Denne artikel indeholder detaljerede protokoller for at påføre gennemtrængende traumatisk hjerneskade (PTBI) til voksen Drosophila og undersøge den resulterende neurogenese.
De molekylære og cellulære mekanismer, der ligger til grund for neurogenese som reaktion på sygdom eller skade, er ikke godt forstået. Men, forståelse af disse mekanismer er afgørende for at udvikle neurale regenerative behandlinger. Drosophila melanogaster er en førende model for undersøgelser af neural udvikling, men historisk set ikke er blevet udnyttet til at undersøge voksne hjerne regenerering. Dette skyldes primært, at den voksne hjerne udviser meget lav mitotisk aktivitet. Ikke desto mindre udløser gennemtrængende traumatisk hjerneskade (PTBI) til den voksne Drosophila centralhjerne generationen af nye neuroner og nye glia. De kraftfulde genetiske værktøjer, der er tilgængelige i Drosophila kombineret med den enkle, men strenge skadesprotokol, der er beskrevet her, gør nu voksen Drosophila-hjerne til en robust model til neural regenerationsforskning. Forudsat her er detaljerede instruktioner for (1) gennemtrængende skader på den voksne centrale hjerne og (2) dissektion, immunohistochemistry, og billeddannelse post-skade. Disse protokoller giver meget reproducerbare resultater og vil lette yderligere undersøgelser til dissekere mekanismer underliggende neural regenerering.
Skader på hjernen og nervesystemet er en væsentlig årsag til død og handicap på verdensplan. Omkring 1,5 millioner amerikanere lider traumatiske hjerneskader (TBI) hvert år1, mens en anslået 6 millioner personer i USA alene lider af neurodegenerative sygdomme, såsom Parkinsons og Alzheimers sygdom2. Både sygdom og skade på hjernen kan forårsage neural degeneration, hvilket fører til sensoriske, kognitive og motoriske defekter3. Udvikling af terapeutiske strategier for reparation af menneskers hjerne har været svært på grund af hjernens komplekse fysiologi. Modelorganismer som Drosophila melanogaster giver et simpelt system til at identificere de grundlæggende mekanismer, der ligger til grund for neurodegeneration og potentielle terapeutiske mål4.
Frugtfluen Drosophila melanogaster har været en stærk modelorganisme i mere end et århundrede, der fremmer områderne genetik, udviklingsbiologi og neurovidenskab5,6. Drosophila hjernen består kun ~ 90.000 neuroner7, en million gange færre end den gennemsnitlige menneskelige hjerne8, men de har mange ligheder. Både menneskelige og flyve hjerner udnytte neurotransmittere GABA, glutamat, acetylcholin, og biogene aminer dopamin og serotonin9. Drosophila og menneskelige neuroner fungerer også på samme måde, med en fælles synaptisk arkitektur og analoge neurale celletyper10. Drosophilas mindre hjernestørrelse og tilgængeligheden af avancerede genetikteknikker i kombination med bevarelsen af molekylære, cellulære og fysiologiske mekanismer mellem Drosophila og pattedyr gør det muligt for Drosophila-forskere at stille spørgsmål, der er upraktiske eller vanskelige at besvare i pattedyrmodeller.
Vores nuværende forståelse af voksen neurogenese i Drosophila, både under homøostase og efter skade, er fortsat begrænset. Mere er kendt om neurogenese under normal udvikling. For eksempel skabes neuroner og glia under udvikling fra prækursorer celler, kaldet neuroblaster10,11. Mindst tre forskellige typer neuroblaster er blevet skelnet i den centrale hjerne. Både type I og type II afstamning neuroblaster forlade cellecyklus ~ 20-30 h efter puparium dannelse12. I modsætning hertil svampen kroppen neuroblaster er de sidste til at opsige celledeling og gøre det via Reaper-afhængige apoptose ~ 85-90 h efter puparium dannelse13. Efter ekslosion, den voksne Drosophila hjernen har få dividere celler (~ 1 celle / hjerne), overvejende glia14. De voksne optiske lapper besidder langsomt cykling neuroblaster i stand til neurogenese15, mens den voksne centrale hjerne har ingen kendte neuroblaster. Manglen på neurale forfædre og begrænset cellespredning ligner stærkt situationen i den voksne pattedyrhjerne, hvilket understreger den potentielle relevans af mekanismerne for voksen neurogenese hos Drosophila for mennesker.
