומות, ולכן היה צפוי שצריכת החמצן בכבד כאשר היא מנורמלת למסת הכבד תהיה בעלת ערך דומה. שיטה שלישית היא נתוני NMR של הנתונים בזמן אמת של תחלופה מטבולית.
המגבלה העיקרית של השיטה היא הניתוח הסופני עצמו. יש עלות משמעותית בעכברים, בציוד, בזמן ובכוח אדם. לכן, יש לנקוט משנה זהירות בעת ביצוע הליכים אלה ואיסוף נתונים. שונות ביולוגית בתוך מודל העכבר יכולה ליצור קושי בניתוח. יתר על כן, זה הכרחי כדי למנוע שיפורים אופטיים. אין צורך בשיפורים אופטיים מכיוון שכל האנטומיה גלויה לעין בלתי. שיפורים אופטיים מגבירים את הפוטנציאל לטעויות להתרחש מכיוון שלמנתח ולעוזר יש שדה ראייה מוגבל, מה שמוביל לתקלות בכבד או למתח לא מכוון בווריד הפורטל, מה שגורם לכשל אם הצנתר נשלף החוצה. יישום נכון של שיטות אלה יביא לשיעור הצלחה > של 95% בניתוח בעכבר C57BL/6J. מגבלה נוספת שיש לקחת בחשבון היא התקופה של 10 דקות הנדרשת כדי שהכבד יגיע למצב יציב. זו אינה מגבלה למחקר המתואר כאן, וגם לא לרבים אחרים, אך עבור כל ניסוי המצדיק את 10 הדקות הראשונות של נתונים שיטה זו לא תספיק. העדר החתימה ההורמונלית המורכבת הקשורה לחילוף החומרים של כל הגוף משמש גם כמגבלה, אם כי ניתן להוסיף גלוקגון, אינסולין וכו ', וכל שילוב שלהם, בחזרה לפרפוסאט.
ישנם מספר יישומים עתידיים פוטנציאליים לטכניקה זו. ככל שפותחו יותר תרופות לטיפול ב-NASH, שיטות סטנדרטיות להערכת חילוף החומרים של אנרגיית הכבד עשויות למצוא יישום רחב. מכיוון ש-NASH קשור מאוד לסרטן הכבד, מודלים של סוגי סרטן אלה הם גם נושאים למחקר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים על היעדר ניגוד עניינים. למממנים לא היה כל תפקיד בתכנון המחקר; באיסוף, ניתוח או פרשנות של נתונים; בכתיבת כתב היד; או בהחלטה לפרסם את התוצאות.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי מימון של המכונים הלאומיים לבריאות (R01-DK105346, P41-GM122698, 5U2C-DK119889). חלק מעבודה זו בוצע במכון המוח של מק'נייט במתקן ההדמיה והספקטרוסקופיה המתקדמת של תהודה מגנטית (AMRIS) של המעבדה הלאומית לשדה מגנטי גבוה, הנתמך על ידי הסכם שיתוף הפעולה מס' של הקרן הלאומית למדע. DMR-1644779 ומדינת פלורידה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL Luer-Lock Single Use Sterile Disposable Syringe | N/A | N/A | Non-specific Brand |
| 100 cm Water Jacketed Glass Column | N/A | N/A | Custom Made |
| 2-0 Silk Suture | Braintree Scientific | N/A | |
| 22 Gauge Catherter 1 in. Without Safety | Terumo | SRFF2225 | |
| 23 G 0.75 in. Hypodemeric Needles | Exel International | 26407 | |
| 27 G 1.5 in. Hypodemeric Needles | Exel International | 26426 | |
| 4x4 in. Surgical Platform | N/A | N/A | Custom Made |
| 70% Alcohol Wipe | N/A | N/A | Non-specific Brand |
| Circulating Water Bath | MS Lauda | N/A | Model no longer manufactured |
| Cotton Tip Applicator | N/A | N/A | Non-specific Brand |
| Delicate Operating Scissors; Straight; Sharp-Sharp; 30mm Blade Length; 4 3/4 " | Roboz | RS-6702 | |
| Dumont #5/45 Forceps | Fine Scientific Tools | 11251-35 | |
| Dumont #7 - Fine Forceps | Fine Scientific Tools | 11274-20 | |
| Hemostats | Fine Scientific Tools | 13015-14 | |
| Heparin Sodium Injectable 1000 units/mL | RX Generics | 71288-0402-02 | |
| Isoflurane | Patterson Veterinary | 14043-0704-06 | |
| Lidocaine HCl 2% | VEDCO Inc. | 50989-0417-12 | |
| Membrane-Thin-Layer Oxygenator | Radnoti | N/A | |
| Metzenbaum Scissors; Curved; Blunt; 27 mm Blade Length; 5 " | Roboz | RS-6013 | |
| Oxygen Meter System | Hanstech Instruments Ltd. | N/A | |
| Saline 0.9% Solution | N/A | N/A | Saline is made in lab |
| Scale | N/A | N/A | Non-specific Brand |
| Variable Speed Analog Console Pump Systems | Cole Palmer | N/A | Models are custom per application |
| Weigh boats | N/A | N/A | Non-specific Brand |
References
- Ragavan, M., McLeod, M. A., Giacalone, A. G., Merritt, M. E. Hyperpolarized Dihydroxyacetone Is a Sensitive Probe of Hepatic Gluconeogenic State. Metabolites. 11 (7), 441 (2021).
- Lumata, L. Hyperpolarized (13)C Magnetic Resonance and Its Use in Metabolic Assessment of Cultured Cells and Perfused Organs. Methods in Enzymology. 561, 561-573 (2015).
- Moreno, K. X., et al. Real-time detection of hepatic gluconeogenic and glycogenolytic states using hyperpolarized [2-13C] dihydroxyacetone. The Journal of Biological Chemistry. 289 (52), 35859-35867 (2014).
- Moreno, K. X., et al. Hyperpolarized δ-[1-13C] gluconolactone as a probe of the pentose phosphate pathway. NMR in Biomedicine. 30 (6), (2017).
- Merritt, M. E., Harrison, C., Sherry, A. D., Malloy, C. R., Burgess, S. C. Flux through hepatic pyruvate carboxylase and phosphoenolpyruvate carboxykinase detected by hyperpolarized 13C magnetic resonance. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (47), 19084-19089 (2011).
- Bailey, L. E., Ong, S. D. Krebs-Henseleit solution as a physiological buffer in perfused and superfused preparations. Journal of Pharmacological Methods. 1 (2), 171-175 (1978).
- Kolwicz, S. C. Jr, Tian, R. Assessment of Cardiac Function and Energetics in Isolated Mouse Hearts Using 31P NMR Spectroscopy. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (42), e2069 (2010).
- Hwang, G. H., et al. Protective effect of butylated hydroxylanisole against hydrogen peroxide-induced apoptosis in primary cultured mouse hepatocytes. Journal of Veterinary Science. 16 (1), 17-23 (2015).
- Bessems, M., et al. The isolated perfused rat liver: standardization of a time-honoured model. Laboratory Animals. 40 (3), 236-246 (2006).
- Beal, E. W., et al. A Small Animal Model of Ex Vivo Normothermic Liver Perfusion. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (136), e57541 (2018).
- Collins, J. B., Song, J., Mahabir, R. C. Onset and duration of intradermal mixtures of bupivacaine and lidocaine with epinephrine. The Canadian Journal of Plastic Surgery. 21 (1), 51-53 (2013).
- Medical Dictionary. , Merriam-Webster. Available from: https://www.merriam-webster.com/medical (2022).
- Thorpe, D. R. A Dissection in Color: The Rat (and the Sheep's Brain). , National Press Books. Palo Alto, CA. (1968).
- Cabral, F., et al. Purification of Hepatocytes and Sinusoidal Endothelial Cells from Mouse Liver Perfusion. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e56993 (2018).
- Operations Manual Setup, Installation and Maintenance. , Hansatech Instruments. Available from: https://www.chem.ucla.edu/dept/Faculty/merchant/pdf/electrode_prep_maintenance.pdf (2006).
- Heparin. , DrugBank Online. Available from: https://go.drugbank.com/drugs/DB01109 (2022).
- Overmyer, K. A., Thonusin, C., Qi, N. R., Burant, C. F., Evans, C. R. Impact of anesthesia and euthanasia on metabolomics of mammalian tissues: studies in a C57BL/6J mouse model. PloS One. 10 (2), 0117232 (2015).
