Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Modellering av et enzymaktivt nettsted ved hjelp av molekylær visualisering Freeware

Published: December 25, 2021 doi: 10.3791/63170
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 3, 4
1The University of Texas at Austin, 2Mount Mary University, 3College of St. Benedict/St. John’s University, 4Wabash College

Summary

En viktig ferdighet i biomolekylær modellering er å vise og kommentere aktive steder i proteiner. Denne teknikken er demonstrert ved hjelp av fire populære gratis programmer for makromolekylær visualisering: iCn3D, Jmol, PyMOL og UCSF ChimeraX.

Abstract

Biomolekylære visualiseringsferdigheter er avgjørende for å forstå sentrale begreper i biovitenskapene, som strukturfunksjonsrelasjoner og molekylære interaksjoner. Ulike programmer gjør det mulig for en elev å manipulere 3D-strukturer, og biomolekylær modellering fremmer aktiv læring, bygger beregningsferdigheter og bygger bro mellom todimensjonale lærebokbilder og de tre dimensjonene i livet. En kritisk ferdighet på dette området er å modellere et proteinaktivt sted, som viser deler av makromolekylet som kan samhandle med et lite molekyl, eller ligand, på en måte som viser bindende interaksjoner. I denne protokollen beskriver vi denne prosessen ved hjelp av fire fritt tilgjengelige makromolekylære modelleringsprogrammer: iCn3D, Jmol/JSmol, PyMOL og UCSF ChimeraX. Denne veiledningen er ment for studenter som ønsker å lære det grunnleggende om et bestemt program, samt instruktører som inkorporerer biomolekylær modellering i læreplanen. Protokollen gjør det mulig for brukeren å modellere et aktivt område ved hjelp av et bestemt visualiseringsprogram, eller å prøve flere av de tilgjengelige gratisprogrammene. Modellen som er valgt for denne protokollen er menneskelig glukokinase, en isoform av enzymet hexokinase, som katalyserer det første trinnet i glykolyse. Enzymet er bundet til et av sine substrater, samt en ikke-reaktiv substratanalog, som gjør det mulig for brukeren å analysere interaksjoner i det katalytiske komplekset.

Introduction

Forstå representasjoner av den molekylære verden er avgjørende for å bli ekspert på biomolekylære vitenskaper1, fordi tolkningen av slike bilder er nøkkelen til å forstå biologisk funksjon2. En elevs introduksjon til makromolekyler kommer vanligvis i form av todimensjonale lærebokbilder av cellemembraner, organeller, makromolekyler, etc., men den biologiske virkeligheten er at disse er tredimensjonale strukturer, og en forståelse av deres egenskaper krever måter å visualisere og trekke ut mening fra 3D-modeller.

Følgelig har utviklingen av biomolekylær visuell leseferdighet i øvre divisjon molekylære livsvitenskapelige kurs fått oppmerksomhet, med en rekke artikler som rapporterer om betydningen og vanskelighetene ved undervisning og vurdering av visualiseringsferdigheter1,3,4,5,6,7,8,9 . Responsen på disse artiklene har vært en økning i antall klasseromsintervensjoner, vanligvis innen et semester i en enkelt institusjon, hvor molekylære visualiseringsprogrammer og modeller brukes til å målrette vanskelige konsepter2,10,11,12,13,14,15 . I tillegg har forskere forsøkt å karakterisere hvordan studentene bruker biomolekylære visualiseringsprogrammer og/eller modeller for å nærme seg et bestemt tema16,17,18,19. Vår egen gruppe, BioMolViz, har beskrevet et rammeverk som deler overordnede temaer innen visuell leseferdighet inn i læringsmål og mål for å veilede slike intervensjoner20,21, og vi leder workshops som trener fakultetet til å bruke rammeverket i baklengs design av vurderinger for å måle visuelle leseferdigheter22.

I sentrum av alt dette arbeidet er en kritisk ferdighet: evnen til å manipulere strukturer av makromolekyler ved hjelp av programmer for biomolekylær visualisering. Disse verktøyene ble utviklet uavhengig ved hjelp av en rekke plattformer; Derfor kan de være ganske unike i drift og bruk. Dette krever programspesifikke instruksjoner, og identifisering av et program som en bruker er komfortabel med, er viktig for å lette fortsatt implementering.

Utover det grunnleggende om å manipulere strukturer i 3D (rotere, velge og endre modellen), er et hovedmål å modellere det aktive stedet for et protein. Denne prosessen gjør det mulig for en elev å utvikle sin forståelse i tre overordnede temaer beskrevet av BioMolViz Framework: molekylære interaksjoner, ligander / modifikasjoner og strukturfunksjonsrelasjoner20,21.

Fire populære valg av programmer for biomolekylær visualisering inkluderer: Jmol/JSmol23, iCn3D24, PyMOL25og UCSF Chimera26,27. Vi oppfordrer de som er nye i Chimera til å bruke UCSF ChimeraX, neste generasjon av Chimera molekylær visualiseringsprogram, som er den støttede versjonen av programmet.

I denne protokollen demonstrerer vi hvordan du bruker hvert av disse fire programmene til å modellere det aktive stedet for human glukokinase med et bundet substratanalogkompleks (PDB ID: 3FGU), og for å vise målinger for å illustrere spesifikke bindende interaksjoner28. Modellen representerer et katalytisk kompleks av enzymet. For å fange det aktive stedet i pre-katalysetilstanden, var en ikke-hydrolyserbar analog av ATP bundet til glukokinase aktivt sted. Denne fosfoaminofosfonsyre-adenylat ester (ANP) inneholder en fosfor-nitrogenbinding i stedet for den vanlige fosfor-oksygenkoblingen i denne posisjonen. Det aktive stedet inneholder også glukose (betegnet BCG i modellen) og magnesium (betegnet MG). I tillegg er det en kaliumion (K) i strukturen, som følge av kaliumklorid som brukes i krystalliseringsløsningsmidlet. Denne ionen er ikke kritisk for biologisk funksjon og befinner seg utenfor det aktive stedet.

Figure 1
Figur 1: ATP/ANP-strukturer. Adenosin tripfosfat (ATP) struktur sammenlignet med fosfoaminofosfoninsyre-adenylat ester (ANP). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Protokollen demonstrerer valg av de bundne ligandene til substratanalogkomplekset og identifisering av aktive rester innen 5 Å av det bundne komplekset, som fanger aminosyrer og vannmolekyler som er i stand til å gjøre relevante molekylære interaksjoner, inkludert hydrofobe og van der Waals interaksjoner.

Displayet er i utgangspunktet manipulert for å vise mesteparten av proteinet i en tegneserierepresentasjon, med det aktive nettstedet aminosyrerester i pinnerepresentasjon for å vise de relevante atomene av proteinet og markere molekylære interaksjoner. Etter trinn 3 i protokollen for hvert program er disse representasjonene brukt, og visningen av proteinet er lik på tvers av programmer (figur 2). På slutten av protokollen er proteintegningen skjult for å forenkle utsikten, og fokusere på det aktive nettstedet.

Figure 2
Figur 2: Strukturer sammenligning på tvers av programmer. Sammenligning av strukturen til 3FGU i hvert program ved å følge juster representasjonstrinnet (trinn 2 eller 3 i hver protokoll). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

CPK farging påføres det aktive stedet aminosyrer og bundne ligander29,30. Dette fargeskjemaet skiller atomer av forskjellige kjemiske elementer i molekylære modeller vist i linje, pinne, ball og pinne og plassfyllende representasjoner. Hydrogen er hvitt, nitrogen er blått, oksygen er rødt, svovel er gult, og fosfor er oransje i CPK-fargeskjemaet. Tradisjonelt brukes svart til karbon, men i moderne bruk kan karbonfarging variere.

Hydrogenatomer er ikke synlige i krystallstrukturer, selv om hvert av disse programmene er i stand til å forutsi deres plassering. Å legge hydrogenatomer til en stor makromolekylær struktur kan skjule utsikten, og dermed vises de ikke i denne protokollen. Følgelig vil hydrogenbindinger bli vist ved å måle fra midten av to heteroatomer (f.eks. oksygen til oksygen, oksygen til nitrogen) i disse strukturene.

