Summary
Eine Methode zur Mikrodissektion des Eileiters der Maus, die die Sammlung der einzelnen Segmente unter Beibehaltung der RNA-Integrität ermöglicht, wird vorgestellt. Darüber hinaus wird ein nicht-enzymatisches oviduktales Zelldissoziationsverfahren beschrieben. Die Methoden eignen sich für die anschließende Gen- und Proteinanalyse der funktionell unterschiedlichen Eileitersegmente und dissoziierten Eileiterzellen.
Abstract
Mausmodellsysteme sind aufgrund ihrer genetischen Manipulierbarkeit und der geringen Kosten experimenteller Behandlungen unübertroffen für die Analyse von Krankheitsprozessen. Aufgrund ihrer geringen Körpergröße haben sich jedoch einige Strukturen, wie der Eileiter mit einem Durchmesser von 200-400 μm, als relativ schwierig erwiesen, außer immunhistochemisch zu untersuchen. In jüngster Zeit haben immunhistochemische Studien komplexere Unterschiede in den Eileitersegmenten aufgedeckt als bisher angenommen; So wird der Eileiter in vier funktionelle Segmente mit unterschiedlichen Verhältnissen von sieben verschiedenen Epithelzelltypen unterteilt. Die unterschiedlichen embryologischen Ursprünge und Verhältnisse der epithelialen Zelltypen machen die vier funktionellen Regionen wahrscheinlich unterschiedlich anfällig für Krankheiten. Zum Beispiel entstehen Vorläuferläsionen zu serösen intraepithelialen Karzinomen aus dem Infundibulum in Mausmodellen und aus der entsprechenden Fimbrialregion im menschlichen Eileiter. Das hier beschriebene Protokoll beschreibt eine Methode zur Mikrodissektion, um den Eileiter so zu unterteilen, dass eine ausreichende Menge und Reinheit der RNA entsteht, die für die nachgeschaltete Analyse wie die reverse transkriptionsquantitative PCR (RT-qPCR) und die RNA-Sequenzierung (RNAseq) erforderlich ist. Ebenfalls beschrieben ist eine meist nicht-enzymatische Gewebedissoziationsmethode, die für die Durchflusszytometrie oder die Einzelzell-RNAseq-Analyse von vollständig differenzierten Eileiterzellen geeignet ist. Die beschriebenen Methoden werden die weitere Forschung unter Verwendung des moinen Eileiters auf dem Gebiet der Fortpflanzung, Fruchtbarkeit, Krebs und Immunologie erleichtern.
Introduction
Der eiförmige Eileiter ähnelt in Funktion und Morphologie dem menschlichen Eileiter1. Beide bestehen aus einem pseudostratifizierten Flimmerepithel, das aus zwei historisch beschriebenen epithelialen Residentzellen besteht: Flimmerzellen und sekretorischen Zellen1,2. Das Eileiter hat drei klassisch anerkannte Segmente: das Infundibulum, die Ampulle und den Isthmus. In einer aktuellen Studie haben Harwalkar et al. 3 untersuchte die Eileitermorphologie und Genexpression, was zur Erweiterung der Kategorisierung von residenten Epithelzellen auf sieben verschiedene Populationen führte. Darüber hinaus etablierten sie die Ampullar-Isthmus-Verbindung als eigenständiges Segment des Eileiters3. Das hierin beschriebene Verfahren, das sich auf das Infundibulum, die Ampulle und den Isthmus konzentriert, könnte leicht erweitert werden, um auch die ampullär-isthmische Verbindung einzubeziehen2,3. Die infundibuläre Region enthält das Ostium oder die Öffnung des Eileiters und umfasst die Fimbriumregion sowie den proximalen Stiel. Wenn Sie sich in Richtung Gebärmutter bewegen, ist als nächstes die Ampulle und dann der Isthmus. Bewimmerte Zellen sind am prominentesten im distalen Ende der Region, proximal zum Eierstock oder infundibulum, während sekretorische Zellen am prominentesten im proximalen Ende oder Isthmussegment sind1. Im Gegensatz zum menschlichen Eileiter ist der eiförmige Eileiter eine gewundene Struktur, die von der Mesosalpinx, einer Erweiterung des breiten Ligamentiotoneums, getragen wird1,4. Darüber hinaus ist das Eileiter der Maus in einem Bursalsack eingeschlossen, der die Wahrscheinlichkeit eines Eizelltransfers in das Eileiter4 erhöht. Die Ampulle wird als Ort der Befruchtung identifiziert, von dem aus sich entwickelnde Embryonen in den Isthmus gelangen, bevor sie in die Gebärmutter gelangen5. Tubensegmente haben einen Durchmesser von 200-400 μm und die längeren Ampull- und Isthmusregionen sind etwa 0,5-1,0 cm lang4. Die Eileiterdehnungen während des Östruszyklus und die Ampulle und das Infundibulum sind dehnungsfähiger als der Isthmus1.
