Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Visualisering av inflammatorisk kaspas inducerad närhet i humana monocyt-härledda makrofager

Published: April 6, 2022 doi: 10.3791/63162
Automatic Translation
1, 1
1Department of Pediatrics, Division of Hematology-Oncology, Department of Molecular and Cellular Biology, Texas Children’s Hospital William T. Shearer Center for Human Immunobiology, Baylor College of Medicine

Summary

Detta protokoll beskriver arbetsflödet för att erhålla monocyter-härledda makrofager (MDM) från humana blodprover, en enkel metod för att effektivt införa inflammatoriska kaspas bimolekylära fluorescenskomplementering (BiFC) reportrar i human MDM utan att kompromissa med cellviabilitet och beteende, och ett bildbaserat tillvägagångssätt för att mäta inflammatorisk kaspasaktivering i levande celler.

Abstract

Inflammatoriska kaspaser innefattar caspase-1, -4, -5, -11 och -12 och tillhör undergruppen av initiator caspases. Caspase-1 krävs för att säkerställa korrekt reglering av inflammatorisk signalering och aktiveras av närhetsinducerad dimerisering efter rekrytering till inflammasomer. Caspase-1 är rikligt i den monocytiska cellinjen och inducerar mognad av de proinflammatoriska cytokinerna interleukin (IL)-1β och IL-18 till aktiva utsöndrade molekyler. De andra inflammatoriska kaspaserna, caspase-4 och -5 (och deras murina homolog caspase-11) främjar IL-1β-frisättning genom att inducera pyroptos. Caspase Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) är ett verktyg som används för att mäta inflammatorisk kaspasinducerad närhet som en avläsning av caspase-aktivering. Caspase-1, -4 eller -5 prodomain, som innehåller regionen som binder till inflammasomen, smälts samman med icke-fluorescerande fragment av det gula fluorescerande proteinet Venus (Venus-N [VN] eller Venus-C [VC]) som associerar till att reformera det fluorescerande Venus-komplexet när kaspaserna genomgår inducerad närhet. Detta protokoll beskriver hur man introducerar dessa reportrar i primära humana monocyt-härledda makrofager (MDM) med hjälp av nukleofsektion, behandlar cellerna för att inducera inflammatorisk kaspasaktivering och mäter kaspasaktivering med fluorescens och konfokalmikroskopi. Fördelen med detta tillvägagångssätt är att det kan användas för att identifiera komponenterna, kraven och lokaliseringen av det inflammatoriska kaspasaktiveringskomplexet i levande celler. Noggranna kontroller måste dock övervägas för att undvika att äventyra cellens livskraft och beteende. Denna teknik är ett kraftfullt verktyg för analys av dynamiska kaspasinteraktioner på inflammasomnivå samt för förhör av de inflammatoriska signalkaskaderna i levande MDM och monocyter härledda från humana blodprover.

Introduction

Kaspaserna är en familj av cysteinaspartatproteaser som kan grupperas i initiator caspases och executioner caspases. Bödelskapaser består av caspase-3, -6 och -7. De finns naturligt i celler som dimerer och klyvs av initiatorkasserna för att utföra apoptos1. Initiator caspases inkluderar human caspase-1, -2, -4, -5, -8, -9, -10 och -12. De finns som inaktiva zymogener (pro-caspaser) som aktiveras genom närhetsinducerad dimerisering och stabiliseras genom auto-proteolytisk klyvning 2,3. De inflammatoriska kaspaserna är en delmängd av initiator caspaserna2 och omfattar caspase-1, -4, -5 och -12 hos människor och caspase-1, -11 och -12 i mus 4,5. Snarare än en apoptotisk roll spelar de en central roll vid inflammation. De förmedlar proteolytisk bearbetning och utsöndring av pro-interleukin (IL)-1β och pro-IL-18 6,7, som är de första cytokinerna som frigörs som svar på patogena inkräktare 8,9. Caspase-1 aktiveras vid rekrytering till sin aktiveringsplattform; ett proteinkomplex med stor molekylvikt som kallas inflammasomen (figur 1A)10. Dimerisering av caspase-4, -5 och -11 sker oberoende av dessa plattformar genom en icke-kanonisk inflammasomväg11,12.

Kanoniska inflammasomer är cytosoliska multimera proteinkomplex som består av ett inflammasomsensorprotein, adapterproteinet ASC (apoptosassocierat fläckliknande protein som innehåller ett CARD) och effektorproteinet caspase-110. De mest väl studerade kanoniska inflammasomerna är den NOD-liknande receptorfamiljen som innehåller en pyrindomän (NLRP), NLRP1 och NLRP3, NLR-familjen som innehåller en CARD (NLRC), NLRC4 och den frånvarande i melanom 2 (AIM2). De innehåller var och en en pyrindomän, ett KORT eller båda domänerna. CARD-domänen förmedlar interaktionen mellan CARD-innehållande caspaser och deras uppströms aktivatorer. Därför krävs ställningsmolekylen ASC, som består av en N-terminal pyrindomän (PYD) och ett C-terminal CARD-motiv13,14, för rekrytering av caspase-1 till NLRP110, NLRP315 och AIM216 inflammasomer.

Varje inflammasom är uppkallad efter sitt unika sensorprotein som känner igen distinkta proinflammatoriska stimuli (figur 1B). Aktivatorer av denna väg kallas kanoniska stimuli. Inflammasomer fungerar som sensorer för mikrobiella komponenter och vävnadsstress och monteras för att utlösa ett robust inflammatoriskt svar genom aktivering av de inflammatoriska kaspaserna17. Inflammasommontering initierar caspase-1-aktivering för att förmedla mognad och utsöndring av dess huvudsubstrat pro-IL-1β och pro-IL-18. Denna process sker via en tvåstegsmekanism. För det första uppreglerar en primingstimulans uttrycket av vissa inflammasomproteiner och pro-IL-1β genom aktivering av NF-κB-vägen. För det andra inducerar en intracellulär (kanonisk) stimulans inflammasommontering och rekrytering av prokaspas-1 6,7.

Caspase-4 och caspase-5 är de mänskliga ortologerna av murin caspase-1111. De aktiveras på ett inflammasomoberoende sätt av intracellulär lipopolysackarid (LPS), en molekyl som finns i det yttre membranet hos gramnegativa bakterier 18,19,20, och av extracellulärt hem, en produkt av hemolys av röda blodkroppar21. Det har föreslagits att LPS binder direkt till CARD-motivet för dessa proteiner och inducerar deras oligomerisering20. Aktivering av caspase-4 eller caspase-5 främjar IL-1β-frisättning genom att inducera en inflammatorisk form av celldöd som kallas pyroptos genom klyvning av det porbildande proteinet gasdermin D (GSDMD)18,19. Dessutom inducerar efflux av kaliumjoner som härrör från caspase-4 och GSDMD-medierad pyroptotisk död aktivering av NLRP3-inflammasomen och efterföljande aktivering av caspase-122,23. Därför betraktas caspase-4, -5 och -11 som intracellulära sensorer för LPS som kan inducera pyroptos och caspase-1-aktivering som svar på specifika stimuli11,24.

Figure 1
Figur 1: Inflammatoriska kaspaser och kaspas-bimolekylär fluorescenskomplementering (BiFC) analys (A) Diagram som visar caspase-BiFC-systemet, där två caspase-1 prodomainer (C1-pro) kopplade till varje icke-fluorescerande fragment av Venus (Venus-C eller Venus-N) rekryteras till NLRP3-aktiveringsplattformen, vilket tvingar Venus att vikas och fluorescera. Detta komplex framträder som en grön fläck under mikroskopet och fungerar som en avläsning för inflammatorisk kaspasinducerad närhet, vilket är det första steget i initiator caspase aktivering. (B) Schematisk som visar domänorganisationen av inflammasomkomponenter och inflammatoriska kaspaser. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Att mäta aktivering av specifika initiatorhöljen är svårt, och det finns inte många metoder tillgängliga för att göra det med avbildningsmetoder. Caspase Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) kan användas för att visualisera inflammatorisk kaspasaktivering direkt i levande celler (Figur 1A)25. Denna teknik har nyligen anpassats för användning i humana monocyt-härledda makrofager (MDM)21. Caspase BiFC mäter det första steget i inflammatorisk kaspasaktivering, inducerad närhet för att underlätta dimerisering. Uttryck av plasmider som kodar för den CARD-innehållande kaspasprodomänen smält till icke-fluorescerande fragment av det fotostabila gula fluorescerande proteinet Venus (Venus-C [VC]) och Venus-N [VN]) används. När de två kaspasprodomänerna rekryteras till sin aktiveringsplattform eller genomgår inducerad närhet, förs de två venushalvorna i närheten och tvingas vika om och fluorescera (se figur 1A,B). Detta ger en realtidsavläsning av specifik inflammatorisk kaspasaktivering.

Human MDM uttrycker rikligt inflammasomgener och mönsterigenkänningsreceptorer som identifierar farosignaler och patogenprodukter. Detta ger en idealisk celltyp för förhör av inflammatoriska kaspasvägar. Dessutom kan de härledas från perifert blod och till och med från patientprover för att bedöma inflammatorisk kaspasaktivering i ett specifikt sjukdomstillstånd. Detta protokoll beskriver hur man introducerar BiFC-kaspasreportrarna i MDM med hjälp av nukleofsektion, en elektroporeringsbaserad transfektionsmetod, hur man behandlar cellerna för att inducera inflammatorisk kaspasaktivering och hur man visualiserar de aktiva caspaskomplexen med hjälp av mikroskopimetoder. Dessutom kan denna metod anpassas för att bestämma den molekylära sammansättningen av dessa komplex, subcellulär lokalisering, kinetik och storleken på dessa högt ordnade strukturer 25,26,27.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Detta protokoll följer riktlinjerna från Baylor College of Medicines mänskliga forskningsetiska kommitté för manipulering av mänskliga prover. Blodprover hanteras enligt de institutionella säkerhetsriktlinjerna för humanprover. Blodprover erhålls vid en regional blodbank, där de samlas in med citratfosfatdextroslösning (CPD). Blod som samlats in med andra antikoagulantia som natriumheparin, litiumheparin eller EDTA kan dock också användas för detta protokoll28,29.

1. Isolering av humana monocyter och differentiering i makrofager

  1. Få antikoagulerat blod från avidentifierade friska individer vid en regional blodbank och isolera mononukleära celler i perifert blod (PBMC) enligt nedan.
    OBS: Utför alla steg i en vävnadsodling laminär flödeshuv. Använd endast sterila rör och använd handskar. Tillsätt 10% blekmedel till alla blodrelaterade produkter vid bortskaffande. Steril PBS (1x) eller DPBS (utan Ca2+ och Mg2+) kan användas omväxlande.
    1. Förbered utspädningsbufferten: Komplettera 1x steril PBS med 2% FBS och 0,5 mM EDTA.
    2. Förbered odlingsmediet: Komplettera RPMI-1640-mediet med FBS (10% (v / v)), glutamax (2 mM) och Penicillin / Streptomycin (50 I.U./50 μg/ml)
    3. Förkyl den löpande bufferten (materialtabell) enligt tillverkarens protokoll.
    4. Späd helblod med två volymer utspädningsbuffert. Överför med hjälp av en serologisk pipett 15 ml av det antikoagulerade blodet till ett 50 ml rör som innehåller 30 ml av utspädningsbufferten. Blanda försiktigt genom inversion.
    5. För varje 10 ml helblod eller 30 ml utspätt blod, tillsätt 15 ml av densitetsgradientmediet till ett 50 ml tomt rör.
    6. Skikta densitetsgradientmediet från steg 1.1.5 med 30 ml utspätt blod långsamt och stadigt med hjälp av en 25 ml serologisk pipett. Håll pipettens spets mot rörets vägg och röret i en lutande vinkel.
    7. Överför försiktigt rören till en svängande hinkcentrifug. Undvik att störa de två faserna. Centrifugera rören vid 400 x g vid rumstemperatur (RT) i 25 minuter med acceleration och retardation inställd på minimivärdet.
    8. Ta försiktigt bort det övre (klara) plasmaskiktet med en 10 ml pipett och kassera i en behållare med blekmedel (10%).
    9. Samla upp det interfasiska (vita) lagret av mononukleära celler i perifert blod (PBMC, figur 2) med en 10 ml pipett och överför till ett nytt 50 ml rör. Kombinera det vita lagret från olika rör av samma givare i ett 50 ml rör upp till 30 ml.
    10. Bringa varje rör till en total volym på 50 ml med utspädningsbufferten från steg 1.1.1 och centrifugera vid 300 x g och 4 °C i 10 min. Ta bort supernatanten med en 10 ml pipett och kassera den i en behållare med blekmedel (10%).
    11. Resuspendera varje cellpellets i 1 ml av den förkylda löpbufferten från steg 1.1.3 med en p1000 mikropipett. Kombinera cellsuspensioner från samma donator i ett nytt 15 ml rör. Höj volymen på varje rör till 15 ml med förkyld löpbuffert och blanda väl genom inversion.
    12. Ta en alikvot på 20 μl av cellsuspensionen från steg 1.1.11 och bered en spädning på 1:100 med 1x steril PBS. Bestäm cellnumret med hjälp av en hemocytometer.
    13. Centrifugera cellsuspensionen från steg 1.1.11 vid 300 x g och 4 °C i 10 minuter och avlägsna supernatanten med en pipett på 10 ml. Använd vid behov en p200-mikropipett för att ta bort supernatanten helt.
    14. Resuspendera de isolerade PBMC:erna i 80 μl förkyld MACS-buffert för varje 1 x 107 celler, vilket ger upp till maximalt 800 μL av bufferten.
    15. Tillsätt 20 μL anti-humana CD14 MicroBeads per varje 1 x 107 celler eller upp till 100 μL per blodprov (~ 100 ml outspädd blod). Blanda väl genom invertering och lägg på en rörrotator i 20 min med kontinuerlig blandning vid 4 °C.
    16. Ta bort proverna från rörrotatorn, tillsätt 10 ml förkyld löpbuffert till varje rör och centrifugera vid 300 x g (acceleration = 5, retardation = 5) och 4 °C i 10 min.
    17. Ta bort supernatanten med en 10 ml pipett och återsuspendera upp till 1 x 108 celler i 500 μl förkyld löpbuffert (2 x 108/ml).
    18. Utför isoleringen av CD14-positiva celler genom magnetisk cellsortering med hjälp av ett manuellt eller automatiserat system (materialtabell) enligt tillverkarens instruktioner.
    19. Ta en alikvot på 20 μl av cellsuspensionen från steg 1.1.18 efter CD14-positivt urval och bered en spädning på 1:100 med 1x steril PBS. Bestäm cellnumret genom att räkna cellerna på en hemocytometer.
    20. Centrifugera de CD14-positiva cellerna vid 300 x g och RT i 10 min. Ta bort supernatanten med en 10 ml pipett eller ett vakuumsystem.
    21. Återsuspendera cellpelleten från steg 1.1.20 i förvärmt odlingsmedium från steg 1.1.2 till en slutlig celltäthet på 1 x 107 celler/ml.
  2. Frö de isolerade CD14-positiva monocyterna vid en celltäthet av 5 x 106 celler.
    1. På en 10 cm vävnadsodlingsskål, tillsätt 10 ml odlingsmedium från steg 1.1.2 kompletterat med 50 ng / ml granulocyt-makrofagkolonistimulerande faktor (GM-CSF).
    2. Tillsätt 0,5 ml av cellsuspensionen från steg 1.1.21 till kulturen medium droppvis och virvla försiktigt på plattan. Inkubera celler i en fuktad vävnadsodlingsinkubator (37 °C, 5 % CO2) över natten.
    3. Nästa dag, aspirera mediet med ett vakuumsystem för att ta bort celler som inte fästes över natten. Tillsätt 10 ml färsk odlingssubstrat kompletterat GM-CSF (50 ng/ml) och inkubera celler i en fuktad vävnadsodlingsinkubator (37 °C, 5 % CO2) i 7 dagar för att möjliggöra fullständig differentiering (se figur 3A för utseende av CD14+-monocyter vid olika differentieringsstadier i GM-CSF ). Byt ut odlingsmediet var 2-3: e dag och komplettera med färsk GM-CSF (50 ng / ml) varje gång.