Oversikt over programmer
Nedlastbare grafiske brukergrensesnitt (GUIer): PyMOL (versjon 2.4.1), ChimeraX (versjon 1.2.5) og Jmol (versjon 1.8.0_301) er GUI-baserte molekylære modelleringsverktøy. Disse tre grensesnittene har kommandolinjer for inndatatypet kode. Mange av de samme funksjonene er tilgjengelige via menyer og knapper i brukergrensesnittet. En vanlig funksjon i kommandolinjen til disse programmene er at brukeren kan laste inn og kjøre tidligere kommandoer på nytt ved hjelp av pil opp og pil ned på tastaturet.

Nettbaserte GUIer: iCn3D (I-see-in-3D) er en WebGL-basert seer for interaktiv visning av tredimensjonale makromolekylære strukturer og kjemikalier på nettet, uten å måtte installere et eget program. Den bruker ikke en kommandolinje, selv om den fullstendige webversjonen har en redigerbar kommandologg. JSmol er en JavaScript- eller HTML5-versjon av Jmol for bruk på et nettsted eller i et nettleservindu, og er veldig lik i drift med Jmol. JSmol kan brukes til å lage online opplæringsprogrammer, inkludert animasjoner.

Proteopedia31,32, FirstGlance i Jmol33og JSmol web interface (JUDE) ved Milwaukee School of Engineering Center for BioMolecular Modeling er eksempler på slike Jmol-baserte online designmiljøer34. Proteopedia wiki er et undervisningsverktøy som lar brukeren modellere en makromolekylstruktur og lage sider med disse modellene på nettstedet35. Proteopedia sceneredigeringsverktøy, bygget ved hjelp av JSmol, integrerer et GUI med tilleggsfunksjoner som ikke er tilgjengelige i Jmol GUI.

Jmol og iCn3D er basert på Java-programmeringsspråket; JSmol bruker enten Java eller HTML5, og PyMOL og ChimeraX er basert på Programmeringsspråket Python. Hvert av disse programmene laster protein databankfiler, som kan lastes ned fra RCSB Protein Data Bank under en 4-sifret alfanumerisk PDB ID36,37. De vanligste filtypene er Protein Data Bank (PDB)-filer som inneholder filtypen .pdb og Crystallographic Information File (CIF eller mmCIF) som inneholder filtypen CIF. CIF har erstattet PDB som standard filtype for Protein Data Bank, men begge filformatene fungerer i disse programmene. Det kan være små forskjeller i hvordan sekvensen/strukturen vises når du bruker CIF i motsetning til PDB-filer; Filene fungerer imidlertid på samme måte, og forskjellene vil ikke bli adressert i detalj her. Molecular Modeling Database (MMDB), et produkt fra National Center for Biotechnology Information (NCBI), er et delsett av PDB-strukturer som kategorisk informasjon er knyttet til (f.eks. biologiske egenskaper, konserverte proteindomener)38. iCn3D, et produkt av NCBI, er i stand til å laste PDB-filer som inneholder MMDB-dataene.

For å vise en modell kan brukeren laste ned ønsket fil fra den dedikerte Protein Data Bank-siden for strukturen (f.eks. https://www.rcsb.org/structure/3FGU), og deretter bruke rullegardinmenyen Fil -menyen i programmet til å åpne strukturen. Alle programmene er også i stand til å laste inn en strukturfil direkte gjennom grensesnittet, og den metoden er detaljert innenfor protokollene.

ChimeraX-, Jmol- og PyMOL-GUIene inneholder hvert enkelt vindu på konsollen som kan endre størrelse ved å dra hjørnet. iCn3D og JSmol er helt i en nettleser. Når du bruker iCn3D, kan det hende at brukeren må rulle i popup-vinduene for å vise alle menyelementer, avhengig av skjermstørrelse og oppløsning.

Protokollene som er beskrevet her, gir en enkel metode for å vise det aktive stedet for enzymet ved hjelp av hvert program. Det skal bemerkes at det er flere måter å utføre trinnene i hvert program. I ChimeraX kan for eksempel den samme oppgaven utføres ved hjelp av rullegardinmenyer, verktøylinjen øverst eller kommandolinjen. Brukere som er interessert i å lære et bestemt program i detalj, oppfordres til å utforske de elektroniske veiledningene, håndbøkene og wikiene som er tilgjengelige for disse programmene39,40,41,42,43,44,45,46.

Eksisterende håndbøker og veiledninger for disse programmene presenterer elementene i denne protokollen som atskilte oppgaver. For å vise et aktivt område må brukeren syntetisere de nødvendige operasjonene fra de forskjellige håndbøkene og veiledningene. Dette manuskriptet utvider eksisterende opplæringsprogrammer som er tilgjengelige ved å presentere en lineær protokoll for modellering av et merket aktivt område med molekylære interaksjoner, noe som gir brukeren en logikk for aktiv områdemodellering som kan brukes på andre modeller og programmer.

Figure 3
Figur 3: ChimeraX GUI. ChimeraX GUI-grensesnitt med rullegardinmenyer, verktøylinje, strukturvisningsprogram og kommandolinje merket. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: iCn3D GUI. iCn3D GUI-grensesnitt med rullegardinmenyene, verktøylinjen, strukturvisningsprogrammet, kommandologgen, velg oppsett og hurtigmenyer for sekvens og merknader merket. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Jmol GUI. Jmol GUI-grensesnitt med rullegardinmenyer, verktøylinje, strukturviser, hurtigmeny og konsoll / kommandolinje merket. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6: PyMOL GUI. PyMOL GUI-grensesnitt med rullegardinmenyer, strukturviser, navn / objektpanel, musekontrollmeny og kommandolinje merket. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Protocol

MERK: Protokollen for hvert program er skissert i ti overordnede trinn, (1) Laste strukturen inn i programmet, (2) Identifisere ligandene på det aktive stedet, (3) Justere representasjonen, (4) Velge rester innen 5 Å for å definere et aktivt sted, (5) Vise samspillet mellom enzymet med de aktive stedsligandene, (6) Vise sidekjedene som pinner og vise/justere det aktive stedet vannmolekyler, (7) Forenkle strukturen, (8) Merking av ligander og hydrogenbundne sidekjeder, (9) Lagre gjengivelsen når som helst for å gå tilbake til arbeid på den eller dele med andre, (10) Lagre et bilde for innebygging eller utskrift. Trinn 1, 4 og 7-10 er identiske for hver protokoll. På grunn av den unike driften av hvert program utføres imidlertid noen protokoller mer effektivt når trinn 2/3 og 5/6 byttes ut.

1. UCSF ChimeraX-protokoll

MERK: Styreflate- og musekontroller. Hvis du vil rotere, klikker og drar eller bruker du dra med to fingre (mus: venstreklikk og dra). For å zoome, knipe og spre (Mac) eller kontrollere + tofingerbevegelse (PC) (mus: rullehjul). Hvis du vil oversette (dvs. flytte hele strukturen), trykker du på alternativet + klikk og dra (Mac) eller skift + klikk og dra (PC) (mus: høyreklikk og dra). Hvis du vil midtstille på nytt, bruker du rullegardinmenyene øverst i grensesnittet til å klikke Handlinger > Vis.

  1. Laste inn strukturen i ChimeraX: I kommandolinjen nederst i brukergrensesnittet som innledes med "Kommando:", skriver du inn:
    åpen 3fgu
    MERK: Når du har skrevet inn en inntastet linjekommando, trykker du på enter på tastaturet for å utføre den.
  2. Identifisere ligandene på det aktive nettstedet: Forsikre deg om at det er to representasjoner, et tegneseriebånd og pinner. Bruk musen til å rotere / zoome proteinet for best å visualisere ligandene som vises nær midten av proteinet, som vises som pinner. Hold pekeren over en ligand for å vise navnet.
  3. Justere representasjonen: Bruk kommandoene i deltrinnene nedenfor til å endre fargene i proteinet og ligandene, bruke CPK-fargelegging på ikke-karbonatomer og deretter fjerne merkingen av markeringen. Utvalgte deler av molekylet blir uthevet i grønt.
    1. Bruk rullegardinmenyene øverst i grensesnittet til å endre fargen: Klikk Handlinger > Farge > Kornblomstblå. Klikk deretter Velg > struktur > Ligand. Hvis du vil velge farge, klikker du Handlinger > Farge > Grå. Hvis du vil bruke CPK-fargelegging, klikker du Velg > alle, og deretter klikker du Handlinger > Farge > Etter heteroatom. Til slutt fjerner du merket ved å klikke Velg > Fjern.
      MERK: Valget kan også fjernes ved å trykke på kontrollen og klikke i den svarte bakgrunnen til strukturviseren eller kommandolinjen ved å skrive: ~select. Som standard, for de fleste strukturer som inneholder 1-4 kjeder, vil ChimeraX automatisk vise vannmolekyler og aminosyrerester innen 3,6 Å av ligander og ioner.
    2. Bruk rullegardinmenyen til å skjule atomene som vises for øyeblikket, ved å klikke Handlinger > atomer/obligasjoner > Skjul.
    3. Bruk rullegardinmenyen til å vise ligandene og Mg ion på det aktive området ved å klikke Velg > struktur > Ligand. Klikk deretter Handlinger > Atoms/Bonds > Show. Deretter klikker du Velg > rester > MG, og deretter på Handlinger > Atoms /Bonds > Show. Hvis du vil fjerne merkingen, klikker du Merk > Fjern.
      MERK: Etter å ha gjort valget med rullegardinmenyen, kan trinn 1.3.3 utføres ved å klikke på Skjul og vis-knappene på Atoms-verktøylinjen.
  4. Velge rester i 5 Å for å definere et aktivt område: Trykk ctrl + skift i strukturvisningen for å velge ligandene og utføre museklikket på et hvilket som helst enkelt atom eller bånd i hver av de tre ligandene, det vil si BCG, ANPog Mg.
    1. Trykk deretter pil opp på tastaturet til alle atomene i de tre ligandene er uthevet med en grønn glød. Definer dette valget for fremtidig bruk ved å klikke Velg > Definer velger på rullegardinmenyenVelg > Definer velger . Skriv inn følgende på hurtigmenyen:
      ligander for å gi navn til det merkede området, og klikk deretter OK.
      MERK: Hvis du klikker pil opp for mange ganger i trinn 1.4.1, merkes hele proteinet. I så fall klikker du pil ned til bare atomene til de tre ligandene er valgt.
    2. Bruk rullegardinmenyen til å velge rester innen 5 Å av ligandene: Klikk på Velg > sone. I popup-vinduet som vises, bytter du rullegardinmenyen Velg til Rester, og kontrollerer at det er merket av for den øverste boksen (kontroller avstanden mindre enn (<) og satt til 5,0 Å). Klikk deretter OK. Bare rester som er mindre enn 5 Å away vil bli fremhevet.
      MERK: Trinn 1.4-1.4.2 kan forenkles mye ved hjelp av kommandolinjen, ved å skrive:
      navn frosne ligander :BGC:MG:ANP
      velg sone ligander 5 utvide sanne rester sant
  5. Vise sidekjedene som pinner og vise/justere de aktive vannmolekylene på stedet: Bruk rullegardinmenyen til å vise utvalget og midten og zoome på utvalget ved å klikke på Handlinger > Atoms/Bonds > Vis for å vise dem. Hvis du vil midtstille det merkede området, klikker du Handlinger > Vis. Deretter, for å fjerne merket, klikk på Velg > Fjern eller klikk hvor som helst i det tomme rommet .
  6. Vise samspillet mellom enzymet og de aktive områdeligandene: Bruk rullegardinmenyene og klikk på Velg > brukerdefinerte velgere > Ligands. Klikk deretter på Verktøy > strukturanalyse > H-obligasjoner. Kontroller at det er merket av for Begrens etter merking i popup-vinduet, rullegardinmenyen er satt til Med minst én ende valgt, og velg atomer er merket av, og klikk deretter OK. Hvis du vil fjerne merkingen, klikker du Merk > Fjern.
    MERK: Merk av i Avstandsetikett-boksen for å se bindingslengder i Å; Dette gjør imidlertid visningen svært opptatt. Til slutt kan du endre fargen på H-bonds ved å klikke på Farge-boksen og velge en ny farge i popup-vinduet.
  7. Forenkle strukturen: bruke den øverste tegneserieverktøylinjen for å skjule tegneserien eller klikke på rullegardinmenyen: Handlinger > Cartoon > Hide.
  8. Merking av ligander og hydrogenbundne sidekjeder: Bruk musen til å velge rester som er hydrogen bundet til ligandene (forbundet med de stiplede linjene), som i trinn 1.4. Deretter klikker du Handlinger > Etikett > Rester > Navnekombinasjonpå rullegardinmenyene. Deretter klikker du Velg > brukerdefinerte velgere > Ligands. Klikk deretter Handlinger > Etikett > rester > Av. Til slutt fjerner du merkingen ved å klikke Merk > Fjern.
  9. Lagre gjengivelsen når som helst for å gå tilbake for å arbeide med den eller dele med andre: Klikk Fil > Lagrepå rullegardinmenyen. Velg en plassering, skriv inn et filnavn, og klikk Lagre.
    MERK: Kontroller at formatet er satt til: ChimeraX-økt *.cxs.
  10. Lagre et bilde for innebygging eller utskrift: Bruk først musen til å orientere molekylet etter ønske. Endre bakgrunnsfargen til hvit ved å skrive på kommandolinjen:
    angi bgColor hvit
    Til slutt klikker du på øyeblikksbildeikonet på verktøylinjen. Bildet lagres på skrivebordet.
    MERK: Bakgrunnsfarge er også tilgjengelig i rullegardinmenyen; på en Mac, klikk på UCSF ChimeraX > Innstillinger; på en PC, klikker du Favoritter > Innstillinger > Bakgrunn.

2. iCn3D-protokoll

MERK: Styreflate- og musekontroller: Hvis du vil rotere, klikker og drar du (mus: venstreklikk og dra). For å zoome, knip sammen og spre (mus: roter rullehjulet). Hvis du vil oversette (dvs. flytte hele strukturen), klikker og drar du med to fingre (mus: høyreklikk og dra). Hvis du vil midtstille på nytt, holder du pekeren over Vis på de øverste rullegardinmenyene, og deretter klikker du Midtstill merket område.