Überproliferation von Zellen, insbesondere sekretorischen Zellen, charakterisieren Vorläuferläsionen zu serösen Tumoren in der Beckenhöhle6. Diese serösen intraepithelialen Läsionen entstehen im Eileiterepithel ausschließlich in der Fimbrienregion; Es ist nicht bekannt, warum die Läsionsbildung auf diese Region beschränkt ist, in der normalerweise der vorherrschende Zelltyp bewimpert und nicht sekretorisch ist2,7,8. Die Regionalität in Bezug auf die normale physiologische Funktion sowie das erhöhte Interesse am eiduktalen Ursprung von Eierstockkrebs9,10,11,12,13 unterstreichen die Bedeutung einer separaten Bewertung der Eileitersegmente.
Die hier beschriebene Methode beschreibt die Erfassung separater Eileitersegmente für nachfolgende nachgeschaltete Analysen der segmentspezifischen Genexpression und Funktion dissoziierter Zellen. Traditionell werden viele Gewebe für die Extraktion ganzer RNA entweder nach der Phenol: Chloroform-Methode oder einer vollständigen Extraktionsmethode auf der Säule verarbeitet. Wir fanden jedoch heraus, dass die RNA-Qualität erhalten blieb, während mit der beschriebenen Kombinationsmethode eine ausreichende Ausbeute erzielt wurde. Mit dieser Methode können sehr kleine funktionelle Segmente des Eileiters für nachgeschaltete Analysen verarbeitet werden, anstatt den Eileiter als Ganzes zu untersuchen, was die für die verschiedenen Segmente repräsentativen Ergebnisse maskieren kann14.
Dissoziierte murine Eileiterzellen wurden selten durch Durchflusszytometrie untersucht, höchstwahrscheinlich aufgrund der begrenzenden Zellausbeute aus diesem Gewebe. Ein Ansatz zur Überwindung dieses Problems bestand darin, Zellen zu dissoziieren, sie in Kultur zu züchten und dann die Redifferenzierung in vitro zu stimulieren, um geeignete Zellzahlen für die nachgeschaltete Zellanalyse zu erhalten15,16,17,18. Eine Einschränkung dieses Ansatzes ist die Zeit ex vivo und die veränderte Mikroumgebung in Kultur, die beide wahrscheinlich die Genexpression verändern. Es wird auch angenommen, dass die morphologische Redifferenzierung die gleiche transkriptionelle und proteomische Signatur aufweist wie das intakte Tier. Die derzeitige Dissoziationsmethode wurde entwickelt, um die höchste Anzahl von Epithelzellen in einer heterogenen eiduktalen Zellpopulation zu erreichen und gleichzeitig die Differenzierung einzelner Zellen beizubehalten. Darüber hinaus begrenzt der meist nicht-enzymatische Ansatz wahrscheinlich den Verlust von Zelloberflächenproteinen.
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Protocol
Alle Tierhandhabungen und -verfahren wurden vom institutionellen Tierpflege- und Verwendungsausschuss der University of California, Riverside, genehmigt und entsprachen den Richtlinien der American Association for Laboratory Animal Care, des Landwirtschaftsministeriums der Vereinigten Staaten und der National Institutes of Health. Die beschriebene Methode verwendete C57BL/6 erwachsene, weibliche Mäuse. Alle Tiere wurden vor der Gewebeentnahme durch Enthauptung eingeschläfert.
HINWEIS: Eine Übersicht über das Protokoll, das einen blauen Farbstoff verwendet, um das effiziente Dissezieren und Abwickeln des Eileiters zu unterstützen, ist in der ersten Abbildung dargestellt (Abbildung 1).
Abbildung 1: Überblick über die Mikrodissektionsmethode. (A) Das linke Feld zeigt die intakte Struktur, aus der der größte Teil des ovariellen Fettpolsters und die Reste des Bindegewebes, die den Eileiter umgeben, entfernt wurden. Danach hilft die Zugabe von Toluidinblau, die Spulen des Eileiters (mittlere Platte) zu unterscheiden. Das rechte Feld zeigt Strukturen nach der Entfernung des Eierstocks. (B) Ein abgewickelter Eileiter mit internen Drehungen zur Bestimmung, wo jedes Segment beginnt und endet. (C) Karikatur der verwendeten Segmentierung (nicht maßstabsgetreu gezeichnet). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
1. Vorbereitung der Dissektionsfläche
- Kleben Sie ein Stück Zahnwachs mit Klebstoff auf eine Petrischale und lassen Sie es trocknen (Abbildung 2A). Desinfizieren Sie das Gericht mit 70% Ethanol. Die Oberfläche ist bereit für die Dissektion.
2. Makrodissektion des Eierstocks, des Eileiters und der Gebärmutter
- Immobilisieren Sie die Petrischale mit dem Dentalwachs auf einer kalten Plattform Ihrer Wahl (z. B. einem Eisbeutel, der vor der Verwendung bei -20 °C aufbewahrt wurde) unter einem Dissektionsmikroskop, wenn Sie zur Dissektion bereit sind (Abbildung 2A).
- Desinfizieren Sie die ventrale Oberfläche des Tieres mit 70% Ethanol. Öffnen Sie die Bauch- und Beckenhöhle mit einer sterilen Dissektionsschere und bewegen Sie den Magen-Darm-Trakt zur Seite, um die dorsale bihornale Gebärmutter zu lokalisieren. Folgen Sie jedem Uterushorn rostrally, um jeden Eileiter und Eierstock zu lokalisieren, der in das Uterusfettpolster eingehüllt ist, das sich direkt unter der Niere befindet (Abbildung 2B, C).
- Schneiden Sie beide lateralen Eileiter mit den Eierstöcken und einem Teil des distalen Uterushorns aus, der noch mit einer Dissektionsschere befestigt ist. Schneiden Sie jedes laterale Uterushorn mit etwa 1-2 cm des Horns ab, das noch am gewundenen Eileiter und Eierstock befestigt ist (Abbildung 2D). Tauchen Sie das Gewebe sofort in 2 ml kaltes Dissektionsmedium (siehe Materialtabelle).
Abbildung 2: Makrodissektion des Eierstocks und der Dissektionsaufbau. Der Eileiter befindet sich dorsal in der Beckenhöhle an der Basis der Niere innerhalb des Eierstockfettpolsters (B). Lokalisieren Sie die Uterusbifurkation in der Beckenhöhle (C) und folgen Sie dem lateralen Uterushorn, um das Uterus-Eileiter-Ovarial-Kontinuum (B) zu lokalisieren. Entfernen Sie diese Strukturen, indem Sie ein Uterushorn durchschneiden und grob sezieren. Auf die Sezierplattform (A) legen und den Uterusanteil mit einer Nadel (A und D) auf Zahnwachs befestigen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
HINWEIS: Lassen Sie genügend Uterushorn intakt und am Eileiter befestigt, um eine Befestigung an der Sezierplattform zu ermöglichen (Abbildung 2D).
- Befestigen Sie das Gebärmuttergewebe mit einer sterilen 25 G Nadel auf dem Zahnwachs, um das Gewebe für die Dissektion zu sichern (Abbildung 2A, D und Abbildung 3A). Reinigen und sezieren Sie unter dem Seziermikroskop das Eierstockfettpolster und das Bindegewebe, um eine klare Visualisierung des Eileiters zu ermöglichen (Abbildung 3B).
Abbildung 3: Schritt für Schritt Eileiter-Mikrodissektion. Nach der Entfernung von Restfett und Bindegewebe (A, B) toluidinblau in das Gewebe (C) geben und dann wegwaschen, um die Visualisierung und anschließende Entfernung des Eierstocks und das Abwickeln der Röhre (D-H) zu erleichtern. Das Infundibulum befindet sich neben dem proximalen Isthmus und der Uterus-Tubal-Verbindung (UTJ). Ziehen Sie das distale Ende leicht, während Sie an der Mesosalpinx schneiden, um die endogenen Windungen des Eileiters (H) abzuwickeln und zu enthüllen, um sich für eine geeignete Segmentierung zu orientieren. Abbildung A-C Maßstabsbalken = 500 μm, D-H Maßstabsbalken = 400 μm (I) Karikatur der verschiedenen Segmente (nicht maßstabsgetreu gezeichnet). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
- Mit einer 1-ml-Spritze das an der Gebärmutter befestigte Eileiter in 1-2 Tropfen steriler 1% iger toluidinblauer Farbstofflösung für 30 s-1 min dosieren und inkubieren. Mit kalter phosphatgepufferter Kochsalzlösung (DPBS) von Dulbecco abspülen und die gesamte Flüssigkeit entfernen (Abbildung 3C).
- Ziehen Sie den Eierstock leicht aus dem gewundenen Eileiter und schneiden Sie ihn an der Schleimbeutelmembran und dem breiten Band ab, um den Eierstock aus dem Eileiter zu entfernen, ohne das Eileitergewebe zu beeinträchtigen (Abbildung 3D, E).
HINWEIS: Der Eierstock ist nicht am Eileiter befestigt, sondern mit dem Eileiter in der Bursalmembran eingeschlossen (Abbildung 2D) und über das breite Band mit der lateralen Seite des Uterus verbunden.
3. Mikrodissektion und Segmentierung des Eileiters
- Lokalisieren Sie das distale, fimbriale Ende des Eileiters, das lateral zum Uterus-Tubal-Übergang (UTJ) gefunden wird. Die Eileiterspulen spulen sich wieder auf sich selbst; daher kann das fimbriale Ende lateral zum proximalen Ende liegen und ist ein geeigneter Ausgangspunkt für die Orientierung beim Abwickeln des Eileiters (Abbildung 3F,I).
- Während Sie das Röhrchen vorsichtig ziehen, schneiden Sie es an der Mesosalpinx (Abbildung 3I) mit einer federförmigen Mikroschere weg, um den Eileiter abzuwickeln (Abbildung 3G).
- Nach dem Abwickeln schneiden Sie die Röhre ab, um die infundibulären, ampullären und isthmischen Regionen zu erzeugen (Abbildung 3H).
