Summary
En viktig färdighet i biomolekylär modellering är att visa och kommentera aktiva platser i proteiner. Denna teknik demonstreras med hjälp av fyra populära gratis program för makromolekylär visualisering: iCn3D, Jmol, PyMOL och UCSF ChimeraX.
Abstract
Biomolekylära visualiseringsfärdigheter är av största vikt för att förstå nyckelbegrepp inom de biologiska vetenskaperna, såsom struktur-funktionsrelationer och molekylära interaktioner. Olika program gör det möjligt för en elev att manipulera 3D-strukturer, och biomolekylär modellering främjar aktivt lärande, bygger beräkningsfärdigheter och överbryggar klyftan mellan tvådimensionella läroboksbilder och livets tre dimensioner. En kritisk färdighet inom detta område är att modellera en proteinaktiv plats, som visar delar av makromolekylen som kan interagera med en liten molekyl, eller ligand, på ett sätt som visar bindande interaktioner. I det här protokollet beskriver vi denna process med hjälp av fyra fritt tillgängliga makromolekylära modelleringsprogram: iCn3D, Jmol/JSmol, PyMOL och UCSF ChimeraX. Denna guide är avsedd för studenter som vill lära sig grunderna i ett specifikt program, liksom instruktörer som införlivar biomolekylär modellering i sin läroplan. Protokollet gör det möjligt för användaren att modellera en aktiv webbplats med hjälp av ett specifikt visualiseringsprogram, eller att prova flera av de tillgängliga gratisprogrammen. Den modell som valts för detta protokoll är humant glukosinas, en isoform av enzymet hexokinas, som katalyserar det första steget i glykolys. Enzymet är bundet till ett av dess substrat, liksom en icke-reaktiv substratanalog, vilket gör det möjligt för användaren att analysera interaktioner i det katalytiska komplexet.
Introduction
Att förstå representationer av den molekylära världen är avgörande för att bli expert på biomolekylära vetenskaper1, eftersom tolkningen av sådana bilder är nyckeln till att förstå biologisk funktion2. En elevs introduktion till makromolekyler kommer vanligtvis i form av tvådimensionella läroboksbilder av cellmembran, organeller, makromolekyler etc. men den biologiska verkligheten är att dessa är tredimensionella strukturer, och en förståelse för deras egenskaper kräver sätt att visualisera och extrahera mening från 3D-modeller.
Följaktligen har utvecklingen av biomolekylär visuell läskunnighet i molekylära life science-kurser i övre divisionen uppmärksammats, med ett antal artiklar som rapporterar om vikten och svårigheterna med att undervisa och bedöma visualiseringsfärdigheter1,3,4,5,6,7,8,9 . Svaret på dessa artiklar har varit en ökning av antalet klassrumsinterventioner, vanligtvis inom en termin i en enda institution, där molekylära visualiseringsprogram och modeller används för att rikta in sig på svåra begrepp2,10,11,12,13,14,15 . Dessutom har forskare försökt karakterisera hur studenter använder biomolekylära visualiseringsprogram och / eller modeller för att närma sig ett specifikt ämne16,17,18,19. Vår egen grupp, BioMolViz, har beskrivit ett ramverk som delar upp övergripande teman inom visuell läskunnighet i inlärningsmål och mål för att vägleda sådana interventioner20,21, och vi leder workshops som utbildar fakulteten att använda ramverket i bakåtdesignen av bedömningar för att mäta visuell läskunnighetsförmåga22.
I centrum för allt detta arbete är en kritisk färdighet: förmågan att manipulera strukturer av makromolekyler med hjälp av program för biomolekylär visualisering. Dessa verktyg utvecklades oberoende med hjälp av en mängd olika plattformar; Därför kan de vara ganska unika i sin drift och användning. Detta kräver programspecifika instruktioner, och identifiering av ett program som en användare är bekväm med är viktigt för att underlätta fortsatt implementering.
Utöver själva grunderna för att manipulera strukturer i 3D (rotera, välja och ändra modellen) är ett viktigt mål att modellera den aktiva platsen för ett protein. Denna process gör det möjligt för en elev att utveckla sin förståelse i tre övergripande teman som beskrivs av BioMolViz Framework: molekylära interaktioner, ligands / modifieringar och strukturfunktionsrelationer20,21.
Fyra populära val av program för biomolekylär visualisering inkluderar: Jmol / JSmol23, iCn3D24, PyMOL25och UCSF Chimera26,27. Vi uppmuntrar de som är nya i Chimera att använda UCSF ChimeraX, nästa generation av Chimera molekylär visualiseringsprogram, som är den för närvarande stödda versionen av programmet.
I det här protokollet visar vi hur man använder vart och ett av dessa fyra program för att modellera den aktiva platsen för humant glukosos med ett bundet substratanalogkomplex (PDB ID: 3FGU) och för att visa mätningar för att illustrera specifika bindningsinteraktioner28. Modellen representerar ett katalytiskt komplex av enzymet. För att fånga den aktiva platsen i pre-katalys tillstånd, var en icke-hydrolyserbara analog av ATP bunden till glukokinas aktiva platsen. Denna fosphoaminofonsyra-adenylatestrar (ANP) innehåller en fosfor-kvävebindning istället för den vanliga fosfor-syrelänkningen vid denna position. Den aktiva platsen innehåller också glukos (betecknad BCG i modellen) och magnesium (betecknad MG). Dessutom finns det en kaliumjon (K) i strukturen, som härrör från kaliumklorid som används i kristalliseringslösningslösningslösningsmedlet. Denna jon är inte kritisk för biologisk funktion och ligger utanför den aktiva platsen.
Figur 1: ATP/ANP-strukturer. Adenosintrifosfat (ATP) struktur jämfört med fosphoaminophosphonic syra-adenylate ester (ANP). Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Protokollet visar valet av de bundna liganderna i substratets analoga komplex och identifieringen av aktiva rester från platsen inom 5 Å från det bundna komplexet, som fångar aminosyror och vattenmolekyler som kan göra relevanta molekylära interaktioner, inklusive hydrofoba och van der Waals interaktioner.
Displayen manipuleras ursprungligen för att visa majoriteten av proteinet i en tecknad representation, med den aktiva platsen aminosyrarester i pinne representation för att visa relevanta atomer av proteinet och markera de molekylära interaktionerna. Efter steg 3 i protokollet för varje program har dessa representationer tillämpats och synen på proteinet är liknande mellan program (figur 2). I slutet av protokollet är proteintecknad film dold för att förenkla vyn och fokusera på den aktiva webbplatsen.
Bild 2: Strukturjämförelse mellan program. Jämförelse av strukturen för 3FGU i varje program efter justeringssteget Representation (steg 2 eller 3 i varje protokoll). Klicka här för att se en större version av den här figuren.
CPK-färgning appliceras på den aktiva platsen aminosyror och bundna ligands29,30. Detta färgschema skiljer atomer av olika kemiska element i molekylära modeller som visas i linje, pinne, boll och pinne och rymdfyllningsrepresentationer. Väte är vitt, kväve är blått, syre är rött, svavel är gult och fosfor är orange i CPK-färgschemat. Traditionellt används svart för kol, även om kolfärgningen i modern användning kan variera.
Väteatomer är inte synliga i kristallstrukturer, även om vart och ett av dessa program kan förutsäga deras plats. Att lägga till väteatomer i en stor makromolekylär struktur kan dölja vyn, så de visas inte i detta protokoll. Följaktligen kommer vätebindningar att visas genom att mäta från mitten av två heteroatomer (t.ex. syre till syre, syre till kväve) i dessa strukturer.
Programöversikter
Nedladdningsbara grafiska användargränssnitt (GUIs): PyMOL (version 2.4.1), ChimeraX (version 1.2.5) och Jmol (version 1.8.0_301) är GUI-baserade molekylära modelleringsverktyg. Dessa tre gränssnitt har kommandorader för att mata in maskinskriven kod. Många av samma funktioner är tillgängliga via menyer och knappar i det grafiska gränssnittet. En vanlig funktion på kommandoraden för dessa program är att användaren kan läsa in och köra tidigare kommandon igen med hjälp av upp- och nedpiltangenterna på tangentbordet.