Figure 2
Figur 2: Schematisk översikt över det experimentella arbetsflödet.

2. Framställning av elektroporeringskomponenter

OBS: Detta protokoll är utformat för en 10 μL-neonspets (materialtabell). För varje transfektion, använd 1-2 x 105 celler. Det rekommenderas att så transfekterade celler på en 48-brunnsplatta eller 8-brunns kammare (10 μL-transfekterade celler per brunn). 1x steril DPBS (utan Ca2+ och Mg2+) kan användas i stället för PBS.

  1. På dag 7, förbered antibiotikafritt medium genom att komplettera RPMI-1640 medium med FBS (10 % (v / v)) och glutamax (2 mM).
  2. Placera serumfritt RPMI-1640 medium, trypsin-EDTA (0,25%) lösning, 1x steril PBS (utan Ca2+ och Mg2+) och komplett odlingsmedium från steg 1.1.2 i ett 37 °C vattenbad.
  3. Om du använder glasbottnade rätter (för konfokalmikroskopi) belägg diskarna med poly-D-lysinhydrobromid.
    1. Täck en 8 välkammare skål med 200 μL poly-D-lysinhydrobromid (0,1 mg / ml i 1x steril PBS) och inkubera i 5 minuter vid RT.
    2. Aspirera poly-D-lysinlösningen och tvätta glaset en gång med 1x steril PBS. Aspirera PBS och fortsätt med steg 2.4.
  4. Tillsätt 200 μl antibiotikafritt medium per brunn på 48-brunnsplattan eller 8 välkammade skålen och förinkubera i en fuktad vävnadsodlingsinkubator (37 °C, 5 % CO2) tills de är redo att plätera de transfekterade cellerna.

3. Beredning av celler för elektroporering

OBS: Utbytet av MDM från en 10 cm skål i slutet av 7-dagars differentieringsperioden är ungefär 1,5 x 106 celler. 1x steril DPBS (utan Ca2+ och Mg2+) kan användas i stället för PBS. Detta protokoll optimerades så att de flesta makrofager lossnar från plattan med upprätthållande av cellviabilitet och integritet. MDM är svåra att ta bort från cellodlingsplattor. Därför kan det vara nödvändigt att utföra steg 3.2 och 3.3 två gånger för att dissociera cellerna. Se till att varje inkubationstid med trypsin-EDTA (0,25%) inte överstiger 5 min.

  1. Aspirera media från helt differentierade makrofager på 10 cm disk och tvätta cellmonoskiktet med varmt serumfritt RPMI-1640-medium. Se till att ta bort mediet helt.
  2. Skörda cellerna genom att tillsätta 2 ml varm trypsin-EDTA (0,25%) lösning per 10 cm skål och inkubera i en fuktad vävnadsodlingsinkubator (37 ° C, 5% CO2) i 5 minuter.
  3. Slutför cellavskiljningen genom att försiktigt pipettera trypsin-EDTA -lösningen (0,25%) upp och ner över hela skålen med en p1000-mikropipett. Överför cellsuspensionen till ett 15 ml koniskt rör som innehåller 5 ml varmt komplett odlingsmedium från steg 1.1.2.
  4. Ta skålen till ett ljust fältmikroskop och kontrollera om cellavlossning i olika synfält. Om det finns en betydande mängd celler kvar, upprepa steg 3.2-3.3.
  5. Centrifugera cellsuspensionen vid 250 x g i 5 min vid RUMSTEMPERATUR.
  6. Aspirera mediet och återsuspendera cellerna i 10 ml 1x steril PBS förvärmd till 37 °C. Ta en alikvot på 20 μl för att bestämma cellnumret med hjälp av en hemocytometer.
  7. Ta 1-2 x 105 celler per avsedd transfektion och placera i ett 15 ml rör. Ta till en slutlig volym på 15 ml med förvärmd 1x steril PBS. Centrifugera vid 250 x g i 5 min vid RT.
  8. Aspirera PBS och centrifugera en gång till i 1 min vid 250 x g. Ta bort eventuella kvarvarande PBS från cellpelleten med en p200-mikropipett.

4. Nukleofektion av caspase BiFC-komponenter i humana monocyt-härledda makrofager

OBS: Detta avsnitt av protokollet utförs med hjälp av Neon Transfection System (Materialtabell). Detta protokoll beskriver stegen för att transfektera 1-2 x 105 celler med hjälp av en 10 μL neonspets (materialtabell). Om du använder en 100 μL Neon-spets, skala upp därefter. Undvik att utsätta celler för resuspensionsbuffert R i mer än 15 minuter, eftersom detta kan minska cellviabiliteten och transfektionseffektiviteten.

  1. Späd reporterplasmiden (dvs. mCherry eller dsRedmito vid 100 ng / μL) i nukleasfritt vatten eller 0,5x TE-buffert för att visualisera de transfekterade cellerna.
  2. Späd caspase BiFC-plasmiderna till en lämplig koncentration i nukleasfritt vatten eller 0,5x TE-buffert, så att den totala volymen plasmider inte överstiger 30% av den totala transfektionsvolymen på 10 μL (dvs. 300 ng / μL C1 Pro-VC och 300 ng / μL C1 Pro-VN).
  3. Förbered ett 1,5 ml sterilt mikrorör per avsedd transfektion och tillsätt lämplig mängd reporterplasmid (dvs. 50 ng eller 0,5 μL) och caspase BiFC-plasmider (dvs. 300 ng eller 1 μL C1 Pro-VC och 300 ng eller 1 μL C1 Pro-VN-fragment). Håll mikrorören i huven hela tiden.
  4. Placera pipettstationen, enheten, spetsarna, elektroporationsrören och pipetten i en steril laminär flödeshuv.
    OBS: Pipettstationen, enheten, spetsarna, elektroporationsrören och pipetten ingår i Neon Transfection System.
  5. Anslut högspännings- och sensorkontakten på pipettstationen till de bakre portarna på enheten enligt tillverkarens instruktioner. Håll pipettstationen nära enheten.
  6. Anslut nätsladden till det bakre nätinloppet och fortsätt att ansluta enheten till eluttaget. Tryck på strömbrytaren för att slå på enheten.
  7. Ange transfektionsparametrarna på startskärmen som visas när enheten är påslagen och korrekt ansluten. Tryck på Spänning, ange 1000 och tryck på Klar för att ställa in spänningen till 1000 V. Tryck på Bredd, ange 40 och tryck på Klar för att ställa in pulsens varaktighet till 40 ms. Slutligen, tryck på # Pulser, ange 2 och tryck på Klar för att ställa in antalet elektriska pulser till 2.
  8. Ta ett av elektroporationsrören (medföljer i satsen) och fyll det med 3 ml elektrolytisk buffert E (för 10 μL spetsar och medföljer i satsen) vid RT. Sätt in elektroporationsröret i pipetthållaren på pipettstationen. Se till att elektroden på sidan av röret är vänd inåt och att ett klickljud hörs när röret sätts in.
  9. Ta cellpelleten från steg 3.8 och tillsätt 10 μL förvärmd resuspension R-buffert (medföljer i satsen) för varje 1-2 x 105 celler. Blanda försiktigt med en p20 mikropipett. Tillsätt 10 μL av cellsuspensionen till varje rör som ställts in i steg 4.3 och blanda försiktigt med en p20-mikropipett.
  10. Ta pipetten och sätt i en spets genom att trycka på tryckknappen till det andra stoppet. Se till att klämman helt tar upp kolvens monteringsstam i spetsen och att inget mellanrum observeras i pipettens övre huvud.
  11. För att aspirera provet, tryck på tryckknappen på pipetten till det första stoppet och doppa i det första röret som innehåller cell / plasmid-DNA-blandning. Sug långsamt in blandningen i pipettspetsen.
    OBS: Undvik luftbubblor eftersom de kan orsaka ljusbågar under elektroporering, och om de detekteras av enheten kan de förhindra leverans av den elektriska pulsen. Om luftbubblor observeras, släpp ut innehållet i röret och försök att aspirera igen.
  12. Sätt in pipetten med provet mycket försiktigt i pipetthållaren. Se till att pipetten klickar och att den är korrekt placerad.
  13. Tryck på Start på pekskärmen och vänta tills de elektriska pulserna levereras. Ett meddelande på skärmen indikerar slutförande.
  14. Ta långsamt bort pipetten från stationen och tillsätt omedelbart den transfekterade cellsuspensionen i motsvarande brunn med förvärmt antibiotikafritt medium från steg 2.4 genom att långsamt trycka på tryckknappen till det första stoppet.
    OBS: Detta tips kan återanvändas upp till tre gånger för samma plasmid; Annars slänger du den i en behållare för biofarligt avfall genom att trycka på tryckknappen till det andra stoppet.
  15. Upprepa steg 4.10–4.14 för varje rör som innehåller en cell/plasmid-DNA-blandning.
  16. Gunga försiktigt plattan med transfekterade celler och inkubera i 1-3 timmar i en fuktad vävnadsodlingsinkubator (37 °C, 5 % CO2).
  17. Tillsätt till varje brunn 200 μl förvärmt odlingsmedium (komplett medium) från steg 1.1.2. Placera skålen i inkubatorn för fuktad vävnadsodling (37 °C, 5 %CO2) igen. Tillåt minst 24 timmar för genuttryck.
  18. Nästa dag, inspektera cellviabiliteten och transfektionseffektiviteten med hjälp av ett epifluorescensmikroskop.
    1. Slå på epifluorescensmikroskopet och den fluorescerande ljuskällan enligt tillverkarens instruktioner och placera odlingsskålen på mikroskopstadiet.
    2. Välj målet 10x eller 20x och filtret 568 nm (RFP).
    3. För att uppskatta cellviabiliteten, tryck på TL-knappen (Transmitted Light LED) för att visualisera alla celler i det valda fältet. När du tittar in i mikroskopets okular, vrid fokusknappen tills celler observeras och kontrollera om cellfästet är i det valda fältet.
      OBS: Helt fästa celler representerar de livskraftiga cellerna medan flytande celler representerar icke-livskraftiga celler. Om brunnens sammanflöde är hög kan närvaron av icke-fästa celler vara resultatet av en överskattning av cellantal och inte resultatet av låg livskraft. Låg sammanflöde åtföljd av ett högt innehåll av flytande celler betyder emellertid låg livskraft som kan bero på ljusbåge under elektroporering, plasmidtoxicitet eller överexponering för resuspension R-buffert. Använd inte brunnar som visar det senare beteendet.
    4. För att uppskatta transfektionseffektiviteten, fokusera på celler i det valda fältet under överfört ljus enligt beskrivningen ovan. Räkna det totala antalet celler i det markerade fältet. När TL (Transmitted Light LED) är avstängd trycker du på LED-knappen (RL) för att slå på.
    5. Finfokus på reportergenen fluorescens (röda blodkroppar) och räkna det totala antalet röda fluorescerande celler. Upprepa dessa steg (4.18.4-4.18.5) för minst två fält till per brunn.

5. Behandling av transfekt MDM och caspase BiFC datainsamling

OBS: Om du planerar att avbilda cellerna med ett epifluorescens- eller konfokalmikroskop rekommenderas behandling med qVD-OPh (20 μM) i 1 timmes tidigare behandling med den valda stimulansen för att förhindra kaspasberoende celldöd (främst apoptos). Detta används vid avbildning för att förhindra att celler lyfter på grund av apoptos, vilket gör dem mycket svåra att avbilda när de rör sig ut ur fokalplanet. Observera att kaspasrekrytering till aktiveringsplattformen och tillhörande caspase BiFC inte är beroende av caspas katalytiska aktivitet, och följaktligen kommer caspashämning inte att påverka detta steg.

  1. Behandla med vald stimulans cirka 24 timmar efter transfektion och inkubera så länge som nödvändigt för varje läkemedel.
    1. Förbered avbildningsmediet genom att komplettera odlingsmediet från steg 1.1.2 med Hepes (20 mM, pH 7,2-7,5) och 2-merkaptoetanol (55 μM).
    2. Tillsätt önskad koncentration av stimulans till det förvärmda bildmediet och blanda försiktigt.
    3. Ta försiktigt bort mediet från cellerna med en p1000-mikropipett och tillsätt 500 μL av stimulanslösningen från steg 5.1.2 ner på sidan av brunnen.
    4. För att köra obehandlade kontrollbrunnar, lägg till bildmedium utan stimulans.
    5. Inkubera cellerna i en fuktad vävnadsodlingsinkubator (37 °C, 5 % CO2) så länge som anges för varje behandling.
  2. Visualisera cellerna med hjälp av ett epifluorescens- eller konfokalmikroskop.
    1. Slå på mikroskopet och den fluorescerande ljuskällan enligt tillverkarens instruktioner.
    2. Välj 10x eller 20x mål och placera odlingsskålen på mikroskopstadiet.
    3. Använd mikroskopets okular, hitta celler under 568 nm-filtret och fokusera på cellerna som uttrycker dsRedmito / mCherry-reportern (röda blodkroppar).
    4. Räkna alla röda blodkroppar i synfältet och registrera numret.
    5. I samma synfält, byt till 488- eller 512-filtret (GFP eller YFP), fortsätt att räkna antalet röda blodkroppar som också är gröna (Venus-positiva eller BiFC-positiva) och registrera antalet.
    6. Räkna minst 100 dsRedmito/mCherry-positiva celler från minst tre enskilda synfält.
    7. Beräkna procentandelen Venus-positiva transfekterade celler per synfält och medelvärde för de resulterande procentsatserna för varje behandling (brunn) för att få standardavvikelsen.
  3. Avbilda cellerna med hjälp av ett epifluorescens- eller konfokalmikroskop
    OBS: För att få konfokala bilder med ett 20x mål eller en större förstoring, bör celler pläteras på glasfat om inte mikroskopet är utrustat med ett långt passmål.
    1. Följ steg 5.2.1-5.2.3. Om du använder ett konfokalmikroskop med oljemålet 40x, 60x eller 63x, placera en droppe olja på målet.
    2. Visualisera livebilden av cellerna på datorskärmen som förvärvats av kameran. Använd epifluorescensljuskällan för fluorescerande bilder eller byt ljuskällan till lasrarna för konfokala bilder.
    3. Finjustera cellernas fokus och position med joystickens styrning och fokushjul.
    4. Ställ in den procentuella lasereffekten och exponeringstiden för lasrarna 512 nm eller 488 nm (YFP eller GFP) och 568 nm (RFP) så att signalen i bilden ser bra ut och inte når mättnad.
    5. Slå på liveinspelningen och undersök den resulterande bilden. Se till att en tydlig topp ses för varje fluor i displayhistorogrammen för båda kanalerna.
    6. Justera lasereffekten och exponeringstiden efter behov. Håll dessa värden så låga som möjligt samtidigt som du kan detektera båda fluorescerande signalerna (RFP och GFP / YFP).
    7. När du visualiserar livebilden av cellerna, ta flera representativa bilder av ett fält som innehåller en eller flera celler som uttrycker mCherry / dsRedmito-reportern för varje brunn på plattan och spara data.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Schemat som visas i figur 2 ger en översikt över hur man erhåller, transfekterar och avbildar human MDM. och slutligen till fler spridda celler när de är helt differentierade (dag 7). Helt differentierade celler lossas sedan från plattan och transfekteras med caspase BiFC-paren (VC och VN) tillsammans med reporterplasmiden (t.ex. dsRedmito, en plasmid som kodar för ett rött fluorescerande protein riktat mot mitokondrierna), som används för att märka de transfekterade cellerna (figur 3B) och används för att bedöma transfektionens effektivitet efter 24 timmar. visa ett exempel på BiFC-resultat med användning av caspase-1 pro BiFC-transfekterade celler behandlade i 20 timmar med nigericin (5 μM), en känd proinflammatorisk stimulans som utlöser monteringen av NLRP3-inflammasomen30,31. Obehandlade celler visar ingen Venus-fluorescens (figur 3B), och i nigericinbehandlade celler visas caspase-1 BiFC som en enda punctum med den typiska formen av ASC-fläckar 32,33,25 (figur 3C). Figur 3D visar ett exempel på kvantifiering av Venus-positiv MDM. Detta resultat överensstämmer med aktivering av en kanonisk inflammasom, där både en primingsignal (LPS) och en intracellulär signal (nigericin) krävs för aktivering av kapas-1.

Figure 3
Figur 3: Differentiering av CD14-monocyter och transfektion av human MDM.,(A) Representativa ljusfältsbilder av CD14+-monocyter från perifert blod som exponerats för GM-CSF vid dagarna 1, 3, 4 och 7 av differentiering (Skalstreck, 100 μm). (B-C) Human MDM transfekterades med caspase-1 pro BiFC-par och transfektionsreportern dsRedmito (50 ng, röd). 24 timmar senare grundades cellerna med och utan LPS (100 ng/ml) i 3 timmar och behandlades med nigericin (5 μM) i bildmedium i 20 timmar. Representativa konfokala bilder av obehandlade och nigericinbehandlade celler visas (skalstreck, 10 μm). BiFC visas i grönt. (D) Celler från (C) bedömdes för procentandelen dsRedmito-positiva celler (röda, transfekterade celler) som var Venus-positiva (gröna, caspase-1 BiFC-komplex) vid 20 h. Felstaplar representerar SD på minst två oberoende antal per brunn. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Ett exempel på plasmidtitrering visas i figur 4, där ökande mängder av varje BiFC-plasmid transfekteras. Detta möjliggör val av den optimala dosen plasmid, vilket resulterar i en specifik signal och minimal bakgrund. Figur 4A visar resultaten av human MDM transfekterad med ökande koncentrationer av caspase-1, -4 och -5 pro BiFC-par (VC och VN) behandlade med heme, en mycket proinflammatorisk molekyl som härrör från förstörelse av röda blodkroppar34. Den högsta andelen Venus-positiva celler för caspase-1, -4 och -5 pro BiFC-par är resultatet från 400 ng, 500 ng respektive 1000 ng transfekterad plasmid. Men att använda den högsta mängden plasmid riskerar också att öka ospecifik bakgrund (figur 4B). Till exempel resulterar transfektion av 1000 ng av caspase-5 pro BiFC-paret i nästan 40% icke-specifik bakgrund. Därför anses användning av den lägre 700 ng-mängden vara optimal för detta plasmidpar (figur 4B). I figur 4C visas representativa konfokala bilder erhållna med ett 20x mål för ett fält av celler 24 timmar efter transfektion. I den här bilden kan man se att de obehandlade transfekterade cellerna är livskraftiga baserat på mitokondriernas utseende (mitokondrier i döda celler är mycket fragmenterade) och cellernas morfologi (apoptotiska celler krymps). Efter behandling med heme framträder caspase-1-komplexet som en enda grön punctum som liknar den som induceras av nigericin i figur 3C, och dess utseende åtföljdes av cellkrympning.

Figure 4
Figur 4: Human MDM transfekterad med olika mängder inflammatorisk caspase pro BiFC-par. caspase-4 pro; eller caspase-5 pro BiFC-par. Human MDM transfekterades med de angivna mängderna av caspase pro BiFC-paren med dsRedmito som transfektionsreporter (50 ng) och inkuberades över natten. Nästa dag avlägsnades odlingsmediet från alla brunnar och celler behandlades med och utan hem (50 μM) i 0,1% FBS-medium. Efter 1 h tillsattes en lika stor mängd komplett medium till alla brunnar för att rekonstituera FBS-koncentrationen till 5% och förhindra att hem dödar cellerna. Efter en total behandling på 20 timmar bedömdes cellerna för andelen dsRedmito-positiva transfekterade celler som var Venus-positiva, bestämda från minst 300 celler per brunn. Felstaplar representerar SD på minst tre oberoende antal per brunn. (B) Human MDM transfekterades med utvalda mängder caspase-1 pro; caspase-4 pro; eller caspase-5 pro BiFC-par, tillsammans med dsRedmito (50 ng) som reporter för transfektion. 24 timmar efter transfektion behandlades celler med eller utan hem (50 μM) i 0,1% FBS. Efter 1 timme rekonstituerades FBS till 5 % för att hämma extracellulärt hem. Celler bedömdes för procentandelen dsRedmito-positiva celler (röda, transfekterade celler) som var Venus-positiva (grönt, caspase BiFC-komplex) vid 20 h bestämt från minst 300 celler per brunn. Resultaten representeras i procent Venus-positiva celler. Felstaplar representerar SD på minst tre oberoende antal per brunn. C) Representativa konfokala bilder som erhållits med ett 20x mål för ett cellfält 24 timmar efter transfektion och behandlats med och utan hem enligt beskrivningen i (B). Röd: dsRedmito-positiva celler; Grön: Venus-positiva celler; Skalstreck, 20 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Detta protokoll beskriver arbetsflödet för att erhålla makrofager från monocyter isolerade från humana blodprover och en metod för att effektivt introducera de inflammatoriska caspase BiFC-reportrarna i human MDM utan att äventyra cellens livskraft och beteende.

Detta protokoll utnyttjar BiFC-tekniken35 för att märka de inflammatoriska kaspaserna vid caspase recruitment domain (CARD) med icke-fluorescerande fragment av det delade fluorescerande proteinet Venus. Inflammatoriska kaspaser kodar för en katalytisk domän som består av en stor (p20) och en liten (p10) underenhet, och ett konserverat protein-proteininteraktionsmotiv som kallas en CARD vid deras N-ändpunkt eller prodom36 (Figur 1B). Rekrytering av inflammatoriska kaspaser till deras aktiveringsplattformar är beroende av en intakt CARD. För detta tillvägagångssätt genereras två caspase prodomain-konstruktioner (som kodar för CARD-motivet), var och en kopplad till de icke-fluorescerande fragmenten av det fotostabila gula proteinet Venus (Venus-C [VC]) och Venus-N [VN]) tillsammans med en fluorescerande transfektionsreporter för att möjliggöra visualisering av cellerna före eller i frånvaro av aktivering av caspase BiFC-reportern. Fluorescens observeras endast när interagerande proteiner kommer tillräckligt nära varandra för att möjliggöra dimerisering och aktivering (se figur 1A). Effektiviteten av denna process kan kvantifieras med hjälp av en standard epifluorescens eller ett konfokalmikroskop. I kombination med encellsavbildning möjliggör detta protokoll visualisering av asynkrona händelser som kan vara oföränderliga i bulkpopulationer, och beroende på bildernas upplösning kan det användas för att bestämma storleken och lokaliseringen av BiFC-komplexet associerat med varje caspase.

Detta protokoll kan anpassas till en rad proteiner som aktiveras genom oligomerisering, och dess tillämplighet är inte begränsad till mikroskopimetoder. Detta tillvägagångssätt möjliggör också undersökning av differentiella krav för inflammatorisk kaspasmontering. SiRNA kan till exempel användas för att identifiera uppströms komponenter/krav för specifik inflammatorisk kaspasaktivering. Caspase-BiFC-sonderna och siRNA-oligo (används för att tysta ett målprotein) kan överföras samtidigt till MDM. Till exempel användes en siRNA-oligo som riktar sig mot ASC-adaptermolekylen, som krävs för montering av NLRP1-, NLRP3- och AIM2-inflammasomer, för att visa att heminducerad aktivering av caspase-1 krävde dessa kanoniska inflammasomer medan caspase-4 och -5 inte gjorde21. Denna metod kan också anpassas till time-lapse-mikroskopi, så kinetiken för den inflammatoriska kaspasaktiveringen kan bestämmas i enskilda celler. Med hjälp av ett sådant tillvägagångssätt kan man bedöma när kaspasdimerisering inträffar genom att exakt detektera tidpunkten för utseendet på BiFC-debuten i förhållande till den tid då cellen genomgår döden genom att övervaka förlust av fluorescens hos transfektionsreportern (mCherry) som en indikation på celllys. Det finns flera sätt att skaffa och analysera caspase BiFC-data; valet beror på frågan som ska besvaras och vilken typ av mikroskop och programvara som finns tillgänglig. Till exempel kan engångsdata som används för att bestämma effektiviteten för aktivering såväl som time-lapse-analys vara särskilt effektiva om en automatisk förvärvsfunktion som tillhandahålls av någon mikroskopprogramvara är tillgänglig. Detta möjliggör objektiv avbildning, eftersom förutbestämda positionsmatriser förvärvas från varje brunn i en flerbrunnsplatta. Bilder kan kvantifieras både genom visuell inspektion och genom att använda automatiserad bildprogramvara som CellProfiler, ImageJ eller MATLAB för att öka noggrannheten och objektiviteten.

Att undersöka kaspasvägar i primära celler är viktigt för att fullt ut förstå de fysiologiska rollerna hos dessa proteiner. Dessutom, eftersom caspase-4 och caspase-5 ersätts av en enda caspase-11 hos möss, är det viktigt att kunna bedöma mänskliga celler. På grund av låg transfektionseffektivitet och toxicitet i samband med många leveranssystem i primära celler kan det dock vara svårt att maximera användningen av tillgängliga plasmidbaserade reportrar. Det inflammatoriska caspase BiFC-protokollet beskriver en enkel metod för att transfektera MDM från perifert blod hos antingen patienter eller friska försökspersoner, vilket minskar antalet celler som krävs per transfektion. Detta gör det möjligt för forskare att utföra mer komplexa experiment med värdefulla celler som makrofager utan att kompromissa med cellviabilitet och cellulära egenskaper. Möjligheten att använda patientprover ger en stor fördel av att kunna bedöma inflammatorisk kaspasaktivering i specifika sjukdomstillstånd. Med några mindre optimeringar kan detta protokoll enkelt anpassas till andra murina eller mänskliga primära celler.

Detta protokoll använder ett elektroporeringsbaserat tillvägagångssätt för transfect MDM γ. Detta är ett småskaligt elektroporeringssystem som använder en 10 μL transfektionsvolym med hög celltäthet för att möjliggöra effektiv överföring av exogent DNA till ett stort antal celler. Det skapar tillfälliga porer i cellmembranet så att plasmider kan passera snabbt och undvika sen endocytos som uppstår under kemisk transfektion och som kan utlösa plasmidnedbrytning. Detta protokoll använder en organisk syrabaserad buffertformulering (buffert R) som introducerar minimal celltoxicitet jämfört med andra buffertar med kloridjoner38. Den lilla volymen och utformningen av pipettspetskammaren hjälper till att generera ett enhetligt elektriskt fält för att upprätthålla fysiologiska förhållanden som resulterar i höga överlevnadsnivåer. Transfektionseffektivitet och cellöverlevnad är starkt beroende av buffertens kemiska sammansättning, celltätheten, pulsens styrka och plasmidkoncentrationen39. Därför är det viktigt att optimera dessa förhållanden för varje celltyp och plasmid som införs. I MDM levererade lägre spänningar med längre pulsvaraktigheter plasmider mer effektivt samtidigt som cellerna var livskraftiga och friska. Följaktligen var inställningarna som användes för detta protokoll 1000 V och 2 pulser på 40 ms som resulterade i transfektionseffektivitet mellan 40-60% med cellviabilitet högre än 90% baserat på cellernas förmåga att åter fästa på plattan efter transfektion. Även om detta protokoll är optimerat för mänsklig MDM, kan variera spänningsinställningarna från 500 V till 1700 V, öka antalet pulser från 1 till 3 och testa längden på pulser från 10 till 40 ms balansera transfektionseffektivitet och cellviabilitet i ytterligare celltyper och experimentella inställningar.

Det finns flera viktiga överväganden för optimal användning av BiFC-tekniken. 1) Det är viktigt att användaren bestämmer den optimala mängden av varje kaspasplasmid som ska införas, eftersom detta kan variera för olika proteiner och celltyper. Detta krävs för att säkerställa maximal känslighet och specificitet hos analysen. Det rekommenderas att köra en pilottitrering av caspase BiFC-plasmiderna (VC- och VN-fragment) mellan 200 ng och 1000 ng som visas i figurerna 4A-B. Det optimala intervallet av plasmid som införs skiljer sig åt för varje enskild kaspas, och därför måste de bedömas individuellt. Välj en plasmidmängd som ger den högsta specifika signalen med minimal bakgrund. Helst bör bakgrundsnivån vara mindre än 10%, men upp till 20% kan användas om den specifika signalen är hög. Det är också viktigt att undvika hårda förhållanden och överdriven manipulation av dessa celler under differentiering, transfektion och behandling. Detta kan också resultera i spontan aktivering och höga bakgrundsnivåer av kaspasaktivering som kan dölja de specifika resultaten eftersom aktivering av immunceller som monocyt eller makrofager är en naturlig process, där de kan förvärva proinflammatoriska funktioner40. Om du använder patientceller kan det vara svårt att kontrollera för någon inneboende variation i nivåer av inflammasomaktivering och genetisk bakgrund som kan sensibilisera eller desensibilisera dem för stimuli och förändringar i deras lokala mikromiljö. Till exempel kan makrofagfunktionen påverkas hos immunkomprometterade individer eller individer som kämpar mot en infektion, eftersom denna typ av cell spelar viktiga homeostatiska funktioner och är involverade i kontrollen av inflammation, bland andra funktioner. Dessa genetiska och miljömässiga faktorer måste beaktas när man bestämmer om en hög bakgrund är ospecifik eller en biologisk effekt. Att använda nära matchade friska kontroller (t.ex. matchade för kön och ålder) kan hjälpa till att bedöma den biologiska betydelsen av en hög bakgrundsnivå av caspase BiFC. 2) Det är kritiskt att VC- och VN-fragmenten introduceras i lika stora mängder eftersom ojämnt uttryck av ett Venus-fragment kan resultera i rekrytering till plattformen vid högre frekvenser och maskera hela den fluorescerande signalen, vilket ger ett falskt negativt resultat. Därför bör integriteten och koncentrationen av varje enskild plasmid valideras före varje transfektion för att undvika att införa olika mängder av VC- och VN-fragmenten. 3) Eftersom detta tillvägagångssätt bygger på det exogena uttrycket från caspase-reportrarna, bör ytterligare kontroller för specificitet inkluderas. Caspase-BiFC-konstruktioner som innehåller enpunktsmutationer som stör bindningen mellan caspasen och dess aktiveringsplattform eller tystnad av en av komponenterna i aktiveringsplattformen med siRNA kan användas för att bekräfta att den fluorescerande signalen beror på specifik bindning av caspasen till inflammasomen. Detta kontrollexperiment bör resultera i minskade nivåer av Venus-positiva celler. 4) Uttryck av caspase BiFC-konstruktionerna kan utlösa eller påverka nedströmshändelser som celldöd. För att kringgå detta rekommenderas icke-enzymatiska versioner av caspasen för BiFC-reportrarna, såsom caspase prodomain eller fullängds caspase där den katalytiska cysteinresten muteras och inaktiveras. För ytterligare kontroll för detta bör kontroll av icke-transfekterade behandlade och obehandlade brunnar inkluderas i experimentet och bör visa liknande beteende som de transfekterade brunnarna. 5) Endogen kaspasaktivitet kan möjligen påverka BiFC-avläsningen. För att kontrollera för detta kan man uttrycka caspase-reportern i celler som är bristfälliga för caspasen som studeras med förväntan att BiFC-effektiviteten skulle vara densamma.

En av de största nackdelarna med detta tillvägagångssätt är att det inte mäter kaspasaktivering i sig, utan det inducerade närhetssteget som krävs för att aktivering ska ske. Detta är en subtil men viktig skillnad. Genom design innehåller prodomänen inte de katalytiska domänerna hos kaspasen som faktiskt dimeriserar. Därför fungerar omveckningen och fluorescensen av Venus-fragmenten som en proxy för kaspasdimerisering eftersom de bara kan vikas om om caspaserna är tillräckligt nära för att dimerisera. Således mäter BiFC specifikt inducerad närhet. Det är möjligt att posttranslationella modifieringar i de katalytiska domänerna kan hindra dimerisering utan att påverka BiFC-signalen. Till exempel fosforyleras caspase-2 på sin katalytiska domän, och detta hindrar dimerisering utan att förhindra rekrytering av caspase-2 till dess aktiveringsplattform41. Därför måste observationer som använder BiFC-metoden kompletteras med funktionella studier för att bekräfta att den observerade fluorescensen är representativ för kaspasaktivering. Trots denna nackdel, om de kontroller som diskuteras här ingår, kan mätningen av inducerad närhet av caspase BiFC ge en korrekt representation av specifik caspase-aktivering.

Sammanfattningsvis är caspase BiFC ett kraftfullt verktyg för analys av dynamiska caspasinteraktioner på inflammasomnivå. Detta protokoll möjliggör förhör av de inflammatoriska kaspassignaleringskaskaderna i levande immunceller. Detta tillvägagångssätt ger inte bara en teknik för att specifikt och noggrant mäta det första steget i kaspasaktivering utan har, genom att appliceras på primära immunceller, potential att avslöja egenskaper hos inflammatoriska kaspaser som inte kunde identifieras med konventionella metoder.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.

Acknowledgments

Vi tackar medlemmarna i LBH:s labb förr och nu som bidragit till utvecklingen av denna teknik. Det här labbet stöds av NIH/NIDDK T32DK060445 (BEB), NIH/NIDDK F32DK121479 (BEB), NIH/NIGMS R01GM121389 (LBH). Figur 2 ritades med hjälp av Biorender-programvaran.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
48 well tissue culture2:34 plates Genesee Scientific 25-108
10 cm Tissue Culture Dishes VWR 25382-166
2 Mercaptoethanol 1000x Thermo Fisher Scientific 21985023
8 well chambered coverglass with 1.5 HP coverglass Cellvis c8-1.5H-N
AutoMACS columns Miltenyi (Biotec) 130-021-101 For automated separation using AutoMACS Pro Separator only
AutoMACS Pro Separator Miltenyi (Biotec) 130-092-545 For automated separation using AutoMACS Pro Separator only
AutoMACS Pro Washing Solution Miltenyi (Biotec) 130-092-987 For automated separation using AutoMACS Pro Separator only
AutoMACS Rinsing Solution Miltenyi (Biotec) 130-091-222 For automated separation using AutoMACS Pro Separator only
AutoMacs running buffer Miltenyi (Biotec) 130-091-221 For manual or automated separation using QuadroMACS or AutoMACS pro Separator
Axio Observer Z1 motorized inverted microscope equipped with a CSU-X1A 5000 spinning disk unit Zeiss Any confocal microscope equipped with a laser module fitted with laser lines of 568 nm (RFP) and 488 or 512 nm (GFP or YFP) wavelengths can be used
AxioObserver A1, Research Grade Inverted Microscope Zeiss Any epifluorescence microscope with fluorescence filters capable of exciting 568 nm (RFP) and 488 or 512 nm (GFP or YFP) wavelengths can be used
CD14+ MICROBEADS Miltenyi (Biotec) 130-050-201 For manual or automated separation using QuadroMACS or AutoMACS pro Separator
DPBS without calcium chloride and magnesium chloride Sigma D8537-6x500ML
DsRed mito plasmid Clontech 632421 Similar plasmids that can be used as fluorescent reporters can be found on Addgene
Fetal Bovine Serum Thermo Fisher Scientific 10437028
Ficoll-Paque PLUS 6 x 100 mL Sigma GE17-1440-02
GlutaMAX Supplement (100x) Thermo Fisher Scientific 35050079
GM-CSF Thermo Fisher Scientific PHC2011
Hemin BioXtra, from Porcine, ≥96.0% (HPLC) Sigma 51280-1G
HEPES Thermo Fisher Scientific 15630106
Inflammatory caspase BiFC plasmids Available by request from LBH lab
LPS-EB Ultrapure Invivogen TLRL-3PELPS
LS Columns Miltenyi (Biotec) 130-042-401 For manual separation using QuadroMACS Separator only
MACS 15 mL Tube Rack Miltenyi (Biotec) 130-091-052 For manual separation using QuadroMACS Separator only
MACS MultiStand Miltenyi (Biotec) 130-042-303 For manual separation using QuadroMACS Separator only
mCherry plasmid Yungpeng Wang Lab Similar plasmids that can be used as fluorescent reporters can be found on Addgene
Neon Transfection System Thermo Fisher Scientific MPK5000 Includes Neon electroporation device, pipette and pipette station
Neon Transfection System 10 µL Kit Thermo Fisher Scientific MPK1096 Includes resuspension buffer R, resuspension buffer T, electrolytic buffer E, 96 x 10 µL Neon tips and Neon electroporation tubes
Nigericin sodium salt, ready made solution Sigma SML1779-1ML
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Thermo Fisher Scientific 15140122
Poly-D-Lysine Hydrobromide Sigma P7280-5mg
QuadroMACS Separator Miltenyi (Biotec) 130-090-976 For manual separation using QuadroMACS Separator only
qVD-OPh Fisher (ApexBio) 50-101-3172
RPMI 1640 Medium Thermo Fisher Scientific 11875119
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red Thermo Fisher Scientific 25200072
UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 Thermo Fisher Scientific 15575020
Zeiss Zen 2.6 (blue edition) software Zeiss Any software used to operate the confocal microscope of choice

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Boatright, K. M., et al. A unified model for apical caspase activation. Molecular Cell. 11 (2), 529-541 (2003).
  2. Pop, C., Salvesen, G. S. Human caspases: activation, specificity, and regulation. Journal of Biological Chemistry. 284 (33), 21777-21781 (2009).
  3. Boice, A., Bouchier-Hayes, L. Targeting apoptotic caspases in cancer. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell Research. 1867 (6), 118688 (2020).
  4. Bolívar, B. E., Vogel, T. P., Bouchier-Hayes, L. Inflammatory caspase regulation: maintaining balance between inflammation and cell death in health and disease. The FEBS Journal. 286 (14), 2628-2644 (2019).
  5. Martinon, F., Tschopp, J. Inflammatory caspases: linking an intracellular innate immune system to autoinflammatory diseases. Cell. 117 (5), 561-574 (2004).
  6. Lamkanfi, M., Vishva, M. D. Mechanisms and functions of inflammasomes. Cell. 157 (5), 1013-1022 (2014).
  7. Viganò, E., et al. Human caspase-4 and caspase-5 regulate the one-step noncanonical inflammasome activation in monocytes. Nature Communications. 6, 8761 (2015).
  8. Cerretti, D. P., et al. Molecular cloning of the interleukin-1 beta converting enzyme. Science. 256 (5053), 97 (1992).
  9. van de Veerdonk, F. L., Netea, M. G., Dinarello, C. A., Joosten, L. A. Inflammasome activation and IL-1β and IL-18 processing during infection. Trends in Immunology. 32 (3), 110-116 (2011).
  10. Martinon, F., Burns, K., Tschopp, J. The inflammasome: a molecular platform triggering activation of inflammatory caspases and processing of proIL-beta. Molecular Cell. 10 (2), 417-426 (2002).
  11. Kayagaki, N., et al. Noncanonical inflammasome activation targets caspase-11. Nature. 479 (7371), 117-121 (2011).
  12. Kayagaki, N., et al. Noncanonical inflammasome activation by intracellular LPS independent of TLR4. Science. 341 (6151), 1246-1249 (2013).
  13. Masumoto, J., et al. ASC, a novel 22-kDa protein, aggregates during apoptosis of human promyelocytic leukemia HL-60 cells. The Journal of Biological Chemistry. 274 (48), 33835-33838 (1999).
  14. Bertin, J., DiStefano, P. S. The PYRIN domain: a novel motif found in apoptosis and inflammation proteins. Cell Death and Differentiation. 7 (12), 1273-1274 (2000).
  15. Agostini, L., et al. NALP3 forms an IL-1beta-processing inflammasome with increased activity in Muckle-Wells autoinflammatory disorder. Immunity. 20 (3), 319-325 (2004).
  16. Bürckstümmer, T., et al. An orthogonal proteomic-genomic screen identifies AIM2 as a cytoplasmic DNA sensor for the inflammasome. Nature Immunology. 10 (3), 266-272 (2009).
  17. Latz, E., Xiao, T. S., Stutz, A. Activation and regulation of the inflammasomes. Nature Reviews Immunology. 13 (6), 397-411 (2013).
  18. Kayagaki, N., et al. Caspase-11 cleaves gasdermin D for noncanonical inflammasome signalling. Nature. 526 (7575), 666-671 (2015).
  19. Shi, J., et al. Cleavage of GSDMD by inflammatory caspases determines pyroptotic cell death. Nature. 526 (7575), 660-665 (2015).
  20. Shi, J., et al. Inflammatory caspases are innate immune receptors for intracellular LPS. Nature. 514 (7521), 187-192 (2014).
  21. Bolívar, B. E., et al. Noncanonical Roles of Caspase-4 and Caspase-5 in Heme-Driven IL-1β Release and Cell Death. The Journal of Immunology. 206 (8), 1878-1889 (2021).
  22. Schmid-Burgk, J. L., et al. Caspase-4 mediates noncanonical activation of the NLRP3 inflammasome in human myeloid cells. European Journal of Immunology. 45 (10), 2911-2917 (2015).
  23. Baker, P. J., et al. NLRP3 inflammasome activation downstream of cytoplasmic LPS recognition by both caspase-4 and caspase-5. European Journal of Immunology. 45 (10), 2918-2926 (2015).
  24. Cullen, S. P., Kearney, C. J., Clancy, D. M., Martin, S. J. Diverse activators of the NLRP3 inflammasome promote IL-1β secretion by triggering necrosis. Cell Reports. 11 (10), 1535-1548 (2015).
  25. Sanders, M. G., et al. Single-cell imaging of inflammatory caspase dimerization reveals differential recruitment to inflammasomes. Cell Death & Disease. 6, 1813 (2015).
  26. Charendoff, C. I., Bouchier-Hayes, L. Lighting up the pathways to caspase activation using bimolecular fluorescence complementation. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (133), e57316 (2018).
  27. Bouchier-Hayes, L., et al. Characterization of cytoplasmic caspase-2 activation by induced proximity. Molecular Cell. 35 (6), 830-840 (2009).
  28. Riedhammer, C., Halbritter, D., Weissert, R. Peripheral blood mononuclear cells: Isolation, Freezing, thawing, and culture. Methods in Molecular Biology. 1304, 53-61 (2016).
  29. Betsou, F., Gaignaux, A., Ammerlaan, W., Norris, P. J., Stone, M. Biospecimen science of blood for peripheral blood mononuclear cell (PBMC) functional applications. Current Pathobiology Reports. 7 (2), 17-27 (2019).
  30. Perregaux, D., et al. IL-1 beta maturation: evidence that mature cytokine formation can be induced specifically by nigericin. The Journal of Immunology. 149 (4), 1294-1303 (1992).
  31. Cheneval, D., et al. Increased mature interleukin-1β (IL-1β) secretion from THP-1 cells induced by nigericin is a result of activation of p45 IL-1β-converting enzyme processing. Journal of Biological Chemistry. 273 (28), 17846-17851 (1998).
  32. Fernandes-Alnemri, T., et al. The pyroptosome: a supramolecular assembly of ASC dimers mediating inflammatory cell death via caspase-1 activation. Cell Death and Differentiation. 14 (9), 1590-1604 (2007).
  33. Lu, A., et al. Unified polymerization mechanism for the assembly of ASC-dependent inflammasomes. Cell. 156 (6), 1193-1206 (2014).
  34. Muller-Eberhard, U., Javid, J., Liem, H. H., Hanstein, A., Hanna, M. Brief report: Plasma concentrations of hemopexin, haptoglobin and heme in patients with various hemolytic diseases. Blood. 32 (5), 811-815 (1968).
  35. Shyu, Y. J., Liu, H., Deng, X., Hu, C. D. Identification of new fluorescent protein fragments for bimolecular fluorescence complementation analysis under physiological conditions. Biotechniques. 40 (1), 61-66 (2006).
  36. Thornberry, N. A., et al. A novel heterodimeric cysteine protease is required for interleukin-1βprocessing in monocytes. Nature. 356 (6372), 768-774 (1992).
  37. Jensen, K., Anderson, J. A., Glass, E. J. Comparison of small interfering RNA (siRNA) delivery into bovine monocyte-derived macrophages by transfection and electroporation. Veterinary Immunology and Immunopathology. 158 (3-4), 224-232 (2014).
  38. Tada, Y., Sakamoto, M., Fujimura, T. Efficient gene introduction into rice by electroporation and analysis of transgenic plants: use of electroporation buffer lacking chloride ions. Theoretical and Applied Genetics. 80 (4), 475-480 (1990).
  39. Bhowmik, P., et al. Targeted mutagenesis in wheat microspores using CRISPR/Cas9. Scientific Reports. 8 (1), 6502 (2018).
  40. Sansom, D. M., Manzotti, C. N., Zheng, Y. What's the difference between CD80 and CD86. Trends in Immunology. 24 (6), 314-319 (2003).
  41. Kurokawa, M., Kornbluth, S. Caspases and kinases in a death grip. Cell. 138 (5), 838-854 (2009).

Tags

Immunologi och infektion utgåva 182
Visualisering av inflammatorisk kaspas inducerad närhet i humana monocyt-härledda makrofager
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bolívar, B. E., Bouchier-Hayes, … More

Bolívar, B. E., Bouchier-Hayes, L. Visualization of Inflammatory Caspases Induced Proximity in Human Monocyte-Derived Macrophages. J. Vis. Exp. (182), e63162, doi:10.3791/63162 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter