Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Modellering af et etzymaktivt websted ved hjælp af molekylær visualisering Freeware

Published: December 25, 2021 doi: 10.3791/63170
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 3, 4
1The University of Texas at Austin, 2Mount Mary University, 3College of St. Benedict/St. John’s University, 4Wabash College

Summary

En vigtig færdighed inden for biomolekylær modellering er at vise og kommentere aktive steder i proteiner. Denne teknik demonstreres ved hjælp af fire populære gratis programmer til makromolekylær visualisering: iCn3D, Jmol, PyMOL og UCSF ChimeraX.

Abstract

Biomolekylære visualiseringsfærdigheder er afgørende for at forstå nøglebegreber i de biologiske videnskaber, såsom strukturfunktionsforhold og molekylære interaktioner. Forskellige programmer giver en elev mulighed for at manipulere 3D-strukturer, og biomolekylær modellering fremmer aktiv læring, bygger beregningsmæssige færdigheder og bygger bro mellem todimensionelle lærebogsbilleder og livets tre dimensioner. En kritisk færdighed på dette område er at modellere et proteinaktivt sted, der viser dele af makromolekylet, der kan interagere med et lille molekyle, eller ligand, på en måde, der viser bindende interaktioner. I denne protokol beskriver vi denne proces ved hjælp af fire frit tilgængelige makromolekylære modelleringsprogrammer: iCn3D, Jmol / JSmol, PyMOL og UCSF ChimeraX. Denne vejledning er beregnet til studerende, der søger at lære det grundlæggende i et bestemt program, samt instruktører, der inkorporerer biomolekylær modellering i deres pensum. Protokollen gør det muligt for brugeren at modellere et aktivt websted ved hjælp af et bestemt visualiseringsprogram eller at få et eksempel på flere af de gratis programmer, der er tilgængelige. Den model, der vælges til denne protokol, er human glucokinase, en isoform af enzymet hexokinase, som katalyserer det første trin af glykolyse. Enzymet er bundet til et af dets substrater samt en ikke-reaktiv substrat analog, som gør det muligt for brugeren at analysere interaktioner i det katalytiske kompleks.

Introduction

Forståelse repræsentationer af den molekylære verden er afgørende for at blive ekspert i biomolekylærvidenskaber 1, fordi fortolkningen af sådanne billeder er nøglen til at forstå biologisk funktion2. En elevs introduktion til makromolekyler kommer normalt i form af todimensionelle lærebogsbilleder af cellemembraner, organeller, makromolekyler osv., men den biologiske virkelighed er, at disse er tredimensionelle strukturer, og en forståelse af deres egenskaber kræver måder at visualisere og udtrække mening fra 3D-modeller.

Derfor har udviklingen af biomolekylær billedkendskab i øvre division molekylær life science kurser fået opmærksomhed, med en række artikler, der rapporterer om vigtigheden og vanskelighederne ved at undervise og vurdere visualiseringsfærdigheder1,3,4,5,6,7,8,9 . Reaktionen på disse artikler har været en stigning i antallet af klasseinterventioner, typisk inden for et semester i en enkelt institution, hvor molekylære visualiseringsprogrammer og modeller bruges til at målrette vanskelige begreber2,10,11,12,13,14,15 . Derudover har forskere forsøgt at karakterisere, hvordan eleverne bruger biomolekyllære visualiseringsprogrammer og / eller modeller til at nærme sig et bestemt emne16,17,18,19. Vores egen gruppe, BioMolViz, har beskrevet en ramme, der underopdeler overordnede temaer i visuelle færdigheder i læringsmål og mål til at guide sådanne interventioner20,21, og vi leder workshops, der uddanner fakultetet til at bruge rammen i det bagudrettede design af vurderinger til at måle visuelle færdigheder22.

I centrum for alt dette arbejde er en kritisk færdighed: evnen til at manipulere strukturer af makromolekyler ved hjælp af programmer til biomolekylær visualisering. Disse værktøjer blev udviklet uafhængigt ved hjælp af en række platforme; derfor kan de være ret unikke i deres drift og brug. Dette kræver programspecifikke instruktioner, og identifikationen af et program, som en bruger er fortrolig med, er vigtigt for at lette den fortsatte implementering.

Ud over det grundlæggende i at manipulere strukturer i 3D (roterende, vælge og ændre modellen), et stort mål er at modellere det aktive sted for et protein. Denne proces gør det muligt for en elev at udvikle deres forståelse i tre overordnede temaer beskrevet af BioMolViz Framework: molekylære interaktioner, ligands / modifikationer og strukturfunktionsforhold20,21.

Fire populære valg af programmer til biomolekylær visualisering omfatter: Jmol / JSmol23, iCn3D24, PyMOL25og UCSF Chimera26,27. Vi opfordrer dem, der er nye til Chimera til at bruge UCSF ChimeraX, den næste generation af Chimera molekylær visualisering program, som er den aktuelt understøttede version af programmet.

I denne protokol demonstrerer vi, hvordan du bruger hvert af disse fire programmer til at modellere det aktive sted for human glucokinase med et bundet substrat analogt kompleks (FBF ID: 3FGU) og til at vise målinger for at illustrere specifikke bindende interaktioner28. Modellen repræsenterer et katalytisk kompleks af enzymet. For at fange det aktive sted i prækalysetilstand var en ikke-hydrolyserbar analog af ATP bundet til glucokinaseaktivstedet. Denne fosfoaminofofisk syre-adenylat ester (ANP) indeholder en fosfor-nitrogenbinding i stedet for den sædvanlige fosfor-iltforbindelse på denne position. Det aktive sted indeholder også glukose (betegnet BCG i modellen) og magnesium (betegnet MG). Derudover er der en kaliumion (K) i strukturen, som følge af kaliumchlorid, der anvendes i krystalliseringsopløsningsmidlet. Denne ion er ikke kritisk for biologisk funktion og er placeret uden for det aktive sted.

Figure 1
Figur 1: ATP/ANP-strukturer. Adenosin triphosphat (ATP) struktur i forhold til fosfoaminophosphonic syre-adenylat ester (ANP). Klik her for at se en større version af dette tal.

Protokollen viser udvælgelsen af de bundne ligands af substrat analog kompleks og identifikation af aktiv-site rester inden for 5 Å af det bundne kompleks, som indfanger aminosyrer og vandmolekyler i stand til at gøre relevante molekylære interaktioner, herunder hydrofobiske og van der Waals interaktioner.

Displayet er oprindeligt manipuleret til at vise størstedelen af proteinet i en tegneserie repræsentation, med det aktive sted aminosyre rester i stick repræsentation for at vise de relevante atomer af proteinet og fremhæve de molekylære interaktioner. Efter trin 3 i protokollen for hvert program er disse repræsentationer blevet anvendt, og proteinets syn er ens på tværs af programmer (Figur 2). I slutningen af protokollen er proteintegningen skjult for at forenkle visningen og fokusere på det aktive websted.

Figure 2
Figur 2: Struktursammenligning på tværs af programmer. Sammenligning af strukturen af 3FGU i hvert program efter trinnet Juster repræsentation (trin 2 eller 3 i hver protokol). Klik her for at se en større version af dette tal.

CPK farve påføres det aktive sted aminosyrer og bundne ligands29,30. Dette farveskema skelner atomer af forskellige kemiske elementer i molekylære modeller vist i linje, pind, bold og stok, og plads-påfyldning repræsentationer. Brint er hvid, kvælstof er blå, ilt er rød, svovl er gul, og fosfor er orange i CPK farveskemaet. Traditionelt, sort bruges til kulstof, men i moderne brug, kulstof farve kan variere.

Hydrogenatomer er ikke synlige i krystalstrukturer, selv om hvert af disse programmer er i stand til at forudsige deres placering. Tilføjelse af brintatomer til en stor makromolekylær struktur kan skjule visningen, så de vises ikke i denne protokol. Derfor vil hydrogenbindinger blive vist ved at måle fra midten af to heteroatomer (f.eks. ilt til ilt, ilt til nitrogen) i disse strukturer.