Webbaserade GUIs: iCn3D (I-see-in-3D) är en WebGL-baserad tittare för interaktiv visning av tredimensionella makromolekylära strukturer och kemikalier på webben, utan att behöva installera ett separat program. Den använder inte en kommandorad, även om den fullständiga webbversionen har en redigerbar kommandologg. JSmol är en JavaScript- eller HTML5-version av Jmol för användning på en webbplats eller i ett webbläsarfönster, och är mycket lik Jmol. JSmol kan användas för att skapa online tutorials, inklusive animationer.
Proteopedia31,32, FirstGlance i Jmol33och JSmol webbgränssnitt (JUDE) vid Milwaukee School of Engineering Center for BioMolecular Modeling är exempel på sådana Jmol-baserade online designmiljöer34. Proteopedia wiki är ett undervisningsverktyg som gör det möjligt för användaren att modellera en makromolekylstruktur och skapa sidor med dessa modeller på webbplatsen35. Proteopedia-scenförfattarverktyget, byggt med JSmol, integrerar ett grafiskt gränssnitt med ytterligare funktioner som inte är tillgängliga i Jmol GUI.
Jmol och iCn3D är baserade på Programmeringsspråket Java; JSmol använder antingen Java eller HTML5, och PyMOL och ChimeraX är baserade på Programmeringsspråket Python. Vart och ett av dessa program laddar proteindatabankfiler, som kan laddas ner från RCSB Protein Data Bank under ett 4-siffrigt alfanumeriskt PDB-ID36,37. De vanligaste filtyperna är PDFB-filer (Protein Data Bank) som innehåller .pdb-tillägget och Crystallographic Information File (CIF eller mmCIF) som innehåller CIF-tillägget. CIF har ersatt PDB som standardfiltyp för Protein Data Bank, men båda filformaten fungerar i dessa program. Det kan finnas små skillnader i hur sekvensen/strukturen visas när du använder CIF i motsats till PDB-filer; Filerna fungerar dock på samma sätt och skillnaderna kommer inte att behandlas i detalj här. Molecular Modeling Database (MMDB), en produkt av National Center for Biotechnology Information (NCBI), är en delmängd av PDB-strukturer som kategorisk information har associerats med (t.ex. biologiska egenskaper, bevarade proteindomäner)38. iCn3D, en produkt från NCBI, kan ladda PDB-filer som innehåller MMDB-data.
För att visa en modell kan användaren ladda ner önskad fil från den dedikerade Protein Data Bank-sidan för strukturen (t.ex. https://www.rcsb.org/structure/3FGU) och sedan använda den nedrullningsbara arkivmenyn i programmet för att öppna strukturen. Alla program kan också ladda en strukturfil direkt via gränssnittet, och den metoden beskrivs i protokollen.
ChimeraX-, Jmol- och PyMOL-GUIs innehåller varsin eller flera fönster på konsolen som kan ändras genom att dra hörnet. iCn3D och JSmol finns helt i en webbläsare. När du använder iCn3D kan användaren behöva bläddra i popup-fönstren för att visa alla menyalternativ, beroende på skärmstorlek och upplösning.
Protokollen som beskrivs här ger en enkel metod för att visa enzymets aktiva plats med hjälp av varje program. Det bör noteras att det finns flera sätt att köra stegen i varje program. I ChimeraX kan till exempel samma uppgift utföras med hjälp av nedrullningsbar menyer, verktygsfältet högst upp eller kommandoraden. Användare som är intresserade av att lära sig ett specifikt program i detalj uppmuntras att utforska onlinehandledning, manualer och Wikis som är tillgängliga för dessa program39,40,41,42,43,44,45,46.
Befintliga handböcker och självstudier för dessa program presenterar objekten i det här protokollet som diskreta uppgifter. Om du vill visa en aktiv plats måste användaren syntetisera de åtgärder som krävs från de olika handböckerna och självstudierna. Detta manuskript utökar befintliga självstudier som är tillgängliga genom att presentera ett linjärt protokoll för modellering av en märkt aktiv plats med molekylära interaktioner, vilket ger användaren en logik för aktiv webbplatsmodellering som kan tillämpas på andra modeller och program.
Bild 3: ChimeraX GUI. ChimeraX GUI-gränssnitt med de nedrullningsbar menyerna, verktygsfältet, strukturvisaren och kommandoraden märkta. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Bild 4: iCn3D GUI. iCn3D GUI-gränssnitt med de nedrullningsbara menyerna, verktygsfältet, strukturvisaren, kommandologgen, välj popup-fönster och popup-menyer för sekvens- och anteckningar märkta. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Bild 5: Jmol GUI. Jmol GUI-gränssnitt med de nedrullningsbar menyerna, verktygsfältet, strukturvisaren, popup-menyn och konsol-/kommandoraden märkta. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 6: PyMOL GUI. PyMOL GUI-gränssnitt med de nedrullningsbar menyerna, strukturvisaren, namn/objektpanelen, menyn för muskontroller och kommandoraden märkt. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Protocol
OBS: Protokollet för varje program beskrivs i tio övergripande steg, (1) Ladda strukturen i programmet, (2) Identifiera liganderna på den aktiva platsen, (3) Justera representationen, (4) Välja rester inom 5 Å för att definiera en aktiv plats, (5) Visa enzymets interaktioner med den aktiva platsen ligands, (6) Visa sidokedjorna som pinnar och visa/justera den aktiva platsens vattenmolekyler, (5) Visa enzymets interaktioner med den aktiva platsen ligands, (6) Visa sidokedjorna som pinnar och visa/justera den aktiva platsens vattenmolekyler, (5) Visa enzymets interaktioner med den aktiva platsen ligands, (6) Visa sidokedjorna som pinnar och visa/justera den aktiva platsens vattenmolekyler, (5) Visa enzymets interaktioner med den aktiva platsen ligands, (6) Visa sidokedjorna som pinnar och visa/justera den aktiva platsens vattenmolekyler, (5) Visa enzymets interaktioner med den aktiva platsen ligands, (6) Visa sidokedjorna som pinnar och visa/justera den aktiva platsens vattenmolekyler, (5) Visa enzymets interaktioner med den aktiva platsen ligands, (6) Visa sidokedjorna som pinnar och visa/justera den aktiva platsens vattenmolekyler, (5) Visa enzymets interaktioner med den aktiva platsen ligands, (6) Visa sidokedjorna som pinnar och visa/justera den aktiva platsens vattenmolekyler (7) Förenkla strukturen, (8) Märkning av ligands och vätebundna sidokedjor, (9) Spara renderingen när som helst för att återgå till arbetet med den eller dela med andra, (10) Spara en bild för inbäddning eller utskrift. Steg 1, 4 och 7-10 är identiska för varje protokoll. Men på grund av den unika driften av varje program körs vissa protokoll mer effektivt när steg 2/3 och 5/6 byts ut.
1. UCSF ChimeraX protokoll
OBS: Styrplatta och muskontroller. Om du vill rotera klickar du och drar eller använder drag med två fingrar (mus: vänsterklick och dra). Zooma, nyp och sprid (Mac) eller styra + tvåfingerrörelser (PC) (mus: rullningshjul). Om du vill översätta (dvs. flytta hela strukturen) trycker du på alternativet + klickar och drar (Mac) eller skift + skift + klicka och dra (PC) (mus: högerklicka och dra). Om du vill centrera om använder du listrutan högst upp i gränssnittet för att klicka på Åtgärder > Visa.
- Läsa in strukturen i ChimeraX: Skriv:
öppen 3fgu
OBS: När du har matat in ett maskinskrivet linjekommando trycker du på retur på tangentbordet för att köra det. - Identifiera liganderna på den aktiva webbplatsen: Se till att det finns två representationer, ett tecknad band och pinnar. Använd musen, rotera / zooma proteinet för att bäst visualisera de ligands som visas nära mitten av proteinet, som visas som pinnar. Hovra över en ligand för att visa dess namn.
- Justera representationen: Använd kommandona i understegen nedan för att färga om proteinet och liganderna, applicera CPK-färgning på icke-kolatomer och avmarkera sedan markeringen. Utvalda delar av molekylen markeras i grönt.
- Använd listrutans menyer högst upp i gränssnittet för att ändra färgningen: Klicka på Åtgärder > färg > Blåklint. Klicka sedan på Välj > struktur > Ligand. Om du vill välja färg klickar du på Åtgärder > Färg > Grå. Om du vill använda CPK-färgning klickar du på Välj > Allaoch klickar sedan på Åtgärder > Färg > By Heteroatom. Avmarkera slutligen markeringen genom att klicka på Välj > Rensa.
Obs: Markeringen kan också avmarkeras genom att trycka på kontroll och klicka i strukturvisningsprogrammets svarta bakgrund eller på kommandoraden genom att skriva: ~select. Som standard, för de flesta strukturer som innehåller 1-4 kedjor, kommer ChimeraX automatiskt att visa vattenmolekyler och aminosyrarester inom 3,6 Å av ligands och joner. - Använd den nedrullningsbar menyn för att dölja de atomer som visas för närvarande genom att klicka på Åtgärder > atomer/bindningar > Dölj.
- Använd listrutan för att visa ligands och Mg ion på den aktiva webbplatsen genom att klicka på Välj > struktur > Ligand. Klicka sedan på Åtgärder > atomer /obligationer > Visa. Klicka sedan på Välj > rester > MGoch sedan på Åtgärder > atomer/obligationer > Visa. Om du vill avmarkera markeringen klickar du på Välj > Rensa.
När du har gjort markeringen med den nedrullningsbar menyn kan steg 1.3.3 utföras genom att klicka på knapparna Dölj och visa i verktygsfältet Atoms.
- Använd listrutans menyer högst upp i gränssnittet för att ändra färgningen: Klicka på Åtgärder > färg > Blåklint. Klicka sedan på Välj > struktur > Ligand. Om du vill välja färg klickar du på Åtgärder > Färg > Grå. Om du vill använda CPK-färgning klickar du på Välj > Allaoch klickar sedan på Åtgärder > Färg > By Heteroatom. Avmarkera slutligen markeringen genom att klicka på Välj > Rensa.
- Välja rester inom 5 Å för att definiera en aktiv plats: I strukturvisaren, för att välja ligands presskontroll + skift och utföra musen klicka på en enda atom eller bindning i var och en av de tre liganderna, dvs BCG, ANPoch Mg.
- Tryck sedan på uppåtpilstangenten på tangentbordet tills alla atomer i de tre liganderna markeras med en grön glöd. Definiera det här valet för framtida användning genom att klicka på den nedrullningsbara menyn Välj > Definiera väljare. Skriv:
ligands för att namnge det aktuella valet och klicka sedan på OK.
Om du klickar på uppilen för många gånger i steg 1.4.1 väljs hela proteinet. Klicka i så fall på nedpilsknappen tills endast atomerna i de tre liganderna är markerade. - Använd rullgardinsmenyn för att välja rester inom 5 Å av liganderna: Klicka på Välj > Zon. I popup-fönstret som visas växlar du listrutan Välj till Resteroch ser till att den övre rutan är markerad (markera det mindre än (<) avståndet och inställt på 5,0 Å). Klicka sedan på OK. Endast rester som är mindre än 5 Å bort kommer att markeras.
OBS: Steg 1.4-1.4.2 kan förenklas avsevärt med kommandoraden genom att skriva:
namn frysta ligands :BGC:MG:ANP
välj zon ligands 5 förlänga sanna rester sant
- Tryck sedan på uppåtpilstangenten på tangentbordet tills alla atomer i de tre liganderna markeras med en grön glöd. Definiera det här valet för framtida användning genom att klicka på den nedrullningsbara menyn Välj > Definiera väljare. Skriv:
- Visa sidokedjorna som pinnar och visa/justera de aktiva vattenmolekylerna: Använd rullgardinsmenyn för att visa markeringen och centrera och zooma på urvalet genom att klicka på Åtgärder > atomer/bindningar > Visa för att visa dem. Om du vill centrera markeringen klickar du på Åtgärder > Visa. Om du sedan vill avmarkera markeringen klickar du på Välj > Rensa eller klicka någonstans i det tomma utrymmet .
- Visa interaktionen mellan enzymet och de aktiva webbplats ligands: Använd rullgardinsmenyerna och klicka på Välj > användardefinierade väljare > Ligands. Klicka sedan på Verktyg > strukturanalys > H-obligationer. I popup-fönstret kontrollerar du att Begränsa efter markering är markerat, att listrutan är inställd på Med minst en ände markerad och Välj atomer kontrolleras och klicka sedan på OK. Om du vill avmarkera markeringen klickar du på Välj > Rensa.
OBS: Markera rutan Avståndsetikett om du vill se bindningslängder i Å; Detta gör dock utsikten mycket upptagen. Slutligen kan du ändra färgen på H-bindningarna genom att klicka på rutan Färg och välja en ny färg i popup-fönstret. - Förenkla strukturen: använda det övre tecknade verktygsfältet för att dölja tecknad film eller klicka på rullgardinsmenyn: Åtgärder > Cartoon > Hide.
- Märkning av ligands och vätebundna sidokedjor: Använd musen för att välja rester som är vätebundna till liganderna (anslutna med de streckade linjerna), som i steg 1.4. Klicka sedan på Åtgärder > etikett > rester > Name Combo ilistnedrullningsmenyerna . Klicka sedan på Välj > användardefinierade väljare > Ligands. Klicka sedan på Åtgärder > Etikett > Rester > Av. Avmarkera slutligen markeringen genom att klicka på Välj > Rensa.
- Spara renderingen när som helst för att återgå till arbetet med den eller dela med andra: klicka på Arkiv > Sparapå den nedrullningsbar menyn. Välj en plats, ange ett filnamn och klicka på Spara.
Se till att formatet är inställt på: ChimeraX-session *.cxs. - Spara en bild för inbäddning eller utskrift: Använd först musen för att orientera molekylen efter önskemål. Ändra bakgrundsfärgen till vit genom att skriva på kommandoraden:
ställa in bgColor vit
Klicka slutligen på ögonblicksbildikonen i verktygsfältet. Bilden sparas på skrivbordet.
Bakgrundsfärg är också tillgänglig i den nedrullningsbar menyn. på en Mac, klicka på UCSF ChimeraX > Inställningar; Klicka på Favoriter > Inställningar > bakgrundpå en dator .
2. iCn3D-protokoll
OBS: Styrplatta och muskontroller: Om du vill rotera klickar och drar du (mus: vänsterklick och dra). Zooma, nyp och bred upp (mus: rotera rullningshjulet). Om du vill översätta (dvs. flytta hela strukturen) klickar du och drar med två fingrar (mus: högerklicka och dra). Om du vill centrera igen håller du muspekaren över Visa i de övre listningsmenyerna och klickar sedan på Centermarkering.
- Läsa in strukturen i iCn3D: Navigera till iCn3D Web-based 3D Structure Viewer och skriv 3FGU i rutan Indata MMDB eller PDB-ID för att läsa in filen.
- Identifiera liganderna på den aktiva webbplatsen: Hovra över analys i rullgardinsmenyn och klicka sedan på Seq. och Anteckningar. Sekvenserna, i detta fall Proteiner och Kemiska/Joner/Vatten, visas i en staplad tabell. Rulla nedåt för att se de aktiva webbplats ligands ANP, BGC och Mg listade. I strukturvisaren hovrar du över liganderna på den aktiva platsen (visas som pinnar i mitten av proteintecknad film) för att se deras namn.
- Justera representationen: Inga inledande justeringar krävs för det här protokollet.
- Välja rester inom 5 Å för att definiera en aktiv webbplats: För att välja ligands, använd rullgardinsmenyn Välj och klicka på Välj på 3D. Se till att resthalterna kontrolleras .
- Om du vill välja ligands håller du ned ALT-knappen på en pc eller knappen Alternativ på en Mac och klickar på den första liganden (t.ex. BCG)med musen eller styrplattan. Tryck sedan på kontroll och klicka på ANP och MG ligands för att lägga till dem i valet.
Obs: Ligands kommer att markeras i gult när de väljs. - Spara det här valet med den nedrullningsbara menyn: Klicka på Välj > Spara markering och använd tangentbordet för att mata in ett namn i popup-fönstret (t.ex. 3 Ligands) och klicka sedan på Spara. Popup-fönstret Välj uppsättningar visas nu.
OBS: Om markeringen är felaktig klickar du på Välj > Rensa markering. - Välj rester inom 5 Å av liganderna: Klicka på Välj > Efter avstånd i rullgardinsmenyn: Klicka på Välj > efter avstånd. I popup-menyn som visas ändrar du det andra objektet (Sfär med radie) till 5 Å genom att skriva i blocket. Klicka på det rutiga ordet Displayoch stäng sedan fönstret genom att klicka på korstecknet i det övre högra hörnet.
Obs: I popup-menyn som visas i steg 2.4.3 lämnar du den första uppsättningen med inmatningen "vald" och den andra uppsättningen som "icke-vald". Observera att atomerna/strukturerna inom 5 Å markeras med gul glöd när du klickar på Display. - Spara den aktiva 5 Å-webbplatsen med den nedrullningsbara menyn: Håll muspekaren över Välj och klicka på Spara markering, ange ett namn i popup-fönstret med tangentbordet (t.ex. 5Ang) och klicka på Spara.
- Skapa sedan en ny markering som kombinerar de två uppsättningarna (5Ang och 3Ligands): Ctrl-klickar (PC) eller kommandoklickar (Mac) 5Ang och 3Ligandspå popup-menyn Välj uppsättningar . Klicka på Välj > Spara markering, använd tangentbordet för att skriva ett namn (t.ex. 5AFull) och klicka sedan på Spara.
- Om du vill välja ligands håller du ned ALT-knappen på en pc eller knappen Alternativ på en Mac och klickar på den första liganden (t.ex. BCG)med musen eller styrplattan. Tryck sedan på kontroll och klicka på ANP och MG ligands för att lägga till dem i valet.
- Visa interaktionen mellan enzymet och de aktiva webbplats ligands som vätebindningar: Hovra över analys i rullgardinsmenyn och klicka på Interaktioner. En omfattande popup-meny med alla icke-samvalenta interaktioner visas.
- Avmarkera allt utom kryssrutorna "Vätebindningar" och "Salt Bridge/Ionic". Klicka på 3Ligands för att välja det första setet och 5Ang för det andra setet. Klicka på den rutiga texten som läser 3D-visningsinteraktioner. Stäng fönstret genom att klicka på korstecknet i det övre högra hörnet.
OBS: Kontakten/interaktionerna representerar förmodligen inducerad dipolinducerad dipolinteraktion, vilket ofta gör displayen upptagen. Om så önskas, ändra avståndet för någon typ av interaktion. - Om du bara vill visa vätebindningar klickar du på 5Afull i popup-fönstret utvalda uppsättningar. Hovra sedan över Analys i den nedrullningsbar menyn och klicka sedan på Chem >.
- Avmarkera allt utom kryssrutorna "Vätebindningar" och "Salt Bridge/Ionic". Klicka på 3Ligands för att välja det första setet och 5Ang för det andra setet. Klicka på den rutiga texten som läser 3D-visningsinteraktioner. Stäng fönstret genom att klicka på korstecknet i det övre högra hörnet.
- Visa sidokedjorna som pinnar och visa/justera de aktiva platsvattenmolekylerna: Använd popup-menyn utvalda uppsättningar och klicka på 5AFull. Klicka sedan på Style > Sidokedjor > Sticki de nedrullningsbar menyerna . Om du vill använda CPK-färgläggning klickar du på Färg > Atom. Slutligen, klicka på Style > Water > Spheres (om du föredrar större vattenmolekyler).
- Förenkla strukturen: Klicka på 5AFulli popup-menyn välj uppsättningar . Klicka sedan på Visa > Visa markering (för att bara se 5AFull-bindningswebbplatsen). Klicka sedan på Style > Proteins > Stick (för att visa proteinkedjan som pinne istället för band).
- Om du vill färglägga ligandernas kolatomer med en kontrasterande färg klickar du på Chemicals i popup-fönstret Välj uppsättningar. Klicka sedan på Visa > Visa markeringpå den nedrullningsbar menyn . Klicka sedan på Välj > Välj på 3D (se till att "atom" kontrolleras). Använd musen och tangentbordet med hjälp av kontrollerna som beskrivs i steg 2.4.1 för att välja alla kolatomer i BGC och ANP. Klicka sedan på Color > Unicolor > Cyan > Cyani den nedrullningsbar menyn .
- Om du vill visa hela den aktiva webbplatsen igen använder du popup-fönstret Välj uppsättningar för att klicka på 5AFull. Klicka sedan på Visa > Visa markeringpå den nedrullningsbar menyn .
- Märkning av ligands och vätebundna sidokedjor: Använd popup-fönstret select set för att välja Interface_alloch klicka sedan på Analys > etikett > Per rest & tali den nedrullningsbara menyn .
OBS: Du måste välja om Per rest & nummer varje gång du vill lägga till en etikett, även om menyalternativet redan har kontrollerats från en tidigare etikett. - Spara renderingen när som helst för att återgå till arbetet med den eller dela med andra: Klicka på Arkiv > Dela länk på den nedrullningsbar menyn. Kopiera den korta WEBBADRESSEN (till exempel: https://structure.ncbi.nlm.nih.gov/icn3d/share.html?r83NqCz41bu7cmcs8) och klistra in den i en webbläsare.
- Spara en bild för inbäddning eller utskrift: Klicka på Välj > Växlingsmarkeringpå den nedrullningsbara menyn: Klicka på Välj > Växla markering . Klicka sedan på Style > Background > White. Slutligen klickar du på Spara > Spara filer > iCn3D PNG-bild och välj önskad storlek.
3. Jmolprotokoll
OBS: Styrplatta och muskontroller: Om du vill rotera klickar och drar du (mus: vänsterklick och dra). Så här zoomar du: rulla lodrätt med två fingrar (mus: skift + vänsterklick + dra lodrätt). Om du vill översätta (dvs. flytta hela strukturen) kontroll + alt + klicka och dra (PC), kontroll + alternativ + klicka och dra (Mac). Så här centrerar du: skift + dubbelklicka i det tomma utrymmet i strukturvisningsfönstret.
- Läsa in strukturen i Jmol: Använd den nedrullningsbar menyn högst upp i det grafiska gränssnittet för att konfigurera arbetsytan med strukturen genom att klicka på Arkiv >-konsol. Klicka sedan på Arkiv > Hämta PDB. Skriv: 3fgu i popup-fönstret
Klicka sedan på OK.
OBS: Alternativt, använd Jmol-konsolen för att ladda strukturen genom att skriva: load = 3fgu
OBS: När du har matat in ett maskinskrivet linjekommando trycker du på retur på tangentbordet för att köra det. - Justera representationen: Öppna popup-menyn genom att högerklicka (eller kontrollera + klicka) var som helst i fönstret Strukturvisare.
- Om du vill ändra proteinet till tecknad representation klickar du på Välj > Selection Halosi popup-menyn . Klicka sedan på Välj > protein > Alla. Klicka slutligen på Style > Scheme > Cartoon.
OBS: Urvalshallor sätter en gul kontur (glöd) runt alla markerade atomer. - Använd den övre rullgardinsmenyn för att dölja vattnet genom att klicka på Visa > Välj > vatten. Klicka sedan på Visa > Atom > Ingenoch klicka slutligen på Visa > Välj > Ingen.
- Om du vill ändra proteinet till tecknad representation klickar du på Välj > Selection Halosi popup-menyn . Klicka sedan på Välj > protein > Alla. Klicka slutligen på Style > Scheme > Cartoon.
- Identifiera liganderna på den aktiva webbplatsen: Använd musen för att zooma in på den aktiva webbplatsen och använd sedan kommandona i understegen för att visa liganderna som pinnar.
Ligad-namn visas i Jmol-konsolen när du läser in filen. Du kan också visa bundna ligand-namn med popup-menyn genom att klicka på Välj > Hetero > av HETATM.- Håll muspekaren över liganderna med musen för att se deras namn. Den aktiva platsen ligger nära mitten av strukturen; liganderna MG, BGC och ANP finns på den aktiva platsen.
- Välj ligands BCG och ANP: Skriv:
välj BGC, ANP - Om du vill visa ligands BCG och ANP som pinnar använder du popup-menyn och klickar på Style > Scheme > Sticks.
- Välja rester inom 5 Å för att definiera en aktiv plats: I Jmol-konsolen skriver du följande kommando för att välja atomer inom 5 Å av de tre liganderna:
välj inom (5, (bgc,anp,mg))- Om du vill välja fullständiga aminosyrarester skriver du följande i konsolen och trycker på Retur
välj inom(grupp, markerad)
OBS: Jmol-konsolen är det bästa sättet att välja restprodukter inom 5 Å.
- Om du vill välja fullständiga aminosyrarester skriver du följande i konsolen och trycker på Retur
- Visa sidokedjorna som pinnar och visa/justera de aktiva platsvattenmolekylerna: Högerklicka för att få popup-menyn och hovra över Style > Scheme > Sticks.
OBS: Steg 3.5 visar de aktiva sidokedjorna på platsen i stickrepresentation. Det kommer fortfarande att finnas några tomma halos i strukturen som representerar vattenmolekylerna på den aktiva platsen.- Kör följande kommando igen i Jmol-konsolen:
välj inom (5, (bgc,anp,mg))
Om du vill köra ett kommando igen klickar du i konsolen och använder sedan piltangenterna på tangentbordet tills kommandot visas och klickar på retur för att köra det igen. - Om du vill visa vattenmolekylatomer tar du bort liganderna och proteinet från urvalet genom att skriva följande två kommandon:
välj ta bort gruppprotein
välj ta bort grupp hetero och inte vatten - Om du vill visa vattenmolekylerna klickar du på rullgardinsmenyn Display. Hovra över Atom och klicka på 20% van der Waals. De gröna magnesiumjonerna kommer fortfarande att visas som pinnar. Visa magnesiumjonen i den vanligare sfärrepresentationen genom att skriva följande kommandon i Jmol-konsolen:
välj Mg
blanksteg 50 % - Färga om liganderna för att skilja dem från proteinet: I Jmol-konsolen skriver du följande för att köra ett kommando som färgar om liganderna i ett ljusare färgschema:
välj (bgc,anp) och kol; färg [211 211 211]
välj (bgc, anp) och syre; färg [255 185 185]
välj (bgc,anp) och kväve; färg [150 210 255]
välj (bgc,anp) och fosfor; färg [255 165,75]
Välj Mg; färg palegreen
- Kör följande kommando igen i Jmol-konsolen:
- Visa interaktionen mellan enzymet och de aktiva platsen ligands: Använd Jmol-konsolen, kör varje rad i följande kommando:
definiera ligbind (ANP, BGC, MG)
välj inom (5, (bgc,anp,mg))
välj ta bort grupp hetero och inte vatten- Om du vill visa rader för att illustrera vätebindningar skriver du det här kommandot i Jmol-konsolen:
ansluta 3.3 (ligbind och (syre eller kväve)) (valt och (syre eller kväve)) strutgul
Ändra sedan tjockleken på raderna genom att skriva följande kommando i konsolen:
välj alla; strut 0.1; välj ingen
- Om du vill visa rader för att illustrera vätebindningar skriver du det här kommandot i Jmol-konsolen:
- Förenkla strukturen: För att dölja proteinets tecknad film och rensa urvalet, i Jmol-konsolen, skriv:
välj alla; tecknad film av; välj ingen - Märkning av ligands och vätebundna sidokedjor: Klicka på Ange plockning > Välj atomi popup-fönstret. Klicka på en atom i en av de vätebundna resterna. Aminosyra- och restnumren visas i konsolen. Använd sedan konsolen för att skriva en etikett, till exempel:
etikett Glu-256 - Spara renderingen när som helst för att återgå till arbetet med den eller dela med andra: Klicka på kameraikonen i den övre menyn. Skriv ett filnamn och välj en plats som ska sparas.
OBS: En exporterad JPEG-fil (.jpg) innehåller informationen för både en bild som den visas i visningsfönstret vid exporttillfället och modellens aktuella tillstånd. Om du vill läsa in modellen igen öppnar du Jmol och drar den sparade JPEG-filen till Jmol-visningsfönstret. - Spara en bild för inbäddning eller utskrift: I Jmol-konsolen färgar du om bakgrunden till vitt genom att skriva:
bakgrund vit
Som i steg 3.9 klickar du på kameraikonen och sparar filen.
4. PyMOL-protokoll
OBS: Styrplatta och muskontroller: Om du vill rotera klickar och drar du (mus: vänsterklick och dra). Om du vill zooma, nypa och sprida (mus: högerklicka och dra). Om du vill översätta (dvs. flytta hela strukturen), styr + klickar och drar (mus: kommando + vänsterklick och dra). Om du vill centrera om går du till den högra objektpanelen och klickar på A > Orient eller Center.
- Läser in strukturen i PyMOL: På kommandoraden nära toppen av det grafiska gränssnittet (föregånget av "PyMOL>"), skriver du:
hämta 3FGU
OBS: När du har matat in ett maskinskrivet linjekommando trycker du på retur på tangentbordet för att köra det. - Justera representationen: Klicka på H > Waters till höger om "3FGU" på H > Waters.
- Identifiera liganderna på den aktiva webbplatsen: Slå först på sekvensvisaren genom att klicka på den övre rullgardinsmenyn: Visa > Sekvens.
- Rulla den grå stapeln till höger tills du hittar ligandnamnen (BCG, ANP, MG, K).
OBS: Det finns två representationer, ett tecknad band och pinnar; liganderna visas som pinnar. Kontrollera att markeringsläget i muskontrollerna längst ned till höger är inställt på Rest- och 3-knappsvisningsläge genom att klicka på dessa namn för att växla igenom alternativen. - Använd musen och rotera och zooma för att göra liganderna synliga.
- Rulla den grå stapeln till höger tills du hittar ligandnamnen (BCG, ANP, MG, K).
- Välja rester inom 5Å för att definiera en aktiv plats: För att välja ligands på den aktiva platsen, klicka på var och en(BCG, ANP, MG) i strukturvisaren. En ny markering dyker upp på namn-/objektpanelen. till höger om det här nya objektet "sele", klicka på A-knappen och klicka sedan på Byt namn på popup-menyn.
OBS: Om du vill rensa en oönskad markering klickar du på det tomma utrymmet i strukturvisaren för att avmarkera.- Använd tangentbordet och ta bort bokstäverna "sele" som visas längst upp till vänster i fönstret för strukturvisare och skriv:
Ligander
OBS: Steg 4.4-4.4.1 kan göras med kommandoraden; typ:
sele ligands, resn BGC+ANP+MG - Använd det här valet om du vill definiera området runt liganderna genom att först duplicera det, klicka på ligands > A > Duplicate. Klicka sedan på sel01 > A > Rename
Använd tangentbordet och ta bort bokstäverna "se101" och skriv:
aktiv - Ändra det här valet så att rester visas inom 5 Å: Klicka på aktiva > A > Ändra > Expandera > med 5 A, Rester. Sedan, för att visa dessa rester som pinnar, klicka på aktiva > S > Lakrits > Sticks. Slutligen klickar du i det tomma utrymmet i strukturvisaren för att avmarkera markeringen.
OBS: Steg 4.4.3 kan göras med kommandoraden, skriv:
sele aktiv, byres alla inom 5 av ligands
visa pinnar, aktiv
- Använd tangentbordet och ta bort bokstäverna "sele" som visas längst upp till vänster i fönstret för strukturvisare och skriv:
- Visa sidokedjorna som pinnar och visa/justera de aktiva platsvattenmolekylerna: Klicka på ligands > A > Duplicerai namn/objektpanel . Om du vill byta namn på markeringen klickar du på Sel02 > A > Byt namn på markering. Ta bort bokstäverna på namnbytesmenyn som visas längst upp till höger i strukturvisningsprogrammet och skriv:
active_water- För att justera det nya urvalet så att det innehåller aktiva platsvattenmolekyler, klicka på active_water > A > Modifiera > runt > atomer inom 4 angstroms. För att ändra detta ytterligare och begränsa till vattenmolekyler, klicka på active_water > A > Modifiera > Begränsa > till lösningsmedel. Klicka slutligen på active_water > A > Preset > Ball and Stick.
OBS: Gui tillåter val inom 4 Å; linjekommandon gör det möjligt att välja ett lämpligare avstånd på 3,3 Å för vätebindning av vattenmolekyler. Van der Waals radier av sfärerna kan inte ställas in i GUI, men valet "boll och pinne" är nära 0,5 Å.
Anmärkning: Steg 4.5-4.5.1 kan utföras med kommandoraden genom att skriva varje rad i följande kod:
välj active_water,((ligands)runt 3,3) och (resn HOH)
visa sfärer, active_water
ändra active_water, vdw=0,5
återuppbygga
- För att justera det nya urvalet så att det innehåller aktiva platsvattenmolekyler, klicka på active_water > A > Modifiera > runt > atomer inom 4 angstroms. För att ändra detta ytterligare och begränsa till vattenmolekyler, klicka på active_water > A > Modifiera > Begränsa > till lösningsmedel. Klicka slutligen på active_water > A > Preset > Ball and Stick.
- Visar interaktionen mellan enzymet och de aktiva ligander. Zooma in på den aktiva webbplatsen genom att klicka på aktiva > A > Zoom. För att hitta polarkontakterna mellan liganderna och den aktiva webbplatsen, klicka på ligands > A > Hitta > Polar kontakter > till alla atomer. Visa avstånd som etiketter genom att klicka på ligands_polar_contacts > S > Labels.
- Förenkla strukturen: Dölj proteinets tecknad film, som döljer den del av proteinet som inte finns på den aktiva webbplatsen, genom att klicka på 3FGU > H > Cartoon i namn / objektpanelen. Dölj sedan etiketterna för vätebindningslängden genom att klicka på ligands_polar_contacts > H > Etiketter på namn-/objektpanelen.
- För att färga liganderna för att skilja dem från proteinet, klicka på ligands > C > By Element > CHNOS och välj alternativet där "C" är cyan (en ljusblå).
Steg 4.7.1 kan utföras med kommandoraden. Typ:
färg cyan, ligands
färg atom, ligands & !elem C
- För att färga liganderna för att skilja dem från proteinet, klicka på ligands > C > By Element > CHNOS och välj alternativet där "C" är cyan (en ljusblå).
- Märkning av ligands och vätebundna sidokedjor: Klicka på aktiva > L > Resterpå namn-/objektpanelen till höger om ett objektnamn.
- Spara renderingen när som helst för att återgå till arbetet med den eller dela med andra: Klicka på Arkiv > Spara session sompå den. Välj sedan en plats i popup-fönstret, skriv ett filnamn och klicka på Spara.
- Spara en bild för inbäddning eller utskrift: Ändra först bakgrunden till vitt på den nedrullningsbar menyn genom att klicka på Visa > Bakgrund > Vitt. Exportera bilden som en ny fil genom att klicka på Arkiv > Exportera bild som > PNG.
Representative Results
Ett framgångsrikt utfört protokoll för vart och ett av programmen resulterar i en molekylär modell som zoomas in på den aktiva webbplatsen, med aktiva webbplatsrester och ligands som visas som pinnar, proteintecknad film dold och ligands visas med ett kontrasterande färgschema. Samverkande aminosyrarester bör märkas med deras identifierare och vätebindning och joniska interaktioner som visas med linjer. Förekomsten av dessa funktioner kan bestämmas genom visuell inspektion av modellen.
För att underlätta den här inspektionen och göra det möjligt för användaren att avgöra om de har utfört stegen i protokollet korrekt har vi tillhandahållit animerade figurer som presenterar en bild av strukturen efter varje steg. För ChimeraX, iCn3D, Jmol och PyMOL illustreras detta i figurerna 7-10.
Bild 7: ChimeraX protokollutgång. Animerad figur som illustrerar steg 1.1-1.8 i ChimeraX-protokollet. Klicka här för att ladda ner den här siffran.
Bild 8: iCn3D-protokollutgång. Animerad figur som illustrerar steg 2.1-2.8 i iCn3D-protokollet. Klicka här för att ladda ner den här siffran.
Bild 9: Jmolprotokollutgång. Animerad figur som illustrerar steg 3.1-3.8 i Jmol-protokollet. Klicka här för att ladda ner den här siffran.
Bild 10:PyMOL-protokollutgång. Animerad figur som illustrerar steg 4.1-4.8 i PyMOL-protokollet. Klicka här för att ladda ner den här siffran.
Det vanligaste felet som kan påverka resultatet av dessa protokoll är felaktig markering, vilket resulterar i att en del av strukturen visas i en oönskad rendering. Detta är vanligtvis ett resultat av felklickning, antingen på själva strukturen eller i någon av visningsmenyknapparna. Ett exempel på ett suboptimalt resultat skulle vara en modell som innehåller rester utanför den aktiva platsen som visas som pinnar. Användaren kan börja analysera om detta fel har inträffat genom att visuellt inspektera resterna som visas som pinnar och se till att de är i närheten av den aktiva webbplatsen ligands. En avancerad metod för att utvärdera om resthalterna finns inom 5Å från de aktiva ligaderna är att använda de mätverktyg som är inbyggda i varje program för att mäta avståndet mellan en närliggande ligand och de aktiva platsresterna. Mätverktygen ligger utanför manuskriptets räckvidd. Vi uppmuntrar dock intresserade användare att utforska de många online-tutorials som beskriver denna typ av analys.
Vi presenterar ett specifikt exempel på en suboptimal körning av detta protokoll, som är resultatet av ett felklick på namn-/objektpanelen i PyMOL. Det här felet visar hela proteinet som pinnar, i stället för att bara visa den aktiva platsen med den här representationen, vilket illustreras i figur 11.
Bild 11: Negativt resultat. Exempel på ett negativt resultat. Felval av hela tecknad film i PyMOL och visa pinnar. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
För att felsöka måste användaren dölja pinnarna för hela modellen (märkt 3FGU i namn/objektpanelen) och sedan visa stickrepresentationen för endast markeringen som heter "aktiv", med hjälp av dölja och visa knappar /kommandon i PyMOL. Att återställa modellen från den här typen av fel är relativt enkelt när användaren kan skapa lämpliga val för olika delar av modellen och visa och dölja dem effektivt. Det är frestande att starta om protokollet och arbeta igenom stegen en annan gång; Vi uppmuntrar dock användaren att inte vara rädd för att gå "off script" och experimentera med modellen. Enligt vår erfarenhet underlättar arbetet med displayfel framsteg i förståelsen av modelleringsprogrammet.
En sida vid sida-visning av den slutliga utdata från ett framgångsrikt utfört protokoll för varje program visas i figur 12. Vyerna är inriktade på samma sätt så att användaren kan jämföra utseendet på de modeller som skapats i olika program.
Bild 12: Slutlig strukturjämförelse mellan program. Jämförelse av strukturen för varje aktiv platsåtergivning i slutet av protokollet. A: ChimeraX, B: iCn3D, C: Jmol, D: PyMOL. PyMOL active site label innehåller alla aktiva platsrester och ligands. De andra utgångarna har endast vätebundna sidokedjor märkta. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Discussion
Detta protokoll beskriver en tiostegsprocess för modellering av en enzym aktiv plats, tillämpas på fyra populära program för biomolekylär modellering. De kritiska stegen i protokollet är: identifiera liganderna på den aktiva platsen, välja rester inom 5 Å för att definiera en aktiv plats och visa interaktionen mellan enzymet och de aktiva ligaderna. Att särskilja de ligands som är relevanta för den biologiska funktionen är av största vikt, eftersom detta gör det möjligt för användaren att definiera de aminosyrarester inom 5 Å som kan spela en roll för att binda liganderna. Slutligen, genom att använda programmet för att visa molekylära interaktioner kan användaren utveckla de färdigheter som krävs för att förstå de molekylära interaktioner som främjar bindning.
En begränsning av datorbaserade molekylära modelleringsprotokoll är beroendet av specifika kommandon och syntax. Även om biokemiska protokoll kan vara toleranta mot små förändringar i förfarandet, kan datorbaserade undersökningar ge mycket olika slutprodukter om förfarandet inte följs noga. Detta är särskilt viktigt när kommandoradsgränssnitt används där programspecifik syntax krävs för att uppnå en viss utdata, och en till synes obetydlig förändring i skiljetecken eller versaler kan orsaka att ett kommando misslyckas. Det finns olika Wikis och manualer för varje program, där en användare kan hitta och felsöka kommandoradsinmatningar; Användaren bör vara uppmärksam på information om kommandosyntaxen. Även om de flesta molekylära visualiseringsprogram innehåller ångra-kommandon, på grund av gränssnittens komplexitet, vänder kommandot ångra inte alltid troget det senast utförda steget. Därför uppmuntras det ofta att spara det aktuella arbetstillståndet, särskilt för nya användare.
Ytterligare begränsningar kan uppstå från de data som används för att skapa själva modellen. Medan de standarder som är inneboende i Protein Data Bank säkerställer en viss nivå av konsekvens, kommer användare av molekylära visualiseringsprogram ofta att stöta på oväntade effekter i en proteinåtergivning. För det första bestäms de flesta strukturer med hjälp av röntgenkristallografi, vilket ger en enda modell av proteinet; NMR-strukturer består dock ofta av flera modeller som kan visualiseras en i taget. För det andra kan strukturer som bestäms av kristallografi eller kryogena elektronmikroskopiexperiment innehålla atomer vars position inte kan klargöras och visas som luckor i vissa representationer av proteinet. Proteinstrukturer kan ha alternativa konformationer av sidokedjor, som, när de visas i stickåtergivning, visas som två grupper som sticker ut från samma aminosyra ryggrad. Även korta delar av ryggraden kan ha sådana alternativa konformationer, och ibland ligands läggs på den aktiva platsen i mer än en bindande konformation.
För en kristallstruktur innehåller de deponerade 3D-koordinaterna alla komponenter i den asymmetriska enheten, vilket ger tillräckligt med information för att reproducera den upprepade enheten i en proteinkristall. Ibland kommer denna struktur att innehålla ytterligare proteinkedjor jämfört med den biologiskt aktiva formen av proteinet (t.ex. fetala hemoglobin mutant, PDB ID: 4MQK). Omvänt kan vissa program inte automatiskt ladda alla kedjor i den biologiskt aktiva enheten. Sars-CoV2-huvudproteas (PDB ID: 6Y2E) laddar till exempel hälften av den biologiskt aktiva dimern (bestående av två proteinkedjor) när den hämtas med hjälp av kommandona som beskrivs i detta protokoll i ChimeraX, PyMOL och Jmol. Även om en liten ändring av kommandot kommer att ladda den biologiskt aktiva dimern, kanske detta övervägande inte är enkelt för nybörjare modelleringsprogramanvändaren. En annan fråga som kan uppstå är identifieringen av den aktiva platsen eller substratet själv. Kristallografiska experiment utförs med hjälp av en mängd olika molekyler, som kan modelleras in i den slutliga strukturen. Till exempel kan sulfatmolekyler binda fosfatbindningsställen på det aktiva området, eller de kan binda andra regioner som inte är relevanta för mekanismen. Dessa molekyler kan dölja korrekt identifiering av själva den aktiva platsen och kan till och med föreslå för studenten att de är en del av mekanismen.
Förmodligen kommer användaren att vilja tillämpa denna procedur på andra aktiva / bindande webbplatser. För att tillämpa detta protokoll i det framtida arbetet med analys av nya proteinaktiva platser måste användaren identifiera vilka av de bundna liganderna som är relevanta för funktionen. Vissa ligands är inte associerade med proteinfunktion, och är istället ett resultat av de lösningsmedels- eller kristalliseringsförhållanden som används för att utföra experimentet (t.ex. kaliumjonen som finns i 3FGU-modellen). De viktigaste liganderna bör identifieras genom att konsultera originalmanuskriptet. Med övning och, i förekommande fall, en förståelse av syntaxen för radkommandot kan en användare tillämpa protokollet för önskat modelleringsprogram på alla enzymaktiva platser och modellera andra makromolekyler som de väljer.
Att identifiera och analysera bundna substrat och ligands är centralt för att klargöra molekylära mekanismer och strukturbaserade läkemedelsdesigninsatser, vilket direkt har lett till förbättringar i behandlingar för sjukdom, inklusive förvärvat immunbristsyndrom (AIDS) och COVID-1947,48,49,50,51,52 . Medan enskilda molekylära visualiseringsprogram erbjuder olika gränssnitt och användarupplevelser, erbjuder de flesta jämförbara funktioner. Det är viktigt för utvecklingen av biomolekylär visualiseringskunskap att biokemistudenter på högre nivå blir bekanta med strukturvisualisering och verktygen för att generera sådana bilder4,20,53. Detta gör det möjligt för studenter att gå bortom tolkningen av tvådimensionella bilder i läroböcker och tidskriftsartiklar och lättare utveckla sina egna hypoteser från strukturdata54, vilket kommer att förbereda utvecklande forskare för att ta itu med framtida folkhälsofrågor och förbättra förståelsen för biokemiska processer.
Sammanfattningsvis beskriver detta protokoll aktiv webbplatsmodellering med fyra ledande gratis makromolekylära modelleringsprogram. Vår community, BioMolViz, använder en icke-programvaruspecifik strategi för biomolekylär modellering. Vi undvek specifikt en kritik eller jämförelse av programfunktioner, även om en användare som provar varje program sannolikt kommer att upptäcka att de föredrar vissa aspekter av makromolekylär modellering i ett program jämfört med ett annat. Vi inbjuder läsarna att använda BioMolViz Framework, som beskriver de biomolekylära visualiseringsbaserade inlärningsmålen och målen som är riktade i detta protokoll, och utforska resurser för undervisning och inlärning av biomolekylär visualisering via BioMolViz communitywebbplats på http://biomolviz.org.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några relevanta eller materiella ekonomiska intressen som hänför sig till den forskning som beskrivs i detta dokument.
Acknowledgments
Finansiering för detta arbete har tillhandahållits av National Science Foundation:
Förbättra STEM Education Grant (Award #1712268)
Forskningssamordningsnätverk inom grundutbildning i biologiutbildning (utmärkelse # 1920270)
Vi är tacksamma mot Karsten Theis, PhD, Westfield University, för hjälpsamma diskussioner om Jmol.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ChimeraX (Version 1.2.5) https://www.rbvi.ucsf.edu/chimerax/ | |||
| Computer | Any | ||
| iCn3D (web-based only: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/icn3d/full.html) | |||
| Java (for Jmol) https://java.com/en/download/ | |||
| Jmol (Version 1.8.0_301) http://jmol.sourceforge.net/ | |||
| Mouse (optional) | Any | ||
| PyMOL (Version 2.4.1 - educational): https://pymol.org/2 educational use only version: https://pymol.org/edu/?q=educational |
References
- Loertscher, J., Green, D., Lewis, J. E., Lin, S., Minderhout, V. Identification of threshold concepts for biochemistry. CBE Life Sciences Education. 13 (3), 516-528 (2014).
- Jaswal, S. S., O’Hara, P. B., Williamson, P. L., Springer, A. L. Teaching structure: Student use of software tools for understanding macromolecular structure in an undergraduate biochemistry course: Teaching structure in undergraduate biochemistry. Biochemistry and Molecular Biology Education. 41 (5), 351-359 (2013).
- Tibell, L. A. E., Rundgren, C. -J. Educational challenges of molecular life science: Characteristics and implications for education and research. CBE Life Sciences Education. 9 (1), 25-33 (2010).
- Schönborn, K. J., Anderson, T. R. The importance of visual literacy in the education of biochemists. Biochemistry and Molecular Biology Education. 34 (2), 94-102 (2006).
- Anderson, T. R. Bridging the educational research-teaching practice gap: The importance of bridging the gap between science education research and its application in biochemistry teaching and learning: Barriers and strategies. Biochemistry and Molecular Biology Education. 35 (6), 465-470 (2007).
- Schönborn, K. J., Anderson, T. R. Bridging the educational research-teaching practice gap: Foundations for assessing and developing biochemistry students’ visual literacy. Biochemistry and Molecular Biology Education. 38 (5), 347-354 (2010).
- Bateman, R. C., Craig, P. A. Education corner: A proficiency rubric for biomacromolecular 3D literacy. PDB Newsletter. 45, 5-7 (2010).
- Mnguni, L., Schönborn, K., Anderson, T. Assessment of visualization skills in biochemistry students. South African Journal of Science. 112, 1-8 (2016).
- Craig, P. A., Michel, L. V., Bateman, R. C. A survey of educational uses of molecular visualization freeware. Biochemistry and Molecular Biology Education. 41 (3), 193-205 (2013).
- Loertscher, J., Villafañe, S. M., Lewis, J. E., Minderhout, V. Probing and improving student’s understanding of protein α-Helix structure using targeted assessment and classroom interventions in collaboration with a faculty community of practice. Biochemistry and Molecular Biology Education. 42 (3), 213-223 (2014).
- Abualia, M., et al. Connecting protein structure to intermolecular interactions: A computer modeling laboratory. Journal of Chemical Education. 93 (8), 1353-1363 (2016).
- Carvalho, I., Borges, A. D. L., Bernardes, L. S. C. Medicinal chemistry and molecular modeling: An integration to teach drug structure–activity relationship and the molecular basis of drug action. Journal of Chemical Education. 82 (4), 588 (2005).
- Forbes-Lorman, R. M., et al. Physical models have gender-specific effects on student understanding of protein structure-function relationships. Biochemistry and Molecular Biology Education. 44 (4), 326-335 (2016).
- Terrell, C. R., Listenberger, L. L. Using molecular visualization to explore protein structure and function and enhance student facility with computational tools. Biochemistry and Molecular Biology Education. 45 (4), 318-328 (2017).
- Zhang, S., et al. Structure-based drug design of an inhibitor of the SARS-CoV-2 (COVID-19) main protease using free software: A tutorial for students and scientists. European Journal of Medicinal Chemistry. 113390, (2021).
- Roberts, J. R., Hagedorn, E., Dillenburg, P., Patrick, M., Herman, T. Physical models enhance molecular three-dimensional literacy in an introductory biochemistry course. Biochemistry and Molecular Biology Education. 33 (2), 105-110 (2005).
- Jenkinson, J., McGill, G. Visualizing protein interactions and dynamics: Evolving a visual language for molecular animation. CBE Life Sciences Education. 11 (1), 103-110 (2012).
- Bussey, T. J., Orgill, M. What do biochemistry students pay attention to in external representations of protein translation? The case of the Shine–Dalgarno sequence. Chemistry Education Research and Practice. 16 (4), 714-730 (2015).
- Harle, M., Towns, M. H. Students’ understanding of primary and secondary protein structure: Drawing secondary protein structure reveals student understanding better than simple recognition of structures. Biochemistry and Molecular Biology Education. 41 (6), 369-376 (2013).
- Dries, D. R., et al. An expanded framework for biomolecular visualization in the classroom: Learning goals and competencies. Biochemistry and Molecular Biology Education. 45 (1), 69-75 (2017).
- The BioMolViz Framework. BioMolViz. , Available from: http://biomolviz.org/framework (2021).
- Procko, K., et al. Meeting report: BioMolViz workshops for developing assessments of biomolecular visual literacy. Biochemistry and Molecular Biology Education. 49 (2), 278-286 (2021).
- Jmol: an open-source Java viewer for chemical structures. , Available from: http://www.jmol.org/ (2021).
- Wang, J., et al. iCn3D, a web-based 3D viewer for sharing 1D/2D/3D representations of biomolecular structures. Bioinformatics. 36 (1), 131-135 (2020).
- PyMOL . The PyMOL Molecular Graphics System. Version 2.0. , Schrödinger, LLC. (2021).
- Goddard, T. D., et al. UCSF ChimeraX: Meeting modern challenges in visualization and analysis. Protein Science. 27 (1), 14-25 (2018).
- Pettersen, E. F., et al. UCSF ChimeraX: Structure visualization for researchers, educators, and developers. Protein Science. 30 (1), 70-82 (2021).
- Petit, P., et al. The active conformation of human glucokinase is not altered by allosteric activators. Acta Crystallographica. Section D. 67 (11), 929-935 (2011).
- Corey, R. B., Pauling, L. Molecular models of amino acids, peptides and proteins. Review of Scientific Instruments. 24, 621-627 (1953).
- Koltun, W. L.
- Hodis, E., et al. Proteopedia - a scientific 'wiki' bridging the rift between three-dimensional structure and function of biomacromolecules. Genome Biology. 9 (8), 1-10 (2008).
- Prilusky, J., et al. Proteopedia: A status report on the collaborative, 3D web-encyclopedia of proteins and other biomolecules. Journal of Structural Biology. 175 (2), 244-252 (2011).
- Martz, E. FirstGlance in Jmol. , Available from: https://www.bioinformatics.org/firstglance/fgij/ (2021).
- Jmol User Design Environment (JUDE). MSOE Centerfor BioMolecular Modeling. , Available from: https://cbm.msoe.edu/modelingResources/jmolUserDesignEnvironment/#forward (2021).
- Castro, C. R., et al. A practical guide to teaching with Proteopedia. Biochemistry and Molecular Biology Education. 49 (5), 707-719 (2021).
- Berman, H. M., et al.
- The Protein Data Bank. , Available from: https://www.rcsb.org/ (2021).
- Wang, Y., et al. MMDB: 3D structure data in Entrez. Nucleic Acids Research. 28 (1), 243-245 (2000).
- iCn3D Help Page. , Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/icn3d/docs/icn3d_help.html (2021).
- MSOE Center for BioMolecular Modeling Jmol Training Guide. , Available from: https://cbm.msoe.edu/modelingResources/jmolTrainingGuide/started.html (2021).
- The Online Macromolecular Museum. , Available from: http://earth.callutheran.edu/Academic_Programs/Departments/BioDev/omm/exhibits.htm (2021).
- Jmol/JSmol Interactive Scripting Documentation. , Available from: https://chemapps.stolaf.edu/jmol/docs/ (2021).
- PyMOL Wiki. , Available from: https://pymolwiki.org/index.php/Main_Page (2021).
- PyMOL Advanced Scripting Workshop by Schrödinger. , Available from: https://pymol.org/tutorials/scripting/index.html (2021).
- UCSF ChimeraX User Guide. , Available from: https://www.cgl.ucsf.edu/chimerax/docs/user/index.html (2021).
- UCSF ChimeraX Tutorials. , Available from: https://www.rbvi.ucsf.edu/chimerax/tutorials.html (2021).
- Kuntz, I. D. Structure-based strategies for drug design and discovery. Science. 257 (5073), 1078-1082 (1992).
- Structure-based drug discovery: an overview. Hubbard, R. E. , (2006).
- Patrick, G. L. An introduction to medicinal chemistry, 6th ed. , Oxford University Press. (2017).
- Van Montfort, R. L., Workman, P. Structure-based drug design: aiming for a perfect fit. Essays in Biochemistry. 61 (5), 431-437 (2017).
- Holdgate, G. A., Meek, T. D., Grimley, R. L. Mechanistic enzymology in drug discovery: a fresh perspective. Nature Reviews. Drug Discovery. 17 (2), 115-132 (2018).
- Wang, M. Y., et al. SARS-CoV-2: structure, biology, and structure-based therapeutics development. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, (2020).
- White, B., Kim, S., Sherman, K., Weber, N. Evaluation of molecular visualization software for teaching protein structure differing outcomes from lecture and lab: Differing outcomes from lecture and lab. Biochemistry and Molecular Biology Education. 30 (2), 130-136 (2002).
- Canning, D. R., Cox, J. R. Teaching the structural nature of biological molecules: Molecular visualization in the classroom and in the hands of students. Chemistry Education Research and Practice. 2 (2), 109-122 (2001).
