Summary
Целью данного протокола является обнаружение фенольных метаболитов в плазме с помощью полуцелевого метода хроматографии-масс-спектрометрии.
Abstract
Группе из 23 пожилых людей давали функциональное питание (напиток и кекс), специально разработанное для профилактики саркопении (возрастной потери мышечной массы). Образцы плазмы брали в начале вмешательства и через 30 дней употребления функциональных приемов пищи. Для выявления фенольных соединений и их метаболитов была проведена полуцелевая ультравысокоэффективная хроматография в сочетании с анализом тандемной массы (UPLC-MS/MS). Белки плазмы осаждали этанолом, а образцы концентрировали и повторно суспендировали в подвижной фазе (1:1 ацетонитрил: вода) перед инъекцией в инструмент UPLC-MS/MS. Разделение проводили с помощью реверсивной фазовой колонны C18 , и соединения идентифицировали с использованием их экспериментальной массы, изотопного распределения и структуры фрагментов. Интересующие соединения сравнивались с соединениями банков данных и внутренней полуцелевой библиотеки. Предварительные результаты показали, что основными метаболитами, выявленными после вмешательства, были фенилуксусная кислота, глицитин, 3-гидроксифенилвалеровая кислота и гомизин М2.
Introduction
Саркопения является прогрессирующим скелетным расстройством, связанным с ускоренной потерей мышц у пожилого населения. Такое состояние увеличивает риск падений и приводит к ограниченной деятельности повседневной жизни. Саркопения присутствует примерно у 5-10% лиц старше 65 лет и около 50% лиц в возрасте 80 лет и старше1. Для лечения саркопении не было одобрено никаких специфических препаратов, поэтому важна профилактика с физической активностью и сбалансированной диетой1,2. Питательные вмешательства со специально разработанными продуктами, обогащенными молочным белком и незаменимыми аминокислотами, показали положительные результаты в предотвращении саркопении2. В других исследованиях авторы включили в рацион витамины и антиоксиданты, такие как витамин Е и изофлавоны, увеличивая преимущества для увеличения мышечной массы на талии и бедрах3.
Brosimum alicastrum Sw. (Ramón) — дерево, произрастающее в мексиканских тропических регионах; он потребляется культурами майя из-за его высокой питательной ценности4. Это хороший источник белка, клетчатки, минералов и фенольных антиоксидантов, таких как хлорогеновая кислота5. Поскольку его можно измельчать в порошок и использовать в хлебобулочных изделиях или потреблять в напитках, недавние исследования оценили включение семенной муки Рамона (RSF) в различные продукты для улучшения их питательной ценности. Был разработан напиток со вкусом капучино, дополненный RSF, который был с высоким содержанием пищевых волокон и содержал более 6 г белка на порцию и был высоко принят потребителями; таким образом, он рассматривался в качестве потенциальной альтернативы для удовлетворения особых диетических требований6. В последующем исследовании RSF также использовался для приготовления кекса и нового напитка, богатого белком, пищевыми волокнами, микроэлементами и фенольными антиоксидантами. Кекс и напиток использовались в диетическом вмешательстве для пожилых людей, которые потребляли оба продукта два раза в день в течение 30 дней. После этого периода улучшился питательный и саркопенический статус участников, а общее фенольное содержание в плазме увеличилось7. Однако определение общих фенольных соединений в плазме проводили спектрофотометрическим методом, поэтому идентификация фактических фенольных соединений, которые были поглощены, была невозможна; более того, этот метод не является полностью специфичным для фенольных соединений, поэтому может произойти некоторое завышение8.
Идентификация и количественная оценка фенольных соединений, которые всасываются после потребления продуктов, богатых этими антиоксидантами, является сложной задачей, но необходима для демонстрации биологической активности этих фитохимических веществ. Биодоступность большинства фенольных соединений низкая; менее 5% из них можно обнаружить без структурной трансформации в плазме. Фенольные соединения подвергаются нескольким биотрансформациям, таким как метилирование, сульфирование или глюкуронизация, которые осуществляются энтероцитами и гепатоцитами9. Фенольные соединения также биотрансформируются микробиотой в бактериальные катаболиты, которые могут оказывать свое благотворное влияние на организм после всасывания в плазму10. Например, фенилуксусная кислота является продуктом бактериальной трансформации флавоноидов и олигомерных проантоцианидинов, которые могут ингибировать до 40% адгезии бактерий (Escherichia coli) в мочевыводящих путях после потребления клюквы11.
