Microdisseção e Dissociação do Ovídeo Murine: Identificação do Segmento Individual e Isolamento de Célula Única

Summary

Um método de microdisseção do oviduto do camundongo que permite a coleta dos segmentos individuais, mantendo a integridade do RNA, é apresentado. Além disso, é descrito o procedimento de dissociação de células oviducais não enzimáticas. Os métodos são apropriados para análise genética e proteica subsequente dos segmentos oviductais funcionalmente diferentes e células oviductais dissociadas.

Abstract

Os sistemas de modelos de camundongos são incomparáveis para a análise dos processos da doença devido à sua manipulabilidade genética e ao baixo custo de tratamentos experimentais. No entanto, devido ao seu pequeno tamanho corporal, algumas estruturas, como o oviduto com diâmetro de 200-400 μm, provaram ser relativamente difíceis de estudar, exceto pela imunohistoquímica. Recentemente, estudos imunohistoquímicos descobriram diferenças mais complexas nos segmentos de oviduto do que foram reconhecidos anteriormente; assim, o oviduto é dividido em quatro segmentos funcionais com diferentes proporções de sete tipos distintos de células epiteliais. As diferentes origens embriológicas e as proporções dos tipos de células epiteliais provavelmente tornam as quatro regiões funcionais diferencialmente suscetíveis à doença. Por exemplo, lesões precursoras de carcinomas intraepiteliol são decorrentes do infundibulum em modelos de camundongos e da região fimbrial correspondente no tubo falópio humano. O protocolo descrito aqui detalha um método de microdisseção para subdividir o oviduto de forma a produzir uma quantidade e pureza suficientes de RNA necessárias para análise a jusante, como a transcrição reversa-quantitativa PCR (RT-qPCR) e o sequenciamento de RNA (RNAseq). Também é descrito um método de dissociação de tecido não enzimático apropriado para citometria de fluxo ou análise rnaseq de células totalmente diferenciadas. Os métodos descritos facilitarão novas pesquisas utilizando o oviduto murino no campo da reprodução, fertilidade, câncer e imunologia.

Introduction

O oviduto murine é semelhante em função e morfologia ao tubo de falópio ^humano1. Ambos consistem em um epitélio ciliado pseudoesstratificado, consistindo de duas células residentes epiteliais historicamente descritas: células ciliadas e células ^secretas1,2. O oviduto possui três segmentos reconhecidos clássicamente: o infundibulum, a ampulla e o istmo. Em um estudo recente, Harwalkar et al. ³ investigou morfologia oviduca e expressão genética levando à expansão da categorização das células epiteliais residentes para sete populações distintas. Além disso, estabeleceram a junção ampullary-istmo como um segmento distinto do oviduct3. O método descrito aqui, que se concentra no infundibulum, ampulla e istmo, poderia facilmente ser estendido para incluir a junção ampuloso-istmímica, bem como ^2,3. A região infundibular contém o ostium, ou abertura do oviduto, e inclui a região fimbrial, bem como o talo proximal. Movendo-se em direção ao útero, em seguida é a ampola, e, em seguida, o istmo. As células ciliadas são mais proeminentes na extremidade distal da região, proximal ao ovário, ou infundibulum, enquanto as células secretary são mais proeminentes no final proximal ou segmento de ^istmo1. Ao contrário do tubo de falópio humano, o oviduto de murina é uma estrutura enrolada apoiada pelo mesosalpinx, uma extensão do peritônio ligamento ^largo1,4. Além disso, o oviduto do rato é envolto em um saco de bursal que aumenta a probabilidade de transferência de oócito para o oviduct4. A ampola é identificada como a localização da fertilização, a partir da qual embriões em desenvolvimento passam para o istmo antes de entrar no ^útero5. Os segmentos tubais têm 200-400 μm de diâmetro e as regiões mais longas e antumes têm aproximadamente 0,5-1,0 cm de ^comprimento4. Os distendes oviduto durante o ciclo estrous e a ampola e o infundibulum são mais distensíveis do que o ^istmo1.

Sobre a proliferação de células, especialmente células secretas, caracterizam lesões precursoras de tumores soros encontrados na cavidade pélvica6. Essas lesões intraeteliais peréluas precursoras surgem no epitélio oviduto apenas na região fimbrial; não se sabe por que a formação da lesão se restringe a essa região onde normalmente o tipo de célula predominante é ciliado, não ^{secretor2,7,8}. A regionalidade em termos de função fisiológica normal, bem como o aumento do interesse pela origem ovidutal do câncer de ovário9,10,11,12,13, ressalta a importância da avaliação separada dos segmentos de oviduto.

O método descrito aqui detalha a coleta de segmentos oviductais separados para análises subsequentes a jusante da expressão genética específica do segmento e função de células dissociadas. Tradicionalmente, muitos tecidos são processados para extração de RNA inteiro seguindo o fenol: método de clorofórmio ou um método de extração completa na coluna; no entanto, descobrimos que a qualidade do RNA foi mantida enquanto produzia rendimento suficiente com o método de combinação descrito. Utilizando esse método, segmentos funcionais muito pequenos do oviduto podem ser processados para análises a jusante em vez de investigar o oviduto como um todo, o que pode mascarar resultados representativos dos diferentes ^segmentos14.

As células oviductais murinas dissociadas raramente têm sido investigadas pela citometria de fluxo, provavelmente devido ao rendimento celular limitante deste tecido. Uma abordagem para superar esse problema tem sido dissociar as células, cultivá-las na cultura e, em seguida, estimular a re-diferenciação in vitro para obter números celulares apropriados para análise celular a jusante15,16,17,18. Uma limitação a essa abordagem é o tempo ex vivo e microambiente alterado na cultura, ambos os quais provavelmente mudam a expressão genética. Há também a suposição de que a reeferirrecialidade morfológica tem a mesma assinatura transcricional e proteômica que estava presente no animal intacto. O método de dissociação atual foi projetado para alcançar o maior número de células epiteliais em uma população de células ovidutoras heterogêneas, mantendo a diferenciação de células únicas. Além disso, a abordagem não enzimática provavelmente limita a perda de proteínas da superfície celular.

Protocol

Todos os procedimentos e manejo de animais foram aprovados pela Universidade da Califórnia, pelo comitê institucional de cuidados e uso de animais de Riverside e estavam de acordo com as diretrizes da Associação Americana de Cuidados de Animais de Laboratório, do Departamento de Agricultura dos Estados Unidos e dos Institutos Nacionais de Saúde. O método descrito utilizou camundongos adultos C57BL/6. Todos os animais foram eutanizados por decapitação antes da colheita de tecidos. NOTA…

Representative Results

O protocolo de dissociação descrito produz 100.000-120.000 células por rato com agrupamento de ambos os ovidutos. O método é suave o suficiente para deixar intactas as bordas celulares multi-ciliadas, permitindo uma distinção entre células multi-ciliadas e células secretas, e verificando se o método de digestão é suave o suficiente para evitar a desfagnáslica. Imagens representativas de imunofluorescência na Figura 5 mostram pequenos aglomerados de células após a etapa 4.2.1,…

Discussion

Os três segmentos do oviduto são histologicamente, morfologicamente, e funcionalmente ^{distintos1,2,3}. O epitélio varia muito de uma extremidade do oviduto para a outra. As células ciliadas dominam na extremidade fimbrial/infundibular, enquanto as células secretas dominam na região ítmica1. Embora este gradiente geral tenha sido reconhecido há algum tempo, o trabalho recente tem descoberto mais dis…

Materials

0.5 mm Stainless steel bead mix	Next Advance	SSB05	Mix 1:1 with 1.4 mm SSB14B, sterilized
1.4 mm Stainless steel bead mix	Next Advance	SSB14B	Mix 1:1 with 0.5 mm SSB05, sterilized
1X Dulbecco's Phosphate Buffered Saline A, pH 7.4 (DPBS)	Gibco	21600-010	Cold, sterile
25G needle	BD	305122
60 mm sterile petri dishes	Corning	430166
70 μm cell meshes	Fisherbrand	22-636-548
Agilent Eukaryote Total RNA 6000 Pico Chip kit	Agilent 2100 Bioanalyzer	5067-1513
Bead Bullet Blender Tissue Homogenizer	Next Advance	BBY24M
Bioanlyzer	Agilent 2100 Bioanalyzer
Bovine serum albumin	Sigma Aldrich	A7906
Cold plate/pack/surface of choice	N/A	N/A	Kept at -20C for dissection
Dental wax	Polysciences Inc.	403
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)/ Ham’s F12	Corning	10-090-CV	Prepare dissection medium: DMEM/ Ham’s F12, 10% FBS, 25 mM Hepes, 1% Pen-Strep
Fetal Bovine Serum	Corning	35-015CV
Fine point forceps of choice	N/A	N/A
Glycine	Sigma Aldrich	G712b	Immunocytochemical validation images
Goat anti-mouse IgG Alexa Fluor 555	Invitrogen	A-21422	Immunocytochemical validation images
Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488	Invitrogen	A-11001	Immunocytochemical validation images
Hepes	Sigma Aldrich	H-3784
Hoescht 33342	Cell Signaling Technologies	4082S	Immunocytochemical validation images
Inverted compound microscope	Keyence BZ-X700
Mouse anti-mouse Occludin	Invitrogen	33-1500	Immunocytochemical validation images
Non-enzymatic dissociation buffer	N/A		5 mM EDTA, 1 g/L glucose, 0.4% BSA, 1X DPBS
Nylon macro-mesh 1 mm x 1 mm	Thomas Scientific	1210U04
Paraformaldehyde	Sigma Aldrich	P-6148	Immunocytochemical validation images
Pen-Strep	MP Biomedicals	10220-718
Prolong Gold Antifade Reagent	Cell Signaling Technologies	9071S	Immunocytochemical validation images: antifade mounting medium
Pronase	Sigma Aldrich	10165921001	Prepare pronase digestion medium: 0.15% Pronase in DMEM/Ham's F12, sterile
Propidium Iodide	Roche	11 348 639 001	Viability validation images
Rabbit anti-mouse Acetylated-Tubulin	Abcam	ab179484	Immunocytochemical validation images
RBC lysis buffer	BD Biosciences	555899
RNeasy Mini Kit	Qiagen	74134	Utilized for on-column purification in text.
Spring form microdissection scissors	Roboz Surgical	RS-5610
Sterile 3 mL bulb pipettors	Globe Scientific	137135
Toluidine blue	Alfa Aesar	J66015	Prepare toluidine blue solution: 1% in 1X DPBS, sterile
Tris-Buffered Saline-Tween (TBST)	N/A	N/A	Immunocytochemical validation images; 0.1 N NaCl, 10 mM Tris-Cl pH 7.5, 1% Tween 20
Triton-X-100	Mallinckrodt Inc.	3555	Immunocytochemical validation images
Trizol RNA Extraction Reagent	Invitrogen	15596026	Referred to as RNA extraction reagent. Nucelase-free water, chloroform and isoproponal are required in supplement of performing Trizol extraction per manufacturer's guidelines