Programoversigter
Grafiske brugergrænseflader, der kan downloades: PyMOL (version 2.4.1), ChimeraX (version 1.2.5) og Jmol (version 1.8.0_301) er GUI-baserede molekylære modelleringsværktøjer. Disse tre grænseflader har kommandolinjer til input indtastet kode. mange af de samme funktioner er tilgængelige via menuer og knapper i GUI. En almindelig funktion i kommandolinjen i disse programmer er, at brugeren kan indlæse og udføre tidligere kommandoer igen ved hjælp af pil op og pil ned på tastaturet.

Webbaserede GUIs: iCn3D (I-see-in-3D) er en WebGL-baseret fremviser til interaktiv visning af tredimensionelle makromolekylære strukturer og kemikalier på internettet uden at skulle installere et separat program. Den bruger ikke en kommandolinje, selvom den fulde webversion indeholder en redigerbar kommandolog. JSmol er en JavaScript eller HTML5 version af Jmol til brug på en hjemmeside eller i en webbrowser vindue, og er meget ens i drift til Jmol. JSmol kan bruges til at oprette online tutorials, herunder animationer.

Proteopedia31,32, FirstGlance i Jmol33og JSmol web interface (JUDE) på Milwaukee School of Engineering Center for BioMolecular Modellering er eksempler på sådanne Jmol-baserede online design miljøer34. Proteopedia wiki er et undervisningsværktøj, der giver brugeren mulighed for at modellere en makromolekylestruktur og oprette sider med disse modeller på hjemmesiden35. Proteopedia scene authoring værktøj, bygget ved hjælp af JSmol, integrerer en GUI med yderligere funktioner, der ikke er tilgængelige i Jmol GUI.

Jmol og iCn3D er baseret på Java programmeringssprog; JSmol bruger enten Java eller HTML5, og PyMOL og ChimeraX er baseret på Python programmeringssproget. Hvert af disse programmer indlæser proteindatabankfiler, som kan downloades fra RCSB Protein Data Bank under en 4-cifret alfanumerisk PDB ID36,37. De mest almindelige filtyper er PDB-filer (Protein Data Bank), der indeholder .pdb udvidelse og den krystallografiske informationsfil (CIF eller MMCIF), der indeholder filtypenavnet .cif. CIF har erstattet FBF som standardfiltype for Protein Data Bank, men begge filformater fungerer i disse programmer. Der kan være små forskelle i den måde, sekvensen / strukturen vises på, når du bruger CIF i modsætning til FBF-filer; Filerne fungerer dog på samme måde, og forskellene vil ikke blive behandlet i detaljer her. Molecular Modeling Database (MMDB), et produkt fra National Center for Biotechnology Information (NCBI), er en delmængde af FBF-strukturer, som kategoriske oplysninger er blevet knyttet til (f.eks. biologiske træk, bevarede proteindomæner)38. iCn3D, et produkt fra NCBI, er i stand til at indlæse FBF-filer, der indeholder MMDB-dataene.

For at få vist en model kan brugeren downloade den ønskede fil fra den dedikerede proteindatabankside til strukturen (f.eks. https://www.rcsb.org/structure/3FGU) og derefter bruge rullemenuen Fil i programmet til at åbne strukturen. Alle programmerne er også i stand til at indlæse en strukturfil direkte gennem grænsefladen, og denne metode er beskrevet i protokollerne.

ChimeraX, Jmol og PyMOL GUIs indeholder hver et eller flere vinduer i konsollen, der kan tilpasses ved at trække i hjørnet. iCn3D og JSmol er helt indeholdt i en webbrowser. Når du bruger iCn3D, skal brugeren muligvis rulle i pop op-vinduerne for at få vist alle menupunkter, afhængigt af skærmstørrelse og opløsning.

Protokollerne detaljeret her giver en enkel metode til at vise det aktive sted for enzymet ved hjælp af hvert program. Det skal bemærkes, at der er flere måder at udføre trinnene i hvert program. I ChimeraX kan den samme opgave f.eks. udføres ved hjælp af rullemenuer, værktøjslinjen øverst eller kommandolinjen. Brugere, der er interesseret i at lære et bestemt program i detaljer, opfordres til at udforske de online tutorials, manualer og Wikis, der er tilgængelige for disse programmer39,40,41,42,43,44,45,46.

Eksisterende manualer og selvstudier til disse programmer præsenterer elementerne i denne protokol som diskrete opgaver. For at vise et aktivt websted skal brugeren syntetisere de nødvendige handlinger fra de forskellige manualer og selvstudier. Dette manuskript øger eksisterende tutorials til rådighed ved at præsentere en lineær protokol til modellering af et mærket aktivt websted med molekylære interaktioner, hvilket giver brugeren en logik for aktiv webstedsmodellering, der kan anvendes på andre modeller og programmer.

Figure 3
Figur 3: ChimeraX GUI. ChimeraX GUI-grænsefladen med rullemenuer, værktøjslinje, strukturfremviser og kommandolinje mærket. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: iCn3D GUI. iCn3D GUI-grænsefladen med rullemenuer, værktøjslinje, strukturfremviser, kommandolog, markering af sæt-pop op-up- og sekvens- og anmærknings-pop op-menuer mærket. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: Jmol GUI. Jmol GUI-grænsefladen med rullemenuer, værktøjslinje, strukturfremviser, pop op-menu og konsol/kommandolinje mærket. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6: PyMOL GUI. PyMOL GUI-grænsefladen med rullemenuer, strukturfremviser, navne/objektpanel, musekontrolelementer og kommandolinje med navnet. Klik her for at se en større version af dette tal.

Protocol

BEMÆRK: Protokollen for hvert program er skitseret i ti overordnede trin, (1) Indlæsning af strukturen i programmet, (2) Identifikation af ligøns på det aktive sted, (3) Justering af repræsentationen, (4) Valg af rester inden for 5 Å for at definere et aktivt sted, (5) Visning af enzymets interaktioner med det aktive sted ligands, (6) Visning af sidekæderne som pinde og visning /justering af det aktive vandmolekyler på stedet (7) Forenkling af strukturen, (8) Mærkning ligands og hydrogen-bonded sidekæder, (9) Lagring af rendering på ethvert tidspunkt at vende tilbage til at arbejde på det eller dele med andre, (10) Lagring af et billede til indlejring eller udskrivning. Trin 1, 4 og 7-10 er identiske for hver protokol. På grund af den unikke funktion af hvert program udføres nogle protokoller dog mere effektivt, når trin 2/3 og 5/6 udskiftes.

1. UCSF ChimeraX-protokollen

BEMÆRK: Pegefelt og musekontrolelementer. Hvis du vil rotere, skal du klikke og trække eller bruge træk med to fingre (mus: venstreklik og træk). Sådan zoomes, klemmes og spredes (Mac) eller styrer + tofingerbevægelse (PC) (mus: rullehjul). Hvis du vil oversætte (dvs. flytte hele strukturen) skal du trykke på indstillingen + klik og træk (Mac) eller skift + klik og træk (pc) (mus: højreklik og træk). Hvis du vil centrere igen, skal du bruge rullemenuerne øverst på grænsefladen til at klikke på Handlinger > Vis.