Opdagelsen af lave niveauer af voksen neurogenese i de voksne Drosophila optiske lapper efter skade15 førte til hypotesen om, at den voksne Drosophila centralhjerne også kunne være i stand til voksen neurogenese16. Denne protokol beskriver at skabe en streng, reproducerbar model af central hjerneskade hos voksne Drosophila, der kan bruges til at undersøge neurogenese i den voksne centrale hjerne. I betragtning af lighederne mellem human og Drosophila hjerne arkitektur og funktion, disse opdagelser kan føre til identifikation af kritiske mål for terapeutisk neurogenese i sårede og syge menneskelige hjerner.
Selv om gennemtrængende skader på den voksne Drosophila hjerne er blevet beskrevet tidligere15,17,18, disse skader fokuseret på de optiske lapper og ikke den centrale hjerne. Desuden mangler der indtil videre detaljerede instruktioner til, hvordan skaderne skal udføres. Denne protokol beskriver en model for gennemtrængende skade på den voksne Drosophila centralhjerne, der gengiver statistisk signifikante beviser for voksen neurogenese efter PTBI.
Reproducerbarheden af denne PTBI-protokol skyldes til dels svampekroppen som skadesmålområdet. Svampekroppen er stor, bestående af ~ 2200 neuroner med komplekse dendrit og axon arbors i store og meget stereotype arrays18. Cellelegemerne af svampekropsneuroner ligger nær hjernens overflade og kan visualiseres gennem hovedktikulaen ved hjælp af udtrykket af grønt fluorescerende protein (GFP) (Figur 1C). Mushroom krop prækursorer er de sidste neurale stamceller til at gennemgå apoptose under udvikling13,12,19. Således er mange champignon krop neuroner er temmelig unge på tidspunktet for ekslosion. Dette førte til hypotesen om, at svampen kroppen kan have mere mitotisk potentiale end andre hjerneområder16. Derudover er svampekroppen kritisk for læring og hukommelse18. Dette gør det muligt at spørge, om PTBI-udløst neurogenese fører til funktionel genopretning.
Andre faktorer, der bidrager til reproducerbarheden af resultaterne omfatter ved hjælp af outcrossed fluer af konsekvente genotyper, udfører krydser i samme retning hver gang, præcist kontrollere opdræt og aldring temperaturer, og analysere mænd og kvinder separat. Ved hjælp af F1 fluer fra en outcross reducerer sandsynligheden for at analysere hjerner homozygot for spontane mutationer. Standardkorset af y[1] w[1]; UAS-mCD8-GFP;; OK107-GAL4 voksne hunner til y[1] w[1] voksne hanfluer resulterer i F1 afkom af genotypen y[1] w[1]; UAS-mCD8-GFP/+;; OK107-GAL4/+. OK107-GAL4 er udtrykt i alle iboende neuroner af svampen kroppen og drev udtryk for membran-bundet reporter UAS-mCD8-GFP tillader visualisering af champignon organer og deres fremskrivninger. For perma-twin-krydsene skal kors til enhver tid forblive på 17 °C for at holde lineagesporingssystemet slukket. Dette sikrer, at ingen dividere celler er mærket under udvikling, og at kun voksen-fødte neuroner og glia er mærket. Til dette formål kan flyverummet også opretholdes ved 17 °C. Selv om den oprindelige beskrivelse af perma-twin system15 anbefalede opdræt flyver ved 18 °C, kan dette føre til betydelig baggrund mærkning.
For konsistens anbefales det også at holde kontrollen uskadte fluer på CO2-puden , da man udfører PTBI. Dette sikrer, at begge sæt fluer har identisk bedøvelseseksponering. Derudover er det ønskeligt, at reproducerbarheden helt trænger ind i hovedet. Man skal dog passe på ikke at bøje spidsen af stiften mod puden, hvilket gør den ubrugelig til fremtidige skader. For dygtige praktikere er der lidt utilsigtet skade på PTBI fluer. Ikke desto mindre kan det være dødeligt at trykke for hårdt på brystkassen for at stabilisere fluen under skade. En måde at vurdere omfanget af den utilsigtede skade på er at kvantificere PTBI-fluernes dødelighed på 24 timer efter skaden. For ensidigt skadede fluer kan dette være 50% eller højere for begyndere. For at sikre, at observerede resultater skyldes PTBI og ikke utilsigtet skade, anbefales det derfor, at begyndere øver sig i at administrere PTBI på ~ 20 fluer dagligt over flere uger og ikke analyserer de resulterende hjerner, før 24 timers dødeligheden konsekvent er <10%.
For at kvantificere mængden af spredning stimuleret af central hjerne PTBI, både anti-fosfohistone H3 (PH3) immunstaining og 5-ethynyl-2′-deoxyuridin (EdU) inkorporering kan anvendes. Anti-PH3 etiketter celler før og i hele metafase, begrænse detektion til kun en brøkdel af de aktivt dividere celler. Således giver anti-PH3 farvning kun et delvist glimt af spredning. EdU er en thymidin analog, der kan indarbejdes i nyligt syntetiseret DNA. Ved fodring fluer EdU før og efter skade, er det muligt at få et mere komplet billede af de celler, der enten deler eller har delt efter skaden. Det faktum, at alle celler, der deler er permanent markeret er nyttigt både for identifikation af langsomt cykling celler og analysere overlevelsen af celler efter indledende spredning. Af uklare årsager, men måske på grund af begrænset gennemtrængelighed af blod – hjerne barrieren, EdU mærkning er ineffektiv og underrapporterer cellespredning i den voksne hjerne. Dette fremgår af det samme antal PH3+ og EdU+-celler i både kontrol- og eksperimentelle hjerner ved 24 timer efter PTBI og ved at observere, at kun en delmængde af nye celler i perma-twin kloner inkorporerer EdU16. For maksimal mærkning er det vigtigt at pre-feed fluerne med EdU, fordi skadede fluer ikke genoptager fodring i flere timer efter PTBI. Fodring blev vurderet ved at tilføje mad farve til EDU løsning og overvågning af mængden af farvestof i tarmen gennem abdominal kutikula16.
Det skal bemærkes, at mens vi har givet en hjerne dissektion protokol i trin 4, alternative teknikker kan anvendes. Flere af disse er tilgængelige i tidligere offentliggjorte protokoller20,21,22. Drosophila melanogaster tilbyder en billig model med kraftfulde genetiske og molekylære værktøjer, der kan bruges til at studere de mekanismer, der ligger til grund for regenerering af flere væv, herunder tarmen og komponenterne i nervesystemet. En ny og reproducerbar skadesmodel, der kan bruges til at studere reaktionen på hjerneskade, er skitseret her. Data opnået ved hjælp af disse protokoller understøtter ideen om, at den voksne Drosophila centralhjerne bevarer den proliferative evne og genererer nye neuroner som reaktion på skade. Disse observationer berettiger yderligere undersøgelse af både omfanget af voksen neurogenese og dens underliggende molekylære mekanismer. Når de komponenter, der er involveret i neural regenerering er identificeret i dette system, kan vi konvertere vores viden om voksne Drosophila neurogenese til mennesker.
The authors have nothing to disclose.
Vi er Stacey Rimkus og Becky Katzenberger taknemmelige for teknisk bistand og Eduardo Moreno for at dele perma-twin lagrene. Vi vil gerne takke Barry Ganetzky og David Wassarman for livlige diskussioner, der utvivlsomt forbedret videnskab og Kent Mok, Cayla Guerra, og Bailey Spiegelberg for deres bidrag til laboratoriet. FasII antistofferne blev udviklet af Corey Goodman og fremstillet fra Developmental Studies Hybridoma Bank, skabt af NIH’s NICHD og vedligeholdt på The University of Iowa, Department of Biology, Iowa City, IA 52242. De fleste af de Drosophila stammer, der anvendes i denne undersøgelse blev fremstillet fra Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC; NIH P40OD018537). Dette arbejde blev støttet af NIH T32 GM007133 (KLC); NIH NS090190 (GBF); NIH NS102698 (GBF); University of Wisconsin Graduate School (GBF); og UW-Madison Women in Science and Engineering Leadership Institute (WISELI) (GBF).
#11 disposable scalpels | Santa Cruz Biotechnology | sc-395923 | used for separating Drosophila heads from trunks prior to brain dissection |
150 mm diameter black Sylgard dishes | Dow | 1696157 | made in the laboratory with reagents from Dow; used for brain dissection |
18 mm coverslips | any | for mounting brains on microscope slides | |
4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI) | ThermoFisher | D1306 | for immunohistochemistry |
70% Ethanol | made from 95% ethanol sourced variously | ||
anti-mouse Cy5 | Jackson ImmunoResearch | 715-175-151 | for immunohistochemistry |
anti-rabbit 568 | ThermoFisher | A11036 | for immunohistochemistry |
bovine serum albumin (BSA) | SIgma Aldrich | A7030 | for immunohistochemisty |
Clear nail polish | any | for sealing coverslips | |
Click-It EdU labeling kit | InVitrogen | C10640 | to detect newly synthesized DNA |
CO2 bubbler | Genesee Scientific | 59-181 | for anesthesia |
CO2 pad | Genesee Scientific | 59-114 | for anesthesia |
CO2 regulator and supply | any | for anesthesia | |
Confocal microscope | any | for imaging fixed, stained and mounted brains | |
cotton plugs | Genesee Scientific | 51-101 | for EdU labeling |
Drosophila vials | Genesee Scientific | 32-109 | for EdU labeling |
Fix buffer (Pipes, EGTA, Magnesium; PEM) | components sourced from various companies | for fixing adult brains; 100 mM piperazine-N,N’-bis(2-ethanesulfonic acid) [PIPES], 1 mM EGTA, 1 mM MgSO4, pH 7.0 | |
Formaldehyde | Sigma Aldrich | 252549 | for fixing adult brains, added to PEM |
Grade 3 round Whatman filters, 23 mm round | Tisch Scientific | 1003-323 | for EdU labeling |
Microfuge tubes | any | for fixing and staining reactions and for storing Minutien pins | |
Microscope slides | any | for mounting brains | |
Minutien pins | Fine Science Tools | 26002-10 | for brain injury; 12.5 μm diameter tip and 100 μm diameter rod |
mouse anti-Fasiclin II | Developmental Studies Hybridoma Bank | 1D4-s | for immunohistochemistry |
NIGHTSEA stereo microscope fluorescence adaptor | Electron Microscopy Sciences | SFA-GR | fluorescence setup for dissecting microscope |
P20, P200 and P1000 pipettors and tips | any | for measuring solutions | |
phosphate buffered saliine (PBS) | components sourced from various companies | for dissecting brains and making immunohistochemistry blocking and washing solutions; 100 mM of K2HPO4, 140 mM of NaCl, pH 7.0 | |
phosphate buffered saline with 0.1% Triton X-100 (PT) | components sourced from various companies | for washing dissected brains | |
phosphate buffered saline with 0.1% Triton X-100 + 2% bovine serum albumin (PBT) | components sourced from various companies | blocking solution for immunohistochemistry and for diluting antibodies | |
rabbit anti-PH3 | Santa Cruz Biotechnology, Inc | sc-8656-R | for immunohistochemistry |
Reinforcement labels | Avery | 5721 | to maintain space between the microscope slide and the coverslip |
Size 0 paintbrushes | any | to manipulate and stabilize adult Drosophila during injury | |
Triton X-100 | Sigma Aldrich | 93443 | |
Two pair of #5 watchmakers forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | used to hold the Minutien pins and for brain dissections |
Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | mounting medium for microscope slides |