Skalerbar isolering og oprensning af ekstracellulære vesikler fra Escherichia coli og andre bakterier

Summary

Bakterier udskiller ekstracellulære vesikler (EV'er) på størrelse med nanometer, der bærer bioaktive biologiske molekyler. EV-forskning fokuserer på at forstå deres biogenese, rolle i mikrobe-mikrobe og værtsmikrobe interaktioner og sygdom samt deres potentielle terapeutiske anvendelser. En arbejdsgang til skalerbar isolering af elbiler fra forskellige bakterier præsenteres for at lette standardisering af EV-forskning.

Abstract

Forskellige bakteriearter udskiller ~ 20-300 nm ekstracellulære vesikler (EV'er), der består af lipider, proteiner, nukleinsyrer, glycaner og andre molekyler afledt af forældrecellerne. Elbiler fungerer som kommunikationsvektorer inden for og mellem arter, samtidig med at de bidrager til interaktionen mellem bakterier og værtsorganismer i forbindelse med infektion og kolonisering. I betragtning af de mange funktioner, der tilskrives elbiler inden for sundhed og sygdom, er der en stigende interesse for at isolere elbiler til in vitro- og in vivo-undersøgelser. Det blev antaget, at adskillelsen af elbiler baseret på fysiske egenskaber, nemlig størrelse, ville lette isoleringen af vesikler fra forskellige bakteriekulturer.

Isolationsarbejdsgangen består af centrifugering, filtrering, ultrafiltrering og størrelsesekskluderingskromatografi (SEC) til isolering af elbiler fra bakteriekulturer. Et pumpedrevet tangentielt flowfiltreringstrin (TFF) blev inkorporeret for at forbedre skalerbarheden, hvilket muliggør isolering af materiale fra liter startcellekultur. Escherichia coli blev brugt som et modelsystem, der udtrykker EV-associeret nanoluciferase og ikke-EV-associeret mCherry som reporterproteiner. Nanoluciferase blev målrettet mod elbilerne ved at fusionere sin N-endestation med cytolysin A. Tidlige kromatografifraktioner indeholdende 20-100 nm elbiler med tilhørende cytolysin A - nanoLuc adskilte sig fra de senere fraktioner indeholdende de frie proteiner. Tilstedeværelsen af EV-associeret nanoluciferase blev bekræftet ved immunogold mærkning og transmission elektronmikroskopi. Denne EV-isolationsarbejdsgang gælder for andre humane tarmassocierede gramnegative og gram-positive bakteriearter. Afslutningsvis muliggør kombination af centrifugering, filtrering, ultrafiltrering / TFF og SEC skalerbar isolering af elbiler fra forskellige bakteriearter. Anvendelse af en standardiseret isolationsarbejdsgang vil lette sammenlignende undersøgelser af mikrobielle elbiler på tværs af arter.

Introduction

Ekstracellulære vesikler (EV'er) er nanometerstore, liposomlignende strukturer bestående af lipider, proteiner, glycaner og nukleinsyrer, udskilt af både prokaryote og eukaryote celler¹. Siden de tidlige undersøgelser, der visualiserer frigivelsen af elbiler fra gramnegative bakterier², er antallet af biologiske funktioner, der tilskrives bakterielle elbiler (20-300 nm i diameter) konstant vokset i de sidste årtier. Deres funktioner omfatter overførsel af antibiotikaresistens³, biofilmdannelse⁴, quorum sensing⁵ og toksinlevering⁶. Der er også stigende interesse for brugen af bakterielle elbiler som terapi, især i vaccinologi⁷ og kræftbehandling⁸.

På trods af den stigende interesse for ev-forskning er der stadig tekniske udfordringer med hensyn til isolationsmetoder. Specifikt er der behov for isoleringsmetoder, der er reproducerbare, skalerbare og kompatible med forskellige EV-producerende organismer. For at skabe et samlet sæt principper for planlægning og rapportering af EV-isolation og forskningsmetoder offentliggør og opdaterer International Society for Extracellular Vesicles MISEV-positionspapiret⁹. Desuden udgør EV-TRACK-konsortiet en åben platform for rapportering af detaljerede metoder til isolering af elektriske køretøjer, der anvendes i offentliggjorte manuskripter for at øge gennemsigtigheden¹⁰.

I denne protokol blev tidligere metoder, der blev anvendt til isolering af elektriske køretøjer fra pattedyrcellekultur, tilpasset^11,12 for at muliggøre isolering af elektriske køretøjer fra bakteriecellekultur. Vi forsøgte at anvende metoder, der muliggør EV-isolering fra en række mikrober, som kan være skalerbare, og balancere EV-renhed og udbytte (som diskuteret i MISEV-positionspapiret⁹). Efter fjernelse af bakterieceller og snavs ved centrifugering og filtrering koncentreres kulturmediet enten ved centrifugalanordningens ultrafiltrering (for et volumen på op til ~ 100 ml) eller pumpedrevet TFF (for større volumener). Elbiler isoleres derefter af SEC ved hjælp af kolonner, der er optimeret til rensning af små elbiler.

Figur 1: Skematisk oversigt over bakteriel ev-isoleringsarbejdsgang. Forkortelser: EV = ekstracellulær vesikel; TFF = filtrering af tangentiel strøm; SEC = størrelsesekskluderingskromatografi; MWCO = afskæring af molekylvægt. Klik her for at se en større version af denne figur.

En muse-kommensal stamme af Escherichia coli (dvs. E. coli MP1¹³) blev anvendt som en modelorganisme og modificeret til at udtrykke EV-associeret nanoluciferase ved fusion til cytolysin A, som tidligere rapporteret¹⁴. De metoder, der anvendes her, kan behandle mindst op til flere liter bakteriekulturer og effektivt adskille EV-associerede fra ikke-EV-associerede proteiner. Endelig kan denne metode også bruges til andre gram-positive og gram-negative bakteriearter. Alle relevante data fra de rapporterede eksperimenter blev indsendt til EV-TRACK-videnbasen (EV-TRACK ID: EV210211)¹⁰.

Protocol

BEMÆRK: Sørg for, at alt arbejde, der involverer bakterier og rekombinant DNA, følger bedste praksis for indeslutning af biosikkerhed, der passer til biosikkerhedsrisikoniveauet for hver stamme. Arbejdet skal udføres i overensstemmelse med lokale, nationale og internationale biosikkerhedsbestemmelser.

1. Bakteriestammer og dyrkningsbetingelser

BEMÆRK: Bakteriestammer, der blev anvendt i denne undersøgelse, var Escherichia coli MP1¹³, Akkermansia mucinophila, Bacteroides thetaiotaomicron, Bifidobacterium breve og Bifidobacterium dentium.

1. For E. coli skal du bruge en steril løkke til at inokulere enkeltkolonier i 250 til 1.000 ml Luria-Bertani (LB) bouillon og inkubere aerobt i en rystende inkubator ved 300 o / min og 37 ° C i 48 timer, før dyrkningen behandles. Til rekombinant E. coli MP1-stamme, der indeholder p114-mCherry-Clyluc (supplerende metode og supplerende figur S1), tilsættes chloramphenicol til LB-agar og bouillon i en slutkoncentration på 17 μg/ml.
2. For A. mucinophila, B. thetaiotaomicron, B. breve og B. dentium, stribe på Brain heart infusion (BHI) agar plader og inkubere anaerob inde i et vinyl anaerob kammer. Pod enkeltkolonier i 100 ml forreduceret BHI bouillon og inkuberes i 48 timer anaerobt.

2. Isolering af elbiler

1. Afklaring af bakteriekulturmedium ved centrifugering og filtrering
   1. Overfør bakteriecellekulturerne podet i trin 1 for at rense 250 ml eller 500 ml polypropylencentrifugeflasker ved hældning. Centrifuger flaskerne i en rotor med fast vinkel med stor kapacitet ved 4 °C og 5.000 × g i 15 min. Overfør supernatanten til rene centrifugeflasker ved omhyggelig hældning, og centrifuge igen ved 10.000 × g i 15 min.
      BEMÆRK: Genbrug flaskerne efter biosikkerheds-passende rengøring og dekontaminering.
      1. Hvis der er store pellets af bakterieceller til stede efter den anden centrifugering, gentages centrifugeringen i en ren flaske for yderligere at fjerne celler.
   2. Supernatanten overføres til en 0,22 μm polyethersulfon vakuumdrevet filteranordning af passende størrelse ved hældning. Filtrer ved at forbinde filtreringsanordningen til en vakuumvægforsyning. Hvis filtreringshastigheden falder betydeligt, skal du blot flytte ethvert ufiltreret materiale til en ny enhed. Opbevar det filtrerede medium ved 4 °C natten over, og fortsæt protokollen den følgende dag, hvis det ønskes.
      BEMÆRK: Centrifugationerne ovenfor tillader typisk behandling af ~ 2x det angivne volumen cellekultur gennem hver enhed. For eksempel kan en enkelt 500 ml filterenhed filtrere ~ 1.000 ml forcentrifugeret kultur. Disse enheder genbruges typisk ikke. Brug af sprøjtefiltre på dette trin anbefales ikke uden optimering, da der blev noteret betydelige tab med de testede modeller. Dette er et potentielt stoppunkt.
   3. Kontroller, om de levedygtige celler fjernes fuldstændigt på dette tidspunkt ved at sprede en aliquot af den filtrerede supernatant på egnede agarplader, og sørg for, at der ikke er kolonier efter inkubation under optimale betingelser for bakteriestammen. Hvis der påvises bakterier, skal du optimere proceduren ovenfor yderligere ved at udføre yderligere centrifugeringer og / eller filtreringer.
2. Koncentration af det filtrerede medium
   1. Hvis du arbejder med volumener betydeligt >100 ml, skal du fortsætte til trin 2.2.2. Hvis du arbejder med volumener på ~ 100 ml, skal du indlæse 90 ml filtreret kulturmedium på reservoiret med en respektive kapacitet 100 kDa molekylvægtsafskæring (MWCO) centrifugal ultrafiltreringsanordning ved hjælp af serologiske pipetter. Balance altid med en matchende ultrafiltreringsanordning, og centrifuge i svingende spandelrotor ved 4 °C og 2.000 × g i 15-30 minutters intervaller, indtil mediets volumen i det øverste reservoir er koncentreret til <0,5 ml.
      1. Fyld reservoiret op med ethvert resterende filtreret kulturmedium. Hvis du "påfylder", skal du fjerne gennemstrømningen i bunden af enheden og afbalancere eventuelle enheder igen.
         BEMÆRK: Det blev observeret, at det maksimale volumen filtreret kulturmedium, der kan koncentreres ved hjælp af disse enheder, er <2 gange det anbefalede volumen.
      2. Hvis viskositeten af det koncentrerede medium i reservoiret øges synligt (mørkt, tyktflydende materiale), fortyndes med fosfatbufferet saltvand (PBS) og koncentreres igen ved centrifugering for at fortynde eventuelle ikke-EV-proteiner, der er mindre end MWCO på 100 kDa.
         BEMÆRK: Dette er et potentielt stoppested.
      3. Overfør det koncentrerede medium til et kulstofbindende rør, opbevar ved 4 °C natten over, og fortsæt protokollen den følgende dag, hvis det ønskes.
   2. Hvis du arbejder med volumener betydeligt >100 ml, skal du vælge en TFF-enhed i passende størrelse (100 kDa MWCO) for at imødekomme det volumen, der skal behandles.
      BEMÆRK: Filtreringsenheder til behandling af 100 ml til >1.000 ml er kommercielt tilgængelige. Lokal tilgængelighed, omkostninger og kompatibilitet med pumpen og slanger/tilslutninger vil diktere, hvilke bestemte modeller der vil være mest nyttige. Op til 2 liter dyrkningsmedium blev behandlet med den enhed, der er angivet i materialetabellen , inden filteret skulle rengøres (se trin 2.3 nedenfor for rengøringsprotokollen).
      1. Saml et filtreringskredsløb med # 16 lavbindende / lavudvaskningsrør, 1/8 tommer slangemodhage til Luer-adaptere, TFF-enheden og en peristaltisk pumpe, som angivet i supplerende figur S2.
         BEMÆRK: Udfør TFF i et biosikkerhedsskab for at minimere risikoen for at forurene EV-præparatet med miljøbakterier.
      2. Ved stuetemperatur begynd at cirkulere det filtrerede, konditionerede medium ved ca. 200 ml/min (minimum 100 ml/min). Bestem det passende omdrejningstal svarende til den ønskede strømningshastighed ved at pumpe 200 ml PBS ind i en gradueret beholder. Når der cirkuleres filtreret, konditioneret medium, opsamles molekylerne <100 kDa, der krydser ultrafiltreringsmembranen som affald i en separat beholder.
         BEMÆRK: Eksemplet nedenfor antager et startvolumen på 2 L kultur.
      3. Fortsæt med at cirkulere det konditionerede medium, indtil dets volumen er reduceret til ~ 100-200 ml. Flyt til mindre fartøjer efter behov. Fortynd 2 gange med PBS, og fortsæt med at cirkulere med pumpen og koncentrer dig ned til 75-100 ml. Fortynd 2 gange med PBS, og fortsæt med at cirkulere til et slutvolumen på 25 ml. Fortynd 2 gange med PBS og fortsæt med at cirkulere indtil <10 ml.
      4. Løft foderslangen ud af prøvebeholderen, og fortsæt med at pumpe for at rense filteret og genvinde den maksimale mængde prøve.
         BEMÆRK: Dette er et potentielt stoppested.
      5. Den koncentrerede prøve overføres til et konisk rør, og den opbevares natten over ved 4 °C, hvis det ønskes. Alternativt kan du fortsætte med protokollen.
      6. Den koncentrerede prøve flyttes til en 15 ml kapacitet på 100 kDa MWCO centrifugal ultrafiltreringsanordning. Centrifuge i en svingende spandrotor ved 4 °C og 2.000 × g i intervaller på 15-30 minutter, indtil mediets volumen i det øverste reservoir er koncentreret til <2 ml.
         BEMÆRK: Dette er et potentielt stoppested.
      7. Overfør det koncentrerede medium til et kulstoffattigt rør, og opbevar ved 4 °C natten over, og fortsæt protokollen den følgende dag, hvis det ønskes.
3. Rengøring af TFF-enheden (valgfrit)
   BEMÆRK: Filtreringshastigheden falder, når TFF-enheden begynder at "tilstoppe" under processen (tilsmudsning). Om nødvendigt kan filteranordningen rengøres for at lette filtrering af yderligere prøver i samme rensningskørsel. Selvom det teoretisk er muligt, er et renset TFF-filter ikke blevet brugt til en anden rensningskørsel for at undgå krydskontaminering.
   1. For at rengøre skal du fjerne alle slanger og hætter fra TFF-enheden og dræne eventuel resterende væske.
   2. Brug den peristaltiske pumpe og slange til at oversvømme både TFF-enhedens indre og ydre rum (dvs. via de parallelle og vinkelrette porte i modellen, der er anført i materialetabellen) med ~ 100 ml destilleret vand. Fjern alle slanger/hætter, og tøm TFF-enheden.
   3. Dæk de ydre (vinkelret, filtrat) porte og cirkulerer 250 ml 20% ethanol i destilleret vand ved >200 ml / min i 10 minutter gennem det indre rum. Afløb, oversvøm med destilleret vand, og afløb igen som ovenfor.
   4. Cirkulere 250 ml 0,5 N frisk NaOH-opløsning i 30 minutter gennem det indre rum og afløb igen.
   5. Tilslut alle slanger og hætter til indløbs-, udløbs- og filtratportene igen, som i supplerende figur S2, og cirkulere 0,5 N NaOH-opløsning igen, indtil et volumen NaOH > 1 ml / cm² filteroverfladeareal gennemsyrer filtermembranen og opsamles som filtrat / affald.
   6. Skyl TFF-enheden med destilleret vand som ovenfor. Brug TFF-enheden med det samme, eller oversvøm enheden med ~ 100 ml 20% ethanol og opbevar natten over ved 4 ° C.
      BEMÆRK: Hvis det opbevares i ethanol, skal du sørge for at dræne, skylle med vand, dræne og cirkulere 250 ml PBS gennem enheden, indtil et volumen på >1 ml^{/ cm 2} filteroverfladeareal gennemsyrer filtermembranen og opsamles som filtrat / affald for at fjerne resterende ethanol inden prøvebehandling.
4. Kromatografi til ekskludering af størrelse (SEC)
   BEMÆRK: SEC bruges til at øge renheden af elbiler og fjerne ikke-vesikulært protein.
   1. Brug en lille SEC-søjle (10 ml sengevolumen) til isolering af elbiler fra <100 ml udgangsmateriale og en større søjle (47 ml sengevolumen) til isolering af elbiler fra >100 ml udgangsmateriale.
      BEMÆRK: Eksemplet nedenfor viser volumener for den større kolonne med volumener for den mindre kolonne i parentes.
   2. Bring SEC-kolonnen og PBS til stuetemperatur over flere timer. Stabiliser SEC-søjlen i lodret position ved hjælp af et standard laboratoriestativ og holder. Alternativt kan du bruge kommercielle kromatografikolonnestande.
   3. Før du tilslutter til SEC-kolonnen, skal prøvebeholderen hydreres ved at lade 5 ml PBS strømme gennem fritten og ind i en affaldsbeholder. Skru indløbshætten på SEC-kolonnen af, tilsæt 2 ml PBS til prøvebeholderen, og tilslut forsigtigt reservoiret til søjlen, da PBS drypper ud gennem fritten (gælder ikke for små SEC-kolonner).
      BEMÆRK: Dette forrige trin forhindrer luftbobler i at blive fanget øverst i SEC-kolonnen. Hvis der er fanget luft, skal du fjerne reservoiret, trykke på kolonnen for at få luftboblen ud og gentage forbindelsesproceduren. For den mindre kolonne skal du blot fjerne hætten på toppen af SEC-kolonnen og fastgøre prøvebeholderen.
   4. Der tilsættes 47 ml (10 ml) PBS til prøvebeholderen, og bunden af SEC-kolonnen fjernes. Tillad, at hele den indlæste prøvebuffer strømmer gennem kolonnen for at opnå ækvilibrering. Kassér gennemstrømningen.
   5. Der indlæses højst 2 ml (0,5 ml) prøve på prøvebeholderen, gennemstrømningen kasseres, og prøven kommer helt ind i kolonnen.
   6. Der tilsættes straks PBS til prøvebeholderen eller beholderen med et volumen på 14,25 ml minus prøvevolumen (3 ml minus prøvevolumenet for den lille kolonne). Lad opløsningen strømme gennem kolonnen, og kassér dette beløb svarende til kolonnens tomme volumen.
      BEMÆRK: For en typisk 2 ml prøve vil mængden af PBS, der skal tilsættes til prøvebeholderen eller tragten, være 12,25 ml.
   7. Placer et 2 ml lavbindende mikrorør direkte under SEC-søjlen. Tilsæt straks 2 ml (0,5 ml) PBS til prøvebeholderen, og lad det komme ind i kolonnen. Mærk denne første 2 ml (0,5 ml) gennemstrømning som fraktion 1. Fortsæt med at tilføje 2 ml (0,5 ml) ad gangen til prøvebeholderen for at indsamle hver efterfølgende fraktion.
      BEMÆRK: De fleste bakterielle elbiler elueres i de første 5 fraktioner. Under optimering blev de første 12 fraktioner indsamlet.
   8. Fraktionerne opbevares ved 4 °C til kortvarig opbevaring (dage) eller -80 °C til langtidsopbevaring.
   9. Rengøring og opbevaring af de genanvendelige SEC-kolonner
      BEMÆRK: SEC-kolonnerne beskrevet i denne protokol kan genbruges op til 5 gange ifølge producenten. Hvis strømningshastigheden for SEC-kolonnerne falder efter <5 anvendelser, anbefaler producenten centrifugering af de koncentrerede prøver ved 10.000 x g i 10 minutter for at rydde eventuelle aggregater før SEC. Indlæs derefter supernatanten af denne centrifugering på SEC-kolonnen til EV-isolering.
      1. For at rengøre og gemme SEC-kolonnen efter hver brug skal du tilføje 2 ml (0,5 ml) 0,5 M NaOH og lade den komme helt ind i kolonnen. Kør 100 ml (20 ml) 20% ethanol gennem søjlen og opbevar den ved 4 °C indtil næste brug. Før næste brug skal ethanolen ækvilibreres til stuetemperatur som ovenfor, og den udveksles med PBS-buffer ved at køre yderligere 150 ml (30 ml) PBS gennem søjlen.
      2. For at rengøre og straks genbruge SEC-kolonnen efter hver brug skal du tilføje 2 ml (0,5 ml) 0,5 M NaOH og lade den komme helt ind i kolonnen. Kør ca. 150 ml (30 ml) PBS-buffer for at vaske NaOH væk. Når eluatets pH-værdi er lig med PBS (~7), kan der indlæses en ny prøve.

3. Kvalitetskontrol af EV-forberedelse

1. Sterilitet test
   BEMÆRK: Da disse elbiler kommer fra bakteriekulturer, er det afgørende at sikre sterilitet inden downstream-brug.
   1. Opnå 100 μL (20 μL) af de fraktioner, der skal anvendes i assays, og pod 3 ml af det medium, der anvendes til at dyrke kildebakterierne. Kultur under de respektive optimale forhold i mindst 3 dage og observere for turbiditet. Alternativt kan du anvende fraktionsprøverne på agarplader, der indeholder det medium, der bruges til at dyrke de producerende bakterier, og se efter kolonidannelse.
      BEMÆRK: Hvis der opdages bakteriel forurening, anbefales det ikke at bruge EV-præparatet til forsøg. Gentag i stedet isolationen, idet du sørger for at minimere risikoen for bakteriel kontaminering ved (a) at udføre tilstrækkelig centrifugering / filtrering af konditioneret bakteriecellekulturmedium, (b) ved hjælp af rene flasker, slanger, filtre og kromatografikolonner og (c) anvende passende aseptiske teknikker.
2. Kvantificering af proteiner
   BEMÆRK: Der blev anvendt et fluorescensbaseret proteinkvantificeringssæt med høj følsomhed (se materialetabellen). Sættet fungerer med et matchende proprietært fluorimeter ved excitations- / emissionsbølgelængder på 485/590 nm.
   1. Bring alle reagenser, standarder og prøver til stuetemperatur.
   2. Der fremstilles en masterblanding af proteinreagens og buffer ved at tilsætte 1 μL reagens til 199 μL buffer for hver prøve og standard, der skal analyseres. Brug tyndvæggede 0,5 ml PCR-rør til at tilføje 10 μL standard + 190 μL mastermix til hvert standardrør.
      BEMÆRK: For at være inden for analyseområdet afhænger mængden af hver fraktion, der skal tilsættes til hvert prøverør, af det forventede proteinudbytte af oprensningen. Typisk blev der anvendt 5 μL af hver fraktion + 195 μL mastermix. Det endelige volumen af prøve + masterblanding skal være 200 μL.
   3. Hvirvel analyserørene, og inkuber i mindst 15 minutter ved stuetemperatur i mørke.
   4. Mål standarderne på det relevante proprietære fluorimeter (se materialetabellen) ved at vælge proteinanalyseindstillingen ved hjælp af pileknapperne og trykke på GO-knappen for at bekræfte. Følg instruktionerne på skærmen, indsæt hvert standardrør og tryk på GO.
   5. Indsæt det eksperimentelle prøverør; tryk på GO for at læse; og bemærk det viste resultat, som er den faktiske proteinkoncentration i assaybufferen/prøveblandingen. For at opnå proteinkoncentrationen i prøven skal du bruge piletasterne til at vælge indstillingen Beregn prøvekoncentration , trykke på GO, og bruge piletasterne til at vælge prøvevolumen , der er føjet til analysebufferen for den givne prøve. Tryk på GO og registrer prøveproteinkoncentrationen. Gentag dette trin for hver prøve, der skal analyseres.
3. Partikeltælling og størrelsesfordeling
   BEMÆRK: Microfluidics resistive pulse sensing (MRPS) blev brugt til at kvantificere EV-koncentration og størrelsesfordeling.
   1. Fortynd prøverne i PBS suppleret med 1% Tween-20, der er filtreret gennem et sprøjtefilter på 0,02 μm til en proteinkoncentration på ca. 0,1 μg/ml.
      BEMÆRK: Målet med fortynding er at nå en forventet partikelkoncentration i området 10¹⁰ partikler / ml i EV-holdige fraktioner. Den optimale fortynding skal muligvis bestemmes empirisk. Der forventes kun få elbiler til senere fraktioner (ud over fraktion 6). Således vil partikelkoncentrationen sandsynligvis være <10¹⁰ partikler / ml på trods af analyse ved lave fortyndinger.
   2. Der lægges 3 μL af hver prøve i engangsmikrofluidikpatronen med en mikropipette, patronen indsættes i MRPS-instrumentet, og tryk på metalknappen med en blå oplyst kant.
   3. Klik på Gå! på anskaffelsessoftwaren, og vent på, at prøven analyseres af instrumentet. Anskaf 1.000 til 10.000 partikelhændelser for at minimere den tekniske statistiske analysefejl. På dette tidspunkt skal du klikke på Stop og Afslut kørsel for at fuldføre eksempelanskaffelsen.
      BEMÆRK: Sammen med rådatafilerne udsender instrumentet et resuméregneark med angivelse af partikelkoncentrationen i prøven. Denne værdi korrigeres i henhold til prøvefortyndingen.
   4. Brug analysesoftware til at indlæse rådata og generere tilpassede grafer over størrelsesfordeling.

4. Opbevaring af elbiler

1. Aliquot individuelle eller samlede fraktioner til 25-50% af den individuelle fraktionsstørrelse (afhængigt af størrelsen af den anvendte søjle) i rør med lavt proteinindhold og opbevares ved -80 ° C for at undgå fryse-optøningscyklusser.
   BEMÆRK: Forskellige applikationer kan kræve mindre eller større alikvoter afhængigt af den forventede mængde, der anvendes i hvert eksperiment. Dette skal bestemmes empirisk. De ikke-EV-holdige fraktioner kan kasseres, hvis de ikke er anvendelige til forskningsmålene.

5. Transmissionselektronmikroskopi

1. Negativ farvning
   1. Der tilsættes 5 μL af EV-prøven til det kulstofbelagte kobber 400-maskegitter, og der inkuberes ved stuetemperatur i 10 min. Prøvesiden vaskes med 5 dråber 5 mM Tris-buffer (pH 7,1) og derefter med 5 dråber destilleret vand.
   2. Plet prøve side med 5 dråber 2% uranylacetat. Fjern enhver ekstra mængde plet med filterpapir, og lad gitteret tørre helt i flere timer eller natten over. Visualiser prøverne med et elektronmikroskop, der drives ved 80 kV.
2. Immunogold mærkning
   1. Påfør 10 μL EV-suspensionen på et formvar/carbon 400 mesh-gitter, og inkuberes ved stuetemperatur i 1 time. Gitteret vaskes i PBS tre gange, og påfør derefter 4% paraformaldehyd i 10 minutter for at fiksere prøven. Vask gitterene fem gange med PBS.
   2. Bloker gitteret med tre vaske PBS indeholdende 0,1% bovin serumalbumin (BSA). Påfør derefter 10 μL af et primært antistof i 40 minutter ved stuetemperatur (her 1 μg / ml nluc-antistof). Der vaskes tre gange igen med PBS indeholdende 0,1% BSA.
   3. Tilsæt 10 μL sekundært guldmærket antistof til gitteret og inkuber i 40 minutter ved stuetemperatur. Vask gitterene tre gange med PBS.
      BEMÆRK: Her blev et gedeantimuseantistof konjugeret med 10 nm guldnanopartikler brugt efter fortynding 1:10 i blokerende buffer. Hvis guldmærkning tilslører EV-visualisering, kan sekundære antistoffer med mindre guldnanopartikler (f.eks. 5 nm) bruges i stedet.
   4. Efterfix gitteret med 10 μL 2,5% glutaraldehyd i 10 minutter ved stuetemperatur. Vask tre gange i PBS. Udfør negativ farvning med 2% uranylacetat (10 μL) i 15 min. Prøverne indlejres i 10 μL 0,5% uranylacetat og 0,13% methylcelluloseopløsning i 10 min.
   5. Lad prøvegitterne tørre natten over ved stuetemperatur, før de billeddannes på elektronmikroskopet.
   6. På mikroskopanskaffelsessoftwaren skal du bestemme eksponeringen empirisk for at opnå den optimale kvalitet af billedet (f.eks. 0,80851 s i denne særlige opsætning) og justere den ved at skrive denne værdi i indstillingsfeltet eksponeringstid . Vælg indstillingen 80 kV , og klik på Start anskaffelse for at tage billedet.

Representative Results

For at vurdere, hvilke SEC-kromatografifraktioner der blev beriget for elbiler, blev SEC-kolonnen fyldt med 2 ml E. coli MP1-konditioneret kulturmedium, der var blevet koncentreret 1.000 gange af TFF, og sekventielle fraktioner blev indsamlet. Ved hjælp af MRPS blev det konstateret, at fraktion 1-6 indeholdt flest elbiler (figur 2A). Efterfølgende fraktioner indeholdt meget få elbiler, der i stedet for EV-frie proteiner (figur 2B). Elbiler var primært <100 nm i diameter (figur 2C). TEM bekræftede EV-berigelse og størrelse, især i fraktion 2-6 (figur 2D).

For yderligere at sikre, at metoderne var i stand til at adskille elektriske køretøjer fra ikke-EV-associerede proteiner, blev der genereret en rekombinant stamme af E. coli MP1, der udtrykker et cytolysin A-nanoluciferase fusionsprotein og frit (ikke-smeltet) mCherry (skematiseret i figur 3A). Cytolysin A fusionsproteiner blev tidligere vist at forbinde med E. coli EVs¹⁴. For at overvåge mCherry-fluorescens blev 100 μL aliquoter fra hver kromatografifraktion overført til brøndene i en 96-brøndsplade. Deres fluorescens blev målt i en mikropladelæser ved hjælp af henholdsvis 580 nm og 620 nm som absorptions- og emissionsbølgelængder.

Tilsvarende blev en 20 μL aliquot af hver fraktion til luminescensmåling blandet med et lige stort volumen af Luciferase-assayopløsningen i en 384-brøndsplade, inkuberet i 15 minutter, og synlig lysluminescens blev målt. Det blev observeret, at EV-berigede fraktioner (fraktioner 2-7) havde høj nanoluciferaseaktivitet, der kunne sammenlignes med senere fraktioner, men kun et meget lavt fluorescerende signal fra ikke-EV-associeret mCherry (figur 3B). Baggrundssignal fra en lige så stor mængde negative kontrol-elbiler (isoleret fra en matchet bakteriestamme, der mangler nanoluciferase-ekspression) var >1.000 gange lavere i EV-fraktioner. Signalet fra den positive kontrol (en nanoluciferase-ekspressiv bakteriecellepille) var ca. 1.000 gange højere end fra EV-fraktionerne (ikke vist). Sidstnævnte blev normaliseret til det oprindelige volumen af cellekulturmateriale, der gav henholdsvis de analyserede celler eller EV'er. EV-foreningen af nanoluciferase blev bekræftet i fraktioner 2-5 ved immunguldmærkning (figur 3C), idet mærkningen blev observeret inden for de små ~ 20 nm isolerede elbiler.

Endelig blev EV'er isoleret fra ~ 100 ml kulturer af følgende forskellige anaerobe bakterier for at vurdere anvendeligheden af denne protokol på andre bakteriearter: A. mucinophila, B. thetaiotaomicron, B. breve og B. dentium fremstillet i BHI-kulturmedium. Som en kontrol blev elbiler isoleret fra det friske BHI-kulturmedium. Mens EV-udbyttet varierede efter art, blev det igen observeret, at tidlig kromatografi fraktion 1-4 blev beriget for elbiler (figur 4A). Det komplekse BHI-medium indeholdt også partikler i EV-størrelse, omend ved <25% af det samlede EV-udbytte i disse præparater (figur 4A, sorte bjælker). Elbiler af disse bakterier viste sig også at være primært <100 nm i størrelse (figur 4B).

Figur 2: Repræsentativ E. coli MP1 EV-eluering i tidlige kromatografifraktioner. (A) Partikelantal ved MRPS i sekventielle 2 ml kromatografifraktioner. SEC-input var 2 L bakteriekultursupernatant koncentreret til 2 ml. Solid linje repræsenterer middelværdi; (B) Proteinkoncentration i hver fraktion. (C) Størrelsesfordeling af fraktion 3 elbiler målt ved MRPS. Solid linje repræsenterer middelværdi; skraveret område repræsenterer 95% CI. Bemærk, at instrumentet ikke kan kvantificere partikler <50 nm. D) Transmissionselektronmikrografer af sekventielle, samlede kromatografifraktioner og friskkulturmedium (kontrol). Alle billeder blev taget med samme skala (100 nm). Bredfelt TEM-billeder er vist i supplerende figur S3. Forkortelser: EV = ekstracellulær vesikel; MRPS = mikrofluidik resistiv puls sensing; SEC = størrelsesekskluderingskromatografi; SEM = standardfejl i middelværdien; CI = konfidensinterval. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 3: Adskillelse af E. coli MP1-elbiler fra EV-fri proteiner af SEC. (A) Skematisk af E. coli MP1, der udtrykker rekombinant mCherry (rød) i cytoplasmaet og periplasm-trafficking cytolysin A-nanoLuciferase fusionsprotein (gule diamanter). (B) nanoLuciferase bioluminescensaktivitet og mCherryfluorescens blev overvåget i sekventielt eluerede kromatografifraktioner. Lodret stiplet linje repræsenterer grænsen for EV-berigede fraktioner baseret på analyser i figur 2. (C) EV-fraktioner (F2-5) blev immunguld mærket efter farvning med anti-nanoLuciferase-antistof. Cyan pilespidser peger på guldkonjugeret sekundært antistof, der kolokaliserer med små elbiler. Kontrol-elbiler fra vildtype E. coli MP1 havde ubetydelig ikke-specifik farvning. Begge billeder blev taget med samme skala (100 nm). Bredfelt TEM-billeder er vist i supplerende figur S4. Forkortelser: EV = ekstracellulær vesikel; SEC = størrelsesekskluderingskromatografi; F = brøk; TEM = transmissionselektronmikroskopi; ClyA-nLuc = cytolysin A-nanoLuciferase fusionsprotein. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 4: Isolering af elbiler fra forskellige bakteriearter. Angivne arter blev dyrket i 48 timer i BHI-medium under anaerobe forhold. EV'er blev isoleret ved ultrafiltrering + SEC. (A) EV-koncentration i de første 4 SEC-fraktioner målt ved MRPS. ±Sorte bjælker repræsenterer partikler, der detekteres i et parti frisk BHI-medium (kontrol). (B) Størrelsesfordeling af elbiler i fraktion 2. Forkortelser: EV = ekstracellulær vesikel; MRPS = mikrofluidik resistiv puls sensing; SEC = størrelsesekskluderingskromatografi; BHI = infusion af hjernehjerte. Klik her for at se en større version af denne figur.

Supplerende figur S1: p114-mCherry-Clyluc plasmid. (A) Kort over p114-mCherry-Clyluc plasmid. (B) Sekvens af J23114-mCherry-clyA-nluc-regionen. Violet, J23114 Promotor; Lyserødt, mCherry gen; Gråt, clyA gen; Grøn, Linker sekvens; Orange, nLuc gen. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur S2: Tangential flow filtration (TFF) opsætning skematisk. Slangen med modhageslanger var forbundet til TFF-enheden, som vist. Foderstrømsrør begynder nedsænket i den filtrerede, konditionerede kulturmediumbeholder, fortsætter gennem den peristaltiske pumpe og forbinder til TFF-enhedens indløbsport. Returstrømmen begynder ved TFF-enhedens udløbsport og slutter over overfladen af det filtrerede, konditionerede kulturmedium. Eventuelt kan en modtryksklemme (f.eks. En skruemøtrik + bolt eller simpel papirklemme) bruges til at øge filtreringshastigheden. Når pumpen cirkulerer det konditionerede medium, fører udviklet tryk i TFF-enheden til ultrafiltrering og fjernelse af komponenter <100 kDa gennem filtrat/affaldsstrømsrør, som kan opsamles i en separat beholder til bortskaffelse (magenta). Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur S3: Widefield transmissionselektronmikrografer. TEM-billeder af sekventielle, samlede kromatografifraktioner og frisk kulturmedium (kontrol) vist i figur 2D. Billederne viser, at E. coli MP1 ekstracellulære vesikler elulater i tidlige kromatografifraktioner. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur S4: Widefield TEM-billeder til figur 3C. EV-fraktionerne (F2-5) blev immunguldmærket efter farvning med anti-nano-Luciferase-antistof. Cyan pilespidser peger på guldkonjugeret sekundært antistof, der kolokaliserer med små elbiler. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende metode: Til rekombinant E. coli MP1-stamme, der huser p114-mCherryClyluc. Klik her for at downloade denne fil.

Discussion

I protokollen ovenfor beskrives en metode, der er skalerbar og pålideligt isolerer elbiler fra forskellige gramnegative / positive og aerobe / anaerobe bakterier. Det har flere potentielle stoppunkter under hele proceduren, selvom det er bedre at undgå at tage længere tid end 48 timer at isolere elbiler fra konditionerede bakteriekulturmedier.

For det første består det af dyrkning af bakterier for at generere betinget bakteriekulturmedium. Det blev konstateret, at forøgelse af kulturtiden til mindst 48 timer og brug af det optimale vækstmedium hjælper med at maksimere EV-udbyttet. Det er sandsynligt, at hver bakterieart skal optimeres med hensyn til disse to parametre. Volumenet af bakteriekulturen er også vigtigt for at sikre, at tilstrækkelige elbiler isoleres til den ønskede anvendelse. For in vitro-undersøgelser er elbilerne typisk isoleret fra mindst 100 ml, mens elbiler for in vivo-undersøgelser typisk er isoleret fra >1 liter kulturmedium. Igen vil EV-produktionsegenskaberne for hver bakteriestamme og den krævede EV-mængde til downstream-assays diktere det mindste startkulturvolumen.

Når det konditionerede dyrkningsmedium er tilgængeligt, skal celler og stort ikke-EV-affald fjernes. Det blev konstateret, at centrifugering er et kritisk skridt i denne proces. Som nævnt i protokollen ovenfor blev der udført to stigende g-kraftcentrifuger. Lejlighedsvis udføres yderligere 10.000 × g centrifugering, hvis det blev bemærket, at pelleten i det andet spin ikke er kompakt. Derefter udføres steril filtrering af denne supernatant gennem et 0,22 μm filter. Utilstrækkelig centrifugering fører til tilstopning og dårlig udførelse af dette filtreringstrin. Det blev bemærket, at fortsat filtrering af supernatanten, efter at filtreringshastigheden er betydeligt bremset, kan føre til filterfejl og forurening af EV-præparatet med forældrebakterierne. Løsningen på vedvarende tilstopning af filteret er at omcentrifugere og/eller genfiltrere supernatanten, hvilket sikrer sterilitet. De beskrevne centrifugerings- og vakuumdrevne filtreringstrin blev testet for op til i alt 4 liter bakteriekultur. Yderligere opskalering af EV-isolering kan kræve ændringer. For eksempel kan begge disse trin potentielt erstattes med sekventiel pumpedrevet filtrering ved hjælp af kompatible filteranordninger med faldende porestørrelse ned til 0,22 μm. Dette mangler dog stadig at blive testet.

I den nuværende protokol beskrives to variationer afhængigt af bakteriekulturens startvolumen. For volumener <100 ml skal du bruge centrifugal ultrafiltreringsanordninger til at koncentrere kulturmediet. MWCO er kritisk i disse trin. For pattedyrs elbiler blev >300 kDa MWCO tidligere brugt^11,12. Dette resulterede imidlertid i meget dårlige EV-udbytter fra bakterier, formodentlig på grund af den mindre størrelsesfordeling. Det anbefales derfor at bruge 100 kDa MWCO. En mindre MWCO kan også bruges, men er forbundet med længere centrifugeringstider og mindre fjernelse af små molekylvægtsforurenende stoffer, hvilket øger prøveviskositeten. Det er også nyttigt at have forskellige størrelser af ultrafiltreringsenheder ved 100 kDa MWCO for at hjælpe med at koncentrere forskellige startvolumener af prøve i hele protokollen.

Alternativt kan du anvende pumpedrevet TFF til at koncentrere prøven til prøvestørrelser på betydeligt >100 ml. igen er det kritisk at bruge en 100 kDa MWCO. Denne metode gør det muligt at behandle store mængder kulturmedium på en halvautomatisk måde. Det er vigtigt at få en TFF-enhed i passende størrelse til startkulturvolumenet. Den anvendte enhed er klassificeret til behandling af op til 200 ml materiale af producenten. Det var muligt at behandle op til ca. 2 L. Imidlertid blev der observeret et alvorligt fald i filtreringshastigheden, når man forsøgte at behandle større mængder, hvilket krævede, at processen blev stoppet og enheden rengjort inden yderligere behandling. Således vil egenskaberne ved hver bakteriekultur og mængden af udgangsmateriale diktere den krævede størrelse af TFF-enheden. Desuden er den opnåelige pumpehastighed en anden vigtig parameter for TFF. Ved lave hastigheder på ~100 ml/min var det nødvendigt at øge modtrykket i TFF-enheden ved hjælp af en klemme, som angivet i supplerende figur S2, for at lette filtreringen, hvilket øger filterets tilsmudsningshastighed. Slangen blev genbrugt op til 2 gange efter passende dekontaminering og autoklavering.

Når prøven er koncentreret, kan den derefter indlæses på en SEC-kolonne for at isolere elbilerne. Kommercielle kolonner optimeret til lille EV-isolering blev brugt. For små startprøver skal du bruge kolonner med 0,5 ml belastningsvolumen og bruge kolonnerne med 2 ml belastningsvolumen til større startprøver op til 2 L. Det er sandsynligt, at behandlingen af startkulturer >2 L vil kræve større kolonner. Producenter af EV-optimerede søjler tilbyder i øjeblikket SEC-kolonner, der er i stand til at acceptere >100 ml koncentreret materiale.

Forskellige metoder bruges til at karakterisere de isolerede elbiler, hvoraf de fleste er bredt tilgængelige. Normalisering var baseret på proteinkoncentrationen for de fleste assays, fordi dette ikke påvirkes af manglende evne til andre kvantificeringsmetoder (nemlig partikelkvantificering ved teknologier som MRPS) til at detektere meget små elbiler <50 nm. MRPS og andre nanopartikelkvantificeringsteknologier er fortsat nyttige i den relative kvantificering af elbiler blandt de forskellige fraktioner.

Et kritisk aspekt af MRPS-kvantificering er fortyndingsniveauet. Når de fortyndes korrekt, bør hyppigheden af detekterede elektriske køretøjer i de fleste tilfælde fortsætte med at stige til detektionsgrænsen, da instrumentet ikke kan kvantificere partikler <50 nm. Utilstrækkelig fortynding vil føre til høj instrumentstøj, hvilket vil generere en artefaktuel klokkeformet kurve med en top >65 nm (ved brug af den anbefalede C-300 mikrofluidikpatron). Under dataanalyse af størrelsesfrekvensfordelingen observeres der stadig en artefakttop mellem 50 nm (instrumentets absolutte detektionsgrænse) og 60 nm på trods af tilstrækkelig fortynding. Dette skyldes sandsynligvis tilstedeværelsen af et betydeligt antal meget små bakterielle elbiler (som visualiseret i TEM, figur 2D), der ligger under grænsen for nøjagtig detektion af MRPS og igen fører til instrumentstøj. I dette tilfælde skal du udelukke datapunkter, der er mindre end den observerede "top", som bliver den de facto nedre kvantificeringsgrænse for den givne prøve.

Som beskrevet i denne protokol kan kvantificeringen af EV-tæthed, total proteinkoncentration og overflod af ikke-EV-proteiner i de eluerede kromatografifraktioner hjælpe brugerne med at beslutte, hvilke fraktioner der skal bruges til downstream-assays. For eksempel blev der påvist små elbiler i puljefraktioner 7-8 (figur 2D); deres forekomst var imidlertid lavere end i de umiddelbart foregående fraktioner, mens den samlede proteinkoncentration (figur 2B) var højere. Dette kan tyde på, at fraktion 7-8 indeholder større mængder ikke-EV-associerede proteiner og derfor muligvis ikke er ønskeligt til visse downstream-applikationer.

Sammenfattende beskrives en alsidig EV-isolationsprotokol, der er afhængig af kommercielt tilgængelige materialer, her. Betydningen af denne metode sammenlignet med udbredte ultracentrifugeringsbaserede metoder er, at den omfatter trin, der let kan reproduceres af forskellige brugere og er meget skalerbare. Dette er især vigtigt for at lette frembringelsen af tilstrækkeligt materiale til in vivo-undersøgelser . Det blev brugt til at isolere elbiler fra kulturer på 100 ml til 2 L. I betragtning af den brede vifte af tilgængelige TFF-enheder er det muligt, at denne protokol kan tilpasses større rensninger med en vis ændring. Den beskrevne isolationsprotokol er primært baseret på elbilers fysiske egenskaber, nemlig deres størrelse, og kan sandsynligvis anvendes på bakteriearter ud over dem, der er beskrevet i denne undersøgelse.

En begrænsning af den beskrevne protokol er, at den favoriserer isolering af små elbiler, især <100 nm, som det ses i de repræsentative resultater. Tidligere rapporter beskriver også tilstedeværelsen af større bakterielle elbiler^15,16. Isolering af større bakterielle elbiler kan kræve ændringer af protokollen ovenfor, for eksempel ved at bruge SEC-kolonner optimeret til større elbiler. Sådanne SEC-kolonner er også kommercielt tilgængelige. Desuden kan andre protokoller sandsynligvis opnå højere EV-renhed (for eksempel densitetsgradient ultracentrifugering eller immunisolering). Disse metoder mangler imidlertid gennemstrømningen og skalerbarheden af de metoder, der er beskrevet i denne undersøgelse. Ændring af denne protokol med yderligere rensningstrin i fremtiden kan yderligere øge udbyttet og renheden af præparater, hvilket kan være vigtigt for eksperimentelle og terapeutiske anvendelser.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5 mL flat cap, thin-walled PCR tubes	Thermo Scientific	3430	it is important to use thin-walled PCR tubes to obtain accurate readings with Qubit
16% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution	Electron microscopy sciences	15700
250 mL Fiberlite polypropylene centrifuge bottles	ThermoFisher	010-1495
500 mL Fiberlite polypropylene centrifuge bottles	ThermoFisher	010-1493
65 mm Polypropylene Round-Bottom/Conical Bottle Adapter	Beckman Coulter	392077	Allows Vivacell to fit in rotor
Akkermansia mucinophila	ATCC	BAA-835
Amicon-15 (100 kDa MWCO)	MilliporeSigma	UFC910024
Avanti J-20 XPI centrifuge	Beckman Coulter		No longer sold by Beckman. Avanti J-26XP is closest contemporary model.
Bacteroides thetaiotaomicron VPI 5482	ATCC	29148
Bifidobacterium breve	NCIMB	B8807
Bifidobacterium dentium	ATCC	27678
Brain Heart infusion (BHI) broth	Himedia	M2101	After autoclaving, Both BHI broth and agar were introduced into the anaerobic chamber, supplemented with Menadione (1 µg/L), hematin (1.2 µg/L), and L-Cysteine Hydrochloride (0.05%). They were then incubated for at least 24 h under anaerobic conditions before inoculation with the anaerobic bacterial strains.
C-300 microfluidics cartridge	Spectradyne
Chloramphenicol	MP Biomedicals	ICN19032105
Electron microscope	FEI company	Tecnai G2 SpiritBT
Escherichia coli HST08 (Steller competent cells)	Takara	636763
Escherichia coli MP1	Dr. Mark Goulian (gift)		commensal bacteria derived from mouse gut
Fiberlite 500 mL to 250 mL adapter	ThermoFisher	010-0151-05	used with Fiberlite rotor to enable 250 mL bottles to be used for smaller size of starting bacterial culture
Fiberlite fixed-angle centrifuge rotor	ThermoFisher	F12-6x500-LEX	fits 6 x 500 mL bottles
Formvar Carbon Film 400 Mesh, Copper	Electron microscopy sciences	FCF-400-CU
Glutaraldehyde (EM-grade, 10% aqeous solution)	Electron microscopy sciences	16100
Hematin	ChemCruz	207729B	Stock solution was made in 0.2 M L-histidine solution as  1.2 mg/mL
Infinite M Nano+ Microplate reader	Tecan		This equibment was used to measure the mCherry fluorescence
In-Fusion  HD Cloning Plus	Takara	638909	For cloning of the PCR fragements into the PCR-lineraized vectors
JS-5.3 AllSpin Swinging-Bucket Rotor	Beckman Coulter	368690
Lauria Bertani (LB) broth, Miller	Difco	244620
L-Cysteine Hydrochloride	J.T. Baker	2071-05	It should be weighed and added directly to the autoclaved BHI media inside the anaerobic chamber
Masterflex Fitting, Polypropylene, Straight, Female Luer to Hose Barb Adapter, 1/8" ID; 25/PK	cole-parmer - special	HV-30800-08	connection adapters for filtration tubing circuit
Masterflex Fitting, Polypropylene, Straight, Male Luer to Hose Barb Adapter, 1/8" ID; 25/PK	cole-parmer - special	HV-30800-24	connection adapters for filtration tubing circuit
Masterflex L/S Analog Variable-Speed Console Drive, 20 to 600 rpm	Masterflex	HV-07555-00
Masterflex L/S Easy-Load Head for Precision Tubing, 4-Roller, PARA Housing, SS Rotor	Masterflex	EW-07514-10
Masterflex L/S Precision Pump Tubing, PharmaPure, L/S 16; 25 ft	Cole Palmer	EW-06435-16	low-binding/low-leaching tubing
Menadione (Vitamin K3)	MP	102259	Stock solution was made in ethanol as 1 mg/mL
MIDIKROS 41.5CM 100K MPES 0.5MM FLL X FLL 1/PK	Repligen	D04-E100-05-N	TFF device we have used to filter up to 2 L of E. coli culture supernatant
Nano-Glo Luciferase Assay System	Promega	N1110	This assay kit was used to measure the luminescence of the nluc reporter protein
NanoLuc (Nluc) Luciferase Antibody, clone 965808	R&D Systems	MAB10026
nCS1 microfluidics resistive pulse sensing instrument	Spectradyne
nCS1 Viewer	Spectradyne		Analysis software for particle size distribution
OneTaq 2x Master Mix with Standard Buffer	NEB	M0482	DNA polymerase master mix used to perform the routine PCR reactions for colony checking
Protein LoBind, 2.0 mL, PCR clean tubes	Eppendorf	30108450
Q5 High-Fidelity 2x Master Mix	NEB	M0492	DNA polymerase master mix used to perform the PCR reactions needed for cloning
qEV original, 35 nm	Izon		maximal loading volume of 0.5 mL
qEV rack	Izon		for use with the qEV-original SEC columns
qEV-2, 35 nm	Izon		maximal loading volume of 2 mL
Qubit fluorometer	ThermoFisher		Item no longer available. Closest available product is Qubit 4.0 Fluorometer (cat. No. Q33238)
Qubit protein assay kit	ThermoFisher	Q33211	Store kit at room temperature. Standards are stored at 4 °C.
Sorvall Lynx 4000 centrifuge	ThermoFisher	75006580
SpectraMax i3x Microplate reader	Molecular Devices		This equipment was used to measure the nanoluciferase bioluminescence
Stericup Quick-release-GP Sterile Vacuum Filtration system (150, 250, or 500 mL)	MilliporeSigma	S2GPU01RE S2GPU02RE S2GPU05RE	One or multiple filters can be used to accommodate working volumes. In our experience, you can filter twice the volume listed on the product size.
Uranyl acetate	Electron microscopy sciences	22400
Vinyl anaerobic chamber	Coy Lab
Vivacell 100, 100,000 MWCO PES	Sartorius	VC1042
Whatman Anotop 10 Plus syringe filters (0.02 micron)	MilliporeSigma	WHA68093002	to filter MRPS diluent