  1. Indlæser strukturen i ChimeraX: Skriv på kommandolinjen nederst i den GUI, der indledes med "Kommando:":
    åben 3fgu
    BEMÆRK: Når du har indtastet en maskinskrevne linjekommandoer, skal du trykke på Retur på tastaturet for at udføre den.
  2. Identifikation af ligands i det aktive websted: Sørg for, at der er to repræsentationer, en tegneserie bånd og pinde. Brug musen, rotere / zoome proteinet til bedst visualisere ligands vises nær midten af proteinet, som er vist som pinde. Hover over en ligand for at vise sit navn.
  3. Justering af repræsentationen: Brug kommandoerne i undertrinene nedenfor til at omfarve proteinet og liganderne, anvende CPK-farve på ikke-kulstofatomer, og fravælg derefter valget. Udvalgte dele af molekylet bliver fremhævet med grønt.
    1. Brug rullemenuerne øverst på grænsefladen til at ændre farven: Klik på Handlinger > Farve > Kornblomstblå. Klik derefter på Vælg > struktur > Ligand. Hvis du vil vælge farven, skal du klikke på Handlinger > Farve > Grå. Hvis du vil anvende CPK-farve, skal du klikke på Vælg > Alleog derefter klikke på Handlinger > Farve > af heteroatom. Ryd markeringen til sidst ved at klikke på Vælg > Ryd.
      BEMÆRK: Markeringen kan også ryddes ved at trykke på ctrl og klikke i den sorte baggrund af strukturfremviseren eller på kommandolinjen ved at skrive: ~vælg. Som standard vil ChimeraX for de fleste strukturer, der indeholder 1-4 kæder, automatisk vise vandmolekyler og aminosyrerester inden for 3,6 Å af ligands og ioner.
    2. Brug rullemenuen til at skjule de aktuelt viste atomer ved at klikke på Handlinger > Atomer/Obligationer > Skjul.
    3. Brug rullemenuen til at få vist ligands og mg ion på det aktive websted ved at klikke på Vælg > struktur > Ligand. Klik derefter på Handlinger > Atomer/Obligationer > Vis. Klik derefter på Vælg > restkoncentrationer > MGog derefter på Handlinger > Atomer/Obligationer > Vis. Hvis du vil rydde markeringen, skal du klikke på Vælg > Ryd.
      BEMÆRK: Når du har foretaget markeringen med rullemenuen, kan trin 1.3.3 udføres ved at klikke på knapperne Skjul og vis på værktøjslinjen Atomer.
  4. Valg af restprodukter inden for 5 Å for at definere et aktivt sted: I strukturfremviseren skal du vælge ligandspressekontrolelementet + skift og udføre museklik på et enkelt atom eller bånd i hver af de tre ligands, dvs.
    1. Tryk derefter på pil op på tastaturet, indtil alle atomer af de tre ligands er fremhævet med en grøn glød. Definer dette valg til senere brug ved at klikke i rullemenuen Vælg > Definer vælger . Skriv i pop op-menuen:
      ligands for at navngive det aktuelle valg, og klik derefter på OK.
      BEMÆRK: Hvis du klikker for mange gange op i trin 1.4.1, vælges hele proteinet. I så fald skal du klikke på pil ned-knappen, indtil kun atomer af de tre ligands er valgt.
    2. Brug rullemenuen til at vælge resterne inden for 5 Å fra ligands: Klik på Vælg > Zone. I det pop op-vindue, der vises, skal du skifte rullemenuen Vælg til Restprodukterog sikre, at den øverste boks er markeret (markér afstanden mellem mindre end (<) og indstilles til 5,0 Å). Klik derefter på OK. Kun rester, der er mindre end 5 Å væk, vil blive fremhævet.
      BEMÆRK: Trin 1.4-1.4.2 kan forenkles i vid udstrækning ved hjælp af kommandolinjen ved at skrive:
      navn frosne ligands :BGC:MG:ANP
      vælg zone ligands 5 udvide sande rester sandt
  5. Visning af sidekæderne som pinde og visning / justering af de aktive vandmolekyler på stedet: Brug rullemenuen til at vise udvælgelsen og midten og zoome på markeringen ved at klikke på Handlinger > Atomer / Bonds > Vis for at vise dem. Hvis du vil centrere markeringen, skal du klikke på Handlinger > Vis. Klik derefter på Vælg > Ryd eller klik et vilkårligt sted i det tomme område for at rydde markeringen.
  6. Viser enzymets interaktioner med de aktive site ligands: Brug rullemenuerne, og klik på Vælg > brugerdefinerede vælgere > Ligands. Klik derefter på Tools > Structure Analysis > H-obligationer. Kontroller, at Begræns efter markering er markeret i pop op-vinduet , rullemenuen er indstillet til Med mindst én ende markeret, og Vælg atomer er markeret, og klik derefter på OK. Hvis du vil rydde markeringen, skal du klikke på Vælg > Ryd.
    BEMÆRK: Markér feltet Afstandsetiket for at se bindingslængder i Å; Dette gør dog udsigten meget travl. Endelig kan du ændre farven på H-bindingerne ved at klikke på feltet Farve og vælge en ny farve i pop op-vinduet.
  7. Forenkling af strukturen: Brug den øverste tegneserieværktøjslinje til at skjule tegneserien, eller klik på rullemenuen: Handlinger > Cartoon > Skjul.
  8. Mærkning ligands og hydrogen-bonded sidekæder: Brug musen til at vælge rester, der er hydrogen bundet til ligands (forbundet med de stiplede linjer), som i trin 1.4. Klik derefter på Handlinger > > > Rester > Navnekombinationi rullemenuerne. Klik derefter på Vælg > brugerdefinerede vælgere > Ligands. Klik derefter på Handlinger > > Rester > Fra. Ryd markeringen til sidst ved at klikke på Vælg > Ryd.
  9. Gemme gengivelsen på et hvilket som helst tidspunkt for at vende tilbage til arbejdet på den eller dele med andre: Klik på Filer > Gemi rullemenuen. Vælg en placering, angiv et filnavn, og klik på Gem.
    BEMÆRK: Sørg for, at formatet er indstillet til: ChimeraX session *.cxs.
  10. Lagring af et billede til integrering eller udskrivning: Brug først musen til at orientere molekylet efter ønske. Skift baggrundsfarven til hvid ved at skrive på kommandolinjen:
    indstille bgColor hvid
    Til sidst skal du klikke på snapshotikonet på værktøjslinjen. Billedet gemmes på skrivebordet.
    BEMÆRK: Baggrundsfarve er også tilgængelig i rullemenuen. på en Mac skal du klikke på UCSF ChimeraX > præferencer; på en pc skal du klikke på Foretrukne > indstillinger > baggrund.

2. iCn3D-protokol

BEMÆRK: Pegefelt og musekontrolelementer: Hvis du vil rotere, skal du klikke og trække (mus: venstre klik og træk). Hvis du vil zoome, knibe og sprede (mus: rotere rullehjulet). Hvis du vil oversætte (dvs. flytte hele strukturen), skal du klikke og trække med to fingre (mus: højreklik og træk). Hvis du vil centrere igen, skal du holde markøren over Vis i de øverste rullemenuer og derefter klikke på Centervalg.

  1. Indlæser strukturen i iCn3D: Naviger til iCn3D Web-based 3D Structure Viewer, og skriv 3FGU i feltet Input MMDB eller PDB ID for at indlæse filen.
  2. Identifikation af ligands på det aktive websted: Hold markøren over analyse i rullemenuen, og klik derefter på Seq. og Anmærkninger. Sekvenserne, i dette tilfælde proteiner og kemiske/ ioner / vand, er vist i et stablet bord. Rul ned for at se det aktive websted ligands ANP, BGC og Mg opført. I strukturen seeren, svæve over ligands i det aktive websted (vist som pinde i midten af protein tegneserie) for at se deres navne.
  3. Justering af repræsentationen: Der kræves ingen indledende justeringer for denne protokol.
  4. Valg af restprodukter inden for 5 Å for at definere et aktivt sted: Hvis du vil vælge ligands, skal du bruge rullemenuen Vælg og klikke på Vælg på 3D. Sørg for, at restkoncentrationer kontrolleres .
    1. Hvis du vil vælge ligands, skal du holde ALT-knappen nede på en pc eller alternativknappen på en Mac og klikke på den første ligand (f.eks. BCG)ved hjælp af musen eller pegefeltet. Tryk derefter på kontrol og klik på ANP og MG ligands for at føje dem til markeringen.
      BEMÆRK: Liganderne vil blive fremhævet i gult, når de vælges.
    2. Gem dette valg ved hjælp af rullemenuen: Klik på Vælg > Gem markering, og brug tastaturet til at indtaste et navn i pop op-vinduet (f.eks. 3Ligands), og klik derefter på Gem. Pop op-vinduet Vælg sæt vises nu.
      BEMÆRK: Hvis markeringen er forkert, skal du klikke på Vælg > Ryd markering.
    3. Vælg resterne inden for 5 Å fra ligands: Klik på Vælg > Efter afstandi rullemenuen . I den popup-menu, der vises, skal du ændre det andet element (Kugle med en radius) til 5 Å ved at skrive i blokken. Klik på det boxede ord Vis, og luk derefter vinduet ved at klikke på krydstegnet i øverste højre hjørne.
      BEMÆRK: I pop op-menuen, der vises i trin 2.4.3, skal du lade det første sæt med inputtet "markeret" og andet sæt være "ikke-valgt". Bemærk, at atomer/strukturer inden for 5 Å fremhæves med en gul glød, når der klikkes på Display.
    4. Gem det aktive 5 Å-websted ved hjælp af rullemenuen: Hold markøren over Vælg og klik på Gem markering, indtast et navn i pop op-vinduet ved hjælp af tastaturet (f.eks. 5Ang), og klik på Gem.
    5. Opret derefter en ny markering, der kombinerer de to sæt (5Ang og 3Ligands): I genvejsmenuen Vælg sæt skal du holde ctrl nede og klikke på (PC) eller klikke på Kommando (Mac) 5Ang og 3Ligands. Klik på Vælg > Gem markering, brug tastaturet til at skrive et navn (f.eks. 5AFull), og klik derefter på Gem.
  5. Viser enzymets interaktioner med de aktive site ligands såsom hydrogenbindinger: Hover over Analyse i rullemenuen og klik på Interaktioner. Der vises en omfattende pop op-menu med alle ikke-valente interaktioner.
    1. Fjern markeringen af alt undtagen afkrydsningsfelterne "Hydrogen bonds" og "Salt Bridge/Ionic". Klik på 3Ligands for at vælge første sæt og 5Ang for andet sæt. Klik på den boksede tekst, der læser 3D-visningsinteraktioner. Luk vinduet ved at klikke på krydset i øverste højre hjørne.
      BEMÆRK: Kontakt/interaktioner repræsenterer formentlig induceret dipol-induceret dipolinteraktion, hvilket ofte gør displayet travlt. Hvis det ønskes, skal du ændre afstanden for enhver form for interaktion.
    2. Hvis du kun vil have vist brintbindinger, skal du klikke på 5Afull i pop op-vinduet med de udvalgte sæt. Hold derefter markøren over Analyse i rullemenuen, og klik derefter på Chem. Binding > Vis.
  6. Visning af sidekæderne som pinde og visning / justering af de aktive vandmolekyler: Brug den udvalgte sæt pop-up-menu og klik på 5AFull. Klik derefter på Style > Side Chains > Sticki rullemenuerne. For at anvende CPK farve skal du klikke på Color > Atom. Endelig skal du klikke på Style > Water > Spheres (hvis du foretrækker større vandmolekyler).
  7. Forenkling af strukturen: Klik på 5AFulli genvejsmenuen med de udvalgte sæt. Klik derefter på Vis > Vis markering i rullemenuerne (for blot at se bindingswebstedet 5AFull). Klik derefter på Style > Proteins > Stick (for at vise proteinkæden som pind i stedet for bånd).
    1. Hvis du vil farve ligandernes kulstofatomer i en kontrastfarve, skal du klikke på Kemikalier i pop op-vinduet Vælg sæt. Klik derefter på Vis > Vis markeringi rullemenuen . Næste klik på Vælg > Vælg på 3D (sørg for" atom" er kontrolleret). Brug musen og tastaturet til at vælge alle kulstofatomer i BGC og ANP ved hjælp af de kontrolelementer, der er beskrevet i trin 2.4.1. Klik derefter på Farve > Unicolor > Cyan > Cyani rullemenuen.
    2. Hvis du vil gense hele det aktive websted, skal du bruge pop op-vinduet Vælg sæt til at klikke på 5AFull. Klik derefter på Vis > Vis markeringi rullemenuen .
  8. Mærkning ligands og hydrogen-bonded sidekæder: Brug de udvalgte sæt pop-up-vindue til at vælge Interface_all, og klik derefter på Analyse > Label > Per Rest &Numberi rullemenuen.
    BEMÆRK: Du skal vælge Per Rest &nummer igen, hver gang du vil tilføje en etiket, selvom menupunktet allerede vil blive kontrolleret fra en tidligere etiket.
  9. Gemme gengivelsen når som helst for at vende tilbage til arbejdet på den eller dele med andre: Klik på > Del link i rullemenuen. Kopier den korte URL-adresse (f.eks. https://structure.ncbi.nlm.nih.gov/icn3d/share.html?r83NqCz41bu7cmcs8), og indsæt den i en browser.
  10. Gemme et billede til integrering eller udskrivning: Klik på Vælg > Til/fra-fremhævningi rullemenuen. Klik derefter på Typografi > Baggrund > Hvid. Endelig skal du klikke på Fil > Gem filer > iCn3D PNG-billede og vælge den ønskede størrelse.

3. Jmol-protokollen

BEMÆRK: Pegefelt og musekontrolelementer: Hvis du vil rotere, skal du klikke og trække (mus: venstre klik og træk). Sådan zoomer du: Rul lodret ved hjælp af to fingre (mus: skift + venstre klik + træk lodret). Hvis du vil oversætte (dvs. flytte hele strukturen) control + alt + klik og træk (pc), control + option + klik og træk (Mac). Sådan centrer du igen: Skift + dobbeltklik i det tomme rum i strukturfremviservinduet.

  1. Indlæser strukturen i Jmol: Brug rullemenuen øverst i gui'en til at konfigurere arbejdsområdet med strukturen ved at klikke på Fil > Console. Klik derefter på Fil > Hent PDB. Skriv: 3fgu i pop op-vinduet
    Klik derefter på OK.
    BEMÆRK: Alternativt kan du bruge Jmol-konsollen til at indlæse strukturen ved at skrive: belastning = 3fgu
    BEMÆRK: Når du har indtastet en maskinskrevne linjekommandoer, skal du trykke på Retur på tastaturet for at udføre den.
  2. Justering af repræsentationen: Åbn pop op-menuen ved at højreklikke (eller styre + klikke) et vilkårligt sted i vinduet Strukturfremviser.
    1. Hvis du vil ændre proteinet til tegneserierepræsentation, skal du klikke på Vælg > Selection Halosi pop op-menuen . Klik derefter på Vælg > Protein > Alle. Endelig skal du klikke på Style >-skema > Cartoon.
      BEMÆRK: Markeringsglorier placerer en gul kontur (glød) omkring alle de valgte atomer.
    2. Brug den øverste rullemenu til at skjule farvandet ved at klikke på Vis > Vælg > vand. Klik derefter på Vis > Atom > Ingen, og klik til sidst på Vis > Vælg > Ingen.
  3. Identifikation af ligands i det aktive websted: Brug musen til at zoome ind på det aktive websted, og brug derefter kommandoerne i undertrinene til at vise liganderne som pinde.
    BEMÆRK: Ligand-navne vises i Jmol-konsollen, når du indlæser filen. Du kan også få vist bundne ligandnavne ved hjælp af pop op-menuen ved at klikke på Vælg > Hetero > af HETATM.
    1. Hover over ligands med musen for at se deres navne. Det aktive sted er nær midten af strukturen; ligands MG, BGC og ANP er placeret på det aktive sted.
    2. Vælg ligands BCG og ANP: Skriv:
      vælg BGC, ANP
    3. Hvis du vil have vist ligands BCG og ANP som pinde, skal du bruge pop op-menuen og klikke på Style > Scheme > Sticks.
  4. Valg af restprodukter inden for 5 Å for at definere et aktivt sted: Skriv følgende kommando i Jmol-konsollen for at vælge atomer inden for 5 Å af de tre ligands:
    vælge inden for (5, (bgc,anp,mg))
    1. Hvis du vil vælge de fulde aminosyrerester, skal du skrive følgende i konsollen og trykke på Enter
      vælge inden for (gruppe, markeret)
      BEMÆRK: Jmol-konsollen er den bedste måde at vælge resterne inden for 5 Å.
  5. Visning af sidekæder som pinde og visning / justering af de aktive vandmolekyler: Højreklik for at få vist pop op-menuen og svæve over Style > Scheme > Sticks.
    BEMÆRK: Trin 3.5 viser de aktive sidekæder på stedet i stick representation. Der vil stadig være nogle tomme glorier i strukturen, som repræsenterer vandmolekylerne i det aktive sted.
    1. Udfør følgende kommando igen i Jmol-konsollen:
      vælge inden for (5, (bgc,anp,mg))
      BEMÆRK: Hvis du vil udføre en kommando igen, skal du klikke i konsollen og derefter bruge piletasterne på tastaturet, indtil kommandoen vises, og klikke på Enter for at udføre den igen.
    2. For at vise vandmolekyleatomer skal du fjerne liganderne og proteinet fra markeringen ved at skrive følgende to kommandoer:
      vælg fjern gruppeprotein
      vælge fjerne gruppe hetero og ikke vand
    3. Hvis du vil have vist vandmolekylerne, skal du klikke på rullemenuen Vis. Hover over Atom og klik på 20% van der Waals. De grønne Magnesiumioner vil stadig blive vist som pinde. Vis magnesiumionen i den mere almindelige sfærerepræsentation ved at skrive følgende kommandoer i Jmol-konsollen:
      vælg Mg
      spacefill 50%
    4. Omfare liganderne for at skelne dem fra proteinet: Skriv følgende i Jmol-konsollen for at udføre en kommando, der omfarver liganderne i et lysere farveskema:
      vælge (bgc,anp) og kulstof; farve [211.211.211]
      vælg (bgc,anp) og ilt farve [255.185.185]
      vælg (bgc,anp) og kvælstof farve [150.210.255]
      vælg (bgc,anp) og fosfor farve [255.165,75]
      vælg Mg; farve palegreen
  6. Viser enzymets interaktioner med det aktive sted ligands: Udfør hver linje i følgende kommando ved hjælp af Jmol-konsollen:
    definere ligbind (ANP, BGC, MG)
    vælge inden for (5, (bgc,anp,mg))
    vælge fjerne gruppe hetero og ikke vand
    1. Hvis du vil have vist linjer for at illustrere hydrogenbindinger, skal du skrive denne kommando i Jmol-konsollen:
      forbinde 3,3 (ligbind og (ilt eller kvælstof)) (udvalgt og (ilt eller kvælstof)) spankulere gul
      Rediger derefter tykkelsen af linjerne ved at skrive følgende kommando i konsollen:
      vælge alle; 0.1; vælge ingen
  7. Forenkling af strukturen: For at skjule proteinets tegneserie og rydde markeringen skal du skrive i Jmol-konsollen:
    vælge alle; tegneserie af; vælge ingen
  8. Mærkning ligands og hydrogen-bonded side kæder: I pop-up-vinduet, skal du klikke på Indstil picking > Vælg Atom. Klik på et atom i en af de hydrogenbundne rester. Aminosyren og restnumrene vises i konsollen. Brug derefter konsollen til at skrive en etiket, f.eks.:
    etiket Glu-256
  9. Gemme gengivelsen på et hvilket som helst tidspunkt for at vende tilbage til arbejdet på den eller dele med andre: Klik på kameraikonet i den øverste menu. Skriv et filnavn, og vælg en placering, der skal gemmes.
    BEMÆRK: En eksporteret JPEG-fil (.jpg) indeholder oplysninger om både et billede, som det vises i visningsvinduet på eksporttidspunktet, samt modellens aktuelle tilstand. Hvis du vil genindlæse modellen, skal du åbne Jmol og trække den gemte JPEG-fil til Jmol Display Window.
  10. Gemme et billede til integrering eller udskrivning: I Jmol-konsollen skal du omfarve baggrunden til hvid ved at skrive:
    baggrund hvid
    Som i trin 3.9 skal du klikke på kameraikonet og gemme filen.

4. PyMOL-protokollen

BEMÆRK: Pegefelt og musekontrolelementer: Hvis du vil rotere, skal du klikke og trække (mus: venstre klik og træk). Hvis du vil zoome, knibe og sprede (mus: højreklik og træk). Hvis du vil oversætte (dvs. flytte hele strukturen), skal du styre + klikke og trække (mus: kommando + venstre klik og træk). Hvis du vil centrere, skal du gå til højre objektpanel og klikke på A > Orient eller Center.

  1. Indlæser strukturen i PyMOL: Skriv: I kommandolinjen nær toppen af GUI (foran "PyMOL>"), skal du skrive:
    hente 3FGU
    BEMÆRK: Når du har indtastet en maskinskrevne linjekommandoer, skal du trykke på Retur på tastaturet for at udføre den.
  2. Justering af repræsentation: I navne / objekt panel på højre side af PyMOL vinduet, til højre for "3FGU" klik på H > Waters.
  3. Identifikation af ligands på det aktive websted: Tænd først sekvensfremviseren ved at klikke på den øverste rullemenu: Vis > Sekvens.
    1. Rul den grå bjælke til højre, indtil du finder ligandnavnene (BCG, ANP, MG, K).
      BEMÆRK: Der er to repræsentationer, en tegneserie bånd og pinde; liganderne vises som pinde. Sørg for, at valgtilstanden i musekontrolelementerne nederst til højre er indstillet til tilstanden Rest og 3-knap visning ved at klikke på disse navne for at skifte gennem indstillingerne.
    2. Brug musen, rotere og zoome for at gøre ligands synlige.
  4. Valg af restkoncentrationer i 5Å for at definere et aktivt sted: Hvis du vil vælge liganderne på det aktive sted, skal du klikke på hver enkelt (BCG, ANP, MG) i strukturfremviseren. Der vises en ny markering i navne/objektpanelet. til højre for dette nye objekt med navnet "sele", skal du klikke på knappen A og derefter klikke på Omdøb i pop op-menuen.
    BEMÆRK: Hvis du vil rydde en uønsket markering, skal du klikke på det tomme mellemrum i strukturfremviseren for at fravælge.
    1. Hvis du bruger tastaturet, skal du slette bogstaverne "sele", der vises øverst til venstre i strukturfremviservinduet, og skriv i stedet for dem:
      Ligander
      BEMÆRK: Trin 4.4-4.4.1 kan udføres ved hjælp af kommandolinjen. slags:
      sele ligands, resn BGC+ANP+MG
    2. Brug denne markering til at definere området omkring ligands ved først at duplikere det, skal du klikke på ligands > A > Duplicate. Klik derefter på sel01 > A > Rename
      Slet bogstaverne "se101" ved hjælp af tastaturet, og skriv:
      aktiv
    3. Rediger dette valg for at få vist rester inden for 5 Å: Klik på aktive > A > > Udvid > med 5 A, Resternei navne/objektpanelet. Derefter, for at vise disse rester som pinde, skal du klikke på aktive > S > lakrids > Sticks. Klik til sidst i det tomme område i Strukturfremviseren for at rydde markeringen.
      BEMÆRK: Trin 4.4.3 kan udføres ved hjælp af kommandolinjen, skriv:
      sele aktiv, byres alle inden for 5 af ligands
      vise pinde, aktive
  5. Visning af sidekæderne som pinde og visning /justering af de aktive vandmolekyler: I navne / objektpanelet skal du klikke på ligands > A > Duplicate. Hvis du vil omdøbe markeringen, skal du klikke på Sel02 > A > Rename Selection. Slet bogstaverne i omdøbningsmenuen, der vises øverst til højre i strukturfremviseren, og skriv:
    active_water
    1. For at justere det nye valg til at indeholde aktive vandmolekyler på stedet skal du klikke på active_water > A > Ændre > Omkring > Atomer inden for 4 Angstroms. For at ændre dette yderligere og begrænse til vandmolekyler skal du klikke på active_water > A > > Begræns > til opløsningsmiddel. Endelig skal du klikke på active_water > A > Preset > Ball and Stick.
      BEMÆRK: GUI tillader udvælgelse inden for 4 Å; linjekommandoer tillader valg af en mere passende afstand på 3,3 Å for hydrogenbinding vandmolekyler. Van der Waals radii af kuglerne kan ikke indstilles i GUI, men "bold og stok" udvælgelse er tæt på 0,5 Å.
      BEMÆRK: Trin 4.5-4.5.1 kan udføres ved hjælp af kommandolinjen ved at skrive hver linje i følgende kode:
      vælge active_water(ligands)omkring 3,3) og (resn HOH)
      vise kugler, active_water
      alter active_water, vdw=0,5
      Genopbygge
  6. Viser enzymets interaktioner med det aktive sted ligands. Zoom ind på det aktive websted ved at klikke på aktiv > A > Zoom. For at finde de polare kontakter mellem ligands og aktive site, skal du klikke på ligands > A > Find > Polar Kontakter > til eventuelle atomer. Vis afstande som etiketter ved at klikke på ligands_polar_contacts > S > Etiketter.
  7. Forenkling af strukturen: Skjul tegneserien af proteinet, som skjuler den del af proteinet, der ikke er på det aktive sted, ved at klikke på 3FGU > H > Cartoon i navne / objektpanelet. Derefter skal du skjule etiketterne på brintbindingslængden ved at klikke på ligands_polar_contacts > H > Etiketter i navne/objektpanelet.
    1. For at farve ligands at skelne dem fra proteinet, skal du klikke på ligands > C > By Element > CHNOS og vælge den mulighed, hvor "C" er cyan (en lyseblå).
      BEMÆRK: Trin 4.7.1 kan udføres ved hjælp af kommandolinjen. Slags:
      farvecyanid, ligands
      farve atomare, ligands &!elem C
  8. Mærkning ligands og hydrogen-bonded side kæder: I navne / objekt panel, på knapperne til højre for ethvert objekt navn, skal du klikke på aktive > L > Rester.
  9. Gemme gengivelsen på et hvilket som helst tidspunkt for at vende tilbage til arbejdet på den eller dele med andre: Klik på Filer > Gem session somi rullemenuen. Vælg derefter en placering i pop op-vinduet, skriv et filnavn, og klik på Gem.
  10. Gemme et billede til integrering eller udskrivning: Først skal du ændre baggrunden til hvid i rullemenuen ved at klikke på Vis > Baggrund > Hvid. Eksporter billedet som en ny fil ved at klikke på Filer > Eksporter billede som > PNG.

Representative Results

En vellykket udført protokol for hvert af programmerne vil resultere i en molekylær model zoomet ind på det aktive sted, med aktive site rester og ligands vist som pinde, protein tegneserie skjult, og ligands vises med en kontrasterende farveskema. Interagerende aminosyrerester skal mærkes med deres identifikatorer og hydrogenbinding og ioniske interaktioner vist med linjer. Tilstedeværelsen af disse funktioner kan bestemmes ved visuel inspektion af modellen.

For at lette denne inspektion og gøre det muligt for brugeren at afgøre, om de har udført protokollens trin korrekt, har vi leveret animerede figurer, der præsenterer et billede af strukturen efter hvert trin. For ChimeraX, iCn3D, Jmol og PyMOL illustreres dette i henholdsvis figur 7-10.

Figur 7: ChimeraX protokoloutput. Animeret figur, der illustrerer trin 1.1-1.8 i ChimeraX-protokollen. Klik her for at downloade dette tal.

Figur 8: iCn3D-protokoloutput. Animeret figur, der illustrerer trin 2.1-2.8 i iCn3D-protokollen. Klik her for at downloade dette tal.

Figur 9: Jmol protokol output. Animeret figur, der illustrerer trin 3.1-3.8 i Jmol-protokollen. Klik her for at downloade dette tal.

Figur 10: PyMOL-protokoloutput. Animeret figur, der illustrerer trin 4.1-4.8 i PyMOL-protokollen. Klik her for at downloade dette tal.

Den mest almindelige fejl, der kan påvirke resultatet af disse protokoller, er fejlagtig udvælgelse, hvilket resulterer i, at en del af strukturen vises i en uønsket gengivelse. Dette skyldes typisk, at du ikke har klikket forkert, enten på selve strukturen eller i en af visningsmenuknapperne. Et eksempel på et suboptimalt resultat ville være en model, der indeholder rester uden for det aktive sted, der vises som pinde. Brugeren kan begynde at analysere, om denne fejl er opstået ved visuelt at inspicere de rester, der vises som pinde og sikre, at de er i nærheden af det aktive sted ligands. En avanceret metode til at vurdere, om de viste rester er inden for 5Å af det aktive sted ligands er at bruge de indbygget måleværktøjer i hvert program til at måle afstanden mellem en nærliggende ligand og den aktive rest af anlægget. Måleværktøjerne ligger uden for dette manuskripts anvendelsesområde. Vi opfordrer dog interesserede brugere til at udforske de mange online tutorials, der beskriver denne type analyse.

Vi præsenterer et specifikt eksempel på en suboptimal udførelse af denne protokol, som følge af et forkert klik på navne / objekter panelet i PyMOL. Denne fejl viser hele proteinet som pinde, snarere end kun at vise det aktive websted ved hjælp af denne repræsentation, som illustreret i figur 11.

Figure 11
Figur 11: Negativt resultat. Eksempel på et negativt resultat. Forkert valg af den fulde tegneserie i PyMOL og visning af pinde. Klik her for at se en større version af dette tal.

For at foretage fejlfinding skal brugeren skjule pindene for hele modellen (mærket 3FGU i navne / objektpanelet) og derefter vise stokrepræsentationen for kun markeringen med navnet "aktiv" ved hjælp af skjul og vis knapper / kommandoer i PyMOL. Gendannelse af modellen fra denne type fejl er relativt ligetil, når brugeren er i stand til at oprette passende valg til forskellige dele af modellen og vise og skjule dem effektivt. Det er fristende at genstarte protokollen og arbejde gennem trinene en anden gang; Vi opfordrer dog brugeren til ikke at være bange for at gå "off script" og eksperimentere med modellen. Det er vores erfaring, at arbejde gennem displayfejl letter fremskridt med at forstå modelleringsprogrammet.

En side om side-visning af det endelige output fra en protokol, der udføres korrekt for hvert program, vises i figur 12. Visningerne er orienteret på samme måde, så brugeren kan sammenligne udseendet af de modeller, der er oprettet i forskellige programmer.

Figure 12
Figur 12: Endelig struktursammenligning på tværs af programmer. Sammenligning af strukturen af hver aktiv gengivelse af websteder i slutningen af protokollen. A: ChimeraX, B: iCn3D, C: Jmol, D: PyMOL. PyMOL's aktive site label omfatter alle aktive rester af stedet og liganderne. De andre udgange har kun hydrogenbundne sidekæder mærket. Klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Denne protokol skitserer en ti-trins proces til modellering af et enzym aktivt sted, der anvendes til fire populære programmer for biomolekylær modellering. De kritiske trin i protokollen er: identifikation af liganderne på det aktive sted, valg af rester inden for 5 Å for at definere et aktivt sted og vise enzymets interaktioner med det aktive sted ligands. At skelne mellem ligands, der er relevante for den biologiske funktion, er altafgørende, da dette giver brugeren mulighed for at definere aminosyrerester inden for 5 Å, der kan spille en rolle i bindingen af liganderne. Endelig ved hjælp af programmet til at vise molekylære interaktioner giver brugeren mulighed for at udvikle de færdigheder, der er nødvendige for at forstå de molekylære interaktioner, der fremmer binding.

En begrænsning af computerbaserede molekylær modellering protokoller er afhængigheden af specifikke kommandoer og syntaks. Mens biokemiske protokoller kan være tolerante over for små ændringer i proceduren, computer-baserede undersøgelser kan give vildt forskellige endelige produkter, hvis proceduren ikke er nøje overholdt. Dette er især vigtigt, når du bruger kommandolinjegrænseflader, hvor programspecifik syntaks er påkrævet for at opnå et bestemt output, og en tilsyneladende ubetydelig ændring i tegnsætning eller store bogstaver kan medføre, at en kommando mislykkes. Der er forskellige Wikis og manualer til hvert program, hvor en bruger kan finde og foretage fejlfinding af kommandolinjeinput. brugeren skal være opmærksom på detaljerne i kommandosyntaksen. Selvom de fleste molekylære visualiseringsprogrammer indeholder fortrydelseskommandoer på grund af grænsefladernes kompleksitet, vender kommandoen undo ikke altid korrekt det sidste udførte trin. Derfor opfordres der ofte til at redde den nuværende arbejdstilstand, især for nye brugere.

Yderligere begrænsninger kan opstå fra de data, der bruges til at oprette selve modellen. Mens de standarder, der er forbundet med Protein Data Bank sikre en vis grad af konsistens, brugere af molekylære visualisering programmer vil ofte støde på uventede virkninger i en protein rendering. For det første bestemmes de fleste strukturer ved hjælp af røntgenkrystallografi, som giver en enkelt model af proteinet; NMR-strukturer består dog ofte af flere modeller, der kan visualiseres en ad gangen. For det andet kan strukturer bestemt ud fra krystallografi eller kryogene elektronmikroskopiforsøg indeholde atomer, hvis position ikke kan belyses og fremstå som huller i visse repræsentationer af proteinet. Proteinstrukturer kan have alternative konformationer af sidekæder, som, når de vises i stick rendering, vises som to grupper, der stikker ud af den samme aminosyre rygrad. Selv korte dele af rygraden kan have sådanne alternative kropsbygninger, og nogle gange er ligands overlejret i det aktive sted i mere end én bindende kropsbygning.

For en krystalstruktur omfatter de deponerede 3D-koordinater alle komponenter i den asymmetriske enhed, som giver nok information til at reproducere den gentagne enhed af en proteinkrystal. Nogle gange vil denne struktur indeholde yderligere proteinkæder sammenlignet med proteinets biologisk aktive form (f.eks. fosterhæmoglobinmutation, FBF ID: 4MQK). Omvendt indlæses nogle programmer muligvis ikke automatisk alle kæder i den biologisk aktive enhed. For eksempel indlæser SARS-CoV2-hovedprotease (FBF ID: 6Y2E) halvdelen af den biologisk aktive dimer (bestående af to proteinkæder), når den hentes ved hjælp af de kommandoer, der er beskrevet i denne protokol i ChimeraX, PyMOL og Jmol. Selvom lille ændring af kommandoen vil indlæse den biologisk aktive dimer, kan denne overvejelse ikke være ligetil for novice modellering program bruger. Et andet problem, der kan opstå, er identifikationen af det aktive sted eller substrat selv. Krystallografiske eksperimenter udføres ved hjælp af en række molekyler, som kan modelleres i den endelige struktur. For eksempel kan sulfatmolekyler binde fosfatbindingssteder på det aktive sted, eller de kan binde andre regioner, der ikke er relevante for mekanismen. Disse molekyler kan skjule den korrekte identifikation af selve det aktive sted og kan endda foreslå den studerende, at de er en del af mekanismen.

Formentlig vil brugeren ønsker at anvende denne procedure på andre aktive / bindende websteder. For at anvende denne protokol i det fremtidige arbejde, der involverer analyse af nye proteinaktive steder, skal brugeren identificere, hvilke af de bundne ligands der er relevante for at fungere. Nogle ligands er ikke forbundet med proteinfunktion, og i stedet er et resultat af opløsningsmiddel eller krystallisering betingelser, der anvendes til at gennemføre eksperimentet (f.eks kalium ion til stede i 3FGU model). De vigtigste ligands bør identificeres ved at konsultere det originale manuskript. Med praksis og, hvor det er relevant, en forståelse af linjekommandosyntaksen, vil en bruger være i stand til at anvende protokollen for det ønskede modelleringsprogram på ethvert enzymaktivt sted og modellere andre makromolekyler efter eget valg.

Identificering og analyse af bundne substrater og ligands er centralt for belysningen af molekylære mekanismer og strukturbaserede lægemiddeldesignindsatser, som direkte har ført til forbedringer i behandlinger for sygdom, herunder erhvervet immundefektsyndrom (AIDS) og COVID-1947,48,49,50,51,52 . Mens individuelle molekylære visualiseringsprogrammer tilbyder forskellige grænseflader og brugeroplevelser, tilbyder de fleste sammenlignelige funktioner. Det er vigtigt for udviklingen af biomolekylær visualisering færdigheder, at øverste niveau biokemi studerende bliver fortrolige med struktur visualisering og værktøjerne til at generere sådanne billeder4,20,53. Dette giver eleverne mulighed for at bevæge sig ud over fortolkningen af todimensionelle billeder i lærebøger og tidsskriftsartikler og lettere at udvikle deres egne hypoteser fra strukturelle data54, som vil forberede udviklingsforskere til at løse fremtidige folkesundhedsproblemer og forbedre forståelsen af biokemiske processer.

Sammenfattende beskriver denne protokol aktiv webstedsmodellering ved hjælp af fire førende gratis makromolekylære modelleringsprogrammer. Vores samfund, BioMolViz, vedtager en ikke-softwarespecifik tilgang til biomolekylær modellering. Vi specifikt undgået en kritik eller sammenligning af programfunktioner, selv om en bruger prøveudtagning hvert program vil sandsynligvis opdage, at de foretrækker visse aspekter af makromoekylær modellering i et program versus en anden. Vi inviterer læserne til at bruge BioMolViz Framework, som beskriver de biomolekyliske visualiseringsbaserede læringsmål og mål, der er målrettet i denne protokol, og udforske ressourcer til undervisning og læring af biomolekylær visualisering gennem BioMolViz-fællesskabswebstedet på http://biomolviz.org.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen relevante eller væsentlige økonomiske interesser, der vedrører den forskning, der er beskrevet i dette papir.

Acknowledgments

Finansieringen af dette arbejde er blevet ydet af National Science Foundation:

Forbedring af bachelor STEM Education Grant (Award #1712268)

Forskning Koordinering Networks i Bachelor i Bachelor Biologi Education (Award # 1920270)

Vi er karsten Theis, ph.d., Westfield University, taknemmelige for nyttige diskussioner om Jmol.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ChimeraX (Version 1.2.5) https://www.rbvi.ucsf.edu/chimerax/
Computer Any
iCn3D (web-based only: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/icn3d/full.html)
Java (for Jmol) https://java.com/en/download/
Jmol (Version 1.8.0_301) http://jmol.sourceforge.net/
Mouse (optional) Any
PyMOL (Version 2.4.1 - educational): https://pymol.org/2 educational use only version: https://pymol.org/edu/?q=educational

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Loertscher, J., Green, D., Lewis, J. E., Lin, S., Minderhout, V. Identification of threshold concepts for biochemistry. CBE Life Sciences Education. 13 (3), 516-528 (2014).
  2. Jaswal, S. S., O’Hara, P. B., Williamson, P. L., Springer, A. L. Teaching structure: Student use of software tools for understanding macromolecular structure in an undergraduate biochemistry course: Teaching structure in undergraduate biochemistry. Biochemistry and Molecular Biology Education. 41 (5), 351-359 (2013).
  3. Tibell, L. A. E., Rundgren, C. -J. Educational challenges of molecular life science: Characteristics and implications for education and research. CBE Life Sciences Education. 9 (1), 25-33 (2010).
  4. Schönborn, K. J., Anderson, T. R. The importance of visual literacy in the education of biochemists. Biochemistry and Molecular Biology Education. 34 (2), 94-102 (2006).
  5. Anderson, T. R. Bridging the educational research-teaching practice gap: The importance of bridging the gap between science education research and its application in biochemistry teaching and learning: Barriers and strategies. Biochemistry and Molecular Biology Education. 35 (6), 465-470 (2007).
  6. Schönborn, K. J., Anderson, T. R. Bridging the educational research-teaching practice gap: Foundations for assessing and developing biochemistry students’ visual literacy. Biochemistry and Molecular Biology Education. 38 (5), 347-354 (2010).
  7. Bateman, R. C., Craig, P. A. Education corner: A proficiency rubric for biomacromolecular 3D literacy. PDB Newsletter. 45, 5-7 (2010).
  8. Mnguni, L., Schönborn, K., Anderson, T. Assessment of visualization skills in biochemistry students. South African Journal of Science. 112, 1-8 (2016).
  9. Craig, P. A., Michel, L. V., Bateman, R. C. A survey of educational uses of molecular visualization freeware. Biochemistry and Molecular Biology Education. 41 (3), 193-205 (2013).
  10. Loertscher, J., Villafañe, S. M., Lewis, J. E., Minderhout, V. Probing and improving student’s understanding of protein α-Helix structure using targeted assessment and classroom interventions in collaboration with a faculty community of practice. Biochemistry and Molecular Biology Education. 42 (3), 213-223 (2014).
  11. Abualia, M., et al. Connecting protein structure to intermolecular interactions: A computer modeling laboratory. Journal of Chemical Education. 93 (8), 1353-1363 (2016).
  12. Carvalho, I., Borges, A. D. L., Bernardes, L. S. C. Medicinal chemistry and molecular modeling: An integration to teach drug structure–activity relationship and the molecular basis of drug action. Journal of Chemical Education. 82 (4), 588 (2005).
  13. Forbes-Lorman, R. M., et al. Physical models have gender-specific effects on student understanding of protein structure-function relationships. Biochemistry and Molecular Biology Education. 44 (4), 326-335 (2016).
  14. Terrell, C. R., Listenberger, L. L. Using molecular visualization to explore protein structure and function and enhance student facility with computational tools. Biochemistry and Molecular Biology Education. 45 (4), 318-328 (2017).
  15. Zhang, S., et al. Structure-based drug design of an inhibitor of the SARS-CoV-2 (COVID-19) main protease using free software: A tutorial for students and scientists. European Journal of Medicinal Chemistry. 113390, (2021).
  16. Roberts, J. R., Hagedorn, E., Dillenburg, P., Patrick, M., Herman, T. Physical models enhance molecular three-dimensional literacy in an introductory biochemistry course. Biochemistry and Molecular Biology Education. 33 (2), 105-110 (2005).
  17. Jenkinson, J., McGill, G. Visualizing protein interactions and dynamics: Evolving a visual language for molecular animation. CBE Life Sciences Education. 11 (1), 103-110 (2012).
  18. Bussey, T. J., Orgill, M. What do biochemistry students pay attention to in external representations of protein translation? The case of the Shine–Dalgarno sequence. Chemistry Education Research and Practice. 16 (4), 714-730 (2015).
  19. Harle, M., Towns, M. H. Students’ understanding of primary and secondary protein structure: Drawing secondary protein structure reveals student understanding better than simple recognition of structures. Biochemistry and Molecular Biology Education. 41 (6), 369-376 (2013).
  20. Dries, D. R., et al. An expanded framework for biomolecular visualization in the classroom: Learning goals and competencies. Biochemistry and Molecular Biology Education. 45 (1), 69-75 (2017).
  21. The BioMolViz Framework. BioMolViz. , Available from: http://biomolviz.org/framework (2021).
  22. Procko, K., et al. Meeting report: BioMolViz workshops for developing assessments of biomolecular visual literacy. Biochemistry and Molecular Biology Education. 49 (2), 278-286 (2021).
  23. Jmol: an open-source Java viewer for chemical structures. , Available from: http://www.jmol.org/ (2021).
  24. Wang, J., et al. iCn3D, a web-based 3D viewer for sharing 1D/2D/3D representations of biomolecular structures. Bioinformatics. 36 (1), 131-135 (2020).
  25. PyMOL . The PyMOL Molecular Graphics System. Version 2.0. , Schrödinger, LLC. (2021).
  26. Goddard, T. D., et al. UCSF ChimeraX: Meeting modern challenges in visualization and analysis. Protein Science. 27 (1), 14-25 (2018).
  27. Pettersen, E. F., et al. UCSF ChimeraX: Structure visualization for researchers, educators, and developers. Protein Science. 30 (1), 70-82 (2021).
  28. Petit, P., et al. The active conformation of human glucokinase is not altered by allosteric activators. Acta Crystallographica. Section D. 67 (11), 929-935 (2011).
  29. Corey, R. B., Pauling, L. Molecular models of amino acids, peptides and proteins. Review of Scientific Instruments. 24, 621-627 (1953).
  30. Koltun, W. L. Precision space-filling atomic models. Biopolymers. 3 (6), 665-679 (1965).
  31. Hodis, E., et al. Proteopedia - a scientific 'wiki' bridging the rift between three-dimensional structure and function of biomacromolecules. Genome Biology. 9 (8), 1-10 (2008).
  32. Prilusky, J., et al. Proteopedia: A status report on the collaborative, 3D web-encyclopedia of proteins and other biomolecules. Journal of Structural Biology. 175 (2), 244-252 (2011).
  33. Martz, E. FirstGlance in Jmol. , Available from: https://www.bioinformatics.org/firstglance/fgij/ (2021).
  34. Jmol User Design Environment (JUDE). MSOE Centerfor BioMolecular Modeling. , Available from: https://cbm.msoe.edu/modelingResources/jmolUserDesignEnvironment/#forward (2021).
  35. Castro, C. R., et al. A practical guide to teaching with Proteopedia. Biochemistry and Molecular Biology Education. 49 (5), 707-719 (2021).
  36. Berman, H. M., et al. The protein data bank. Nucleic Acids Research. 28, 235-242 (2000).
  37. The Protein Data Bank. , Available from: https://www.rcsb.org/ (2021).
  38. Wang, Y., et al. MMDB: 3D structure data in Entrez. Nucleic Acids Research. 28 (1), 243-245 (2000).
  39. iCn3D Help Page. , Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/icn3d/docs/icn3d_help.html (2021).
  40. MSOE Center for BioMolecular Modeling Jmol Training Guide. , Available from: https://cbm.msoe.edu/modelingResources/jmolTrainingGuide/started.html (2021).
  41. The Online Macromolecular Museum. , Available from: http://earth.callutheran.edu/Academic_Programs/Departments/BioDev/omm/exhibits.htm (2021).
  42. Jmol/JSmol Interactive Scripting Documentation. , Available from: https://chemapps.stolaf.edu/jmol/docs/ (2021).
  43. PyMOL Wiki. , Available from: https://pymolwiki.org/index.php/Main_Page (2021).
  44. PyMOL Advanced Scripting Workshop by Schrödinger. , Available from: https://pymol.org/tutorials/scripting/index.html (2021).
  45. UCSF ChimeraX User Guide. , Available from: https://www.cgl.ucsf.edu/chimerax/docs/user/index.html (2021).
  46. UCSF ChimeraX Tutorials. , Available from: https://www.rbvi.ucsf.edu/chimerax/tutorials.html (2021).
  47. Kuntz, I. D. Structure-based strategies for drug design and discovery. Science. 257 (5073), 1078-1082 (1992).
  48. Structure-based drug discovery: an overview. Hubbard, R. E. , (2006).
  49. Patrick, G. L. An introduction to medicinal chemistry, 6th ed. , Oxford University Press. (2017).
  50. Van Montfort, R. L., Workman, P. Structure-based drug design: aiming for a perfect fit. Essays in Biochemistry. 61 (5), 431-437 (2017).
  51. Holdgate, G. A., Meek, T. D., Grimley, R. L. Mechanistic enzymology in drug discovery: a fresh perspective. Nature Reviews. Drug Discovery. 17 (2), 115-132 (2018).
  52. Wang, M. Y., et al. SARS-CoV-2: structure, biology, and structure-based therapeutics development. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, (2020).
  53. White, B., Kim, S., Sherman, K., Weber, N. Evaluation of molecular visualization software for teaching protein structure differing outcomes from lecture and lab: Differing outcomes from lecture and lab. Biochemistry and Molecular Biology Education. 30 (2), 130-136 (2002).
  54. Canning, D. R., Cox, J. R. Teaching the structural nature of biological molecules: Molecular visualization in the classroom and in the hands of students. Chemistry Education Research and Practice. 2 (2), 109-122 (2001).

Tags

Biokemi udgave 178
Modellering af et etzymaktivt websted ved hjælp af molekylær visualisering Freeware
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Procko, K., Bakheet, S., Beckham, J. … More

Procko, K., Bakheet, S., Beckham, J. T., Franzen, M. A., Jakubowski, H., Novak, W. R. P. Modeling an Enzyme Active Site using Molecular Visualization Freeware. J. Vis. Exp. (178), e63170, doi:10.3791/63170 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter