Summary
この記事では、成人 ショウジョウバエ に外傷性脳損傷(PTBI)を与え、その結果として生じる神経新生を調べるための詳細なプロトコルを提供します。
Abstract
疾患や傷害に応答して神経新生の根底にある分子および細胞のメカニズムはよく理解されていない。しかし、これらのメカニズムを理解することは、神経再生療法を開発するために不可欠です。 ショウジョウバエメラノガスター は、神経発達の研究のための主要なモデルですが、歴史的に成人の脳再生を調査するために利用されていません。これは主に、成人の脳が非常に低い有糸分裂活性を示すためです。それにもかかわらず、成人 ショウジョウバエ 中枢脳に外傷性脳損傷(PTBI)を貫通することは、新しいニューロンおよび新しいグリアの生成を引き起こす。 ショウジョウバエ で利用可能な強力な遺伝ツールは、ここで説明されている単純だが厳格な傷害プロトコルと組み合わせることで、成人 ショウジョウバエ 脳を神経再生研究のための堅牢なモデルにしています。ここでは、(1)成人の中枢脳への貫通傷害および(2)解剖、免疫組織化学、および傷害後のイメージングに関する詳細な指示を提供する。これらのプロトコルは、非常に再現性の高い結果をもたらし、神経再生の基礎となるメカニズムを解剖するための追加の研究を容易にする。
Introduction
脳や神経系の損傷は、世界中の死と障害の主な原因です。毎年約150万人のアメリカ人が外傷性脳損傷(TBI)に苦しんでいますが、米国だけでも推定600万人がパーキンソン病やアルツハイマー病2などの神経変性疾患に苦しんでいます。脳の病気と傷害の両方が神経変性を引き起こし、感覚、認知、運動障害につながる3。人間の脳修復のための治療戦略の開発は、脳の複雑な生理学のために困難であった.ショ ウジョウバエメラノガスター などのモデル生物は、神経変性および潜在的治療標的の基礎となる基本的なメカニズムを同定するための簡単なシステムを提供する4。
ショウジョウバエのメラノガスターは、遺伝学、発生生物学、神経科学の分野を進め、1世紀以上にわたり強力なモデル生物となっています。ショウジョウバエ脳は、平均的な人間の脳8よりも100万倍少ない約90,000ニューロン7を含むが、多くの類似点を有する。人間と飛ぶ脳の両方は、神経伝達物質GABAを利用します, グルタミン酸, アセチルコリン, そして、バイオジェニックアミンドーパミンとセロトニン9.ショウジョウバエとヒトニューロンも同様に機能し、共有シナプスアーキテクチャと類似性神経細胞タイプ10を有する。ショウジョウバエの脳サイズが小さく、高度な遺伝学技術が利用可能で、ショウジョウバエと哺乳類の間の分子、細胞、生理学的メカニズムの保全と組み合わせて、ショウジョウバエの研究者が哺乳類モデルでは非現実的または答えにくい質問をすることができます。
ショウジョウバエの成人神経新生に関する我々の現在の理解は、ホメオスタシスおよび後の傷害の両方において、依然として限られている。より多くの正常な発達中の神経新生について知られています。.例えば、ニューロンとグリアは、神経芽細胞10,11と呼ばれる前駆細胞からの発達中に作成されます。少なくとも3種類の神経芽細胞が中央脳で区別されている。I型とII型系統神経芽細胞は、両方とも、puparium形成後〜20〜30時間後に細胞周期を出る12。対照的に、キノコ体神経芽細胞は、細胞分裂を終了する最後であり、子犬の形成後にリーパー依存性アポトーシス〜85〜90時間を介してそうする13。次いで、成人ショウジョウバエの脳は、分裂細胞(〜1細胞/脳)が少なく、主にglia14である。成人の視神経葉は神経新生15が可能なゆっくりとサイクリング神経芽細胞を有し、成人中央脳は既知の神経芽細胞を有しない。神経前駆物質の不足と限られた細胞増殖は、成人哺乳類の脳の状況に強く似ており、ショウジョウバエにおける成人神経新生のメカニズムの潜在的な関連性を人間に強調している。
傷害15後の成人ショウジョウバエの視神経新生における成人神経新生の低レベルの発見は、成人ショウジョウバエ中枢脳も成人神経新生が可能であるかもしれないという仮説につながった。このプロトコルは、成人中枢脳の神経新生を調査するために使用できる成人ショウジョウバエにおける中枢脳損傷の厳格で再現可能なモデルを作成することを説明する。ヒトとショウジョウバエの脳アーキテクチャと機能の類似性を考えると、これらの発見は、負傷および病気の人間の脳における治療神経新生の重要な標的の同定につながる可能性がある。
Protocol
このプロトコルは、UW-Madisonの動物ケアガイドラインに従います。
1. PTBIの成人 ショウジョウバエ 生成
- 標準の十字架の場合は、20 バージン y[1] w[1]を配置します。UAS-mCD8-GFP;;OK107-GAL417成人女性と10 y[1]w[1]17成人男性は、食品を含むバイアル(材料表を参照)で一緒に飛びます。多数の同期子孫を使用するには、同時に 10 ~ 20 の十字を設定します。標準の十字は、遺伝子型のF1子孫を生じさせる: y[1] w[1];UAS-mCD8-GFP/+;;OK107-GAL4/+。
- 交配と産卵のために25°Cにバイアルを置きます。子孫を最大化するには、2〜4日ごとに新しいバイアルに両親を移し、以前のバイアルを25°Cで維持します。 両親が最初に入れられた18日後に各バイアルを捨て、F2の子孫がいないことを確認します。
注:親の各セットから3セットの子孫(「broods」)を生成することができます。 - F1の子孫が閉じ始める日から10日が経過したら、確認してください。
- 交配と産卵のために25°Cにバイアルを置きます。子孫を最大化するには、2〜4日ごとに新しいバイアルに両親を移し、以前のバイアルを25°Cで維持します。 両親が最初に入れられた18日後に各バイアルを捨て、F2の子孫がいないことを確認します。
- 系統学的研究のために, 遺伝子型のF1パーマ双子の男性15 を使用してください: w;FRT40A, UAS-CD2-RFP, UAS-GFP-Mir/FRT40A, UAS-CD8-GFP, UAS-CD2-Mir;浴槽 -GAL80ts/act-GAL4 UAS-flp.一貫性を保つには、毎回同じ方向に交差します。
- パーマ双子の男性を生成するには, 場所 20 処女 w;FRT40A, UAS-CD2-RFP, UAS-GFP-Mir;浴槽-GAL80ts/TM6B女性および10のw;FRT40A, UAS-CD8-GFP, UAS-CD2-Mir;act-GAL4 UAS-flp/TM6B15 成人男性は、食品を含むバイアルで一緒に.
- 交配と産卵のために17°Cにバイアルを置きます。両親を新しい食べ物のバイアルに7日ごとに移し、17°Cですべてのバイアルを維持します。 両親が最初に入れられた35日後に各バイアルを捨て、F2の子孫がいないことを確認します。
- F1の子孫が閉じ始める日から21日後に確認してください。
2. 外傷性脳損傷の貫通 (PTBI; 図1)
- 新しく閉じた F1 フライを並べ替えます。6時間以内に若い男性を選択して、6時間の後のエローション。これらの男性は、バイアルあたり40以下のハエで、食べ物を含むきれいなバイアルに入れられます。
注:これは、CO2 パッド上のハエを麻酔し、まだ腸内にメコニウム(腹壁を通して暗い緑色のスポットとして見える)を持つ成人男性を特定することによって、午前中に最も簡単に達成されます。 - 5-エチニル-2'-デオキシウリジン(EdU)を使用して前供給する( 材料表を参照)EdUで細胞を分割することを計画している場合、傷害の前に6時間。詳細については、ステップ 3 を参照してください。
- 70%エタノールを充填した1.5 mLマイクロ遠心分離管に100ピンを入れることにより、ミヌティエンピン( 材料表を参照)を5分間消毒します。
- 70%エタノールを噴霧し、清潔な糸くずのないティッシュで乾燥させてCO2 パッドとペイントブラシを消毒します。工具が清潔で乾燥したら、40人以下の並べ替えられたF1男性を清潔なパッドに戻します。
- フライパッド上の2つのグループにF1の男性を分離します。1つのグループは、コントロール、怪我をしていないハエとして機能します。第2の実験群はPTBIに供される。
- 鉗子を使用して、マイクロ遠心分離管から4-5の新しいMinutienピンを引き出し、CO2 パッドの端の近くに置きます。解剖スコープの下で、鋭いポイントを持つまっすぐなミヌーティエンピンを選択してください。
注: 実験に Minutien ピンを 1 本使用すると、変動性が減少します。鋭いピンを再利用します。70%エタノールを含む別の1.5 mLマイクロ遠心分離チューブに損傷または鈍いピンを入れ、安全に処分します。 - 標準の十字型のハエを使用する場合は、ステレオ顕微鏡の発光ダイオード(LED)ランプに、緑色蛍光タンパク質(GFP)用の適切な励起フィルタと発光フィルタを装備したスイッチをオンにします。これにより、440-460 nMで励起が可能となり、500-560 nMの可視化が可能になります。
注:このランプとフィルタセットを使用すると、キノコ本体の細胞体が頭のキューティクルを通して緑色に蛍光を発します(図1C)。パーマツインハエや他の遺伝子型のハエの場合、ステレオ顕微鏡用の標準的な白色光照度器を使用して、キノコの身体に損傷を標的にするための頭部キューティクルのランドマークを視覚化することができます(図1C)。 - 鉗子を使用して、選択したMinutienピンを片手で拾い上げ(右利きの人のために、これは通常は右手です)、もう一方の(通常は左)手の絵筆を持ち上げてください。実験グループからハエを選択し、右にハエの頭を持つヘッドカプセルの後ろ図を持っているようなハエを配置します。胸郭の前部にブラシを置き、軽く押し下げてハエを安定させる。
- 頭の右側にあるキノコ本体の細胞体にミヌーティエンピンの先端を向け、ヘッドカプセルを貫通します。ランドマークを使用する場合は、オセリと眼の後縁の間の後頭のキューティクルをターゲットにします(図1)。
- 怪我をした後、ペイントブラシを使ってミヌーティエンピンから頭をそっと押し出します。
- RNA-SeqまたはqRT-PCRに脳を使用する場合は、頭の左側に2度目の損傷を与えます。
- 実験グループ内のすべてのハエを傷つけるには、ステップ2.8~2.10を繰り返します。
- すべてのハエが負傷したら、コントロールと負傷したハエを食品を含むラベル付きの別々のバイアルに入れられます。ハエが麻酔から回復し、その後の老化の間にハエが食物に巻き込まれるのを防ぐために、バイアルを水平に(すなわち、彼らの側面に)置きます。
- 標準のクロスハエを25°Cに置き、パーマツインハエを30°Cで老化します。
- 24時間を超えるハエの場合は、1~2日ごとに清潔な食べ物に入れられます。
3. EdU ラベリング
- 10 mM 5-エチニル-2'デオキシウリジン(EdU)の在庫をジメチルスルホキシド(DMSO)で準備します。これは-20°Cで12ヶ月まで貯えることができる。
- 50 μM EdU の 200 μL を 10% スクロースで準備します。PTBIの前に6時間のエドゥとのプレフィードフライ。
- 20μM EdUを10%スクロースに200 μL、23mmの丸いグレード3のフィルターペーパー( 材料表を参照)に空のバイアルに入れてください。
- ハエをバイアルに入れる。その後、綿のプラグでバイアルを密封します。
- 25°Cで6時間、加湿インキュベーターにバイアルを水平に置きます。
- ステップ 2.3-2.10 の説明に従って PTBI を実行します。
- ハエをEdU含有バイアルに戻します。バイアルを綿栓で密封します。
- 25°Cの加湿インキュベーターでバイアルを水平に24時間横に置きます。以下に説明するいずれかの手順に従います(ステップ3.8.1-3.8.3)。
- ステップ4で説明したように、固定剤、洗浄バッファー、およびブロッキングバッファーを使用して、アジドを使用して脳を解剖し、固定し、抗体染色前に行ったEdU検出反応を用いた。
- ハエを新しいフィルターペーパーを含むクリーンバイアルに移し、50 μM EdUを10%スクロースに200 μLします。バイアルを25°Cインキュベーターに水平に置きます。ラベリングの間は 24 時間ごとに繰り返します。そして、抗体染色の前に行ったEdU検出反応を用いてアジ化のない緩衝液を用いてステップ4に記載したとおりの脳を解剖して固定する。
- EdUでパルスチェイスラベルを使用するには、24時間ごとにエハを新しいフィルターペーパーを含むクリーンバイアルに、200 μLの50 μMを10%スクロースに移します。パルス期間の後(例えば、4日間)、ハエを標準的なショウジョウバエ食品を含むバイアルに移す。バイアルを25°Cインキュベーターに3日間置きます。そして、抗体染色の前に行ったEdU検出反応を用いてアジ化のない緩衝液を用いてステップ4に記載したとおりの脳を解剖して固定する。
4. 解剖、免疫検査、実装
- 100 μLの固定液を備えた1.5 mLマイクロ遠心分離管を準備します:PEM(100 mMピペラジンN、N'-ビス(2-エタンスルホン酸)[PIPES]、1 mM EGTA、1 mM MgSO4、pH 7.0 を参照)および氷上の場所に4%ホルムアルデヒドを使用します。
注:1つの遺伝子型と状態の20の脳は、単一のチューブで処理することができます。 - 70%エタノールの1つの小さなプール(約100 μL)とリン酸緩衝生理食塩水の3つの小さなプール(PBS;K2HPO4の100 mM、NaClの140 mM、pH 7.0)を備えた解剖プレートを準備します。
- 70%エタノールで消毒されたCO2 パッド上で、10個のコントロールまたは実験的なハエを麻酔します。
- メスを使用して各フライのトランクから頭を分離します。
- 70%エタノールで濡れたペイントブラシでヘッドを集め、解剖プレートのエタノールプールに2〜5分間ヘッドを置きます。
注:これはわずかに脳を脱水し、彼らは頭のキューティクルから離れて解剖することが容易になります。 - 頭部をPBSの約100 μLプールに移し、脳を解剖し、各脳をPBSのクリーンな~100 μLプールに移動させます。2組のウォッチメーカーの鉗子を使用してヘッドキューティクルの後ろを開き、1組の鉗子でキューティクルを保持し、2番目の鉗子の閉じた先端を使用してキューティクルから脳をそっと詮索します。
- 切断された脳を、切断され、脳の侵入を可能にするためにbeveedされたプラスチックチップを備えたP200ピペットを使用して、固定溶液の100 μLを含むマイクロ遠心分離管に移します。
- 室温で20〜25分の固定。P200またはガラスピペットで慎重に取り外します。
- 1 mLの'PT'(PBSプラス0.1%トリトンX-100)で固定脳を4回洗浄し、各洗浄の間に数分間脳を落ち着かせる。
注:脳が激しく落ち着かないと、まだ脂肪の体や気管が付いている可能性が高いです。 - PBSの1 mLに0.1%トリトンX-100および2%ウシ血清アルブミン(PBT)のブロックサンプルを室温で〜1時間用いた。
- ブロッキング溶液を取り除き、PBTで4°Cで一晩100μLの一次抗体溶液を含むサンプルをインキュベートします。本研究で使用される一次抗体は、ウサギの抗PH3(1:500)およびマウス抗ファシクリンII(1:20)である( 材料表参照)。
- PTの1 mLでサンプルを5回洗浄し、脳が各洗浄の間に数分間落ち着くことを可能にする。
- 最終洗浄を取り除き、4°Cで一晩100μLの二次抗体溶液をインキュベートします。 ここで使用される二次抗体は、抗ウサギ568(1:400)および抗マウスCy5(1:100)です( 材料表参照)。
- PTの1 mLでサンプルを5回洗浄し、脳が各洗浄の間に数分間落ち着くことを可能にする。最後の洗浄中に、4',6-ディアミディノ-2-フェニリンドール、ジ塩酸塩(DAPI;10 μM溶液の1:100)を10分間加えて核を染色します。洗浄を取り外し、各チューブに50~100μLを残します。
- 各スライドの中央に1枚の自己接着補強ラベルを配置し、アンチフェードマウントメディアの50 μL液滴を各ラベルの中央に配置して、顕微鏡スライドを準備します( 材料表を参照)。補強ラベルは、スライドの少し上にカバースリップを保持し、取り付けられた脳が過度に平坦化するのを防ぎます。
- 慎重にカットとベベリングプラスチックチップを装備したP200を使用して、可能な限り少ない洗浄バッファーで準備スライドに各マイクロ遠心チューブから脳を転送します。1つのスライドに10の頭脳を取り付けることができます。
- 各スライドにカバースリップを配置し、マニキュアでスライドを密封する前に、フォースを使用して脳をそっと再配置します。後側を上または前側のどちらかを上にして脳を向けるが、互いに触れ合うべきではない。
注:脳全体を通して高品質の共焦点画像を得ることは困難であるため、一部の脳は各方向に取り付ける必要があります。 - 準備スライドを平らにして、4°Cの暗闇の中でイメージングまで保管してください。長期保存(1年まで)の場合、スライドは-20°Cで保存することができます。
5. 共焦点イメージング
注:DAPIおよび蛍光二次抗体(すなわち、405 nm、488 nm、および568 nm、633nm)に適した励起レーザーおよび放出フィルターキューブを用いるレーザー走査型共焦点顕微鏡を用いる画像脳。
- 顕微鏡、レーザー、コントローラー、コンピュータの電源を入れます。
- 取得ソフトウェアを開きます。
- 取得モードでは、最大 4 つのチャンネルを選択し、目的のチャンネルの順次スキャンのパラメータを設定します。各チャンネルのレーザーパワーを5~10%に上げます。
- 顕微鏡の上にスライドを置きます。
- 蛍光性付着を使用して画像化する脳を選択します( 材料表を参照)。
- 取得モードで、フレーム寸法として 1024 x 1024 ピクセルを選択します。
- 取得モードで Z-stack オプションを選択し、Z-stack を 2 μm のセクションで取り出す必要があることを示し、サンプルを通して焦点を合わせ、イメージする上と下の焦点面を選択します。
- 60xの目的を使用してキノコの体などの20xの目的と特定の脳領域を使用して、脳全体のZスタック画像を収集します。
6. データ分析
- 増殖する細胞とパーマツインクローンの数を手動で定量化するか、画像解析ソフトウェアを使用して数値を定量化します( 資料表を参照)。ソフトウェアを使用する場合は、10μm以上の領域を含む対象領域(ROI)を選択します。
Representative Results
PTBIは細胞増殖を刺激する
中枢脳PTBI後の神経新生の程度を決定するために、増殖反応は、エブロシスの6時間以内に収集および負傷した若年成人男性で測定された。増殖の有意な増加は、抗ホスホヒストン3(PH3)を用いて24時間後傷害を観察した。コントロール中枢脳の約3個のPH3+細胞と、負傷した中央脳の11個のPH3+細胞が24時間ポストPTBIで観察される(図2A-D)。分裂細胞の大部分は、傷害部位の近くに位置しています。細胞分裂のための第二のアッセイは、単一の傷害からの累積細胞増殖を定量化し、新たに作成された細胞がどの程度生き残ったかを評価するために使用された。5-エチニル-2'-デオキシウリジン(EdU)は、新たに合成されたDNAおよびDNA合成を経た細胞を永久に標識する細胞に組み込むことができるチミジン類似体である。ハエはEdUの4日間のパルスを与えられ、続いて3日間の追跡が行われました。これにより、標識された細胞は生存可能であり、増殖後少なくとも3日後に生存した。7日までに、コントロール中央脳に平均2個のEdU+細胞があり、負傷した中央脳にはそれぞれ平均11個のEdU+細胞が存在した(図2E)。これは、PH3抗体を用いて24時間後傷害を得た結果と同様である。細胞増殖を14日で測定すると、無傷のコントロールは中央脳あたり平均1 EdU+細胞を測定し、負傷した脳は平均29個のEdU+細胞(図2E)を記録し、PTBIの後の第2週には細胞増殖が少なくとも続いていることが示された。
細胞増殖は年齢依存性
中枢脳における最大の増殖反応は、エブロス後の最初の24時間内に観察された(図3)。7日後のエローションによって、貫通傷害は依然として増殖の有意な増加を引き起こし、中央脳当たり平均6PH3+細胞を有する。それでも、14日後のエローションによって、PTBIに続いて細胞が分裂する能力は、コントロール脳と同様に1分割細胞に有意に低下する(図3)。したがって、PTBI後の細胞増殖の可能性は、年齢依存性である。
新しく作成されたニューロンは、ターゲット領域を修正するために投影することができます
PTBI後の神経再生を評価するために、パーマツイン標識システム15を用いた。パーマツイン系統トレースは、緑色蛍光タンパク質(GFP)または赤色蛍光タンパク質(RFP)15で細胞とその子孫を永久に標識します。負傷したサンプルでは、コントロールよりも2日と2週間でより多くのペルマツインクローンが検出された(図4A-E)。特に、PTBI脳の約50%に新しいキノコの体ニューロンが2週間損傷後にあった(図4N)。これらの新しいニューロンは、キノコの体のカリックスとその軸索に適切にデンドライトをキノコの体の葉に適切に投影した(図4D、F、G)。これは、新しく作成された細胞が損傷したキノコの体の修復に関与する機能的なニューロンである可能性があることを示しています。再生すると思われる脳の他の領域には、楕円体(EB)(図4H、I)、アンテナローブ(AL)(図4J、K)、および大きなクローンを有する横角(LH)(図4L、M)がそれぞれ約26%、26%、20%の時間を有する(図4N)。これらの結果は、成人の神経新生の調査のためのこのシステムの有用性を強調する。PTBIに続く一連のイベントと新しいニューロンの生成に向けた提案されたモデルを図5に示す。
図1:小児性ショウジョウバエ中枢脳への外傷性脳損傷(PTBI)の貫通。 (A)大人のフライヘッドの外装の模式図。これは正面図です。したがって、動物の右側は視聴者の左にある。(B)灰色で示された傷害軌道を有する成人ショウジョウバエ頭部の内部の模式図。これは後景です。したがって、この画像とその後の図では、脳の右側が右側にあります。中枢脳PTBIは、キノコの体(緑色)と脂肪体(青)とヘモ細胞(赤)を含む脳外の組織を含む複数の脳構造に影響を与えます。CB = 中央脳領域.OL= オプティックローブ領域。(C)キノコ体(矢印頭)が緑色蛍光タンパク質(GFP)で標識されている生きた成人の頭部の逆体図。これは「標準遺伝子型」です(詳細はテキストを参照)。PTBIプロトコルは、キノコの体に損傷を再現します.この図は、Reference16 から適合されています。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:PTBIは細胞増殖を刺激する。無傷の制御(A)とPTBI(B)の回路図。右上の青いボックスは、パネル(C)と(D)でより高い倍率で示される脳領域を示しています。(C,D)PH3抗体(赤色)を使用して、傷害後24時間の細胞増殖をアッセイした。コントロールブレイン(C)では、PH3+細胞はほとんどなく、MBの近くに存在しません。しかし、PTBI脳(D)では、MBの近くにPH3+細胞があります。(e) 増殖細胞の定量化この数字は、キノコの体の近くだけでなく、脳全体に増殖する細胞を反映しています。24時間で、無傷のコントロール脳は平均3PH3+細胞/脳(n = 11脳、28細胞)を持ち、24時間ポストPTBI、脳は平均11 PH3+細胞/脳(n = 17脳、181細胞)を持っていた。7日間で、無傷のコントロールはEdU+細胞がほとんどなく、平均2つのEdU+細胞/脳(n = 15の脳、24個の細胞)、7日間のポストPTBI脳は平均11個のEdU+細胞/脳(n = 22脳、238細胞)を有する。14日で、無傷のコントロールは平均1 EdU +細胞/脳(n = 8脳、11細胞)を有し、14日間のポストPTBI脳は平均29個のEdU+細胞/脳(n = 14脳、400細胞)を有する。この実験のセットでは、エブロシスの6時間以内の若年成人男性が使用された。3時点の制御とPTBIサンプルの非対t検定は、それぞれp<0.0001、p<0.0001、p<0.0002の降伏値を得る。誤差範囲は標準偏差(SD)を反映しています。この図は、Reference16 から適合されています。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:PTBIに対する増殖反応は年齢とともに減少する。 傷害後に生じる細胞増殖の量に年齢が影響を及ぼすかどうかを調べるため、新たに閉鎖された成人男性をPTBIの7日、14日、および28日前に動物と比較し、傷害後24時間で細胞増殖をアッセイするために抗PH3を用いた。エブロセンの6時間以内に負傷したハエは、年齢に一致したコントロール(n = 11脳、28細胞)の平均3 PH3+細胞/脳と比較して、平均11 PH3+細胞/脳(n = 17脳、182細胞)を有していた。7日齢のハエは、その後PTBIを受け、平均2 PH3+細胞/脳(n = 5脳、12細胞)の年齢に一致した対照と比較して、平均6PH3+細胞/脳(n = 11脳、65細胞)を有していた。ハエがPTBIの14日前に老化し、24時間後にアッセイされたとき、年齢に一致したコントロールと同様に平均1 PH3+細胞/脳(n = 8脳、11細胞)があり、平均1 PH3+細胞/脳(n = 4脳、2細胞)であった。28日間の無傷のコントロール(n = 4、1細胞)およびPTBI(n = 3、1細胞)は、いずれも平均0PH3+細胞/脳を飛ぶ。PTBI がこれら 4 つの時点で比較を制御するための非対 t 検定は、それぞれ p<0.0001、p<0.04、p<0.07、p<0.84 です。この図は、Reference16 から適合されています。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:パーマツイン系統トレースは、PTBIに続く軸索の脳再生および適切なターゲティングを示す。パーマツイン系統トレースシステム15を利用して、PTBI後の神経新生を解析した。このシステムは、緑色蛍光タンパク質(GFP)または赤色蛍光タンパク質(RFP)で細胞および子孫を永久に標識します。ハエは開発中にシステムをオフに保つために17°Cで飼育しました。パーマツイントランス遺伝子を運ぶF1雄は、卵管の際に採取し、その後、負傷し、30°Cで2〜14日間回復した。(A) 2日間の怪我のないコントロールでは、脳全体に散在するGFP+細胞がいくつかあります。(B)14日目に、コントロール中央脳に存在するGFP+細胞は比較的少ない。(C)それに比べて、2日間の負傷した脳は、傷害(矢頭)の近くに集まりがちなGFP+細胞が多い。(D) 傷害後14日で、傷害部位の近くに大きなクローンがある。これらのクローンのいくつかは、キノコの体管に沿って投影軸索を持っています (矢印頭).GFP チャネルのみがここに表示されます。PTBI サンプルには同様の RFP+ クローンがありました。(E)クローンの数は時間の経過とともに増加するPTBI.Controlの無傷の脳(n = 13)は2日で平均10クローンを有し、2日間のPTBI脳(n = 20)は平均23クローン(p<0.00002)を有する。7日で、制御脳は脳あたり平均9クローン(n = 18)を持ち、7日間のPTBI脳は脳あたり平均39クローン(n = 16)を持っていた(p値<0.00000002)。これは、損傷後2日(p値<0.0009)で見られたクローンの数よりも有意に多い。14日間のコントロール脳では、脳あたり平均10クローンがあり、これは2日間および7日間のコントロールと有意に変わりません。しかし、PTBI後の14日間で、平均66 GFP+クローンがあり、これは年齢に一致したコントロール(p<0.0000003)または2日間のポストPTBI脳(p値<0.0001)よりも有意に多い。エラーバーはSDを反映します. (F-M) PTBIは、脳内の複数の領域でクローン形成を刺激します.左側のパネルは、PTBI後14日に大きなクローンが発見された脳領域の模式図である(A、H、J、L)。右側のパネルは、代表的な脳(G、I、K、M)の高い倍率を示しています。多くの14日間の脳は、特定の標的領域に投影されたクローンを持っていた。これらには、キノコ本体(MB)(F,G)、楕円体(EB)(H,I)、アンテナローブ(Al)(J,K)、横角(LH)(L,M)が含まれていました。(N)クローン数とクローンサイズの両方が時間ポストPTBIと共に増加する。大きなクローンを持つ脳領域の割合は、コントロールおよび負傷した脳で2、7、および14日で計算された。2日目には、対照脳の約8%(n=13)がALクローンを示したが、2日間の負傷した脳にはALクローンはなかった(n=20)。7日間の対照脳(n=18)では、6%がALを持ち、6%がEBクローンを持っていた。PTBI後7日目(n=16)では、脳の6%がALクローン、6%がEBクローン、19%が大きなMBクローンを持っていた。14日で、コントロールブレイン(n = 9)はクローンを持つ特定の領域を示さなかったが、PTBI脳の47%(n = 15)はMBクローンを有し、PTBI脳の20%はALクローンを有し、27%はEBクローンを有し、27%はLHクローンを有していた。この図は、Reference16 から適合されています。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:外傷性脳損傷(PTBI)に通関した後の再生モデルの概要 若年成人 ショウジョウバエでは、カナニカル神経芽細胞遺伝子の発現を欠く中央脳内に静止した神経芽細胞様細胞がある。24時間ポストPTBIによって、静止した神経芽細胞様細胞が活性化され、神経芽細胞遺伝子を発現し、増殖し始めている。4時間と24時間のポストPTBIの両方で、細胞死の波がある16。7日で、増殖率は依然として高く、新しい細胞の多くは成熟した細胞アイデンティティを採用し、ニューロンまたはグリアになる。PTBI後14日で、軸索と樹状突起を持つ新しいニューロンの大きなクローンがそれぞれの標的領域に正しく突出した。ロコモド欠損症も14日までに回復し、成人 ショウジョウバエ が機能的および構造的に再生できることを示唆している。この図は、Reference16 から適合されています。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
Discussion
成人ショウジョウバエ脳への貫通傷害は以前に15,17,18に記載されているが、これらの傷害は中央脳ではなく視神経に焦点を当てた。さらに、怪我を実行する方法についての詳細な指示は、これまでのところ欠けています。このプロトコルは、PTBI後の成人神経新生に関する統計的に有意な証拠を再現する成人ショウジョウバエ中枢脳への傷害を貫通するためのモデルを記述する。
このPTBIプロトコルの再現性は、部分的には、傷害対象領域としてキノコ体に起因する。キノコの体は大きく、複雑な樹状突起と軸索アーバーを持つ〜2200ニューロンから構成され、大きく、高度にステレオタイプ化された配列18。キノコの体の細胞体は脳の表面近くにあり、緑色蛍光タンパク質(GFP)の発現を用いて頭のキューティクルを通して可視化することができる(図1C)。キノコの前駆体は、発達中にアポトーシスを受ける最後の神経幹細胞である13,12,19。したがって、多くのキノコの体のニューロンは、切除の時点でかなり若いです。これは、キノコの体が他の脳領域よりも有糸分裂性の可能性を持っているかもしれないという仮説につながった16.さらに、キノコの体は学習と記憶18にとって重要です。これは、PTBI 誘発神経新生が機能回復につながるかどうかを尋ねることができます。.
結果の再現性に寄与する他の要因としては、一貫した遺伝子型の外交ハエを使用すること、毎回同じ方向に交差を行う、飼育温度と老化温度を正確に制御すること、および男性と女性を別々に分析することが含まれます。アウトクロスからF1ハエを使用すると、自発的突然変異について脳のホモ接合を分析する確率が低下します。 y[1] w[1]の標準クロス。UAS-mCD8-GFP;;OK107-GAL4 成人女性から y[1] w[1] 成人男性ハエは遺伝子型 y[1] w[1]のF1子孫をもたらす。UAS-mCD8-GFP/+;;OK107-GAL4/+。 OK107-GAL4 は、キノコ体のすべての固有のニューロンで発現され、キノコ体とその予測の視覚化を可能にする膜結合 レポーターUAS-mCD8-GFP の発現を駆動する。パーマツインクロスの場合、十字は系統トレースシステムの電源を切るために常に17°Cのままでなければなりません。これにより、分裂細胞は発達中に標識されず、成人生まれのニューロンとグリアだけが標識されることを保証します。この上、フライルームは17°Cで維持することができます。 パーマツインシステム15 の最初の説明は、18°Cでハエを飼育することを推奨しているが、これは重要な背景標識につながる可能性があります。
一貫性を保つために、PTBIを実行するCO2 パッド上のコントロールを無傷でハエに保つこともお勧めします。これにより、両ハエのセットが同一の麻酔被ばくを持つことになります。また、ヘッドを完全に貫通する再現性が望ましい。ただし、ピンの先端をパッドに曲げないように注意し、将来の怪我に使用できなくなります。熟練した開業医にとって、PTBIハエに対する意図しない害はほとんどありません。それにもかかわらず、損傷時にハエを安定させるために胸郭を強く押しすぎると致死的になる可能性があります。意図しない傷害の程度を評価する1つの方法は、PTBIハエの死亡率を24時間後の傷害で定量化することである。一方的に負傷したハエの場合、これは初心者の場合は50%以上になる可能性があります。したがって、観察された結果がPTBIによるものであり、意図しない傷害によるものではないことを保証するために、初心者は数週間にわたって毎日〜20ハエにPTBIを投与する練習をし、24時間の死亡率が一貫して<10%になるまで結果の脳を分析しないことをお勧めします。
中脳PTBIによって刺激される増殖量を定量化するために、抗ホスホヒストンH3(PH3)免疫染色および5-エチニル-2'-デオキシウリジン(EdU)の組み込みの両方を採用することができる。抗PH3は、メタフェーズの前後に細胞にラベルを付け、積極的に分裂している細胞のほんの一部にしか検出を制限しません。したがって、抗PH3染色は、増殖の部分的な一見のみを提供する。EdU は、新たに合成された DNA に組み込むことができるチミジンアナログです。ハエを負傷前後にエドゥに供給することにより、損傷後に分裂しているか、または分裂している細胞のより完全な画像を得ることは可能である。分裂する細胞が永久にマークされているという事実は、ゆっくりと循環する細胞の同定と、最初の増殖後の細胞の生存をアッセイする両方に役立ちます。理由は不明だが、血液脳関門の透過性が限られているため、EdU標識は非効率的であり、成人脳における細胞増殖を過少報告する。これは、24時間後PTBIの制御脳と実験脳の両方でPH3+およびEdU+細胞の同様の数によって証明され、パーマツインクローンの新しい細胞のサブセットのみがEdU16を組み込むことを観察することによって証明される。最大標識のためには、負傷したハエはPTBI後の数時間の給餌を再開しないので、エズでハエを事前に供給することが不可欠です。給餌は、EdU溶液に食品着色料を添加し、腹部キューティクル16を通して腸内の染料の量を監視することによって評価した。
なお、ステップ4では脳解剖プロトコルを提供しているが、代替技術が用いられ得る。これらのいくつかは、以前に公開されたプロトコル20、21、22で利用可能です。 ショウジョウバエメラノガスター は、神経系の腸および構成要素を含む複数の組織の再生の基礎となるメカニズムを研究するために使用することができる強力な遺伝的および分子的ツールを備えた低コストモデルを提供する。脳損傷に対する反応を研究するために使用できる新しい再現性の傷害モデルをここで概説する。これらのプロトコルを用いて得られたデータは、成人 ショウジョウバエ 中央脳が増殖能力を保持し、傷害に応答して新しいニューロンを生成するという考えを支持する。これらの観察は、成人の神経新生の程度とその基礎となる分子メカニズムの両方のさらなる調査を保証する。神経再生に関与する成分がこのシステムで同定されると、成人 性ショウジョウバエの 神経新生に関する知識をヒトに変換することができます。
Disclosures
著者には利益相反はありません。
Acknowledgments
ステイシー・リムクスとベッキー・カッツェンバーガーの技術支援と、パーマツイン株を共有してくれたエドゥアルド・モレノに感謝しています。バリー・ガネツキーとデビッド・ワッサーマンは、間違いなく科学を改善し、ケント・モク、ケイラ・ゲラ、ベイリー・シュピーゲルバーグが研究室に貢献してくれた活発な議論に感謝します。FasII抗体はコーリー・グッドマンによって開発され、NIHのNICHDによって作成され、アイオワ大学、アイオワシティ、IA 52242で維持された発達研究ハイブリドーマ銀行から得られました。この研究で使用される ショウジョウバエ 株のほとんどは、ブルーミントンショウジョウバエストックセンター(BDSC;NIH P40OD018537)。この研究は、NIH T32 GM007133 (KLC) によってサポートされました;NIH NS090190 (GBF);NIH NS102698 (GBF);ウィスコンシン大学大学院(GBF)そして、科学と工学リーダーシップ研究所(WISELI)(GBF)のUW-マディソン女性。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #11 disposable scalpels | Santa Cruz Biotechnology | sc-395923 | used for separating Drosophila heads from trunks prior to brain dissection |
| 150 mm diameter black Sylgard dishes | Dow | 1696157 | made in the laboratory with reagents from Dow; used for brain dissection |
| 18 mm coverslips | any | for mounting brains on microscope slides | |
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI) | ThermoFisher | D1306 | for immunohistochemistry |
| 70% Ethanol | made from 95% ethanol sourced variously | ||
| anti-mouse Cy5 | Jackson ImmunoResearch | 715-175-151 | for immunohistochemistry |
| anti-rabbit 568 | ThermoFisher | A11036 | for immunohistochemistry |
| bovine serum albumin (BSA) | SIgma Aldrich | A7030 | for immunohistochemisty |
| Clear nail polish | any | for sealing coverslips | |
| Click-It EdU labeling kit | InVitrogen | C10640 | to detect newly synthesized DNA |
| CO2 bubbler | Genesee Scientific | 59-181 | for anesthesia |
| CO2 pad | Genesee Scientific | 59-114 | for anesthesia |
| CO2 regulator and supply | any | for anesthesia | |
| Confocal microscope | any | for imaging fixed, stained and mounted brains | |
| cotton plugs | Genesee Scientific | 51-101 | for EdU labeling |
| Drosophila vials | Genesee Scientific | 32-109 | for EdU labeling |
| Fix buffer (Pipes, EGTA, Magnesium; PEM) | components sourced from various companies | for fixing adult brains; 100 mM piperazine-N,N’-bis(2-ethanesulfonic acid) [PIPES], 1 mM EGTA, 1 mM MgSO4, pH 7.0 | |
| Formaldehyde | Sigma Aldrich | 252549 | for fixing adult brains, added to PEM |
| Grade 3 round Whatman filters, 23 mm round | Tisch Scientific | 1003-323 | for EdU labeling |
| Microfuge tubes | any | for fixing and staining reactions and for storing Minutien pins | |
| Microscope slides | any | for mounting brains | |
| Minutien pins | Fine Science Tools | 26002-10 | for brain injury; 12.5 μm diameter tip and 100 μm diameter rod |
| mouse anti-Fasiclin II | Developmental Studies Hybridoma Bank | 1D4-s | for immunohistochemistry |
| NIGHTSEA stereo microscope fluorescence adaptor | Electron Microscopy Sciences | SFA-GR | fluorescence setup for dissecting microscope |
| P20, P200 and P1000 pipettors and tips | any | for measuring solutions | |
| phosphate buffered saliine (PBS) | components sourced from various companies | for dissecting brains and making immunohistochemistry blocking and washing solutions; 100 mM of K2HPO4, 140 mM of NaCl, pH 7.0 | |
| phosphate buffered saline with 0.1% Triton X-100 (PT) | components sourced from various companies | for washing dissected brains | |
| phosphate buffered saline with 0.1% Triton X-100 + 2% bovine serum albumin (PBT) | components sourced from various companies | blocking solution for immunohistochemistry and for diluting antibodies | |
| rabbit anti-PH3 | Santa Cruz Biotechnology, Inc | sc-8656-R | for immunohistochemistry |
| Reinforcement labels | Avery | 5721 | to maintain space between the microscope slide and the coverslip |
| Size 0 paintbrushes | any | to manipulate and stabilize adult Drosophila during injury | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | 93443 | |
| Two pair of #5 watchmakers forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | used to hold the Minutien pins and for brain dissections |
| Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | mounting medium for microscope slides |
References
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