- Nach der Exzision des Infundibulums (Fimbrialende und proximaler Stiel) schneiden Sie die ampulläre Region heraus, indem Sie nach der zweiten prominenten Drehung der Röhre schneiden (schnitt zwischen den Kurven zwei und drei, ungefähr 1 cm lang). Schneiden Sie schließlich den verbleibenden Teil auf den UTJ ab, der die isthmische Region ist (Abbildung 3H).
HINWEIS: Der Eileiter wird sich nicht vollständig zu einer geraden Struktur abwickeln. Das Rohr behält seine Windungen bei (Abbildung 3H)3. Basierend auf den nachfolgenden Windungen, die der ampullären Region folgen, kann man das verbleibende Rohr weiter in die ampullär-isthmische Verbindung und den Isthmus3 segmentieren. Nach der Ampullenexzision zwischen den Kurven fünf und sechs schneiden, um die ampullär-isthmische Verbindung zu erhalten; die verbleibende Röhre (Kurve sechs zum Beginn des UTJ) ist der Isthmus3.
- Nach der Exzision des Infundibulums (Fimbrialende und proximaler Stiel) schneiden Sie die ampulläre Region heraus, indem Sie nach der zweiten prominenten Drehung der Röhre schneiden (schnitt zwischen den Kurven zwei und drei, ungefähr 1 cm lang). Schneiden Sie schließlich den verbleibenden Teil auf den UTJ ab, der die isthmische Region ist (Abbildung 3H).
- Sofortiges Einfrieren von sezierten Gewebesegmenten in flüssigem Stickstoff zur RNA-Isolierung oder Fixierung und Verarbeitung jedes Segments für eine orientierte Einbettung und immunhistologische Analyse.
- 200 μL kaltes RNA-Extraktionsreagenz und 1:1 Homogenisierungsperlenmischung (siehe Materialtabelle) in das Gewebe geben, wenn Sie mit der RNA-Extraktion fortfahren (siehe Schritt 5.1).
4. Eileiterdissoziation
- Fortsetzung von Schritt 3.1.1 oben) Für eine optimale Dissoziation des Epithels öffnen Sie den Eileiter nach Möglichkeit in den Bereichen (d. h. Infundibulum und Ampulle), um das luminale Epithel freizulegen (Abbildung 4A).
Abbildung 4: Eileiterzelldissoziation, Teil 1. Cartoon, der zeigt, wie man das distale Epithel für eine optimale Zelldissoziation freilegt (A) und ein Bild, das den einfachsten Weg zeigt, das 1 mm2-Netz (B) zu verwenden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
- Ausgehend von der Fimbrialregion schlitzen Sie das Rohr mit einer Pinzette als Hebel in Längsrichtung mit einer Federschere auf.
- Zerkleinern Sie die aufgeschlitzten Teile und den verbleibenden Eileiter in Segmente (~ 1-2 mm groß) und fügen Sie 5 ml warmen, nicht-enzymatischen Dissoziationspuffer hinzu (siehe Tabelle der Materialien) und inkubieren Sie bei 37 ° C.
- Resuspendieren Sie die Gewebestücke und dissoziierten Zellen mit einem Bulbpipettor alle 3 min für 9-10 min. Verdünnen Sie den Dissoziationspuffer 1:1 mit kaltem Dissektionsmedium.
- Sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation (350 x g, 3 min, 4 °C). Resuspendieren Sie die Zellen in 2 mL RBC-Lysepuffer für 2 min bei Raumtemperatur und verdünnen Sie sie dann 1: 1 mit kaltem Dissektionsmedium.
- Sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation (350 x g, 3 min, 4 °C) und resuspenieren Sie in 5 ml Kaltpronaselösung.
- Inkubieren Sie in Pronase-Verdauungsmedium und resuspen Sie die Zellklumpen mit einem BulbPipettor alle 3-5 min, bis eine einzelne Zellsuspension erreicht ist (~ 25-30 min).
HINWEIS: Dieser Schritt wird am besten in einer Gewebekulturplatte oder einem Gewebekolben durchgeführt, um eine ständige Beobachtung zu ermöglichen und eine unnötige Überbelichtung der Pronase zu vermeiden.
- Inkubieren Sie in Pronase-Verdauungsmedium und resuspen Sie die Zellklumpen mit einem BulbPipettor alle 3-5 min, bis eine einzelne Zellsuspension erreicht ist (~ 25-30 min).
- Führen Sie die Zellen durch ein steriles Makronetz (1 mm x 1 mm Netz, das mit einem Gummiband an einem konischen Röhrchen befestigt ist (Abbildung 4B)), um alle verbleibenden undissoziierten Gewebestücke zu entfernen. Sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation (350 x g, 3 min, 4 °C) und resuspenieren Sie sie in einem kalten Medium, das für die nachgeschaltete Analyse geeignet ist (z. B. FACS-Puffer, wenn Sie mit der Färbung für die Durchflusszytometrie fortfahren).
5. RNA-Extraktion von Eileitersegmenten
- Homogenisieren Sie snapgefrorene Proben in 200 μL RNA-Extraktionsreagenz in einem Bead Bullet Blender Gewebehomogenisator auf Stufe 12 für zwei Intervalle (je 3 min) bei 4 °C unter Verwendung der Edelstahl-Perlenmischung.
HINWEIS: Um die RNA-Integrität zu erhalten, sollten Proben sofort aus dem snapgefrorenen Zustand in das RNA-Extraktionsreagenz bewegt und nicht gewogen werden. - Kurz zentrifugieren Sie homogenat bei 100-200 x g in einer Tischzentrifuge für ca. 5 s bei Raumtemperatur, um die Flüssigkeit von den Kügelchen zu trennen. Den Überstand in ein frisches Röhrchen geben.
- Weitere 200 μL RNA-Extraktionsreagenz in die Kügelchen geben, um weitere Proben zu gewinnen, gefolgt von einer Zentrifugation (100-200 x g, 5 s, Raumtemperatur). Kombinieren Sie die Überstände.
HINWEIS: Verwenden Sie eine kleine Pipettenspitze (die meisten p200-Spitzen sind geeignet), um eine Perlenverschleppung beim Entfernen des Überstandes zu verhindern. - Befolgen Sie die Richtlinien des Herstellers, um RNA phasenweise zu trennen und auszufällen. Repräsentative Proben wurden über Nacht bei -20 °C mit 100% Isopropanol (ca. 2:1 Volumen, Isopropanol: gewonnene wässrige Phase) ausgefällt.
- Den kompletten RNA-Niederschlag zusammen mit der Lösung in eine RNA-bindende Spinsäule überführen und für 30 s bei 9.500 x g zentrifugieren. Reinigen Sie die RNA an der Säule gemäß den Richtlinien des Herstellers und eluieren Sie dann die RNA in 20 μL nukleasefreiem Wasser. Beurteilen Sie die Qualität/Quantität eines Mikrovolumen-Spektralphotometers und/oder Bioanalytikers.
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Representative Results
Das beschriebene Dissoziationsprotokoll ergibt 100.000-120.000 Zellen pro Maus mit Pooling beider Eileiter. Die Methode ist schonend genug, um mehrgliedrige Zellränder intakt zu lassen, was eine Unterscheidung zwischen multi-ciliarierten Zellen und sekretorischen Zellen ermöglicht und überprüft, ob die Verdauungsmethode sanft genug ist, um eine Dedifferenzierung zu verhindern. Repräsentative Immunfluoreszenzbilder in Abbildung 5 zeigen kleinzellige Klumpen nach Schritt 4.2.1, fixiert für 3 min in 4% Paraformaldehyd (PFA)/ DPBS, gewaschen mit 1% Rinderserumalbumin (BSA)/ Tris-gepuffertem Kochsalzlösungs-Tween (BTBST) und in Suspension gefärbt. Kurz gesagt, die Zellen wurden für 15 min bei Raumtemperatur in 0,5% TritonX-100/BTBST permeabilisiert, in BTBST gewaschen, für Hintergrundfluoreszenz für 2 h bei Raumtemperatur in 20 mM Glycin/ DPBS abgeschreckt, in BTBST gewaschen und dann für 1 h bei Raumtemperatur in 5% BSA/ 0,1% TritonX-100/ TBST blockiert. Die Zellen wurden dann im primären Antikörper bei 4 °C über Nacht in BTBST (Maus-Anti-Maus-Okkludin (1:2000); Kaninchen-Anti-Maus-acetyliertes Tubulin (1:1000)) inkubiert, gefolgt von mehreren Wäschen in BTBST. Sekundäre Antikörper wurden für 1 h bei Raumtemperatur in BTBST (Ziegen-Anti-Maus-IgG Alexa Fluor 555 (1:1000); Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG Alexa Fluor 488 (1:1000)) zugegeben, mehrmals in BTBST gewaschen, einmal in DPBS, und dann in Kernfärbung für 20 min bei Raumtemperatur (1:2000, Hoescht 33342) gefolgt von einer Wäsche in DPBS. Die Zellen wurden in 80 μL Antifade-Montagemedium resuspendiert und vor der Bildgebung über Nacht im Dunkeln gelassen (Abbildung 5A). Abbildung 5B zeigt Zellen am Ende des Dissoziationsprotokolls. Während des gesamten Protokolls wurden Machbarkeitsbewertungen vorgenommen, und repräsentative Bilder sind in Abbildung 5B-D dargestellt. Propidiumiodid wurde bei 1:100 Verdünnung zugegeben, und Zellen wurden sofort auf einem inversen Fluoreszenzmikroskop beobachtet (Abbildung 5C, rote Färbung). Zilien blieben in kleinen Zellclustern (Abbildung 5A) und Einzelzellsuspensionen (Abbildung 5E) intakt, wobei bei vielen Zellen beobachtet wurde, dass Zilien immer noch schlagen (Suppl. Video 1).
Abbildung 5: Eileiterzelldissoziation, Teil 2. Fluoreszenz- und Phasenkontrastbilder eines Zellclusters, der positiv für Okkludin (rot), Kerne (blau) und acetyliertes Tubulin (grün) ist. Der beschichtete apikale Rand (grün in AI und AV) bleibt während des gesamten Protokolls intakt und widersteht einer weiteren Verdauung einzelner Zellen (E). AI: merge, AII: roter Kanal, AIII: blauer Kanal, AIV: Phasenkontrast, AV: grüner Kanal. Nach einer kurzen Pronase-Inkubation ist die Mehrheit der Zellen einzeln. Die Färbung von Propidiumiodid (PI) zeigt eine Lebensfähigkeit von etwa 93%. (B) Helles Feld, (C) roter Kanal PI positiv, (D) merge. (E) der einset bei merge zeigt einen intakten Flimmerrand auf einer einzelnen dissoziierten Zelle. Solche Zellen hatten aktiv Zilien geschlagen (siehe Suppl. Video 1). Die Bilder wurden auf einem inversen zusammengesetzten Fluoreszenzmikroskop aufgenommen. Abbildung AI-V-Maßstabsleiste = 20 μm, B-D-Maßstabsleiste = 50 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Das beschriebene RNA-Isolationsprotokoll liefert eine ausreichende Ausbeute und Reinheit, die für die segmentale RT-qPCR und RNAseq erforderlich ist. Die Ergebnisse zeigen, dass diese Methode 800-1200 ng RNA pro Segment liefert (Abbildung 6A), mit Ausnahme von infundibulären Proben, bei denen eine Poolbildung von zwei Tieren für eine angemessene Ausbeute für nachgeschaltete Assays erforderlich sein kann. Die vorgestellten Ergebnisse für Infundibulum sind aus zwei Tieren gepoolt, insgesamt vier infundibuläre Regionen (Abbildung 6). Dieses Protokoll ist erfolgreich bei der Erzielung reiner RNA, die zunächst mit einem Mikrovolumenspektrophotometer und weiter mit einem Bioanalytiker analysiert wird (Abbildung 6B, C). Proben haben ein Absorptionsverhältnis von 260/280 nm zwischen 1,8 und 2,0 (Abbildung 6B), das typisch für reine RNA-Nukleotidspezies ist19. Für jede Probe wurden Absorptionsverhältnisse (260/230 nm) mit einem Einschlusskriterium zwischen 1 und 2,2 entnommen, was für eine begrenzte Kontamination durch Isolationsreagenzien repräsentativ ist (Daten nicht gezeigt)19. Die Bioanalytik der Proben zeigte eine hohe Integrität der RNA mit einer bewerteten RNA-Integritätszahl (RIN) über sieben (Abbildung 6C), die für die nachgeschaltete Expression und Sequenzierungsanalyse geeignet ist20.
Abbildung 6: Qualitätsbewertung der segmentalen RNA. Die gesamte RNA wurde mittels Mikrovolumenspektrophotometer und Bioanalytiker auf Ausbeute (A) und Qualität (B,C) untersucht. RIN: RNA-Integritätszahl, wie vom Bioanalytiker bewertet. Balken sind der Mittelwert ± Standardabweichung (SD), N = 12 Proben pro Segment aus zwei separaten RNA-Extraktionen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Ergänzendes Video 1: Live-Cell-Imaging von schlagenden Zilien auf dissoziierten Zellen. Schlagen von Zilien nach der Pronase-Verdauung. Die Videos wurden auf einem inversen Verbindungsmikroskop aufgenommen. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.
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Discussion
Die drei Segmente des Eileiters sind histologisch, morphologisch und funktionell unterscheidbar1,2,3. Das Epithel variiert stark von einem Ende des Eileiters zum anderen. Bewimperte Zellen dominieren am fimbrialen/infundibulären Ende, während sekretorische Zellen in der isthmischen Region dominieren1. Während dieser Gesamtgradient seit einiger Zeit erkannt wurde, haben neuere Arbeiten mehr Unterschiede zwischen den eiduktalen Segmenten aufgedeckt. Während also bewimperte Zellen in Richtung des proximalen Endes der Röhre seltener werden, gibt es einen starken Abfall ihrer Anzahl (von etwa 60% auf 10% Ciliation), die von der Ampulle zur ampullär-isthmischen Verbindung übergeht3. Darüber hinaus werden Epithelzellpopulationen in den proximalen und distalen Segmenten von entwicklungsspezifischen Linien abgeleitet1,2,3. Distale Epithelzellen des Infundibulums und der Ampulle tragen nicht zu proximalen Epithelzellpopulationen im Isthmus bei, wie die Linienverfolgung von Epithelmarkern zeigt. Am embryonalen Tag 12,5 (E12,5) haben eiduktale Epithelzellen eine unterschiedliche Linie, die unabhängig vom proximalen Epithelzellmarker PAX22 ist. Diese Entdeckungen, zusätzlich zu der vielfältigen Zellpopulation zwischen den verschiedenen Segmenten, unterstreichen die Notwendigkeit, die Segmente unabhängig voneinander zu untersuchen. Die beschriebene Methode beschreibt ein schrittweises Abwickel- und Segmentidentifikationsprotokoll gemäß den drei historisch beschriebenen Segmenten (Infundibulum, Ampulle und Isthmus). Aufgrund der jüngsten Etablierung der ampullär-isthmischen Verbindung als definitives Eileitersegment wurde der Identifizierung und Sammlung der drei klassisch beschriebenen Bereiche Priorität eingeräumt. Das Verfahren kann jedoch erweitert werden, um eine separate Sammlung der ampullär-isthmischen Verbindung einzubeziehen, wie oben beschrieben3.
Die Verwendung des blauen Farbstoffs und die Lage des Infundibulums ist ein kritischer Schritt, um den Eileiter schnell und effizient abzuwickeln. Der blaue Farbstoff hebt das Ostium und die Spulen des Rohres hervor und ermöglicht so ein schnelleres und effizienteres Entwickeln und Sammeln. Die anfängliche Lage des Ostiums orientiert sich während des gesamten Abwickelns an den distalen (infundibulären) und proximalen (isthmischen) Bereichen des Eileiters. Darüber hinaus ermöglicht es dem Chirurgen, den proximalen Uterushornanteil während des Abwickelns auf der Dissektionsplattform zu halten, beide Hände für die empfindlichen Dissektionsschritte zu verwenden. Die anfängliche Entfernung des gewundenen Eileiters und versuche, diese Struktur abzuwickeln, ohne die Röhre unbeweglich zu machen oder ohne die Verwendung des Farbstoffs, kann leicht zu Verwirrung über die distalen und proximalen Enden führen oder einen Bruch der Röhre verursachen. Rohrbruch ist einfach, daher ist beim Abwickeln Vorsicht geboten, da ein Bruch eine reproduzierbare Segmentierung unerreichbar macht. Die Verwendung einer hochwertigen, federförmigen Mikroschere wird dringend empfohlen, um die besten Ergebnisse zu erzielen.
Die Bewertung der Genexpressionssignatur in den verschiedenen Segmenten des Eileiters, zum Beispiel während des Östruszyklus und als Reaktion auf verabreichte Hormone und Zytokine, wird höchstwahrscheinlich zu einem viel besseren Verständnis dafür führen, wie sich der Eileiter als Reaktion auf diese Reize verändert. Diese Daten können auch Aufschluss darüber geben, welche Faktoren zur Epitheltransformation beitragen. Das hierin enthaltene RNA-Extraktionsprotokoll wurde entwickelt, um die höchstmögliche Quantität und Qualität für dieses Gewebe von begrenzter Größe und elastischer Tubenstruktur zu erhalten. Die beschriebene Homogenisierung, RNA-Fällung und konjunktionelle Verwendung des Phenols: Chloroform und On-Säulen-Aufreinigungsmethoden erwiesen sich als am effizientesten, um eine angemessene Qualität und Quantität der RNA für die nachgeschaltete Analyse zu erreichen. Die eileiterförmigen Segmente wurden nicht gewogen und ganze Segmente wurden sofort zur Gewebehomogenisierung verarbeitet, um eine Erwärmung des Gewebes zu verhindern, die zum RNA-Abbau führt. Da die kleinen Tubensegmente mehrere Homogenisierungsschritte erfordern, ist es außerdem wichtig sicherzustellen, dass die Homogenisierung bei 4 °C durchgeführt wird, um die Probenintegrität zu erhalten. Da diese Methode ausreicht, um eine angemessene Ausbeute für die nachgelagerte Analyse zu erzielen, wäre eine zukünftige Anwendung dieser Technik die Durchführung eines segmentalen RNAseq, das bisher nicht berichtet wurde, was wesentlich zu unserem Verständnis der Eileiterphysiologie beitragen würde.
Während der Entwicklung des Zelldissoziationsprotokolls fanden wir heraus, dass robuste und/oder lange enzymatische Verdauungen einen nachweisbaren Verlust von Zilien verursachten. Wir haben uns daher auf die Entwicklung einer Methode konzentriert und diese erreicht, die die Zellmorphologie bewahrt. Verbesserungen der Einzelzellausbeute, wie hierin beschrieben, ermöglichen robustere und sofortige multiplexierte Analysen der verschiedenen epithelialen und stromalen Zelltypen durch Durchflusszytometrie. Die Verwendung eines nicht-enzymatischen Dissoziationsprotokolls, gefolgt von einer kurzen Inkubation in Pronase, wird wahrscheinlich auch die Konservierung von Zelloberflächenantigenen gegenüber Dissoziationsmethoden unter Verwendung langer oder robuster Verdauungsmethoden verbessern2,18. Die Einzelzellsequenzierungsanalyse benötigt im Vergleich zu gemultiplexten Durchflusszytometrie-Panels weitaus weniger Zellen2,21. So kann eine Einzelzellsequenzierung der drei beschriebenen Segmente des Eileiters mit dem beschriebenen Protokoll möglich sein.
Da der Eileiter nicht über seine gesamte Länge filetiert werden kann, könnte eine mögliche Einschränkung des derzeitigen Verfahrens darin bestehen, dass Zellen, die das Epithel des engeren Isthmus bilden, die Exposition gegenüber den Dissoziationsreagenzien verringert hätten und daher in der endgültigen Suspension möglicherweise nicht im gleichen Verhältnis wie in vivo vorhanden wären.
Aufgrund der Wicklung des Eileiters kann die Orientierung für immunhistochemische Analysen aller eileiterförmigen Segmente schwierig sein3. Die beschriebene Segmentdissektion mit anschließender orientierter Einbettung der Eileitersegmente ermöglicht jedoch eine umfassendere Längs- und Querschnittsbildanalyse, ohne dass das gesamte intakte Spiralrohr seriell durchquert werden muss. Darüber hinaus hilft der blaue Farbstoff, der zum Abwickeln verwendet wird, bei der korrekten Orientierung beim Einbetten der kleinen Rohrsegmente.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preiszugeben.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde zum Teil durch einen DoD Breakthrough Award an AMW (BCRP W81XWH-14-1-0425) unterstützt. KCR wurde teilweise durch intramurale Stipendien unterstützt: das Pease Cancer Pre-Doctoral Fellowship und das Mary Galvin Burden Pre-Doctoral Fellowship in Biomedical Sciences und die University of California, Riverside, intramurale Auszeichnungen: den Graduate Council Fellowship Committee Dissertation Research Grant und den Graduate Division Dissertation Year Program Award. Die Autoren danken Gillian M. Wright und Alyssa M. Kumari für die Unterstützung bei der frühzeitigen Fehlerbehebung dieser Methode.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 mm Stainless steel bead mix | Next Advance | SSB05 | Mix 1:1 with 1.4 mm SSB14B, sterilized |
| 1.4 mm Stainless steel bead mix | Next Advance | SSB14B | Mix 1:1 with 0.5 mm SSB05, sterilized |
| 1X Dulbecco's Phosphate Buffered Saline A, pH 7.4 (DPBS) | Gibco | 21600-010 | Cold, sterile |
| 25G needle | BD | 305122 | |
| 60 mm sterile petri dishes | Corning | 430166 | |
| 70 μm cell meshes | Fisherbrand | 22-636-548 | |
| Agilent Eukaryote Total RNA 6000 Pico Chip kit | Agilent 2100 Bioanalyzer | 5067-1513 | |
| Bead Bullet Blender Tissue Homogenizer | Next Advance | BBY24M | |
| Bioanlyzer | Agilent 2100 Bioanalyzer | ||
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A7906 | |
| Cold plate/pack/surface of choice | N/A | N/A | Kept at -20 °C for dissection |
| Dental wax | Polysciences Inc. | 403 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)/ Ham’s F12 | Corning | 10-090-CV | Prepare dissection medium: DMEM/ Ham’s F12, 10% FBS, 25 mM Hepes, 1% Pen-Strep |
| Fetal Bovine Serum | Corning | 35-015CV | |
| Fine point forceps of choice | N/A | N/A | |
| Glycine | Sigma Aldrich | G712b | Immunocytochemical validation images |
| Goat anti-mouse IgG Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A-21422 | Immunocytochemical validation images |
| Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11001 | Immunocytochemical validation images |
| Hepes | Sigma Aldrich | H-3784 | |
| Hoescht 33342 | Cell Signaling Technologies | 4082S | Immunocytochemical validation images |
| Inverted compound microscope | Keyence BZ-X700 | ||
| Mouse anti-mouse Occludin | Invitrogen | 33-1500 | Immunocytochemical validation images |
| Non-enzymatic dissociation buffer | N/A | 5 mM EDTA, 1 g/L glucose, 0.4% BSA, 1X DPBS | |
| Nylon macro-mesh 1 mm x 1 mm | Thomas Scientific | 1210U04 | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P-6148 | Immunocytochemical validation images |
| Pen-Strep | MP Biomedicals | 10220-718 | |
| Prolong Gold Antifade Reagent | Cell Signaling Technologies | 9071S | Immunocytochemical validation images: antifade mounting medium |
| Pronase | Sigma Aldrich | 10165921001 | Prepare pronase digestion medium: 0.15% pronase in DMEM/Ham's F12, sterile |
| Propidium Iodide | Roche | 11 348 639 001 | Viability validation images |
| Rabbit anti-mouse Acetylated-Tubulin | Abcam | ab179484 | Immunocytochemical validation images |
| RBC lysis buffer | BD Biosciences | 555899 | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74134 | Utilized for on-column purification in text |
| Spring form microdissection scissors | Roboz Surgical | RS-5610 | |
| Sterile 3 mL bulb pipettors | Globe Scientific | 137135 | |
| Toluidine blue | Alfa Aesar | J66015 | Prepare toluidine blue solution: 1% in 1X DPBS, sterile |
| Tris-Buffered Saline-Tween (TBST) | N/A | N/A | Immunocytochemical validation images; 0.1 N NaCl, 10 mM Tris-Cl pH 7.5, 1% Tween 20 |
| Triton-X-100 | Mallinckrodt Inc. | 3555 | Immunocytochemical validation images |
| Trizol RNA Extraction Reagent | Invitrogen | 15596026 | Referred to as RNA extraction reagent. Nucelase-free water, chloroform and isoproponal are required in supplement of performing Trizol extraction per manufacturer's guidelines |
References
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