  1. Laste inn strukturen i iCn3D: Naviger til iCn3D Web-basert 3D Structure Viewer og skriv inn 3FGU i boksen Input MMDB eller PDB ID for å laste inn filen.
  2. Identifisere ligandene på det aktive området: Hold markøren over Analyse i rullegardinmenyen, og klikk deretter Seq. og Merknader. Sekvensene, i dette tilfellet proteiner og kjemiske / ioner / vann, vises i et stablet bord. Rull ned for å se de aktive områdeligandene ANP, BGC og Mg oppført. I strukturviseren holder du pekeren over ligandene på det aktive nettstedet (vist som pinner i midten av proteintegningen) for å se navnene deres.
  3. Justering av representasjonen: Ingen innledende justeringer kreves for denne protokollen.
  4. Velge rester i 5 Å for å definere et aktivt område: Hvis du vil velge ligandene, bruker du rullegardinmenyen Velg og klikker Velg på 3D. Kontroller at det er merket av for Rester .
    1. Hvis du vil velge ligandene, holder du nede ALT-knappen på en PC eller Tilvalg -knappen på en Mac og klikker den første liganden (f.eks. BCG) ved hjelp av musen eller styreflaten. Trykk deretter på kontroll og klikk på ANP- og MG-ligander for å legge dem til i utvalget.
      MERK: Ligandene blir uthevet i gult når de velges.
    2. Lagre dette valget ved hjelp av rullegardinmenyen: Klikk på Velg > Lagre merket område og bruk tastaturet til å skrive inn et navn i popup-vinduet (f.eks. 3Ligands), og klikk deretter Lagre. Popup-vinduet Velg sett vises nå.
      MERK: Hvis valget er feil, klikker du på Velg > Fjern merket område.
    3. Velg rester innen 5 Å av ligandene: Klikk Velg >etter avstand på rullegardinmenyen. I hurtigmenyen som vises, endrer du det andre elementet (Sfære med radius) til 5 Å ved å skrive inn blokken. Klikk det innbokserte ordet Skjerm, og lukk deretter vinduet ved å klikke kryssskiltet øverst til høyre.
      MERK: I hurtigmenyen som vises i trinn 2.4.3, lar du det første settet med inngangen "valgt" og det andre settet som "ikke-valgt". Vær oppmerksom på at atomene/strukturene i 5 Å blir uthevet med en gul glød når Displayet klikkes.
    4. Lagre det 5 Å aktive nettstedet ved hjelp av rullegardinmenyen: Hold markøren over Velg og klikk på Lagre utvalg, skriv inn et navn i popup-vinduet ved hjelp av tastaturet (f.eks. 5Ang), og klikk på Lagre.
    5. Deretter oppretter du et nytt utvalg som kombinerer de to settene (5Ang og 3Ligands): På hurtigmenyen Velg sett ctrl-klikk (PC) eller kommando-klikk (Mac) 5Ang og 3Ligands. Klikk Velg > Lagre merket område, bruk tastaturet til å skrive inn et navn (f.eks. 5AFull), og klikk deretter Lagre.
  5. Vise samspillet mellom enzymet og de aktive områdeligandene, for eksempel hydrogenbindinger: Hold markøren over Analyse i rullegardinmenyen, og klikk Interaksjoner. En omfattende hurtigmeny med alle ikke-kovalente samhandlinger vises.
    1. Fjern merket for alt unntatt avmerkingsboksene "Hydrogenbindinger" og "Salt Bridge/Ionic". Klikk på 3Ligands for å velge det første settet og 5Ang for det andre settet. Klikk den innrammede teksten som leser samhandlinger med 3D-visning. Lukk vinduet ved å klikke på kryssskiltet øverst til høyre.
      MERK: Kontakten/interaksjonene representerer antagelig indusert dipolindusert dipolinteraksjon, noe som ofte gjør skjermen opptatt. Hvis du vil, kan du endre avstanden for alle typer interaksjoner.
    2. Hvis du bare vil vise hydrogenbindinger, klikker du på 5Afull i popup-vinduet for utvalgte sett. Deretter holder du pekeren over Analyse på rullegardinmenyen, og deretter klikker du Chem. Binding > Show.
  6. Vise sidekjettingene som pinner og vise/justere de aktive vannmolekylene på stedet: Bruk hurtigmenyen for utvalgte sett og klikk på 5AFull. Deretter klikker du Style > Side Chains > Sticki rullegardinmenyene. Hvis du vil bruke CPK-farge, klikker du Farge > Atom. Til slutt klikker du på Style > Water > Spheres (hvis du foretrekker større vannmolekyler).
  7. Forenkle strukturen: Klikk på 5AFullpå hurtigmenyen velg sett. Deretter klikker du på Vis > Vis valg i rullegardinmenyene (for å bare se 5AFull bindingsside). Deretter klikker du på Style > Proteins > Stick (for å vise proteinkjeden som pinne i stedet for bånd).
    1. Hvis du vil fargelegge ligandenes karbonatomer i en kontrastfarge, klikker du på Kjemikalier i popup-vinduet Velg sett. Deretter klikker du Vis > Vis valgpå rullegardinmenyen. Neste klikk på Velg > Velg på 3D (sørg for at "atom" er merket). Bruk kontrollene som er beskrevet i trinn 2.4.1, til å velge alle karbonatomer i BGC og ANP. Klikk deretter Farge > enfarget > Cyan > Cyanpå rullegardinmenyen.
    2. Hvis du vil vise hele det aktive området på nytt, bruker du popup-vinduet Velg sett til å klikke 5AFull. Deretter klikker du Vis > Vis valgpå rullegardinmenyen.
  8. Merking av ligander og sidekjeder med hydrogenbinding: Bruk popup-vinduet for valgsett til å velge Interface_all, og klikk deretter Analyse > Etikett > Per rest &tallpå rullegardinmenyen.
    MERK: Du må velge Per rest på nytt & Antall hver gang du vil legge til en etikett, selv om menyelementet allerede er merket av fra en tidligere etikett.
  9. Lagre gjengivelsen når som helst for å gå tilbake for å arbeide med den eller dele med andre: Klikk På Fil > Del kobling på rullegardinmenyen. Kopier den korte URL-adressen (for eksempel https://structure.ncbi.nlm.nih.gov/icn3d/share.html?r83NqCz41bu7cmcs8) og lim den inn i en nettleser.
  10. Lagre et bilde for innebygging eller utskrift: Klikk Velg > Aktiver/deaktiver uthevingpå rullegardinmenyen. Klikk deretter Stil > bakgrunn > hvit. Til slutt klikker du på Fil > Lagre filer > iCn3D PNG Image og velger ønsket størrelse.

3. Jmol-protokollen

MERK: Styreflate- og musekontroller: For å rotere, klikk og dra (mus: venstreklikk og dra). Slik zoomer du: Rull loddrett med to fingre (mus: skift + venstreklikk + dra loddrett). Hvis du vil oversette (dvs. flytte hele strukturen) kontroll + alt + klikk og dra (PC), ctrl + alternativ + klikk og dra (Mac). Hvis du vil midtstille på nytt: skift + dobbeltklikk i det tomme området i strukturvisningsvinduet.

  1. Laste inn strukturen i Jmol: Bruk rullegardinmenyen øverst i GUI for å sette opp arbeidsområdet med strukturen ved å klikke på Fil >-konsoll. Klikk deretter Fil > Få PDB. I popup-vinduet skriver du inn: 3fgu
    Klikk deretter OK.
    MERK: Alternativt kan du bruke Jmol-konsollen til å laste inn strukturen ved å skrive: load = 3fgu
    MERK: Når du har skrevet inn en inntastet linjekommando, trykker du på enter på tastaturet for å utføre den.
  2. Justere representasjonen: Åpne hurtigmenyen ved å høyreklikke (eller kontrollere + klikke) hvor som helst i strukturvisningsvinduet.
    1. Hvis du vil endre proteinet til tegneserierepresentasjon, klikker du Velg > Utvalg Halospå hurtigmenyen. Deretter klikker du på Velg > Protein > Alle. Til slutt klikker du på Style > Scheme > Cartoon.
      MERK: Markeringshaloer setter et gult omriss (glød) rundt alle de valgte atomene.
    2. Bruk den øverste rullegardinmenyen til å skjule vannet ved å klikke på Vis > Velg > vann. Deretter klikker du Vis > Atom > Ingen, og til slutt klikker du Vis > Velg > Ingen.
  3. Identifisere ligandene på det aktive området: Bruk musen til å zoome inn på det aktive området, og bruk deretter kommandoene i deltrinnene til å vise ligandene som pinner.
    MERK: Ligandnavn vises i Jmol-konsollen når du laster inn filen. Du kan også vise bundne ligandnavn ved hjelp av hurtigmenyen ved å klikke Velg > Hetero > av HETATM.
    1. Hold pekeren over ligandene med musen for å vise navnene. Det aktive stedet er nær sentrum av strukturen; ligandene MG, BGC og ANP er plassert på det aktive stedet.
    2. Velg ligandene BCG og ANP: Bruk Jmol-konsollen til å skrive inn:
      velg BGC, ANP
    3. Hvis du vil vise ligandene BCG og ANP som pinner, bruker du hurtigmenyen og klikker Style > Scheme > Sticks.
  4. Velge rester innenfor 5 Å for å definere et aktivt sted: I Jmol-konsollen skriver du inn følgende kommando for å velge atomer innen 5 Å av de tre ligandene:
    innenfor (5, (bgc, anp, mg))
    1. Hvis du vil velge fullstendige aminosyrerester, skriver du inn følgende i konsollen og trykker enter
      velg innenfor(gruppe, valgt)
      MERK: Jmol-konsollen er den beste måten å velge rester innen 5 Å.
  5. Vise sidekjedene som pinner og vise/justere de aktive områdevannmolekylene: Høyreklikk for å vise hurtigmenyen, og hold markøren over Style > Scheme > Sticks.
    MERK: Trinn 3.5 viser de aktive sidekjedene på stedet i pinnerepresentasjon. Det vil fortsatt være noen tomme glorier i strukturen som representerer vannmolekylene på det aktive stedet.
    1. I Jmol-konsollen utfører du følgende kommando på nytt:
      innenfor (5, (bgc, anp, mg))
      MERK: Hvis du vil utføre en kommando på nytt, klikker du i konsollen, og deretter bruker du piltastene på tastaturet til denne kommandoen vises, og klikker Enter for å kjøre den på nytt.
    2. Hvis du vil vise vannmolekylatomer, fjerner du ligandene og proteinet fra det merkede området ved å skrive inn følgende to kommandoer:
      velg fjerne gruppeprotein
      velg fjern gruppe hetero og ikke vann
    3. Hvis du vil vise vannmolekylene, klikker du på rullegardinmenyen Vis. Hold markøren over Atom og klikk på 20% van der Waals. De grønne magnesiumionene vil fortsatt bli vist som pinner. Vis magnesiumionen i den vanligste sfærerepresentasjonen ved å skrive inn følgende kommandoer i Jmol-konsollen:
      velg Mg
      spacefill 50 %
    4. Endre fargene i ligandene for å skille dem fra proteinet: I Jmol-konsollen skriver du inn følgende for å utføre en kommando som endrer fargene i ligandene i et lysere fargevalg:
      velg (bgc, anp) og karbon; farge [211,211,211]
      velg (bgc, anp) og oksygen; farge [255,185,185]
      velg (bgc, anp) og nitrogen; farge [150,210,255]
      velg (bgc, anp) og fosfor; farge [255,165,75]
      velg Mg; farge blekgrønn
  6. Vise enzymets interaksjoner med de aktive områdeligandene: Bruk Jmol-konsollen til å utføre hver linje i følgende kommando:
    definere ligbind (ANP, BGC, MG)
    innenfor (5, (bgc, anp, mg))
    velg fjern gruppe hetero og ikke vann
    1. Hvis du vil vise linjer for å illustrere hydrogenbindinger, skriver du inn denne kommandoen i Jmol-konsollen:
      3,3 (ligbind og (oksygen eller nitrogen)) (valgt og (oksygen eller nitrogen)) spankulere gult
      Deretter endrer du tykkelsen på linjene ved å skrive inn følgende kommando i konsollen:
      velg alle; stivelse 0,1; velg ingen
  7. Forenkle strukturen: For å skjule tegneserien av proteinet og fjerne utvalget, i Jmol-konsollen, skriv:
    velg alle; tegneserie av; velg ingen
  8. Merking av ligander og hydrogenbundne sidekjeder: I popup-vinduet klikker du på Angi plukking > Velg atom. Klikk på et atom i en av de hydrogenbundne rester. Aminosyren og resttallene vises i konsollen. Deretter bruker du konsollen til å skrive inn en etikett, for eksempel:
    etikett Lim-256
  9. Lagre gjengivelsen når som helst for å gå tilbake til arbeid på den eller dele med andre: Klikk på kameraikonet i den øverste menyen. Skriv inn et filnavn, og velg en plassering du vil lagre.
    MERK: En eksportert JPEG-fil (.jpg) inneholder informasjonen for både et bilde slik det vises i visningsvinduet på eksporttidspunktet, samt modellens gjeldende tilstand. Hvis du vil laste inn modellen på nytt, åpner du Jmol og drar den lagrede JPEG-filen inn i Jmol Display Window.
  10. Lagre et bilde for innebygging eller utskrift: Endre fargene i bakgrunnen til hvitt i Jmol-konsollen ved å skrive inn:
    bakgrunn hvit
    Som i trinn 3.9, klikker du på kameraikonet og lagrer filen.

4. PyMOL-protokoll

MERK: Styreflate- og musekontroller: For å rotere, klikk og dra (mus: venstreklikk og dra). Hvis du vil zoome, knipe sammen og spre (mus: høyreklikk og dra). Hvis du vil oversette (dvs. flytte hele strukturen), kontrollerer du + klikker og drar (mus: kommando + venstreklikk og dra). Hvis du vil midtstille på nytt, går du til høyre objektpanel og klikker A > Orient eller Midtstill.

  1. Laste strukturen inn i PyMOL: I kommandolinjen nær toppen av GUI (med "PyMOL>" foran), skriver du:
    hente 3FGU
    MERK: Når du har skrevet inn en inntastet linjekommando, trykker du på enter på tastaturet for å utføre den.
  2. Justere representasjonen: I navn/ objektpanelet på høyre side av PyMOL-vinduet, til høyre for "3FGU" klikker du på H > Waters.
  3. Identifisere ligandene på det aktive området: Slå først på sekvensvisningsprogrammet ved å klikke på den øverste rullegardinmenyen: Vis > sekvens.
    1. Rull i det grå feltet til høyre til du finner ligandnavnene (BCG, ANP, MG, K).
      MERK: Det er to representasjoner, et tegneseriebånd og pinner; ligandene vises som pinner. Kontroller at valgmodusen i musekontrollene nederst til høyre er satt til rest- og treknappvisningsmodus ved å klikke på disse navnene for å veksle mellom alternativene.
    2. Bruk musen til å rotere og zoome for å gjøre ligandene synlige.
  4. Velge rester i 5Å for å definere et aktivt område: Hvis du vil velge ligandene på det aktive området, klikker du på hver av dem (BCG, ANP, MG) i strukturvisningsprogrammet. Det dukker opp en ny markering i navne-/objektpanelet. til høyre for dette nye objektet med navnet "sele", klikk på A-knappen, og klikk deretter på Gi nytt navn i hurtigmenyen.
    MERK: For å fjerne et uønsket utvalg, klikk på det tomme rommet i strukturviseren for å fjerne merkingen.
    1. Bruk tastaturet til å slette bokstavene "separer" som vises øverst til venstre i strukturvisningsvinduet, og skriv inn følgende i stedet for dem:
      ligander
      MERK: Trinn 4.4-4.4.1 kan gjøres ved hjelp av kommandolinjen; type:
      sele ligander, resn BGC+ANP+MG
    2. Bruk dette valget til å definere området rundt ligandene ved først å duplisere det, klikk på ligander > A > Dupliser. Klikk deretter på sel01 > A > Rename
      Bruk tastaturet til å slette bokstavene "se101" og skriv:
      aktiv
    3. Endre dette valget for å vise rester innen 5 Å: I navne-/objektpanelet klikker du på aktiv > A > Endre > Utvid > med 5 A, Rester. Deretter, for å vise disse rester som pinner, klikk på aktiv > S > Lakris > Pinner. Til slutt klikker du i det tomme området i strukturvisningsprogrammet for å fjerne merkingen.
      MERK: Trinn 4.4.3 kan gjøres ved hjelp av kommandolinjen, skriv inn:
      sele aktiv, byres alle innen 5 av ligander
      vis pinner, aktive
  5. Vise sidekjettingene som pinner og vise/justere de aktive vannmolekylene på stedet: I navne-/objektpanelet klikker du på ligander > A > Dupliser. Hvis du vil gi nytt navn til det merkede området, klikker du Sel02 > A > Gi nytt navn til merket område. Slett bokstavene i menyen som vises øverst til høyre i strukturvisningsprogrammet, og skriv inn:
    active_water
    1. Hvis du vil justere det nye utvalget slik at det inneholder aktive vannmolekyler på stedet, klikker du på active_water > A > Endre > Rundt > atomer innen 4 Angstroms. For å endre dette ytterligere og begrense til vannmolekyler, klikk på active_water > A > Endre > Begrens > til løsningsmiddel. Til slutt klikker du på active_water > A > Forhåndsinnstilling > ball og pinne.
      MERK: GUI tillater valg innen 4 Å; linjekommandoer tillater valg av en mer hensiktsmessig avstand på 3,3 Å for hydrogenbinding av vannmolekyler. Van der Waals radii av kulene kan ikke settes i GUI, men "ball og pinne" -valget er nær 0,5 Å.
      MERK: Trinn 4.5-4.5.1 kan utføres ved hjelp av kommandolinjen ved å skrive inn hver linje i følgende kode:
      velg active_water ((ligander) rundt 3,3) og (resn HOH)
      vise sfærer, active_water
      endre active_water, vdw=0,5
      gjenoppbygge
  6. Viser samspillet mellom enzymet og de aktive stedets ligander. Zoom inn på det aktive området ved å klikke på aktiv > A > Zoom. Hvis du vil finne polarkontaktene mellom ligandene og det aktive området, klikker du ligander > A > Finn > Polar-kontakter > Til alle atomer. Vis avstander som etiketter ved å klikke ligands_polar_contacts > S > Etiketter.
  7. Forenkle strukturen: Skjul tegneserien til proteinet, som skjuler den delen av proteinet som ikke er på det aktive nettstedet, ved å klikke på 3FGU > H > Cartoon i navn / objektpanelet. Deretter skjuler du etikettene på hydrogenbindingslengden ved å klikke på ligands_polar_contacts > H > Etiketter i navn / objektpanelet.
    1. For å farge ligandene for å skille dem fra proteinet, klikk på ligander > C > By Element > CHNOS og velg alternativet der "C" er cyan (en lyseblå).
      MERK: Trinn 4.7.1 kan utføres ved hjelp av kommandolinjen. Type:
      farge cyan, ligander
      farge atomisk, ligander &!elem C
  8. Merking av ligander og hydrogenbundne sidekjeder: I navne-/objektpanelet, til høyre for et objektnavn, klikker du på aktiv > L > Rester.
  9. Lagre gjengivelsen når som helst for å gå tilbake for å arbeide med den eller dele den med andre: Klikk Fil > Lagre økt som på rullegardinmenyen. Velg deretter en plassering i popup-vinduet, skriv inn et filnavn og klikk på Lagre.
  10. Lagre et bilde for innebygging eller utskrift: Først endrer du bakgrunnen til hvit i rullegardinmenyen ved å klikke Vis > bakgrunn > hvit. Eksporter bildet som en ny fil ved å klikke Fil > Eksporter bilde som > PNG.

Representative Results

En vellykket utført protokoll for hvert av programmene vil resultere i en molekylær modell zoomet inn på det aktive nettstedet, med aktive nettstedrester og ligander vist som pinner, proteintegningen skjult og ligander vist med et kontrastfargeskjema. Interagerende aminosyrerester bør merkes med deres identifikatorer, og hydrogenbinding og ioniske interaksjoner vist med linjer. Tilstedeværelsen av disse funksjonene kan bestemmes ved visuell inspeksjon av modellen.

For å lette denne inspeksjonen og gjøre det mulig for brukeren å avgjøre om de har utført trinnene i protokollen på riktig måte, har vi gitt animerte figurer som presenterer et bilde av strukturen etter hvert trinn. For ChimeraX, iCn3D, Jmol og PyMOL er dette illustrert i henholdsvis figur 7-10.

Figur 7: ChimeraX-protokollutdata. Animert figur som illustrerer trinn 1.1-1.8 i ChimeraX-protokollen. Klikk her for å laste ned denne figuren.

Figur 8: iCn3D-protokollutdata. Animert figur som illustrerer trinn 2.1-2.8 i iCn3D-protokollen. Klikk her for å laste ned denne figuren.

Figur 9: Jmol-protokollutgang. Animert figur som illustrerer trinn 3.1-3.8 i Jmol-protokollen. Klikk her for å laste ned denne figuren.

Figur 10: PyMOL-protokollutgang. Animert figur som illustrerer trinn 4.1-4.8 i PyMOL-protokollen. Klikk her for å laste ned denne figuren.

Den vanligste feilen som kan påvirke utfallet av disse protokollene er feilaktig valg, noe som resulterer i at en del av strukturen vises i en uønsket gjengivelse. Dette er vanligvis et resultat av feilklikking, enten på selve strukturen eller i en av visningsmenyknappene. Et eksempel på et suboptimalt resultat vil være en modell som inneholder rester utenfor det aktive nettstedet som vises som pinner. Brukeren kan begynne å analysere om denne feilen har oppstått ved å visuelt inspisere rester som vises som pinner og sikre at de er i nærheten av de aktive området ligander. En avansert metode for å vurdere om de viste rester er innenfor 5Å av de aktive området ligander er å bruke måleverktøyene som er innebygd i hvert program for å måle avstanden mellom en nærliggende ligand og den aktive stedet rester. Måleverktøyene er utenfor omfanget av dette manuskriptet; Vi oppfordrer imidlertid interesserte brukere til å utforske de mange online veiledningene som beskriver denne typen analyse.

Vi presenterer et spesifikt eksempel på en sub-optimal utførelse av denne protokollen, som følge av et feilklikk på navn / objektpanelet i PyMOL. Denne feilen viser hele proteinet som pinner, i stedet for å vise bare det aktive området ved hjelp av denne representasjonen, som illustrert i figur 11.

Figure 11
Figur 11: Negativt resultat. Eksempel på et negativt resultat. Feilvalg av hele tegneserien i PyMOL og visning av pinner. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

For å feilsøke må brukeren skjule pinnene for hele modellen (merket 3FGU i navn / objektpanelet), og deretter vise pinnerepresentasjonen for bare det merkede området som heter "aktiv", ved hjelp av skjul og vis knapper / kommandoer i PyMOL. Det er relativt enkelt å gjenopprette modellen fra denne typen feil når brukeren er i stand til å lage passende valg for forskjellige deler av modellen og vise og skjule dem effektivt. Det er fristende å starte protokollen på nytt og jobbe seg gjennom trinnene en annen gang; Vi oppfordrer imidlertid brukeren til ikke å være redd for å gå "off script" og eksperimentere med modellen. Vår erfaring er at det å jobbe gjennom visningsfeil legger til rette for fremgang i forståelsen av modelleringsprogrammet.

En sidestilt visning av den endelige utdataene fra en protokoll som ble utført for hvert program, vises i figur 12. Visningene er orientert på samme måte slik at brukeren kan sammenligne utseendet på modellene som er opprettet i forskjellige programmer.

Figure 12
Figur 12: Endelig struktursammenligning på tvers av programmer. Sammenligning av strukturen for hver aktive områdegjengivelse på slutten av protokollen. A: ChimeraX, B: iCn3D, C: Jmol, D: PyMOL. PyMOL aktiv stedsetikett inkluderer alle aktive stedsrester og ligandene. De andre produksjonene har bare hydrogenbindingskjeder merket. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Discussion

Denne protokollen skisserer en ti-trinns prosess for modellering av et enzymaktivt sted, anvendt på fire populære programmer for biomolekylær modellering. De kritiske trinnene i protokollen er: identifisere ligandene på det aktive stedet, velge rester innen 5 Å for å definere et aktivt sted, og vise samspillet mellom enzymet med de aktive områdeligandene. Å skille ligandene som er relevante for den biologiske funksjonen er avgjørende, da dette gjør det mulig for brukeren å definere aminosyrerester innen 5 Å som kan spille en rolle i bindingen av ligandene. Til slutt, ved å bruke programmet til å vise molekylære interaksjoner, kan brukeren utvikle ferdighetene som er nødvendige for å forstå molekylære interaksjoner som fremmer binding.

En begrensning av datamaskinbaserte molekylære modelleringsprotokoller er avhengigheten av bestemte kommandoer og syntaks. Selv om biokjemiske protokoller kan være tolerante for små endringer i prosedyren, kan databaserte undersøkelser gi svært forskjellige sluttprodukter hvis prosedyren ikke følges nøye. Dette er spesielt viktig når du bruker kommandolinjegrensesnitt der programspesifikk syntaks kreves for å oppnå en bestemt utdata, og en tilsynelatende ubetydelig endring i tegnsetting eller stor forbokstav kan føre til at en kommando mislykkes. Det finnes forskjellige Wikier og håndbøker for hvert program, der en bruker kan finne og feilsøke kommandolinjeinndata; brukeren bør være nøye med detaljene i kommandosyntaksen. Selv om de fleste molekylære visualiseringsprogrammer inkluderer angrekommandoer, reverserer ikke alltid angrekommandoen det siste trinnet på grunn av kompleksiteten i grensesnittene. Derfor oppfordres det ofte å lagre den nåværende arbeidstilstanden, spesielt for nye brukere.

