Summary
성인 제브라피쉬의 기계적 뇌 손상 모델은 높은 재생 능력을 조절하는 분자 메커니즘을 조사하기 위해 설명됩니다. 이 방법은 형광 면역 염색을 사용하여 재생 반응을 평가하기 위해 여러 종의 작은 물고기의 시신경에 찔린 상처 손상을 만드는 것을 설명합니다.
Abstract
제브라피쉬는 중추신경계(CNS) 재생 능력이 우수하지만 메다카는 CNS 재생 능력이 낮습니다. 제브라피쉬와 메다카의 성체 시신경에서 뇌 손상 모델을 개발했으며 이러한 어종에 걸쳐 이 조직의 높은 재생 능력을 조절하는 분자 메커니즘을 밝히기 위해 비교 조직학적 및 분자 분석이 수행되었습니다. 여기에서는 바늘을 사용하여 성인 시신경에 대한 찔린 상처 손상 모델과 신경 줄기 세포(NSC)의 증식 및 분화를 위한 조직학적 분석을 제시합니다. 바늘을 시신경의 중앙 영역에 수동으로 삽입 한 다음 물고기를 심장 내로 관류하고 뇌를 해부했습니다. 이어서, 이들 조직을 냉동 절개하고, 적절한 NSC 증식 및 분화 마커에 대한 면역염색을 사용하여 평가하였다. 이 tectum 손상 모델은 제브라피쉬와 메다카 모두에서 강력하고 재현 가능한 결과를 제공하여 손상 후 NSC 반응을 비교할 수 있습니다. 이 방법은 제브라피쉬, 메다카, 아프리카 송사리를 포함한 작은 경골에 사용할 수 있으며 재생 능력을 비교하고 고유한 분자 메커니즘을 조사할 수 있습니다.
Introduction
제브라피쉬(Danio rerio)는 다른 포유류에 비해 중추신경계(CNS)를 재생하는 능력이 증가했다 1,2,3. 최근에, 이러한 증가된 재생 능력의 기초가 되는 분자 메커니즘을 더 잘 이해하기 위해, 차세대 시퀀싱 기술을 이용한 조직 재생의 비교 분석이 수행되었다 4,5,6. 제브라 피쉬와 테트라포드의 뇌 구조는 상당히 다릅니다 7,8,9. 이것은 유사한 뇌 구조와 생물학적 특징을 가진 작은 물고기를 사용하는 여러 뇌 손상 모델이 이러한 재생 능력 증가에 기여하는 기본 분자 메커니즘의 조사를 용이하게 하기 위해 개발되었음을 의미합니다.
또한, 메다카 (Oryzias latipes)는 제브라 피쉬에 비해 심장 및 신경 재생 능력이 낮은 인기있는 실험실 동물입니다 10,11,12,13. 제브라피쉬와 메다카는 성체 신경 줄기 세포(NSC)에 대해 유사한 뇌 구조와 틈새를 가지고 있습니다.14,15,16,17. 제브라피쉬와 메다카에서 시신경은 두 가지 유형의 NSC, 신경상피 유사 줄기 세포와 방사상 신경교 세포(RGC)를 포함합니다15,18. 성인 제브라피쉬의 시신경에 대한 찔린 상처 손상이 이전에 개발되었으며, 이 모델은 이 동물 19,20,21,22,23에서 뇌 재생을 조절하는 분자 메커니즘을 조사하는 데 사용되었습니다. 이 젊은 성인 제브라피쉬 찔린 상처 부상 모델은 RGC 19,24,25에서 재생 신경 발생을 유도했습니다. 시신경의 이 찔린 상처는 견고하고 재현 가능한 방법이다 13,19,20,21,22,23,24,25. 동일한 손상 모델을 성인 메다카에 적용했을 때, 메다카 시신경에서 RGC의 낮은 신경원성 능력은 손상 후 RGC 증식 및 분화의 비교 분석을 통해 밝혀졌습니다13.
시신경의 칼에 찔린 상처 손상 모델도 mummichog 모델26에서 개발되었지만, tectum 손상의 세부 사항은 종뇌 손상27과 비교할 때 잘 문서화되지 않았습니다. 제브라피쉬와 메다카를 사용한 시신경의 찔린 상처 손상은 차등 재생 능력을 가진 종 간의 차등 세포 반응과 유전자 발현을 조사할 수 있게 해줍니다. 이 프로토콜은 주사 바늘을 사용하여 시신경에 찔린 상처 손상을 수행하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 제브라피쉬와 메다카와 같은 작은 물고기에 적용할 수 있습니다. 형광 면역조직화학 및 냉동 절편을 사용한 조직학적 분석과 세포 증식 및 분화 분석을 위한 시료 전처리 공정이 여기에 설명되어 있습니다.
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Protocol
모든 실험 프로토콜은 국립 산업 기술 종합 연구소(National Institute of Advanced Industrial Science and Technology)의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(Institutional Animal Care and Use Committee)의 승인을 받았습니다. 제브라피쉬와 메다카는 표준 절차28에 따라 유지되었다.
1. 성인 시신경의 찔린 상처 부상
- 마취를 위해 0.4%(w/v) 트리카인 원액을 준비합니다. 100mL 원액의 경우 400mg 트리카인 메탄설포네이트( 재료 표 참조)를 증류수 90mL에 녹이고 1M Tris HCl 완충액(pH 9.0)을 사용하여 pH를 7.0으로 조정합니다. pH가 조정되면 물을 최대 100mL까지 추가한 다음 적절한 분취량을 만들어 -20°C에서 보관합니다.
- 성체 제브라피쉬 또는 메다카를 마취하려면 0.4% 트리카인 원액을 어류 시설수로 희석하여 0.02%(w/v) 트리카인 용액을 준비합니다.
- 0.02 % tricaine 용액으로 물고기를 마취하십시오. 움직이지 않거나 접촉에 반응하지 않으면 마취됩니다 (1-2 분).
- 마취된 생선을 스티로폼 트레이( 재료 표 참조)에 놓고 스티로폼에 수직으로 삽입된 두 개의 30G 바늘 사이에 물고기를 똑바로 고정합니다.
- 물고기 머리가 움직이지 않도록 물고기 몸을 잡고 두개골을 통해 30G 바늘을 시신경 반구 중 하나의 내측 영역에 수직으로 삽입합니다(그림 1A, B). 삽입 깊이는 ~0.75mm로 30G 베벨 길이의 절반과 거의 같습니다. 이 삽입 깊이는 제브라피쉬와 메다카의 몸 크기가 비슷하기 때문에 뇌 손상을 유발합니다.
참고: Medaka는 두개골에 비늘이 있습니다. 30G 바늘을 사용하여 비늘을 긁고 제거하여 찔린 상처를 효율적이고 정확하게 유도합니다(그림 1C). - 부상당한 물고기를 신선한 생선 시설 물이 있는 어항으로 옮기고 마취에서 완전히 회복되면 수조를 물고기 사육 시스템으로 옮깁니다.
알림: 물고기는 회복되어 몇 분 안에 자유롭게 움직이기 시작합니다. - 손상 후 혈통 분석을 위해 5mM 브로모데옥시유리딘(BrdU)을 함유한 신선한 어류 시설수를 준비한 다음(재료 표 참조) 이 5mM BrdU 용액으로 어류를 미리 결정된 시간동안 배양합니다(실험 설계에 의해 결정됨). 그런 다음 2단계에 따라 이 물고기를 해부하고 BrdU 통합 및 세포 계통 정체성을 적절하게 평가합니다.
참고: 이 단계는 세포 계통 분석을 위한 선택적 단계입니다. BrdU 신호를 검출하려면 4.3단계와 같이 항원 검색을 수행하십시오.
2. 뇌 해부
- 0.02% 트리카인 용액, 해부용 스티로폼 트레이, 인산염 완충 식염수(1x PBS)가 포함된 10mL 주사기와 연장 튜브 및 심내 관류용 30G 바늘( 재료 표 참조)을 준비합니다.
- 선택한 시점에서 부상당한 물고기를 마취하십시오.
- 스티로폼 트레이에 종이 타월을 놓고 종이 타월 위에 마취 된 생선을 놓습니다.
- 항문 지느러미의 양쪽에 두 개의 30G 바늘을 수직으로 삽입하여 물고기 몸을 제자리에 고정합니다(그림 2A).
- 항문에서 심장까지 복부 절개를 하고(그림 2B) 이 장기의 양쪽에 30G 바늘 두 개를 더 삽입하여 심장이 보이도록 합니다(그림 2C).
참고: 심장은 제브라피쉬와 메다카 모두에서 피하의 은빛 상피층으로 덮여 있습니다(그림 2C). - 집게의 끝으로 은색 상피층을 부드럽게 제거합니다(그림 2D).
- 30G 바늘을 심실에 삽입하고 경사를 위로 유지하고 집게를 사용하여 심방을 절개합니다(그림 2E). 주사기를 조심스럽게 눌러 1x PBS를 누르고 심방이 혈액을 씻어 냈는지 확인합니다.
알림: 바늘이 심실을 관통하는 것을 방지하려면 바늘을 반 경사 깊이까지 조심스럽게 삽입한 다음 삽입 깊이를 조정하십시오. 관류가 잘되면 아가미가 하얗게 변합니다(그림 2F,G). - 혈액이 배출되고 아가미가 하얗게 변한 후 관류를 중지하십시오.
- 물고기 몸을 제자리에 고정하는 바늘을 제거하고 물고기 복부 쪽을 아래로 고정합니다(그림 2H). 척수를 자르고 시신경과 종뇌에서 두개골을 제거합니다(그림 2I). 그런 다음 시신경을 절단하고 뇌를 조심스럽게 해부합니다.
알림: 해부하는 동안 시신경은 지각에 연결되어 있으므로 주의하십시오. 시신경을 당기면 시신경이 뇌에서 분리될 수 있습니다. 혈액 제거가 완료되지 않으면 뇌가 연한 분홍색으로 보입니다( 그림 2J의 오른쪽 뇌). - 뇌를 1x PBS에 4% 파라포름알데히드 1mL와 함께 1.5mL 튜브로 옮기고 4°C에서 밤새 고정합니다.
3. 냉동 절편의 준비
- 고정된 뇌를 1x PBS에서 각각 5분 동안 세 번 세척합니다.
- 뇌를 냉동 보호하려면 1x PBS에 30%(w/v) 자당 1mL가 포함된 1.5mL 튜브로 옮기고 4°C에서 밤새 배양합니다. OCT 30mL와 30% 자당 15mL를 조합하여 임베딩 화합물(OCT 화합물과 30% 자당의 2:1 혼합물, 재료 표 참조)을 준비합니다. 4 °C에서 보관하십시오.
알림: 혼합 화합물에서 기포를 제거하려면 50mL 튜브를 10,000 x g 에서 실온에서 2분 동안 원심분리하거나 튜브를 밤새 똑바로 세워 두십시오. - 해부된 뇌가 임베딩 화합물과 함께 크라이오몰드에 포매된 직후 크라이오몰드를 냉각시키기 위해 알루미늄 블록을 -80°C에서 하룻밤 동안 인큐베이션한다.
알림: 액체 질소를 사용하여 알루미늄 블록을 냉각할 수도 있습니다. 이 경우 알루미늄 블록은 매립하기 직전에 알루미늄 블록을 덮을 수 있을 만큼 충분한 액체 질소로 채워진 스티로폼 상자에 넣어야 합니다. 액체 질소 승화를 확인한 후, 미리 냉각 된 알루미늄 블록에 cryomold를 놓습니다. 알루미늄 블록에 한 번에 몇 개의 극저온 금형을 놓을 수 있는지 확인하는 것이 좋습니다. 모든 샘플을 빠르게 냉각할 수 있는 충분한 공간을 확보하기 위해 액체 질소 또는 추가 사전 냉각 블록을 사용하는 것이 좋습니다. - 예냉된 알루미늄 블록을 스티로폼 상자에 넣습니다. 알루미늄 블록이 따뜻해지는 것을 방지하기 위해 뚜껑이 있는 스티로폼 상자를 사용하십시오.
- 관상 절편의 경우 뇌를 극저온 몰드에 삽입하고 현미경으로 집게를 사용하여 방향을 조정합니다(그림 3A).
- 스티로폼 상자의 예냉된 알루미늄 블록에 극저온 몰드를 놓고 OCT 화합물이 얼도록 합니다(그림 3B). OCT 화합물이 얼기 시작하면 흰색이됩니다.
- 표본 디스크에 작은 원형의 OCT 화합물을 바르고 극저온 블록을 장착하여 극저온 블록을 표본 디스크에 부착합니다.
- 검체 디스크를 저온 유지 장치에 넣고 OCT 화합물을 완전히 동결합니다.
- 저온 유지 장치의 표본 헤드에 표본 디스크를 놓습니다.
- 크라이오 블록의 방향을 설정하고 OCT를 트리밍하여 추가 영역을 제거합니다.
알림: 종뇌를 절단하는 동안 절단면의 방향을 조정하십시오. 블레이드에는 저온 유지 장치가 장착되어 있습니다. 시편 헤드의 각도를 변경하여 절단면의 방향을 조정할 수 있습니다. - 저온 유지 장치를 사용하여 전체 시신경을 통해 14μm 두께의 직렬 섹션을 절단합니다. 슬라이드를 -25°C에서 보관하십시오.
알림: 장기 보관은 -80 °C여야 합니다.
4. 형광 면역염색
- 건조 유리는 실온(RT)에서 30분 동안 슬라이드 랙에서 슬라이드됩니다. RT에서 30분 동안 1x PBS로 슬라이드를 세척합니다. 항 -PCNA 또는 BrdU 항체로 면역 염색을 수행해야하는 경우 4.2 단계 또는 4.3 단계로 진행하십시오.
- 500mL 비이커에 10mM 구연산나트륨 500mL를 준비하고, 구연산염 완충액을 핫플레이트 마그네틱 교반기 상에서 85°C로 가온한 후, 슬라이드를 슬라이드 염색 랙에 넣고 85°C에서 30분 동안 구연산염 완충액에서 랙을 배양한다. 끓지 않으려면 온도를 약 85 °C로 유지하십시오. 항원 회수 후, 슬라이드를 1x PBS(PBSTr) 중 0.1% 트리톤으로 3회 세척하고, 각 세척은 RT에서 5분 정도 소요한다.
참고: 이 단계는 증식 세포 핵 항원(PCNA) 검색을 위한 선택적 단계입니다. - 증류수에 12N HCl을 희석하여 2N HCl 용액을 준비합니다. 액체 차단제( 재료 표 참조)를 사용하여 소수성 장벽으로 선을 그려 섹션 주위에 2N HCl 용액을 유지합니다.
- 슬라이드를 면역염색 트레이에 놓고 200-300μL의 2N HCl 용액을 도포합니다. 트레이를 37°C에서 30분 동안 배양합니다. 항원 회수 후 0.1% PBSTr로 3회 세척하고 각 세척은 RT에서 5분 정도 소요됩니다.
참고: 이 단계는 BrdU 항원 검색을 위한 선택적 단계입니다.
- 슬라이드를 면역염색 트레이에 놓고 200-300μL의 2N HCl 용액을 도포합니다. 트레이를 37°C에서 30분 동안 배양합니다. 항원 회수 후 0.1% PBSTr로 3회 세척하고 각 세척은 RT에서 5분 정도 소요됩니다.
- 종이 타월을 사용하여 남은 용액을 흡수하고 제거하십시오. 그런 다음 액체 차단제를 사용하여 소수성 장벽을 그려 필요에 따라 섹션 주위에 항체 용액을 유지합니다.
- 슬라이드를 트레이에 놓고 200-300 μL의 블로킹 용액, PBSTr의 3%(v/v) 말 혈청)를 모든 슬라이드에 바르고 RT에서 1시간 동안 슬라이드를 배양합니다.
- RT에서 5분 동안 PBSTr로 섹션을 세척하고 세 번 반복합니다.
- 블로킹 용액(각 슬라이드에 대한 항체 용액 200-300 μL)을 사용하여 1차 항체( 재료 표 참조)를 준비합니다. 종이 타월로 나머지 PBSTr을 제거하고 슬라이드를 면역염색 트레이에 놓습니다. 1차 항체 용액을 모든 슬라이드에 적용하고 4°C에서 밤새 트레이를 배양합니다.
- RT에서 5분 동안 PBSTr로 섹션을 세척하고 세 번 반복합니다.
- 블로킹 완충액(1:500)을 사용하여 형광 2차 항체 용액( 재료 표 참조)을 준비합니다. 종이 타월로 나머지 PBSTr을 제거하고 슬라이드를 면역염색 트레이에 놓습니다. 모든 슬라이드에 2차 항체 용액을 바르고 알루미늄 호일로 트레이를 가리십시오. RT에서 1-2 시간 동안 배양하십시오.
- PBSTr로 섹션을 빛에 노출시키지 않고 RT에서 5분 동안 세 번 세척합니다.
- 핵 염색을 위해 Hoechst 용액(1x PBS에서 500:1 희석, 재료 표 참조)을 준비합니다. 종이 타월로 나머지 PBSTr을 제거하고 슬라이드를 면역염색 트레이에 놓습니다. 모든 슬라이드에 Hoechst 용액을 바르고 트레이를 알루미늄 호일로 덮습니다. RT에서 30 분 동안 배양하십시오.
- 빛을 노출시키지 않고 RT에서 10분 동안 1x PBS로 섹션을 세척합니다.
- 종이 타월을 사용하여 나머지 1x PBS를 흡수 및 제거하고 형광 면역염색을 위해 수용성 장착 매체( 재료 표 참조)를 사용하여 슬라이드에 섹션을 장착합니다. 24 x 45mm 커버슬립을 섹션에 천천히 놓습니다. 슬라이드를 빛에 노출시키지 않고 4°C에서 보관하십시오.
- 형광 현미경 또는 컨포칼 현미경으로 단면을 관찰하고 이미지화합니다.
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Representative Results
우반구에 바늘 삽입을 사용하여 시신경의 찔린 상처 손상(그림 1, 그림 4A 및 그림 5A)은 방사상 신경교 세포(RGC) 증식 및 신생아 뉴런 생성을 포함한 다양한 세포 반응을 유도합니다. 유사하게, 제브라피쉬와 메다카의 노화 개체군은 재생 반응에서 노화 효과를 상쇄하는 데 사용되었습니다. 그런 다음 동결 절편에 형광 면역 염색을 수행하고 제브라 피쉬와 메다카의 지각 손상 후 RGC 증식 및 분화를 분석했습니다 (그림 4-5) 13.
증식 세포 마커에 대한 항체, 증식 세포 항원 (PCNA) 및 RGC 마커, 뇌 지질 결합 단백질 (BLBP)을 사용하였으며, 이들은 제브라피쉬 및 메다카에서 입수할 수 있다13,19. 앞서 설명한 바와 같이, 대부분의 RGC는 반대쪽 손상되지 않은 반구에서 정지(PCNA 음성)였습니다(그림 4B)13. 그럼에도 불구하고 RGC 증식은 medaka tectum에서 손상 후 2일(dpi)에 유도되었습니다(그림 4C,D)13. 손상 후 RGC 증식의 유도는 제브라피쉬와 메다카 재생 반응 모두의 공통된 특징이다13,19.
BrdU 라벨링은 세포 계통을 평가하고 뇌 손상 후 RGC 분화를 분석하는 데 사용되는 간단한 방법입니다(그림 5A)13. 범뉴런 마커인 HuC 및 BrdU에 대한 항체를 사용한 면역염색은 이전에 제브라피쉬와 메다카의 손상된 구조에서 RGC 분화를 비교하는 데 사용되었습니다(그림 5B,C)13. 이러한 항체가 표적 종에서 이용 가능한 경우, 비교 분석이 수행 될 수있다.
손상이 적절하게 유도되면 손상 부위는 시신경의 중심-등쪽 영역에 위치합니다(그림 4C). 핵 염색 및 헤마톡실린 및 에오신 염색은 이어서, 손상 부위 13,19,20,21,22,23,24,25를 확인하기 위해 사용될 수 있다. 손상 후, 핵 염색이있는 뇌실 주위 회색 지대가 관찰 될 수 있습니다 (그림 4C). 손상이 내측 등쪽 부위에 위치하는 경우, RGC 증식은 유의하게 증가하지 않는다25.
그림 1: 바늘을 사용한 성인 시신경의 찔린 상처 . (A) 성인 제브라피쉬의 등쪽 모습. Zebrafish는 스티로폼에 수직으로 삽입된 두 개의 구부러진 바늘 사이에 똑바로 세워져 있습니다. (ᅡ') (A)에서 박스형 영역의 확대 이미지. 30G 바늘은 시신경의 os frontale 과 os parietale 이라고 하는 두 두개골 사이의 경계의 내측 영역에 삽입됩니다. 노란색 원은 부상 부위를 나타내고 흰색 점선은 시신경에 있는 두 개의 두개골을 나타냅니다. (B) 성인 메다카의 등쪽 모습. (비') (B)에 있는 박스형 영역의 확대 이미지. 30G 바늘이 시신경의 경계에 삽입됩니다. 노란색 원은 부상 부위를 나타내고 흰색 점선은 시신경에 있는 두 개의 두개골을 나타냅니다. (C) Medaka는 두개골에 비늘이 있습니다. 두개골 비늘은 칼에 찔려 상처를 입기 전에 제거되어야 합니다. 점선은 시신경의 눈금을 나타냅니다. 스케일 바: A-B에서 2mm, A', B' 및 C에서 1mm. Telencephalon(Tel), optic tectum(OT), os frontale (F) 및 os parietale (P). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 작은 성인 물고기의 심장 내 관류. (A) 심장 내 관류 및 뇌 해부를 위해 준비된 구부러진 바늘을 사용하여 스티로폼에 고정된 제브라피쉬의 복부 모습. (B) 복부 절개는 항문 지느러미의 기원에서 가슴까지 이루어집니다. (C) 심장은 제브라피쉬와 메다카 모두에서 피하선이라고 하는 은빛 상피층 뒤에 있습니다. 은 상피층 옆에 구부러진 바늘을 사용하는 또 다른 고정은 더 쉽게 접근할 수 있도록 합니다. 흰색 실선은 심실(V)을 나타내고 점선은 피하를 나타냅니다. (d) 은 상피층은 1x PBS의 심내 관류 전에 제거된다. (예) Canula는 심장 내 관류를 위해 심실에 삽입됩니다. 심장 내 관류 전(F)과 후(G)의 아가미. 혈액 제거가 완료되지 않으면 아가미가 빨갛게 남아 있습니다. (H-J) PBS 관류 후 뇌 해부하여 조직에서 혈액을 제거한다. (I)와 같이 시신경과 종뇌에서 두개골을 제거합니다. 혈액 제거가 완료되지 않으면 뇌가 연한 분홍색으로 보입니다((J)의 오른쪽 뇌). 스케일 바: A-C 및 H에서 2mm, D-G 및 I-J에서 1mm. 후각 전구 (OB), 종뇌 (Tel), 시신경 구조 (OT), 구근 동맥 (Ba), 심실 (V) 및 심방 (At). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 동결된 절편에 대한 뇌 임베딩. (A) 뇌는 임베딩 화합물이 있는 극저온 몰드에 내장되어 있습니다. 앞쪽이 내려갔습니다. (B) 극저온 금형은 사전 냉각 된 알루미늄 블록에서 냉각됩니다. Telencephalon (Tel), optic tectum (OT). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 성인 메다카에서 지각 손상 후 RGC 증식에 대한 형광 면역염색의 대표적인 결과 . (A) 시신경 지각 및 관상 절편의 우반구에 대한 찔린 상처 손상의 개략도. (비씨) 손상 후 2일째 대측 비손상(B) 및 손상(C) 쪽에서 증식성 RGC(PCNA + BLBP + 세포)의 대표적인 결과. C' 의 흰색 화살촉은 찔린 상처로 인해 교란된 뇌실주위 회색 영역을 나타냅니다. (D) (C)에서 박스형 영역의 확대 이미지. (D)의 흰색 화살촉은 PCNA + BLBP + 세포를 나타냅니다. 스케일 바: B-D에서 50 μm. 참고 문헌13의 허가를 받아 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: tectum 손상 후 신생아 뉴런 생성에 대한 형광 면역염색의 대표적인 결과 . (A) 브로모데옥시유리딘(BrdU) 치료 및 시신경 및 관상 절편의 찔린 상처 손상의 개략도. (비씨) 손상된 제브라피쉬(B)와 메다카(C)에서 손상 후 7일째에 신생아 뉴런(BrdU+HuC+ 세포)의 대표적인 결과. 스케일 바: B-C에서 50μm. 참고 문헌13의 허가를 받아 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
여기에서는 뇌 손상 후 RGC 증식 및 분화의 평가를 용이하게 하기 위해 바늘을 사용하여 시신경에 찔린 상처 손상을 유도하는 데 사용할 수 있는 일련의 방법이 설명되어 있습니다. 바늘 매개 찔린 상처는 표준 도구 세트를 사용하여 많은 실험 샘플에 적용할 수 있는 간단하고 효율적으로 구현된 방법입니다. 제브라피쉬 뇌의 여러 영역에 대한 찔린 상처 손상 모델이 개발되었습니다 3,19,29. 시신경은 뇌에서 가장 큰 부분 중 하나이며 조작하기 쉽습니다. 또한, 시신경의 대부분의 RGC는 종뇌와 비교할 때 생리학적 조건에서 정지 상태이므로 손상에 따라 RGC 증식 및 분화를 더 쉽게 관찰할 수 있습니다 3,19.
찔린 상처 부상의 중요한 단계와 한계 중 하나는 수동 바늘 삽입입니다. 재현 가능한 결과를 생성하고 비교 분석을 용이하게 하기 위해서는 일관된 손상이 필요합니다. 정확한 삽입 위치와 깊이는 매우 중요하며 실험에서 재현 가능한 부상을 만드는 데 도움이 됩니다. 이 백서는 매번 유사한 부상을 입기 위한 명확한 지침을 제공합니다. 또한, 손상 후 RGC의 증식은 손상된 지각의 신경 발생에 필수적입니다. 부상당한 제브라 피쉬와 메다카에서 RGC 증식은 1dpi에서 증가하고 7dpi13,19에서 반대쪽 손상되지 않은 반구와 동일한 기저 수준으로 돌아갑니다.
찔린 상처 손상은 비특이적 세포 절제를 유도하는 기계적 손상 방법 중 하나입니다. 대조적으로, 니트로환원효소/메트로니다졸 시스템과 같은 세포 특이적 절제에 대한 형질전환 접근법도 개발되었습니다30,31,32. 이러한 절제 모델은 실험 목적에 따라 선택해야 합니다. 비특이적 절제술은 찔린 상처 및 허혈성 뇌졸중과 같은 뇌 손상에 적합합니다. 대조적으로, 세포 특이적 절제는 파킨슨병과 같은 신경퇴행성 질환과 관련된 특정 세포의 퇴행을 평가하는 데 더 적합할 수 있습니다.
최근, 제브라피쉬를 이용한 허혈성 손상 모델이 개발되고 있다33, 그러나 이러한 모델들은 혈류를 모니터링하기 위해 형질전환 라인과 형광 현미경을 필요로 한다. 따라서 이러한 모델은 유전적 접근이 좋지 않은 종에 적용하기 어렵고 처리량이 찔린 상처 손상 모델보다 낮습니다.
위에서 언급했듯이, 시신경의 찔린 상처는 간단하며 일반적인 도구를 사용하여 아프리카 송사리와 mummichog와 같은 다른 작은 물고기 모델에 쉽게 적용할 수 있다26. 또한, 종 간의 비교 분석은 시퀀싱 기술을 사용하여 잘 조사되었습니다. 따라서 이 간단한 방법은 세포 반응과 유전자 발현의 비교 분석을 사용하여 제브라피쉬에서 NSC의 재생 능력을 연구할 때 필수적입니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 작업은 JSPS KAKENHI 보조금 번호 18K14824 및 21K15195와 일본 AIST의 내부 보조금으로 지원되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL syringe | TERUMO | SS-10ESZ | |
| 1M Tris-HCl (pH 9.0) | NIPPON GENE | 314-90381 | |
| 30 G needle | Dentronics | HS-2739A | |
| 4% Paraformaldehyde Phosphate Buffer Solution | Wako | 163-20145 | |
| Aluminum block | 115 x 80 x 37 mm (W x D x H) is enough size to freeze 6 cryomolds | ||
| Anti-BLBP | Millipore | ABN14 | 1:500 |
| Anti-BrdU | Abcam | ab1893 | 1:500 |
| Anti-HuC | Invitrogen | A21271 | 1:100 |
| Anti-PCNA | Santa Cruz Biotechnology | sc-56 | 1:200 |
| Brmodeoxyuridine | Wako | 023-15563 | |
| Confocal microscope C1 plus | Nikon | ||
| Cryomold | Sakura Finetek Japan | 4565 | 10 x 10 x 5 mm (W x D x H) |
| Cryostat | Leica | CM1960 | |
| Danio rerio WT strains RW | |||
| Extension tube | TERUMO | SF-ET3520 | |
| Fluoromount (TM) Aqueous Mounting Medium, for use with fluorescent dye-stained tissues | SIGMA-ALDRICH | F4680-25ML | |
| Forceps | DUMONT | 11252-20 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488 | Invitrogen | A32723 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 | Invitrogen | A11035 | |
| Hoechst 33342 solution | Dojindo | 23491-52-3 | |
| Hydrochloric Acid | Wako | 080-01066 | |
| Incubation Chamber for 10 slides Dark Orange | COSMO BIO CO., LTD. | 10DO | |
| MAS coat sliding glass | Matsunami glass | MAS-01 | |
| Micro cover glass | Matsunami glass | C024451 | |
| Microscopy | Nikon | SMZ745T | |
| Normal horse serum blocking solution | VECTOR LABRATORIES | S-2000-20 | |
| O.C.T Compound | Sakura Finetek Japan | 83-1824 | |
| Oryzias latipes WT strains Cab | |||
| PAP Pen Super-Liquid Blocker | DAIDO SANGYO | PAP-S | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) Tablets, pH 7.4 | TaKaRa | T9181 | |
| Styrofoam tray | 100 x 100 x 10 mm (W x D x H) styrofoam sheet is available as tray | ||
| Sucrose | Wako | 196-00015 | 30 % (w/v) Sucrose in PBS |
| Tricaine (MS-222) | nacarai tesque | 14805-24 | |
| Trisodium Citrate Dihydrate | Wako | 191-01785 | |
| Triton X-100 | Wako | 04605-250 |
References
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