Структурное разнообразие встречающихся в природе фенольных соединений, в сочетании с разнообразием их метаболитов и их низкой биодоступностью, делает их идентификацию в плазме еще более сложной. Метаболомное профилирование с использованием платформ спектроскопического анализа, таких как ядерный магнитный резонанс (ЯМР) и тандемная масс-спектроскопия (MS / MS), вероятно, является лучшим подходом для достижения этой цели; к сожалению, оборудование не является легкодоступным, а разработка протоколов анализа по-прежнему ограничена12. В нескольких исследованиях сообщалось о РС / МС в сочетании с системой разделения (такой как жидкостная хроматография) в качестве стратегии снижения сложности масс-спектров в метаболомических исследованиях. Недавнее внедрение методов разделения сверхвысокопроизводительной жидкостной хроматографии (UPLC) сократило время анализа и повысило разрешение и чувствительность по сравнению с обычными высокопроизводительными жидкостными протоколами, поэтому системы UPLC-MS/MS быстро получили широкое признание сообщества аналитической метаболомики13. Таким образом, некоторые исследования исследовали фенольные метаболиты и обнаружили глюкуронизированные производные из кофейной кислоты, кверцетина и феруловой кислоты, а также сульфированные производные из сиринговой и ванильной кислоты в плазме лиц после приема клюквы14. Предыдущие протоколы предназначались для поиска фенольных соединений и фенольных метаболитов в биожидкостях, таких как плазма. Эти протоколы были основаны на идентификации и количественной оценке с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), соединенной с УФ-ви-детектором15. Тем не менее, такие протоколы требуют использования аутентичных стандартов для оценки абсолютной идентификации и точной количественной оценки. Широкий круг исследований выявил наиболее распространенные метаболиты в биожидкостях (сульфированные, глюкуронизированные и метилированные формы) UPLC-MS и UPLC-MS/MS; однако большая часть бактериальных метаболитов не была зарегистрирована из-за отсутствия баз данных, содержащих их полную информацию16. Идентификация метаболитов осложняется стоимостью и коммерческой доступностью стандартов метаболитов. Поэтому наилучшей стратегией может быть нецелевой или полуцелевой анализ метаболитов РС/МС, который опирается на использование информации о молекулярных признаках (m/z, моноизотопная точная масса, изотопное распределение и паттерн фрагментации) для определения химической идентичности и сравнивает ее со свободно доступными онлайн-базами данных, содержащими полифенольные метаболиты, идентифицированные в биожидкостях после потребления полиполифенол-рихттов12 . Наиболее важными базами данных, используемыми в исследованиях UPLC-MS / MS для идентификации фенольных соединений и их метаболитов, являются база данных метаболомов человека (HMDB), библиотека LipidBlast, библиотека METLIN и другие дополнительные базы данных, такие как PubChem, ChemSpider и Phenol Explorer17.
В настоящем исследовании был разработан полуцелевой метод UPLC-MS/MS для анализа образцов плазмы группы пожилых людей, участвующих в исследовании потребления кекса и напитков, содержащих RSF7. Данные из различных бесплатных онлайн-баз данных метаболитов плазмы были собраны и интегрированы в специализированную базу данных. Эта база данных может быть автоматически доступна программному обеспечению оборудования для идентификации полифенольных метаболитов в пяти образцах плазмы до и после 30-дневного вмешательства в питание. Это делается для выявления основных фенольных соединений, или их метаболитов, которые всасываются из специально разработанных функциональных продуктов, предназначенных для профилактики саркопении.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Образцы плазмы, используемые в этом протоколе, были собраны в предыдущем исследовании в соответствии со всеми этическими принципами и одобрены Комитетом по институциональной этике и биоэтике (CIEB-2018-1-37) из Автономного университета Сьюдад-Хуареса. Полный протокол экстракции и идентификации фенольных соединений и метаболитов в плазме методом UPLC-MS/MS представлен на фиг.1.
Рисунок 1: Схематическое изображение экстракции и идентификации фенольных соединений и метаболитов в плазме полуцелевым методом UPLC-MS/MS. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
1. Пробоподготовка
- Храните образцы плазмы при температуре -80 °C до анализа.
- Разморозка образцов плазмы при комнатной температуре в течение 15 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы могут быть помещены на водяную баню при температуре 37 °C для ускорения процесса (5 мин). - Поместите 200 мкл образца плазмы в микропробирку объемом 2 мл и смешайте с 1000 мкл чистого этанола. Вихрь образца плазмы в течение 30 с.
ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда используйте перчатки при работе с образцами плазмы. - Центрифугирование образца при 6,580 х г в течение 5 мин. После центрифугирования соберите супернатант с помощью микропипетки или пипетки Пастера и поместите его в новую микропробирку. Храните супернатант при температуре 4 °C.
- Смешайте гранулы с предыдущей стадии с 1000 мкл 100% этанола, вихрь в течение 30 с, а затем центрифугу при 6 580 х г в течение 5 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Гранулы плотно упакованы и должны быть хорошо повторно использованы для обеспечения контакта между образцом и чистым этанолом. Рекомендуется использовать микропипетку для промывки гранул этанолом. - После центрифугирования соберите супернатант и смешайте с супернатантом, ранее полученным на этапе 1.4. в микротрубке 2 мл.
- Удалите этанол из образца, используя чистый азот (99,997%) при 135 фунтах на квадратный дюйм. Держите иглу на расстоянии 1 см от верхней части микропробирки, чтобы предотвратить потерю образца и промывку, пока образец не высохнет. Для испарения этанола не требуется тепло.
ПРИМЕЧАНИЕ: Поток азота должен быть низким, чтобы предотвратить потерю пробы. После того, как этанол высушен, держите поток азота не менее 5 минут, чтобы обеспечить сухость образца. На этом этапе протокол может быть приостановлен; образцы должны храниться при температуре -20 °C. Не храните образцы более 12 ч. - Повторно суспендируют сухие образцы в 100 мкл смеси ацетонитрила: воды в пропорции 50:50 (v:v).
- Отфильтруйте образец через мембрану нейлонового шприца 0,45 мкм непосредственно в микровставку флакона ВЭЖХ.
ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы во флаконе могут храниться при температуре -20 °C перед анализом. Хранить образцы не более 8 ч. Рекомендуется вводить образцы в систему UPLC сразу после фильтрации.
2. Анализ UPLC-MS/MS
- Впрыскивайте 3 мкл образца в UPLC, оснащенный реверсивной колонной C18 (50 мм x 2,1 мм; 1,8 мкм). Установите температуру автопробоотборника на уровне 20 °C, а столбчатого термостата на 25 °C. Вводите каждый образец в трех экземплярах.
- Используйте 0,1% (v:v) муравьиной кислоты в воде в качестве растворителя А и 100% ацетонитрила в качестве растворителя В. Установите скорость потока на уровне 0,4 мл/мин и градиентную программу следующим образом: 0-1 мин 10% В, 1-4 мин 30% В, 4-6 мин 38% В, 6-8 мин 60% В, 8-8,5 мин 60% В, 8,5-9 мин 10% В (таблица 1).
- Установите масс-спектрометр на отрицательный режим ионизации. Используйте азот в качестве сушильного газа при 340 °C и расходе 13 л/мин. Установите давление небулайзера на уровне 60 фунтов на квадратный дюйм. Установите капиллярное напряжение на уровне 4000 В, напряжение фрагментора на 175 В и напряжение скиммера на 65 В. Используйте энергию столкновения при 20 В (таблица 2).
- Сканируйте массы в диапазоне от 100 до 1100 масс к заряду (м/з) и, для MS/MS, массы сканирования в диапазоне 50-1000 м/з (таблица 2). Установите сбор данных в автоматический режим MS/MS. Используйте следующую ссылочную массу: 119.036 и 966.0007.
| Время (мин) | Растворитель А (0,1 % муравьиной кислоты в воде ВЭЖХ) | Растворитель B (100% ацетонитрил) |
| 0 до 1 | 90 | 10 |
| 1 до 4 | 70 | 30 |
| 4 до 6 | 62 | 38 |
| 6 до 8 | 40 | 60 |
| от 8 до 8,5 | 40 | 60 |
| 8.5 до 9 | 90 | 10 |
Таблица 1: Градиент подвижной фазы, используемый для разделения фенольных соединений по UPLC.
| Режим ионизации | Отрицательная |
| Сушильный газ | Азот при 340 °C, расход 13 л/мин |
| Давление небулайзера | 60 фунтов/кв. дюйм |
| Капиллярное напряжение | 175 В |
| Ms сканирующие массы | 100-1100 м/з |
| Ms/MS сканирующие массы | 50-1000 м/з |
Таблица 2: Параметры ионизации для анализа MS/MS.
3. Построение базы данных
- Поиск фенольных соединений, фенольных метаболитов или других соединений, представляющих интерес в научной литературе.
- Откройте программное обеспечение для управления базами данных, входящее в систему UPLC. Выберите | файлов Новая | составной библиотеки персональных баз данных (PCDL) Создайте новый PCDL. Выберите тип PCDL: LC/MS Metabolomics. Задайте имя для PCDL. Затем выберите Создать.
- На панели инструментов выберите PCDL , а затем параметр Разрешить редактирование . Затем нажмите кнопку Найти соединения .
ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку это новый PCDL, результаты таблицы будут пустыми. Это изменится, как только новые соединения будут добавлены в PCDL.- Добавляйте соединения в специализированную библиотеку соединений персональной базы данных, копируя их из общей библиотеки прибора. Откройте существующую базу данных инструмента, включенную в программное обеспечение для управления базами данных. Нажмите кнопку Найти составы. В параметре Одиночный поиск введите составные критерии поиска, чтобы найти интересующее соединение.
ПРИМЕЧАНИЕ: Соединения можно найти по названию, молекулярной формуле, точной массе и времени удержания. - В таблице составных результатов выберите процентное соединение. Чтобы выбрать несколько соединений, щелкните первое соединение, удерживая нажатой клавишу CTRL , а затем щелкните каждое интересующее соединение. Затем щелкните правой кнопкой мыши на всех выделенных соединениях и выберите Добавить в PCDL.
- В новом окне найдите и выберите специализированный файл персональной базы данных. Пометьте поля Включить спектры для соединений, если они присутствуют , и Включить информацию о подвижности ионов для соединений, если они присутствуют. Нажмите кнопку Добавить . В новом диалоговом окне выберите Да , чтобы проверить добавленные новые соединения. Выберите Нет , чтобы продолжить поиск интересующих соединений.
- Добавляйте соединения в специализированную библиотеку соединений персональной базы данных, копируя их из общей библиотеки прибора. Откройте существующую базу данных инструмента, включенную в программное обеспечение для управления базами данных. Нажмите кнопку Найти составы. В параметре Одиночный поиск введите составные критерии поиска, чтобы найти интересующее соединение.
- Если интересующие соединения отсутствуют в общей библиотеке прибора, добавьте новые соединения вручную.
- Откройте специализированную персональную базу данных. После открытия выполните шаг 3.3. Выберите параметр «Редактировать соединения ». Нажмите кнопку Добавить новый .
- В верхней части окна заполните информацию о новом соединении. Введите формулу, имя, имя IUPAC, номер CAS, идентификатор Chemspider и другие идентификаторы.
- Используйте информацию, доступную в бесплатных онлайн-библиотеках (Chemspider, PubChem и Phenol Explorer), чтобы заполнить информацию для нового интересующего соединения. По завершении нажмите кнопку Сохранить как новую , чтобы сохранить новую составную информацию в специализированной персональной базе данных.
ПРИМЕЧАНИЕ: При добавлении информации из свободных библиотек обязательно включайте информацию о соединении без присутствия ионов хлорида или йодида. Это может изменить точную массу и молекулярную формулу интересующего соединения.
- Повторите процесс со всеми интересующими соединениями, чтобы заполнить специализированную персональную базу данных.
4. Анализ данных
- Используйте качественное управляющее программное обеспечение прибора для идентификации фенольных соединений и фенольных метаболитов, присутствующих в образцах.
- Откройте пример файла. На панели «Хроматограмма» выберите «Определить хроматограммы» и извлеките общую ионную хроматограмму (TIC), извлеченную ионно-хроматограмму MS (EIC) и EIC MS/MS. Выберите параметр интегрировать хроматограмму.
- На панели « Найти соединения » выберите « Найти по формулам-параметрам». В новом окне выберите Источник формул , а затем параметр База данных/библиотека . Найдите ранее созданную базу персональных данных и нажмите кнопку Открыть.
- Выберите параметр «Сопоставление формул» и установите допуск на массовое совпадение 5 частей на миллион (ppm).
ПРИМЕЧАНИЕ: Различный допуск на совпадение масс может быть установлен на уровне 10 ppm; эта разница зависит от используемого масс-спектрометра. - Выберите параметр «Отрицательные ионы » и выберите только диалоговое окно -H . В параметре Результаты отметьте диалоговые окна Извлечение EIC, Извлечение очищенного спектра, Извлечение необработанного спектра и Включение структуры .
- Выберите параметр Фильтры результатов . Отметьте Предупредите, если счет есть , и установите счет матча на уровне 80,00%. Отметка Не совпадает, если счет есть , и установите счет на уровне 75,00%.
ПРИМЕЧАНИЕ: При необходимости результаты совпадений и не совпадений могут быть изменены на более низкие значения. Это снизит точность идентификации. - Нажмите на кнопку Найти соединения по формуле , чтобы определить соединения, представляющие интерес в образце.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Пошаговый процесс идентификации фенольных метаболитов с помощью полуцелевого анализа UPLC-MS/MS в отрицательном режиме образцов плазмы показан на рисунке 2. Во-первых, общая ионная хроматограмма (ТИЦ) из экстракта фенолов плазмы (полученная после осаждения белка из общего образца плазмы) была получена с помощью качественного программного обеспечения прибора. Затем использовали извлеченную ионную хроматограмму, а точную массу и структуру фрагментации (ms/MS анализ) каждого сигнала (или молекулярного признака) сравнивали с данными конкретной персональной базы данных, созданной также в программном обеспечении прибора. Сигналам с массовым соответствием менее 5 ppm присваивалась молекулярная формула из базы данных. Наконец, изотопное распределение каждого сигнала сравнивали с распределением назначенной молекулярной формулы для достижения окончательной предварительной идентификации. Соединения, которые а) были идентифицированы только в одной реплике или б) представляли площадь ниже 10 000, рассматривались как ложные идентификации. Из этого анализа в образцах плазмы было идентифицировано в общей сложности 25 фенольных соединений и метаболитов (таблица 3). В этом списке были обнаружены как фенольные соединения, так и их метаболиты, такие как 3-гидроксифенилвалеровая кислота и изопропил 3-(3,4-дигидроксифенил)-2-гидроксипропаноат. Поскольку режим отрицательной ионизации лучше всего подходит для всех классов фенольных соединений, кроме антоцианов, эти соединения не могут быть обнаружены с помощью настоящего способа. Если антоцианы являются важными компонентами пищевой матрицы, следует также использовать положительный режим.
| Фенольные метаболиты | Р.Т. (мин.) | Формула | Предшественник | Экспериментальная масса | Теоретическая масса | Разница (ppm) | |
| 2,3-дигидроксибензойная кислота | 0.622 | Ц7Н6О4 | 153.0203 | 154.0273 | 154.0266 | 4.2 | |
| 2-гидроксигиппуровая кислота | 8.631 | Ц18Н33НО4 | 410.1648 | 411.1725 | 411.1717 | 1.8 | |
| 3,4-дигидрокситолуол | 2.239 | С7Н8О2 | 123.0451 | 124.0524 | 124.0524 | -0.25 | |
| 3-гидроксифенилвалериановая кислота | 6.717 | Ц11Н14О3 | 193.0874 | 194.0947 | 194.0943 | 2.12 | |
| 5-(3',4'-дигидроксифенил)-валериановая кислота | 4.293 | Ц11Н14О4 | 209.0823 | 210.0894 | 210.0892 | 0.68 | |
| 6-гидроксиэнтеродиол | 9.201 | Ц18Н22О5 | 317.1387 | 318.1465 | 318.1467 | -0.65 | |
| Аюгол | 3.889 | Ц15Н24О9 | 347.134 | 348.1418 | 348.142 | -0.59 | |
| Бензойная кислота | 3.915 | Ц7Н6О2 | 121.0296 | 122.0367 | 122.0368 | -0.28 | |
| Карнозиновая кислота | 6.785 | Ц20Н28О4 | 331.1905 | 332.1979 | 332.1988 | -2.58 | |
| Карносол | 6.347 | Ц20Н26О4 | 329.1764 | 330.1842 | 330.1831 | 3.43 | |
| Катехол | 0.892 | Ц6Н6О2 | 109.0297 | 110.037 | 110.0368 | 1.91 | |
| Глицитин | 6.01 | Ц22Н22О10 | 445.1155 | 446.1228 | 446.1213 | 3.4 | |
| Гесперетин | 6.01 | Ц16Н14О6 | 301.0718 | 302.0796 | 302.079 | -1.81 | |
| Гиппуровая кислота | 1.396 | Ц9Н9НО3 | 178.051 | 179.058 | 179.0582 | -1.16 | |
| Гомованиловая кислота | 0.823 | Ц9Н10О4 | 181.0503 | 182.0576 | 182.0579 | -1.88 | |
| Изопропил 3-(3,4-дигидроксифенил)-2-гидроксипропаноат | 6.177 | Ц12Н16О5 | 239.0926 | 240.0999 | 240.0998 | 0.48 | |
| Фенилуксусная кислота | 5.666 | Ц8Н8О2 | 135.0444 | 136.0518 | 136.0524 | -4.92 | |
| Флоретическая кислота | 2.811 | Ц9Н10О3 | 165.0556 | 166.0626 | 166.063 | -2.41 | |
| Протокатехуический альдегид | 1.094 | Ц7Н6О3 | 137.0247 | 138.0311 | 138.0317 | -4.5 | |
| Секоизоларицирезинол | 8.837 | Ц20Н26О6 | 361.1656 | 362.1729 | 362.1729 | -0.23 | |
| Ванилин | 2.508 | Ц8Н8О3 | 151.04 | 152.0471 | 152.0473 | -1.82 | |
| Эпикатехин 3'-O-глюкуронид | 9.342 | Ц21Н22О12 | 465.1024 | 466.109 | 466.1111 | -4.64 | |
| Гомисин М2 | 5.234 | Ц22Н26О6 | 385.1676 | 386.1746 | 386.1729 | 4.38 | |
| Ирисолидон | 6.145 | Ц17Н14О6 | 313.0727 | 314.0798 | 314.079 | 2.33 | |
| Уролитин С | 6.753 | Ц13Н8О5 | 243.0294 | 244.0368 | 244.0372 | -1.69 | |
Таблица 3: Предварительная идентификация фенольных соединений и метаболитов в образцах плазмы полуцелевым методом UPLC-MS/MS.
Для оценки эффективности разработанного способа идентификации основных фенольных соединений или их метаболитов, которые абсорбировались из RSF-содержащего кекса и напитка, были проанализированы пять алеаторных образцов участников исследования, полученных до и после 30-дневного вмешательства. Относительное содержание каждого соединения рассчитывали путем деления площади под кривой (AUC) после обработки AUC до обработки. Из этого анализа можно было заметить, что некоторые соединения появлялись только в образцах, полученных до лечения, другие оставались неизменными, в то время как некоторые из них увеличивались после потребления функциональных продуктов. В таблице 4 приведен список из 12 фенольных соединений, которые показали увеличение плазмы после 30-дневного потребления RSF-содержащих продуктов. Фенилуксусная кислота была единственным метаболитом, обнаруженным последовательно в более высоких концентрациях после лечения. Глицитин, гликозилированный изофлавон и 3-гидроксифенилвалеровая кислота (фенольный метаболит) увеличились в трех из пяти образцов, но уменьшились в двух других. Гомисин М2, лигнан, был обнаружен в трех из пяти образцов только после вмешательства в питание. Другие фенольные соединения (такие как гесперетин, секоизоларицирезинол и ванилин) и метаболиты (такие как 2-гидроксигиппуровая кислота) были обнаружены только в одном образце и только после лечения.
| Образец (AUC после лечения/AUC до лечения) | |||||||
| Соединение | Формула | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | |
| 2-гидроксигиппуровая кислота | Ц18Н33НО4 | T | нд | нд | нд | нд | |
| 3-гидроксифенилвалериановая кислота | Ц11Н14О3 | 1.30 | 2.69 | 2.69 | 0.62 | 0.62 | |
| 6-гидроксиэнтеродиол | Ц18Н22О5 | нд | нд | T | нд | нд | |
| Глицитин | Ц22Н22О10 | 1.88 | 1.07 | 1.07 | 0.43 | 0.45 | |
| Гесперетин | Ц16Н14О6 | T | нд | нд | нд | нд | |
| Фенилуксусная кислота | Ц8Н8О2 | 4.06 | T | T | T | 1.28 | |
| Флоретическая кислота | Ц9Н10О3 | T | нд | нд | нд | нд | |
| Протокатехуический альдегид | Ц7Н6О3 | T | нд | нд | нд | нд | |
| Секоизоларицирезинол | Ц20Н26О6 | T | нд | нд | нд | нд | |
| Ванилин | Ц8Н8О3 | T | нд | нд | нд | нд | |
| Гомисин М2 | Ц22Н26О6 | нд | T | T | T | нд | |
Таблица 4: Список фенольных соединений, повышавшихся в плазме лиц пожилого возраста после 30-дневного потребления RSF-содержащих продуктов. Данные представляют собой соотношения содержания (AUC) каждого соединения после лечения по сравнению с их содержанием до обработки. T указывает, что соединение было идентифицировано только в образце после лечения. Nd: не обнаружено.
Рисунок 2: Протокол идентификации метаболитов фенольных соединений полуцелевыми UPLC-MS/MS. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Идентификация и количественная оценка биологически активных фитохимических веществ, которые поглощаются после употребления пищи или пищевой добавки, имеют решающее значение для демонстрации и понимания пользы для здоровья этих соединений и продуктов, содержащих их. В настоящей работе был разработан метод UPLC-MS/MS, направленный только на идентификацию основных фенольных соединений и их метаболитов, увеличившихся в концентрации в плазме после 30-дневного питательного вмешательства двумя пищевыми продуктами, специально разработанными для пожилых людей. Предполагалось, что, если одно соединение увеличивалось или появлялось в плазме только после периода вмешательства, это соединение было поглощено и/или биотрансформировано из продуктов, используемых в вмешательстве.
UPLC-MS/MS является одной из предпочтительных технологий метаболомных исследований, в которых многие низкомолекулярные соединения анализируются одновременно в сложных образцах для оценки эффекта некоторой обработки или изменения окружающей среды13. Это можно сделать с помощью целевых и нецелевых (или глобальных) методов. Целевые анализы сосредоточены на известном небольшом количестве метаболитов, представляющих интерес. Они являются наилучшим вариантом для количественной оценки соединений с имеющимися стандартами, обеспечивая наилучшую специфичность и чувствительность; однако эти методы должны быть тщательно оптимизированы для выбранных метаболитов и не способны обнаруживать неожиданные соединения в образцах12. В других исследованиях ВЭЖХ в сочетании с детектором UV-vis использовался для идентификации фенольных кислот и метаболитов в плазме, но этот тип исследования использовал аналитические стандарты для идентификации и количественной оценки соединения, представляющего интерес15. В другом исследовании было предложено добавить внутренний стандарт18; однако в этой работе были проанализированы только феруловая и кофейная кислоты и их метаболиты. С другой стороны, синтез внутренних стандартов фенольных метаболитов был предложен в качестве альтернативы отсутствию коммерческих аналитических стандартов19. Тем не менее, синтез большого разнообразия фенольных соединений является сложным, трудоемким и дорогостоящим. Нецелевые методы пытаются обнаружить и идентифицировать как можно больше молекулярных соединений и в первую очередь генерируют гипотезы12. Они могут идентифицировать несколько сотен соединений в одном образце, присваивая формулы обнаруживаемым хроматографическим сигналам с характерными признаками, такими как m/z или измеренная точная масса, время удержания хроматографической карты, изотопный отпечаток пальца и т. Д., Поэтому данные, генерируемые этими анализами, очень обильны и могут быть трудно интерпретировать20 . Поскольку целью настоящего метода было не получение полного метаболического профиля образцов плазмы (что было бы нецелевым подходом), а идентификация основных фенольных соединений и фенольных метаболитов (ранее неизвестных) в них, был разработан полуцелевой подход. Для этого все идентифицированные сигналы извлекались автоматически с помощью программного обеспечения прибора, а затем сравнивались с самостоятельно созданной базой данных, содержащей 645 фенольных соединений и их метаболитов, которые были получены из бесплатных онлайн-баз данных. База данных включала эталонные схемы фрагментации MS/MS соединений, которые использовались для присвоения названия и формулы соединения, что позволяет более точно идентифицировать соединения в образце12.
Наиболее важными этапами протокола были: 1) предварительная обработка образцов (экстракция и концентрация фенольных соединений и метаболитов из образцов плазмы); 2) построение полной и специфической базы данных для полуцелевого анализа образцов и идентификации всех возможных соединений, относящихся к определенному классу соединений; и 3) выбор параметров, используемых качественным программным обеспечением прибора (допуск на массовое совпадение ppm и оценка%) для точной идентификации соединений в образце. При предварительной обработке образца необходимо соблюдать осторожность, чтобы избежать потери интересующих соединений, восстановить их в высокой конечной концентрации и быть в состоянии устранить интерферирующие соединения. При создании конкретной базы данных крайне важно провести тщательный поиск литературы, а затем использовать бесплатные онлайновые базы данных для получения конкретных химических данных, которые будут использоваться для идентификации соединений в образце. Отбор наилучших значений для массового совпадения и оценки требовал предварительной валидации аналитического метода с использованием стандартов и известных образцов21,22.
После того, как протокол был реализован, общие проблемы и их рекомендуемые решения были следующими: 1) В образцах не было выявлено соединений. Это было связано с низкой концентрацией соединений и могло быть решено путем сушки образца и повторного растворения его в меньшем объеме. 2) Сигналы появились в ТИЦ, но соединения не были идентифицированы. Это могло быть связано со сбоем калибровки массы, поэтому разница между экспериментальными и теоретическими массами была высокой. В этом случае калибровка массы прибора должна выполняться в соответствии с изготовителем и моделью оборудования. Второй причиной может быть неполная личная база данных, поэтому очень важно постоянно проверять и поддерживать базу данных. Массы соединений, подозреваемых в том, что они представляют интерес, могут быть проверены и сопоставлены с свободно доступными онлайн-базами данных или новой научной литературой. 3) Сигналы появились в пустых прогонах. Это указывает на загрязнение и может быть решено путем очистки иглы и колонки автосамплера. Стандартный протокол очистки заключается в выполнении некоторых запусков с использованием метанола, затем изопропанола и, наконец, ацетонитрила в качестве подвижной фазы. Затем колонну повторно уравновешивают, запуская подвижную фазу не менее 30 минут.
Основными трудностями в разработке такого рода метода являются: 1) низкая биодоступность, в общих чертах, всех фитохимических веществ, включая фенольные соединения, что приводит к очень низким концентрациям в плазме16; 2) высокое разнообразие фенольных соединений, присутствующих в пищевых продуктах, которое увеличивается за счет их метаболизма и биотрансформации, возникающих в энтероцитах и гепатоцитах человека и микробиоте толстой кишки23; 3) отсутствие стандартов (некоторые стандарты существуют, но их очень трудно получить) для многих соединений, особенно для метаболитов, и существование некоторых неизвестных или неохарактеризованных соединений23; и 4) переменные реакции среди индивидов, как в абсорбции, так и в метаболизме фитохимических веществ14. Чтобы преодолеть проблему низких плазменных концентраций фенольных метаболитов, их следует экстрагировать и концентрировать. Это может быть достигнуто путем микротвердофазной экстракции14 или, как в настоящей работе, путем добавления растворителей, которые осаждают белки и растворяют фенольные соединения и метаболиты, с последующим испарением растворителя и ресуспензией в меньшем объеме19. Этот метод прост, экономичен и адекватен для небольшого количества образцов. Тем не менее, восстановление интересующих соединений может быть легко улучшено за счет использования больших объемов плазмы, поэтому конечная концентрация всех соединений будет выше. Высокое разнообразие фенольных метаболитов и отсутствие стандартов является причиной, по которой полуцелевой подход был использован для идентификации соединений, увеличенных вмешательством, прежде чем пытаться количественно оценить их. Используя специально созданную базу данных вместо совершенно нецелевого анализа, можно было игнорировать многочисленные первичные метаболиты в плазме, ориентируясь только на фенольные соединения и их метаболиты. Важным ограничением этой базы данных, специфичным для фенольных соединений и их метаболитов человека, было отсутствие масс-спектральной информации по многим соединениям и их метаболитам, что снижает точность идентификации соединения.
Большая вариабельность среди индивидов регулярно наблюдается в исследованиях, оценивающих абсорбцию и метаболизм фенольных соединений, как количественно, так и качественно. В настоящих результатах один человек представил 18 соединений в образце плазмы, взятом после вмешательства, в то время как другие показали только 9 или 10. Более того, многие фенольные соединения и метаболиты были обнаружены только в исходных образцах (до вмешательства), и они также варьировались среди отдельных лиц. В целом, более половины идентифицированных соединений показали более высокие концентрации (AUC) до, чем после вмешательства, или были обнаружены только в образцах до вмешательства. Поэтому необходимо было сравнить отдельные образцы, взятые до и после вмешательства, чтобы понять, какие соединения были фактически увеличены им. Единственным метаболитом, который последовательно увеличивался после лечения, была фенилуксусная кислота, микробный катаболит флаван-3-ols24, который был обнаружен в плазме лиц при острых исследованиях потребления богатых фенолами продуктов14,25. Большинство исследований, которые идентифицировали и количественно определили фенольные метаболиты в плазме, были острыми исследованиями, в которых концентрации соединений контролировали в течение 24 ч после употребления богатой фенолами пищи, отмечая, что через 24 ч их концентрации были близки к базальному значению19,25. Поэтому понятно, что образцы, проанализированные в настоящей работе, показали низкие количества и концентрации фенольных метаболитов. Недавно Zhang et al.25 оценили потребление красной малины, как в острых исследованиях, так и после 4 недель приема добавок. Они отметили, что как острые, так и хронические вмешательства увеличивали фенольные соединения и их метаболиты, в то время как после 4-недельного приема добавок базальная плазменная концентрация некоторых метаболитов увеличивалась (мочекаменные, коричные, фенилпропионовая и гиппуровая кислоты) и других снижалась (конъюгированные производные антоцианина).
Заключительный анализ метода, разработанного в настоящем документе, показывает, что в большинстве своем он хорошо подходил для цели, для которой он был создан. Предварительная обработка образца была простой и эффективной, и было достигнуто разделение UPLC и полуцелевая идентификация МС/МС фенольных метаболитов. Этот полуцелевой метод может быть полезен в качестве первого скринингового подхода для идентификации фенольных соединений, которые могут поглощаться из различных пищевых матриц, а также фенольных метаболитов, присутствующих в плазме человека. Кроме того, протокол полезен, поскольку он позволяет идентифицировать, когда нет стандартов для фенольных соединений или метаболитов. Наконец, метод использует небольшое количество плазмы, что имеет решающее значение в большинстве исследований in vivo , где образцов плазмы не хватает. Тем не менее, рекомендуется, чтобы для будущих исследований перед хроническим вмешательством было проведено острое исследование, чтобы лучше идентифицировать основные фенольные соединения и метаболиты, всасываемые из специально разработанных продуктов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Все авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Acknowledgments
Авторы благодарны за финансовую поддержку со стороны CONACYT, Мексика (CB-2016-01-286449) и UACJ-PIVA (проекты 313-17-16 и 335-18-13). OAMB хотел бы поблагодарить CONACYT за его стипендию Ph.D. Мы с благодарностью благодарим техническую поддержку от офиса Multimedia Production от UACJ.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetonitrile | Tedia | Al1129-001 | LC Mass spectrometry |
| Autosampler | Agilent Technologies | G4226A | 1290 Infinity series |
| C18 reverse phase column | Agilent Technologies | 959757-902 | Zorbax Eclipse plus C18 2.1x50 mm, 1.8 μm; Rapid resolution HD |
| Centrifuge | Eppendorf | 5452000018 | Mini Spin; Rotor F-45-12-11 |
| Column compartment with thermostat | Agilent Technologies | G1316C | 1290 Infinity series |
| Diode Array Detector (UV-Vis) | Agilent Technologies | G4212B | 1260 Infinity series |
| Electrospray ionnization source | Agilent Technologies | G3251B | Dual sprayer ESI source |
| Formic acid | J.T. Baker | 0128-02 | Baker reagent, ACS |
| Mass Hunter Data Acquisition | Agilent Technologies | G3338AA | |
| Mass Hunter Personal Compound Datbase and Library Manager | Agilent Technologies | G3338AA | |
| Mass Hunter Qualitative Analysis | Agilent Technologies | G3338AA | |
| Microcentrifuge tube | Brand | BR780546 | Microcentrifuge tube, 2 mL with lid |
| Pure ethanol | Sigma-Aldrich | E7023-1L | 200 proof, for molecular biology |
| Q-TOF LC/MS | Agilent Technologies | G6530B | 6530 Accurate Mass |
| Quaternary pump | Agilent Technologies | G4204A | 1290 Infinity series |
| Syringe filter | Thermo Scientific | 44514-NN | 17 mm, 0.45 μm, nylon membrane |
| Thermostat | Agilent Technologies | G1330B | 1290 Infinity series |
| Vial | Agilent Technologies | 8010-0199 | Amber, PFTE red silicone 2 mL with screw top and blue caps |
| Vial insert | Agilent Technologies | 5183-2089 | Vial insert 200 μL for 2mL standard opening, conical |
| Water | Tedia | WL2212-001 | LC Mass spectrometry |
References
- Morley, J. E., Anker, S. D., von Haehling, S. Prevalence, incidence, and clinical impact of sarcopenia: facts, numbers, and epidemiology-update 2014. Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle. 5 (4), 253-259 (2014).
- Cruz-Jentoft, A. J., Sayer, A. A.
- Beaudart, C., et al. Nutrition and physical activity in the prevention and treatment of sarcopenia: systematic review. Osteoporosis International. 28 (6), 1817-1833 (2017).
- Ozer, H. K. Phenolic compositions and antioxidant activities of Maya nut (Brosimum alicastrum): Comparison with commercial nuts. International Journal of Food Properties. 20 (11), 2772-2781 (2017).
- Subiria-Cueto, R., et al. Brosimum alicastrum Sw. (Ramón): An alternative to improve the nutritional properties and functional potential of the wheat flour tortilla. Foods. 8 (12), 1-18 (2019).
- Martínez-Ruiz, N., Torres, L. E. J., del Hierro-Ochoa, J. C., Larqué-Saavedra, A. Bebida adicionada con Brosimum alicastrum sw.: Una alternativa para requerimientos dietarios especiales. Revista Salud Pública y Nutrición. 18 (3), 1-10 (2019).
- Rodríguez-Tadeo, A., et al. Functionality of bread and beverage added with brosimum alicastrum sw. Seed flour on the nutritional and health status of the elderly. Foods. 10 (8), 1-21 (2021).
- Muñoz-Bernal, ÓA., et al. Nuevo acercamiento a la interacción del reactivo de Folin-Ciocalteu con azúcares durante la cuantificación de polifenoles totales. TIP Revista Especializada en Ciencias Químico-Biológicas. 20 (2), 28-33 (2017).
- Luca, S. V., et al. Bioactivity of dietary polyphenols: The role of metabolites. Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 60 (4), 626-659 (2020).
- Kawabata, K., Yoshioka, Y., Terao, J. Role of intestinal microbiota in the bioavailability and physiological functions of dietary polyphenols. Molecules. 24 (2), (2019).
- de Llano, D. G., Moreno-Arribas, M. V., Bartolomé, B. Cranberry polyphenols and prevention against urinary tract Infections: Relevant considerations. Molecules. 25 (15), (2020).
- Alsaleh, M., et al. Mass spectrometry: A guide for the clinician. Journal of Clinical and Experimental Hepatology. 9 (5), 597-606 (2019).
- Wang, X., Sun, H., Zhang, A., Wang, P., Han, Y. Ultra-performance liquid chromatography coupled to mass spectrometry as a sensitive and powerful technology for metabolomic studies. Journal of Separation Science. 34 (24), 3451-3459 (2011).
- Feliciano, R. P., Mills, C. E., Istas, G., Heiss, C., Rodriguez-Mateos, A. Absorption, metabolism and excretion of cranberry (poly)phenols in humans: A dose response study and assessment of inter-individual variability. Nutrients. 9 (3), (2017).
- Mateos, R., Goya, L., Bravo, L. Uptake and metabolism of hydroxycinnamic acids (chlorogenic, caffeic, and ferulic acids) by HepG2 cells as a model of the human liver. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 54 (23), 8724-8732 (2006).
- Rodriguez Lanzi,, Perdicaro, C., Antoniolli, D. J., Piccoli, A., Vazquez Prieto, M. A., Fontana, A. Phenolic metabolites in plasma and tissues of rats fed with a grape pomace extract as assessed by liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Archives of Biochemistry and Biophysics. , 28-33 (2018).
- Hou, Y., He, D., Ye, L., Wang, G., Zheng, Q., Hao, H. An improved detection and identification strategy for untargeted metabolomics based on UPLC-MS. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 191, 113531 (2020).
- Nagy, K., et al. First identification of dimethoxycinnamic acids in human plasma after coffee intake by liquid chromatography-mass spectrometry. Journal of Chromatography A. 1218 (3), 491-497 (2011).
- Marmet, C., Actis-Goretta, L., Renouf, M., Giuffrida, F. Quantification of phenolic acids and their methylates, glucuronides, sulfates and lactones metabolites in human plasma by LC-MS/MS after oral ingestion of soluble coffee. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 88, 617-625 (2014).
- McCord, J., Strynar, M. Identifying per-and polyfluorinated chemical species with a combined targeted and non-targeted-screening high-resolution mass spectrometry workflow. Journal of Visualized Experiments. 2019 (146), 1-15 (2019).
- Muñoz-Bernal, ÓA., et al. Phytochemical characterization and antiplatelet activity of Mexican red wines and their by-products. South African Journal of Enology and Viticulture. 42 (1), 77-90 (2021).
- Muñoz-Bernal, ÓA. Enriquecimiento de un vino tinto con un extracto de compuestos fenólicos provenientes de orujo de uva: bioaccesibilidad, análisis sensorial y respuesta biológica. Universidad Autónoma de Ciudad Juárez. , (2021).
- Low, D. Y., et al. Data sharing in PredRet for accurate prediction of retention time: Application to plant food bioactive compounds. Food Chemistry. , 357 (2021).
- Sánchez-Patán, F., et al. Gut microbial catabolism of grape seed flavan-3-ols by human faecal microbiota. Targeted analysis of precursor compounds, intermediate metabolites and end-products. Food Chemistry. 131 (1), 337-347 (2012).
- Zhang, X., Sandhu, A., Edirisinghe, I., Burton-Freeman, B. M. Plasma and urinary (poly)phenolic profiles after 4-week red raspberry (Rubus idaeus L.) intake with or without fructo-oligosaccharide supplementation. Molecules. 25 (20), (2020).