Ytterligere begrensninger kan oppstå fra dataene som brukes til å lage selve modellen. Mens standardene i Protein Data Bank sikrer et visst nivå av konsistens, vil brukere av molekylære visualiseringsprogrammer ofte støte på uventede effekter i en proteingjengivelse. For det første bestemmes de fleste strukturer ved hjelp av røntgenkrystallografi, som gir en enkelt modell av proteinet; NMR-strukturer består imidlertid ofte av flere modeller som kan visualiseres én om gangen. For det andre kan strukturer bestemt av krystallografi eller kryogene elektronmikroskopieksperimenter inneholde atomer hvis posisjon ikke kan belyses og vises som hull i visse representasjoner av proteinet. Proteinstrukturer kan ha alternative konformasjoner av sidekjeder, som, når de vises i pinnegjengivelse, vises som to grupper som stikker ut av samme aminosyre ryggrad. Selv korte deler av ryggraden kan ha slike alternative konformasjoner, og noen ganger legges ligander på det aktive stedet i mer enn ett bindende konformasjon.

For en krystallstruktur inkluderer de avsatte 3D-koordinatene alle komponentene i den asymmetriske enheten, som gir nok informasjon til å reprodusere den gjentatte enheten til en proteinkrystall. Noen ganger vil denne strukturen inneholde flere proteinkjeder sammenlignet med proteinets biologisk aktive form (f.eks. fosterhmoglobinmutant, PDB ID: 4MQK). På den annen side kan det hende at noen programmer ikke automatisk laster inn alle kjedene til den biologisk aktive enheten. For eksempel laster SARS-CoV2 hovedprotease (PDB ID: 6Y2E) halvparten av den biologisk aktive dimmeren (bestående av to proteinkjeder) når den hentes ved hjelp av kommandoene beskrevet i denne protokollen i ChimeraX, PyMOL og Jmol. Selv om en liten endring av kommandoen vil laste inn den biologisk aktive dimmeren, kan det hende at denne vurderingen ikke er enkel for brukeren av nybegynnermodelleringsprogrammet. Et annet problem som kan oppstå er i identifiseringen av det aktive nettstedet eller substratet selv. Krystallografiske eksperimenter utføres ved hjelp av en rekke molekyler, som kan modelleres inn i den endelige strukturen. For eksempel kan sulfatmolekyler binde fosfatbindingssteder på det aktive stedet, eller de kan binde andre regioner som ikke er relevante for mekanismen. Disse molekylene kan skjule riktig identifisering av selve det aktive stedet og kan til og med foreslå for studenten at de er en del av mekanismen.

Formodentlig vil brukeren ønske å bruke denne prosedyren på andre aktive / bindende nettsteder. For å anvende denne protokollen i det fremtidige arbeidet med analyse av nye proteinaktive steder, må brukeren identifisere hvilke av de bundne ligandene som er relevante for å fungere. Noen ligander er ikke forbundet med proteinfunksjon, og er i stedet et resultat av løsningsmiddel- eller krystalliseringsforholdene som brukes til å utføre eksperimentet (f.eks. kaliumionen som er tilstede i 3FGU-modellen). De viktigste ligandene bør identifiseres ved å konsultere det opprinnelige manuskriptet. Med praksis og, der det er aktuelt, en forståelse av linjekommandosyntaksen, vil en bruker kunne anvende protokollen for ønsket modelleringsprogram på ethvert enzymaktivt sted, og å modellere andre makromolekyler etter eget valg.

Identifisering og analyse av bundne substrater og ligander er sentralt i belysningen av molekylære mekanismer og strukturbasert legemiddeldesigninnsats, som direkte har ført til forbedringer i behandlinger for sykdom, inkludert ervervet immunsviktsyndrom (AIDS) og COVID-1947,48,49,50,51,52 . Mens individuelle molekylære visualiseringsprogrammer tilbyr forskjellige grensesnitt og brukeropplevelser, tilbyr de fleste sammenlignbare funksjoner. Det er viktig for utviklingen av biomolekylær visualiseringskompetanse at biokjemistudenter på øverste nivå blir kjent med strukturvisualisering og verktøyene for å generere slike bilder4,20,53. Dette gjør det mulig for studentene å bevege seg utover tolkningen av todimensjonale bilder i lærebøker og tidsskriftartikler og lettere utvikle sine egne hypoteser fra strukturdata54, som vil forberede utviklende forskere til å løse fremtidige folkehelseproblemer og forbedre forståelsen av biokjemiske prosesser.

Oppsummert beskriver denne protokollen aktiv områdemodellering ved hjelp av fire ledende gratis makromolekylære modelleringsprogrammer. Samfunnet vårt, BioMolViz, tar i bruk en ikke-programvarespesifikk tilnærming til biomolekylær modellering. Vi unngikk spesifikt en kritikk eller sammenligning av programfunksjoner, selv om en bruker som tar prøver hvert program sannsynligvis vil oppdage at de foretrekker visse aspekter ved makromolekylær modellering i ett program kontra et annet. Vi inviterer leserne til å bruke BioMolViz-rammeverket, som beskriver de biomolekylære visualiseringsbaserte læringsmålene og målene som er målrettet i denne protokollen, og utforske ressurser for undervisning og læring av biomolekylær visualisering gjennom BioMolViz-samfunnets nettsted på http://biomolviz.org.

Disclosures

Forfatterne erklærer at de ikke har relevante eller materielle økonomiske interesser knyttet til forskningen som er beskrevet i denne artikkelen.

Acknowledgments

Støtten til dette arbeidet er gitt av National Science Foundation:

Forbedre stipend for realfagsutdanning (pris #1712268)

Forskningskoordineringsnettverk i bachelorutdanning i marinbiologi (pris # 1920270)

Vi er takknemlige til Karsten Theis, PhD, Westfield University, for nyttige diskusjoner om Jmol.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ChimeraX (Version 1.2.5) https://www.rbvi.ucsf.edu/chimerax/
Computer Any
iCn3D (web-based only: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/icn3d/full.html)
Java (for Jmol) https://java.com/en/download/
Jmol (Version 1.8.0_301) http://jmol.sourceforge.net/
Mouse (optional) Any
PyMOL (Version 2.4.1 - educational): https://pymol.org/2 educational use only version: https://pymol.org/edu/?q=educational

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Loertscher, J., Green, D., Lewis, J. E., Lin, S., Minderhout, V. Identification of threshold concepts for biochemistry. CBE Life Sciences Education. 13 (3), 516-528 (2014).
  2. Jaswal, S. S., O’Hara, P. B., Williamson, P. L., Springer, A. L. Teaching structure: Student use of software tools for understanding macromolecular structure in an undergraduate biochemistry course: Teaching structure in undergraduate biochemistry. Biochemistry and Molecular Biology Education. 41 (5), 351-359 (2013).
  3. Tibell, L. A. E., Rundgren, C. -J. Educational challenges of molecular life science: Characteristics and implications for education and research. CBE Life Sciences Education. 9 (1), 25-33 (2010).
  4. Schönborn, K. J., Anderson, T. R. The importance of visual literacy in the education of biochemists. Biochemistry and Molecular Biology Education. 34 (2), 94-102 (2006).
  5. Anderson, T. R. Bridging the educational research-teaching practice gap: The importance of bridging the gap between science education research and its application in biochemistry teaching and learning: Barriers and strategies. Biochemistry and Molecular Biology Education. 35 (6), 465-470 (2007).
  6. Schönborn, K. J., Anderson, T. R. Bridging the educational research-teaching practice gap: Foundations for assessing and developing biochemistry students’ visual literacy. Biochemistry and Molecular Biology Education. 38 (5), 347-354 (2010).
  7. Bateman, R. C., Craig, P. A. Education corner: A proficiency rubric for biomacromolecular 3D literacy. PDB Newsletter. 45, 5-7 (2010).
  8. Mnguni, L., Schönborn, K., Anderson, T. Assessment of visualization skills in biochemistry students. South African Journal of Science. 112, 1-8 (2016).
  9. Craig, P. A., Michel, L. V., Bateman, R. C. A survey of educational uses of molecular visualization freeware. Biochemistry and Molecular Biology Education. 41 (3), 193-205 (2013).
  10. Loertscher, J., Villafañe, S. M., Lewis, J. E., Minderhout, V. Probing and improving student’s understanding of protein α-Helix structure using targeted assessment and classroom interventions in collaboration with a faculty community of practice. Biochemistry and Molecular Biology Education. 42 (3), 213-223 (2014).
  11. Abualia, M., et al. Connecting protein structure to intermolecular interactions: A computer modeling laboratory. Journal of Chemical Education. 93 (8), 1353-1363 (2016).
  12. Carvalho, I., Borges, A. D. L., Bernardes, L. S. C. Medicinal chemistry and molecular modeling: An integration to teach drug structure–activity relationship and the molecular basis of drug action. Journal of Chemical Education. 82 (4), 588 (2005).
  13. Forbes-Lorman, R. M., et al. Physical models have gender-specific effects on student understanding of protein structure-function relationships. Biochemistry and Molecular Biology Education. 44 (4), 326-335 (2016).
  14. Terrell, C. R., Listenberger, L. L. Using molecular visualization to explore protein structure and function and enhance student facility with computational tools. Biochemistry and Molecular Biology Education. 45 (4), 318-328 (2017).
  15. Zhang, S., et al. Structure-based drug design of an inhibitor of the SARS-CoV-2 (COVID-19) main protease using free software: A tutorial for students and scientists. European Journal of Medicinal Chemistry. 113390, (2021).
  16. Roberts, J. R., Hagedorn, E., Dillenburg, P., Patrick, M., Herman, T. Physical models enhance molecular three-dimensional literacy in an introductory biochemistry course. Biochemistry and Molecular Biology Education. 33 (2), 105-110 (2005).
  17. Jenkinson, J., McGill, G. Visualizing protein interactions and dynamics: Evolving a visual language for molecular animation. CBE Life Sciences Education. 11 (1), 103-110 (2012).
  18. Bussey, T. J., Orgill, M. What do biochemistry students pay attention to in external representations of protein translation? The case of the Shine–Dalgarno sequence. Chemistry Education Research and Practice. 16 (4), 714-730 (2015).
  19. Harle, M., Towns, M. H. Students’ understanding of primary and secondary protein structure: Drawing secondary protein structure reveals student understanding better than simple recognition of structures. Biochemistry and Molecular Biology Education. 41 (6), 369-376 (2013).
  20. Dries, D. R., et al. An expanded framework for biomolecular visualization in the classroom: Learning goals and competencies. Biochemistry and Molecular Biology Education. 45 (1), 69-75 (2017).
  21. The BioMolViz Framework. BioMolViz. , Available from: http://biomolviz.org/framework (2021).
  22. Procko, K., et al. Meeting report: BioMolViz workshops for developing assessments of biomolecular visual literacy. Biochemistry and Molecular Biology Education. 49 (2), 278-286 (2021).
  23. Jmol: an open-source Java viewer for chemical structures. , Available from: http://www.jmol.org/ (2021).
  24. Wang, J., et al. iCn3D, a web-based 3D viewer for sharing 1D/2D/3D representations of biomolecular structures. Bioinformatics. 36 (1), 131-135 (2020).
  25. PyMOL . The PyMOL Molecular Graphics System. Version 2.0. , Schrödinger, LLC. (2021).
  26. Goddard, T. D., et al. UCSF ChimeraX: Meeting modern challenges in visualization and analysis. Protein Science. 27 (1), 14-25 (2018).
  27. Pettersen, E. F., et al. UCSF ChimeraX: Structure visualization for researchers, educators, and developers. Protein Science. 30 (1), 70-82 (2021).
  28. Petit, P., et al. The active conformation of human glucokinase is not altered by allosteric activators. Acta Crystallographica. Section D. 67 (11), 929-935 (2011).
  29. Corey, R. B., Pauling, L. Molecular models of amino acids, peptides and proteins. Review of Scientific Instruments. 24, 621-627 (1953).
  30. Koltun, W. L. Precision space-filling atomic models. Biopolymers. 3 (6), 665-679 (1965).
  31. Hodis, E., et al. Proteopedia - a scientific 'wiki' bridging the rift between three-dimensional structure and function of biomacromolecules. Genome Biology. 9 (8), 1-10 (2008).
  32. Prilusky, J., et al. Proteopedia: A status report on the collaborative, 3D web-encyclopedia of proteins and other biomolecules. Journal of Structural Biology. 175 (2), 244-252 (2011).
  33. Martz, E. FirstGlance in Jmol. , Available from: https://www.bioinformatics.org/firstglance/fgij/ (2021).
  34. Jmol User Design Environment (JUDE). MSOE Centerfor BioMolecular Modeling. , Available from: https://cbm.msoe.edu/modelingResources/jmolUserDesignEnvironment/#forward (2021).
  35. Castro, C. R., et al. A practical guide to teaching with Proteopedia. Biochemistry and Molecular Biology Education. 49 (5), 707-719 (2021).
  36. Berman, H. M., et al. The protein data bank. Nucleic Acids Research. 28, 235-242 (2000).
  37. The Protein Data Bank. , Available from: https://www.rcsb.org/ (2021).
  38. Wang, Y., et al. MMDB: 3D structure data in Entrez. Nucleic Acids Research. 28 (1), 243-245 (2000).
  39. iCn3D Help Page. , Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/icn3d/docs/icn3d_help.html (2021).
  40. MSOE Center for BioMolecular Modeling Jmol Training Guide. , Available from: https://cbm.msoe.edu/modelingResources/jmolTrainingGuide/started.html (2021).
  41. The Online Macromolecular Museum. , Available from: http://earth.callutheran.edu/Academic_Programs/Departments/BioDev/omm/exhibits.htm (2021).
  42. Jmol/JSmol Interactive Scripting Documentation. , Available from: https://chemapps.stolaf.edu/jmol/docs/ (2021).
  43. PyMOL Wiki. , Available from: https://pymolwiki.org/index.php/Main_Page (2021).
  44. PyMOL Advanced Scripting Workshop by Schrödinger. , Available from: https://pymol.org/tutorials/scripting/index.html (2021).
  45. UCSF ChimeraX User Guide. , Available from: https://www.cgl.ucsf.edu/chimerax/docs/user/index.html (2021).
  46. UCSF ChimeraX Tutorials. , Available from: https://www.rbvi.ucsf.edu/chimerax/tutorials.html (2021).
  47. Kuntz, I. D. Structure-based strategies for drug design and discovery. Science. 257 (5073), 1078-1082 (1992).
  48. Structure-based drug discovery: an overview. Hubbard, R. E. , (2006).
  49. Patrick, G. L. An introduction to medicinal chemistry, 6th ed. , Oxford University Press. (2017).
  50. Van Montfort, R. L., Workman, P. Structure-based drug design: aiming for a perfect fit. Essays in Biochemistry. 61 (5), 431-437 (2017).
  51. Holdgate, G. A., Meek, T. D., Grimley, R. L. Mechanistic enzymology in drug discovery: a fresh perspective. Nature Reviews. Drug Discovery. 17 (2), 115-132 (2018).
  52. Wang, M. Y., et al. SARS-CoV-2: structure, biology, and structure-based therapeutics development. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, (2020).
  53. White, B., Kim, S., Sherman, K., Weber, N. Evaluation of molecular visualization software for teaching protein structure differing outcomes from lecture and lab: Differing outcomes from lecture and lab. Biochemistry and Molecular Biology Education. 30 (2), 130-136 (2002).
  54. Canning, D. R., Cox, J. R. Teaching the structural nature of biological molecules: Molecular visualization in the classroom and in the hands of students. Chemistry Education Research and Practice. 2 (2), 109-122 (2001).

Tags

Biokjemi utgave 178
Modellering av et enzymaktivt nettsted ved hjelp av molekylær visualisering Freeware
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Procko, K., Bakheet, S., Beckham, J. … More

Procko, K., Bakheet, S., Beckham, J. T., Franzen, M. A., Jakubowski, H., Novak, W. R. P. Modeling an Enzyme Active Site using Molecular Visualization Freeware. J. Vis. Exp. (178), e63170, doi:10.3791/63170 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter