Summary
Bu makale, erişkin Drosophila'ya Penetrasyon Travmatik Beyin Hasarı (PTBI) uygulamak ve ortaya çıkan nörogenezleri incelemek için ayrıntılı protokoller sunmaktadır.
Abstract
Hastalığa veya yaralanmaya yanıt olarak nörogenezin altında kalan moleküler ve hücresel mekanizmalar iyi anlaşılmamıştır. Bununla birlikte, bu mekanizmaları anlamak nöral rejeneratif tedaviler geliştirmek için çok önemlidir. Drosophila melanogaster sinirsel gelişim çalışmaları için önde gelen bir modeldir, ancak tarihsel olarak yetişkin beyin yenilenmesini araştırmak için kullanılmamıştır. Bunun nedeni öncelikle yetişkin beyninin çok düşük mitotik aktivite sergilemesidir. Bununla birlikte, travmatik beyin hasarının (PTBI) yetişkin Drosophila merkezi beynine nüfuz etmesi, yeni nöronların ve yeni gliaların neslini tetikler. Drosophila'da bulunan güçlü genetik araçlar, burada açıklanan basit ama titiz yaralanma protokolü ile birleştiğinde yetişkin Drosophila beynini nöral rejenerasyon araştırmaları için sağlam bir model haline getirilmektedir. Burada (1) erişkin merkezi beyinde delici yaralanmalar ve (2) diseksiyon, immünohistokimya ve yaralanma sonrası görüntüleme için ayrıntılı talimatlar verilmiştir. Bu protokoller oldukça tekrarlanabilir sonuçlar verir ve nöral rejenerasyon altta kalan mekanizmaların parçalanmaları için ek çalışmaları kolaylaştıracaktır.
Introduction
Beyin ve sinir sistemindeki hasar, dünya çapında önemli bir ölüm ve sakatlık nedenidir. Her yıl yaklaşık 1,5 milyon Amerikalı travmatik beyin hasarı (TBI) yaşarken, sadece Amerika Birleşik Devletleri'nde yaklaşık 6 milyon kişi Parkinson ve Alzheimer Hastalığı2 gibi nörodejeneratif hastalıklardan muzdariptir. Hem hastalık hem de beyindeki yaralanma, duyusal, bilişsel ve motor kusurlara yol açan nöral dejenerasyona neden olabilir3. İnsan beyninin onarımı için terapötik stratejiler geliştirmek, beynin karmaşık fizyolojisi nedeniyle zor olmuştur. Drosophila melanogaster gibi model organizmalar, nörodejenerasyon ve potansiyel terapötik hedeflerin altında kalan temel mekanizmaları tanımlamak için basit bir sistem sağlar4.
Meyve sineği Drosophila melanogaster, bir yüzyıldan fazla bir süredir genetik, gelişim biyolojisi ve sinirbilim alanlarını ilerleten güçlü bir model organizma olmuştur5,6. Drosophila beyni sadece ~90.000 nöron7'den oluşur, ortalama insan beyninden bir milyon kat daha az8, ancak birçok benzerlikleri vardır. Hem insan hem de sinek beyinleri GABA, glutamat, asetilkolin ve biyojenik aminler dopamin ve serotonin9 nörotransmitterlerini kullanır. Drosophila ve insan nöronları da ortak sinaptik mimari ve benzer sinirsel hücre tipleri ile benzer şekilde çalışır10. Drosophila'nın daha küçük beyin büyüklüğü ve drosophila ve memeliler arasındaki moleküler, hücresel ve fizyolojik mekanizmaların korunması ile birlikte gelişmiş genetik tekniklerinin mevcudiyeti, Drosophila araştırmacılarının memeli modellerinde pratik olmayan veya cevaplaması zor sorular sormasına izin verir.
Drosophila'daki yetişkin nörogenez anlayışımız, hem homeostaz sırasında hem de yaralanmayı takiben sınırlı kalmaktadır. Normal gelişim sırasında nörogenez hakkında daha fazla şey bilinmektedir. Örneğin, nöronlar ve glia, nöroblastlar10,11 adı verilen öncül hücrelerden gelişim sırasında oluşturulur. Merkezi beyinde en az üç farklı nöroblast türü ayırt edilmiştir. Hem Tip I hem de Tip II soy nöroblastları puparium oluşumundan sonra hücre döngüsünden ~20-30 saat sonra çıkar12. Buna karşılık, mantar vücut nöroblastları hücre bölünmesini son haline getirmek için son ve bunu Puparium oluşumundan sonra Reaper bağımlı apoptoz ~ 85-90 saat yoluyla yapar13. Eklozyondan sonra, yetişkin Drosophila beyninin ağırlıklı olarak glia14 olmak üzere birkaç bölünen hücresi (~1 hücre / beyin) vardır. Yetişkin optik loblar nörogenez15 yeteneğine sahip yavaşça bisiklete binen nöroblastlara sahipken, yetişkin merkezi beynin bilinen bir nöroblastları yoktur. Sinir progenitörlerinin kıtlığı ve sınırlı hücre çoğalması, yetişkin memeli beynindeki duruma şiddetle benzemektedir ve Drosophila'daki yetişkin nörogenez mekanizmalarının insanlara potansiyel ilgisinin altını çizmektedir.
Yaralanmadan sonra yetişkin Drosophila optik loblarında düşük düzeyde erişkin nörogenezinin keşfi15 , yetişkin Drosophila merkezi beyninin de yetişkin nörogenez yeteneğine sahip olabileceği hipotezine yol açtı16. Bu protokol, yetişkin Drosophila'da , yetişkin merkezi beyindeki nörogenezleri araştırmak için kullanılabilecek titiz, tekrarlanabilir bir merkezi beyin hasarı modeli oluşturmayı açıklar. İnsan ve Drosophila beyin mimarisi ve işlevi arasındaki benzerlikler göz önüne alındığında, bu keşifler yaralı ve hastalıklı insan beyinlerinde terapötik nörogenez için kritik hedeflerin belirlenmesine yol açabilir.
Protocol
Bu protokol UW-Madison'un hayvan bakım yönergelerine uyar.
1. PTBI için yetişkin Drosophila üretme
- Standart haç için, 20 bakire y[1] w[1] yerleştirin; UAS-mCD8-GFP;; OK107-GAL417 yetişkin dişiler ve 10 y[1] w[1]17 yetişkin erkek, yiyecek içeren şişelerde birlikte uçar (bkz. Malzeme Tablosu). Çok sayıda senkron yavruya sahip olmak için aynı anda 10-20 haç ayarlayın. Standart haç, genotipin F1 soyuna yol açar: y[1] w[1]; UAS-mCD8-GFP/+;; OK107-GAL4/+.
- Şişeleri çiftleşme ve yumurtlama için 25 °C'ye yerleştirin. Soyu en üst düzeye çıkarmak için, ebeveynleri her 2-4 günde bir yeni şişelere aktarın ve önceki şişeleri 25 ° C'de koruyun. F2 soyu olmadığından emin olmak için ebeveynlerin ilk yerleştirilmesinden 18 gün sonra her şişeyi atın.
NOT: Her ebeveyn kümesinden 3 yavru kümesi ("kuluçkalar") oluşturulabilir. - F1 soylarının ne zaman ekskür etmeye başlayacağını ~10 gün sonra kontrol edin.
- Şişeleri çiftleşme ve yumurtlama için 25 °C'ye yerleştirin. Soyu en üst düzeye çıkarmak için, ebeveynleri her 2-4 günde bir yeni şişelere aktarın ve önceki şişeleri 25 ° C'de koruyun. F2 soyu olmadığından emin olmak için ebeveynlerin ilk yerleştirilmesinden 18 gün sonra her şişeyi atın.
- Soy çalışmaları için genotip F1 perma-twin males15 kullanın: w; FRT40A, UAS-CD2-RFP, UAS-GFP-Mir/FRT40A, UAS-CD8-GFP, UAS-CD2-Mir; tub-GAL80ts/act-GAL4 UAS-flp. Tutarlılık için, bu çaprazı her seferinde aynı yönde yapın.
- Perma-ikiz erkekler üretmek için, 20 bakire w yerleştirin; FRT40A, UAS-CD2-RFP, UAS-GFP-Mir; tub-GAL80ts/TM6B dişiler ve 10 w; FRT40A, UAS-CD8-GFP, UAS-CD2-Mir; act-GAL4 UAS-flp/TM6B15 yetişkin erkekler birlikte yiyecek içeren şişelerde.
- Şişeleri çiftleşmek ve yumurtlama için 17 °C'ye yerleştirin. Ebeveynleri her 7 günde bir yeni yiyecek şişelerine aktarın ve tüm şişeleri 17 °C'de koruyun. F2 soyu olmadığından emin olmak için ebeveynlerin ilk yerleştirilmesinden 35 gün sonra her şişeyi atın.
- F1 soylarının ne zaman ekskür etmeye başlayacağını ~21 gün sonra kontrol edin.
2. Travmatik beyin hasarına nüfuz etmek (PTBI; Şekil 1)
- Yeni eklenen F1 sineklerini sıralayın. Eklozyon sonrası 6 saat içinde genç erkekleri seçin. Bu erkekleri, şişe başına 40 veya daha az sinek içeren yiyecek içeren temiz şişelere yerleştirin.
NOT: Bu, sabahın ortasında CO2 pedinde sinekleri uyuşturarak ve bağırsaklarında hala mekonyum (karın duvarından koyu yeşilimsi bir nokta olarak görülebilir) olan yetişkin erkekleri tanımlayarak kolayca gerçekleştirilir. - Bölünen hücreleri EdU ile etiketlemeyi planlıyorsanız, yaralanmadan önce 6 saat boyunca 5-etirenil-2'-deoksiyürin (EdU) (bkz. Malzeme Tablosu) ile ön besleme. Ayrıntılar için 3.
- %70 etanol dolu 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne ~100 pim yerleştirerek Minutien pimlerini (bkz. Malzeme Tablosu) en az 5 dakika sterilize edin.
- %70 etanol püskürterek CO2 pedini ve bir boya fırçasını sterilize edin ve temiz tüy bırakmayan bir doku ile kurulayın. Aletler temiz ve kuruduktan sonra, 40 veya daha az sıralanmış F1 erkeğini temiz ped üzerine geri aktarın.
- F1 erkeklerini sineklikte 2 gruba ayırın. Bir grup kontrol görevi görecek, yaralanmamış sinekler. İkinci deney grubu PTBI'ye tabi tutulacak.
- Toparlama kullanarak, mikrosantrifüj tüpünden 4-5 yeni Minutien pimini çekin ve CO2 pedinin kenarına yerleştirin. Diseksiyon kapsamının altında, keskin bir noktaya sahip düz bir Minutien pimi seçin.
NOT: Bir deney için tek bir Minutien pimi kullanmak değişkenliği azaltacaktır. Keskin pimleri yeniden kullan. Hasarlı veya künt pimleri güvenli bertaraf için% 70 etanol içeren ayrı bir 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin. - Standart çaprazdan sineklerle çalışıyorsanız, yeşil floresan proteini (GFP) için uygun heyecan ve emisyon filtreleriyle donatılmış stereo mikroskop ışık yayan diyot (LED) lambasını takın. Bu, 440-460 nM'de heyecanlanmaya izin verir ve 500-560 nM görselleştirmeye izin verir.
NOT: Bu lamba ve filtre seti ile mantar gövdesinin hücre gövdeleri baş manikürden yeşile doğru floresanlanacaktır (Şekil 1C). Perma-ikiz sinekler veya diğer genotiplerin sinekleri için, stereo mikroskop için standart bir beyaz ışık aydınlatıcı, mantar gövdesindeki yaralanmayı hedeflemek için kafa kütiküldeki yer işaretlerini görselleştirmek için kullanılabilir (Şekil 1C). - Seçilen Minutien pimini bir elinde (sağ elini kullananlar için bu genellikle sağ eldir) ve diğer elinde (genellikle sol) boya fırçasını almak ve tutmak için forsepsleri kullanın. Deneysel gruptan bir sinek seçin ve sineği, sinek başı sağa doğru baş kapsülünün dorsal bir görünümüne sahip olacak şekilde konumlandırın. Fırçayı sırt toraksının ön kısmına yerleştirin ve sineği stabilize etmek için hafifçe aşağı itin.
- Minutien piminin ucunu mantar vücudunun sağ tarafındaki hücre gövdelerini hedefleyin ve kafa kapsülüne nüfuz edin. Yer işaretlerini kullanıyorsanız, ocelli ile gözün sırt jantı arasındaki sırt başı piksini hedef edin (Şekil 1).
- Yaralanmayı tamamladıktan sonra, kafayı Minutien piminin dışına hafifçe itmek için boya fırçasını kullanın.
- Beyni RNA-Seq veya qRT-PCR için kullanıyorsanız, başın sol tarafında ikinci bir yaralanma yapın.
- Deneysel gruptaki tüm sinekleri yaralamak için 2.8-2.10 adımlarını tekrarlayın.
- Tüm sinekler yaralandıktan sonra, kontrolü ve yaralı sinekleri yiyecek içeren etiketli, ayrı şişelere yerleştirin. Sinekler anesteziden ve sonraki yaşlanma sırasında sineklerin yiyeceğe yakalanmasını önlemek için iyileşirken şişeleri yatay olarak (yani yanlarına) yatırın.
- Standart çapraz sinekleri 25 °C'ye yerleştirin ve perma-ikiz sinekleri 30 °C'de yaşlarına yerleştirin.
- 24 saatten uzun sinekler için, her 1-2 günde bir temiz yiyeceklere yerleştirin.
3. EdU etiketleme
- Dimetil sülfit (DMSO) içinde 10 mM 5-etil-2'-deoksiyridin (EdU) stoğu hazırlayın. Bu, -20 °C'de 12 aya kadar saklanabilir.
- % 10 sakkarozda 200 μL 50 μM EdU hazırlayın. Ptbi'den önce 6 saat boyunca EdU ile ön yem uçar.
- 200 μL 50 μM EdU'yu% 10 sakkaroza 23 mm yuvarlak sınıf 3 filtre kağıdına yerleştirin (bkz. Malzeme Tablosu) aksi takdirde boş bir şişeye yerleştirin.
- Sinekleri şişeye yerleştirin. Sonra şişeyi pamuklu bir fişle kapatın.
- Şişeyi 6 saat boyunca 25 °C'de nemlendirilmiş bir inkübatöre yatay olarak yatırın.
- PTBI'yi 2.3-2.10 adımlarında açıklandığı gibi gerçekleştirin.
- Sinekleri EdU içeren şişeye geri yerleştirin. Şişeyi pamuklu bir fişle kapatın.
- Şişeyi 25 °C'de nemlendirilmiş bir inkübatöre 24 saate kadar yatay olarak döşeyin. Aşağıda açıklanan adımlardan birini izleyin (adım 3.8.1-3.8.3).
- Azit olmadan ve antikor boyamadan önce gerçekleştirilen EdU algılama reaksiyonu ile fiksatif, yıkama tamponu ve bloke tamponu kullanarak 4.
- Sinekleri% 10 sakkarozda yeni bir filtre kağıdı ve 200 μL 50 μM EdU içeren temiz bir şişeye aktarın. Şişeyi yatay olarak 25 °C inkübatöre yerin. Etiketleme süresince her 24 saat tekrarlayın. Daha sonra antikor boyamadan önce gerçekleştirilen EdU algılama reaksiyonu ile azitsiz tamponlar kullanarak 4.
- EdU ile nabız kovalama etiketi için, EdU'yu darbe süresi boyunca besleyin, sinekleri her 24 saat yeni bir filtre kağıdı ve% 10 sakkarozda 50 μM'lik 200 μL içeren temiz bir şişeye aktarın. Nabız süresinden sonra (örneğin, 4 gün), sinekleri standart Drosophila yiyecekleri içeren bir şişeye aktarın. Şişeyi 3 gün daha 25 °C inkübatöre yerleştirin. Daha sonra antikor boyamadan önce gerçekleştirilen EdU algılama reaksiyonu ile azitsiz tamponlar kullanarak 4.
4. Diseksiyon, immünostokimya ve montaj
- 100 μL fiksatif ile 1,5 mL mikrosantrifüj tüpleri hazırlayın: PEM'de %4 formaldehit (100 mM piperazin-N,N'-bis(2-etanesülfonic asit) [PIPES], 1 mM EGTA, 1 mM MgSO4, pH 7,0) (bkz. Malzeme Tablosu) ve buzun üzerine yerleştirin.
NOT: Tek bir genotip ve durumun 20 kadar beyni tek bir tüpte işlenebilir. - %70 etanolden oluşan küçük bir havuz (~100 μL) ve fosfat tamponlu üç küçük salin havuzlu bir diseksiyon plakası hazırlayın (PBS; 100 mM K2HPO4, 140 mM NaCl, pH 7.0).
- %70 etanol ile sterilize edilmiş bir CO2 pedinde ~10 kontrol veya deneysel sinekleri uyuşturmak.
- Neşter kullanarak başı her bir sineğin gövdesinden ayırın.
- Kafaları% 70 etanol içine ıslatılmış bir boya fırçası ile toplayın ve diseksiyon plakasındaki etanol havuzuna 2-5 dakika boyunca kafaları yerleştirin.
NOT: Bu, beyinleri hafifçe susuz bırakır ve kafa maniküründen uzak kesilmelerini kolaylaştırır. - Kafaları ~100 μL PBS havuzuna aktarın ve beyinleri parçalara ayrıştırarak her beyni temiz bir ~100 μL PBS havuzuna taşıyın. Bunu, baş manikül arkasını açmak için iki çift Watchmakers tostiki kullanarak ve ikinci bir çift mantının kapalı ucunu kullanarak beyni kütikülden hafifçe çıkarırken bir çift mandiya ile tutarak gerçekleştirin.
- Kesilen beyinleri, beyinlerin girişine izin vermek için kesilmiş ve eğimli plastik bir uçla donatılmış bir P200 pipetörü kullanarak sabitleme çözeltisinin 100 μL'sini içeren bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
- Oda sıcaklığında 20-25 dakika sabitlayın. Düzeltmeyi bir P200 veya cam pipetle dikkatlice çıkarın.
- Sabit beyinleri 1 mL 'PT' (PBS artı% 0.1 Triton X-100) ile dört kez yıkayın ve beyinlerin her yıkama arasında birkaç dakika yerleşmesini bekleyin.
NOT: Beyinler yıkamalar arasında hızla yerleşmezse, hala şişman bir vücuda ve / veya trakeaya bağlı olmaları muhtemeldir. - Oda sıcaklığında ~1 saat boyunca 1 mL PBS artı %0,1 Triton X-100 ve %2 sığır serum albümininde (PBT) örnekleri engelleyin.
- Bloklama solüsyonunun çıkarın ve PBT'de 4 °C'de bir gecede 100 μL birincil antikor çözeltisi ile numuneleri kuluçkaya yatırın. Bu çalışmada kullanılan birincil antikorlar tavşan anti-PH3 (1:500) ve fare anti-Fasiclin II (1:20) 'dir (bkz. Malzeme Tablosu).
- Numuneleri 1 mL PT ile beş kez yıkayın, böylece beyinler her yıkama arasında birkaç dakika yerleşir.
- Son yıkamayı çıkarın ve 4 °C'de bir gecede 100 μL ikincil antikor çözeltisinde kuluçkaya yatırın. Burada kullanılan ikincil antikorlar anti-tavşan 568 (1:400) ve anti-fare Cy5 (1:100) 'dir (bkz. Malzeme Tablosu).
- Numuneleri 1 mL PT ile beş kez yıkayın, böylece beyinler her yıkama arasında birkaç dakika yerleşir. Son yıkama sırasında, çekirdeği lekelendirmek için 10 dakika boyunca 4',6-Diamidino-2-Fenilindole, Dihidrochloride (DAPI; 10 μM çözeltinin 1:100'ü) ekleyin. Her tüpte 50-100 μL bırakarak yıkamayı çıkarın.
- Her slaydın ortasına tek bir kendinden yapışkanlı takviye etiketi ve her etiketin ortasına 50 μL'lik solmaya karşı montaj ortamı damlacıkları yerleştirerek mikroskop slaytları hazırlayın (bkz. Malzeme Tablosu). Takviye etiketi kapak kapağını slaytların biraz üzerinde tutar ve monte edilen beyinlerin aşırı düzleşmesini önler.
- Beyni her mikrosantrifüj tüpünden, kesilmiş ve eğimli plastik uçlu bir P200 kullanarak mümkün olduğunca az yıkama tamponu ile hazırlanmış bir kaydırağa dikkatlice aktarın. Tek bir kaydırağın üzerine 10 kadar beyin monte edilebilir.
- Her kaydırağa bir kapak koymadan ve slaydı oje ile kapatmadan önce beyinleri hafifçe yeniden konumlandırmak için tokmaklar kullanın. Beyinleri arka taraf yukarı veya ön taraf yukarı olacak şekilde yönlendirin, ancak birbirine dokunmamalıdır.
NOT: Tüm beyin üzerinden yüksek kaliteli konfokal görüntüler elde etmek zor olduğundan, her oryantasyonda bazı beyinler monte edilmelidir. - Hazırlanan slaytları görüntülemeye kadar 4 °C'de düz ve karanlıkta saklayın. Daha uzun süreli depolama için (1 yıla kadar), slaytlar -20 °C'de saklanabilir.
5. Konfokal görüntüleme
NOT: DAPI ve floresan ikincil antikorlara (sırasıyla 405 nm, 488 nm ve 568 nm, 633 nm) uygun ekscitasyon lazerleri ve emisyon filtre küpleri ile lazer taramalı konfokal mikroskop kullanan görüntü beyinleri.
- Mikroskop, lazerler, denetleyici ve bilgisayarın gücünü açın.
- Edinme yazılımını açın.
- Alma modunda, en fazla dört kanal seçin ve istenen kanalların sıralı taranmasının parametresini ayarlayın. Her kanal için lazer gücünü % 5-10'a çıkarın.
- Mikroskopa bir slayt yerleştirin.
- Epifluoresans ataşmanı kullanılarak görüntülenecek bir beyin seçin (bkz. Malzeme Tablosu).
- Edinme modunda çerçeve boyutu olarak 1024 x 1024 piksel seçin.
- Alım modunda, Z yığını seçeneğini seçin, Z yığınının 2 μm bölümde alınması gerektiğini belirtin ve görüntülenecek üst ve alt odak düzlemlerini seçerek numuneye odaklanın.
- 20x objektif ve mantar gövdesi gibi belirli beyin bölgelerini 60x amaç kullanarak tüm beyinlerin Z yığını görüntülerini toplayın.
6. Veri analizi
- Görüntü analiz yazılımını kullanarak çoğalyan hücreleri ve perma-twin klonlarının sayısını manuel olarak ve/veya kullanarak ölçün (bkz. Yazılım kullanırken, en az 10 μm alanlara sahip ilgi alanlarını (ROI' ler) seçin.
Representative Results
PTBI hücre çoğalmasını uyarır
Merkezi bir beyin PTBI'sine bağlı olarak nörogenezin boyutunu belirlemek için, eklozyondan 6 saat içinde toplanan ve yaralanan genç yetişkin erkeklerde proliferatif yanıt ölçüldü. Aktif olarak mitoz uygulanan hücreler için bir belirteç olan anti-fosfohistone 3 (PH3) kullanılarak yaralanma sonrası 24 saat çoğalmada önemli bir artış gözlendi. Merkezi beyinleri kontrol eden yaklaşık 3 PH3+ hücre ve yaralı merkez beyinlerde 11 PH3+ hücre PTBI sonrası 24 saat gözlenir (Şekil 2A-D). Bölünen hücrelerin çoğu yaralanma bölgesinin yakınında bulunur. Hücre bölünmesi için ikinci bir test, kümülatif hücre çoğalmasını tek bir yaralanmadan ölçmek ve yeni oluşturulan hücrelerin ne ölçüde hayatta kaldığını değerlendirmek için kullanıldı. 5-etirenil-2'-deoksiroridin (EdU), yeni sentezlenen DNA'ya dahil edilebilen ve DNA sentezi geçirmiş hücreleri kalıcı olarak etiketleyebilen bir timin analogudur. Sineklere 4 günlük EdU nabzı atıldı, ardından 3 günlük bir kovalamaca yapıldı. Bu, etiketli hücrelerin canlı olduğunu ve çoğaldıktan en az 3 gün sonra hayatta kaldığını ortaya koydu. 7 gün boyunca, merkezi beyinleri kontrol eden ortalama 2 EdU+ hücre ve yaralı merkez beyinlerde sırasıyla ortalama 11 EdU+ hücresi vardı (Şekil 2E). Bu, PH3 antikorunu kullanarak yaralanma sonrası 24 saat elde edilen sonuçlara benzer. Hücre çoğalması 14 gün olarak ölçüldüğünde, yaralanmamış kontroller merkezi beyin başına ortalama 1 EdU+ hücre iken, yaralı beyinler ortalama 29 EdU+ hücre (Şekil 2E) ile hücre çoğalmasının en az bir PTBI'yi takip eden ikinci haftaya kadar devam ettiğini göstermiştir.
Hücre çoğalması yaşa bağlıdır
Merkezi beyinde en büyük proliferatif yanıt eklozyon sonrası ilk 24 saat içinde gözlenmiştir (Şekil 3). Eklozyondan 7 gün sonra, delici bir yaralanma hala merkezi beyin başına ortalama 6 PH3 + hücre ile çoğalmada önemli bir artışa neden olur. Yine de, eklozyondan 14 gün sonra, hücrelerin PTBI'yi takiben bölünme yeteneği, kontrol beyinlerininkine benzer şekilde önemli ölçüde 1 bölünen hücreye düşer (Şekil 3). Bu nedenle, PTBI sonrası hücre çoğalma potansiyeli yaşa bağlıdır.
Yeni oluşturulan nöronlar hedef alanları düzeltmeyi projeleyebilir
PTBI sonrası nöral rejenerasyonunu değerlendirmek için perma-twin etiketleme sistemi15 kullanılmıştır. Perma-ikiz soy izleme, hücreleri ve soylarını yeşil floresan protein (GFP) veya kırmızı floresan protein (RFP)15 ile kalıcı olarak etiketler. Yaralı örneklerde kontrollere göre 2 gün 2 haftada daha fazla perma-ikiz klon saptandı (Şekil 4A-E). Özellikle, YARALANMADAN 2 hafta sonra PTBI beyinlerinin ~% 50'sinde yeni mantar vücut nöronları vardı (Şekil 4N). Bu yeni nöronlar dendritlerini mantar gövdesi kaliksine ve aksonlarını mantar vücut loblarına uygun olarak yansıttılar (Şekil 4D, F,G). Bu, yeni oluşturulan hücrelerin hasarlı mantar gövdelerinin onarımında rol oynayan fonksiyonel nöronlar olabileceğini gösterir. Beynin yenilenmeye başlayan diğer bölgeleri arasında elipsoid cisim (EB) (Şekil 4H,I), anten lobları (AL) (Şekil 4J,K) ve büyük klonlara sahip olan yanal boynuz (Şekil 4L,M) sırasıyla %26, %26 ve %20 oranında (Şekil 4N) sayıldı. Bu sonuçlar, yetişkin nörogenezinin araştırılması için bu sistemin faydasının altını çiziyor. PTBI'yi takip eden ve yeni nöronların üretimine yol açan olayların sırası için önerilen bir model Şekil 5'te gösterilmiştir.
Şekil 1: Travmatik Beyin Hasarının (PTBI) yetişkin Drosophila merkezi beynine nüfuz etmesi. (A) Yetişkin bir sinek kafasının dış şeması. Bu ön görüş. Böylece, hayvanın sağ tarafı izleyicinin solundadır. (B) Gri ile belirtilen yaralanma yörüngesi ile yetişkin bir Drosophila kafasının iç şeması. Bu arka görüş. Böylece, bu görüntüde ve sonraki rakamlarda, beynin sağ tarafı sağdadır. Merkezi beyin PTBI, mantar gövdesi (yeşil) ve şişman vücut (mavi) ve hemositler (kırmızı) dahil olmak üzere beyin dışındaki dokular da dahil olmak üzere birden fazla beyin yapısını etkiler. CB = merkezi beyin bölgesi. OL= optik lob bölgesi. (C) Mantar gövdelerinin (ok uçları) yeşil floresan protein (GFP) ile etiket edildiği canlı bir yetişkin kafasının dorsal görünümü. Bu 'standart genotip' (ayrıntılar için metne bakın). PTBI protokolü tekrar tekrar mantar gövdelerinde yaralanmaya neden olur. Bu Şekil Reference16'dan uyarlanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: PTBI hücre çoğalmasını uyarır. Yaralanmamış denetim (A) ve PTBI (B) şemaları. Sağ üst köşelerdeki mavi kutular, panellerde (C) ve (D) daha yüksek büyütmede gösterilen beyin bölgelerini gösterir. (C,D) PH3 antikor (kırmızı) yaralanmadan 24 saat sonra hücre çoğalmasını test etmek için kullanıldı. Kontrol beyinlerinde (C), az sayıda PH3+ hücresi vardır ve MB'nin yakınında yoktur. Bununla birlikte, PTBI beyinlerinde (D), MB'nin yakınında PH3+ hücreleri vardır. (E) Çoğalma hücrelerinin nicelemesi. Sayılar, sadece mantar vücudunun çevresinde değil, tüm beyinlerde çoğalyan hücreleri yansıtır. 24 saat içinde, yaralanmamış kontrol beyinleri ortalama 3 PH3+ hücreye /beyne (n = 11 beyin, 28 hücre), PTBI sonrası 24 saat, beyinlerde ortalama 11 PH3+ hücre/beyin (n = 17 beyin, 181 hücre) vardı. 7 günde, yaralanmamış kontroller ortalama 2 EdU+ hücre / beyin (n = 15 beyin, 24 hücre) ile az sayıda EdU+ hücresine sahipken, 7 günlük PTBI sonrası beyinlerde ortalama 11 EdU+ hücre / beyin (n = 22 beyin, 238 hücre) vardı. 14 günde, yaralanmamış kontroller ortalama 1 EdU+ hücre /beyine (n = 8 beyin,11 hücre), 14 günlük PTBI sonrası beyinlerde ise ortalama 29 EdU+ hücre/beyin (n = 14 beyin, 400 hücre) vardır. Bu deneyler kümesi için, eklozyonun 6 saat içindeki genç yetişkin erkekler kullanılmıştır. 3 zamanlı noktalarda kontrol ve PTBI örneklerinin eşleşmemiş t testleri sırasıyla p<0.0001, p<0.0001 ve p<0.0002 verim değerleridir. Hata çubukları standart sapmayı (SD) yansıtır. Bu Şekil Reference16'dan uyarlanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: PTBI'ye proliferatif yanıt yaşla birlikte azalır. Yaşın yaralanma sonrası ortaya çıkan hücre çoğalması miktarını etkileyip etkilemediğini araştırmak için, yeni eklenen yetişkin erkekler, YARALANMADAN 24 saat sonra hücre çoğalmasını test etmek için anti-PH3 kullanılarak PTBI'den 7 gün, 14 gün ve 28 gün öncesine kadar olan hayvanlarla karşılaştırıldı. Eklozyonun 6 saat içinde yaralanan sinekler ortalama 11 PH3+ hücreye/beyne (n = 17 beyin, 182 hücre) sahipken, yaşla eşleşen kontrollerde ortalama 3 PH3+ hücre/beyin (n = 11 beyin, 28 hücre) vardı. 7 güne kadar yaşlanan ve daha sonra PTBI'ye maruz kalan sinekler, ortalama 2 PH3+ hücre/beyin (n = 5 beyin, 12 hücre) ile yaşla eşleşen kontrollere kıyasla ortalama 6 PH3+ hücreye /beyne (n = 11 beyin, 65 hücre) sahipti. Sinekler PTBI'den 14 gün öncesine kadar yaşlandığında ve 24 saat sonra test edildiğinde, yaşla eşleşen kontrollere benzer ortalama 1 PH3+ hücre / beyin (n = 8 beyin, 11 hücre) vardı ve bu da ortalama 1 PH3 + hücre / beyin (n = 4 beyin, 2 hücre). 28 günlük yaralanmamış kontrol (n = 4, 1 hücre) ve PTBI (n = 3, 1 hücre) ortalama 0 PH3 + hücre / beyin uçar. PTBI'nin bu 4 zamanlı noktalarda karşılaştırmaları kontrol etmesi için eşleşmeyen t testleri sırasıyla p<0.0001, s<0.04, p<0.07 ve p<0.84'tür. Bu Şekil Reference16'dan uyarlanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Perma-ikiz soy izleme, ptbi'yi takiben beyin yenilenmesini ve aksonların uygun şekilde hedeflenmesini göstermektedir. PTBI sonrası nörogenez analiz etmek için perma-twin lineage-tracing system15 kullanılmıştır. Bu sistem, bölünen hücreleri ve soyları yeşil floresan protein (GFP) veya kırmızı floresan protein (RFP) ile kalıcı olarak etiketler. Geliştirme sırasında sistemi kapalı tutmak için 17 °C'de sinekler yetiştirildi. Perma-ikiz transgenes taşıyan F1 erkekleri eklozyon üzerine toplandı, daha sonra yaralandı ve 2 veya 14 gün boyunca iyileşmek için 30 ° C'ye yerleştirildi. (A) 2 günlük yaralanmamış kontrollerde, beyne dağılmış bazı GFP+ hücreleri vardır. (B) 14 günde, kontrol merkezi beyninde nispeten az sayıda GFP+ hücresi bulunur. (C) Buna karşılık, 2 günlük yaralı beyinler, yaralanmanın yakınında kümelenme eğiliminde olan daha fazla GFP + hücresine sahiptir (ok ucu). (D) Yaralanma sonrası 14 gün içinde, yaralanma bölgesinin yakınında büyük klonlar vardır. Bu klonların bazılarında mantar gövde yolları (ok ucu) boyunca projeli aksonlar vardır. Burada yalnızca GFP kanalı gösterilir; PTBI örneklerinde benzer RFP+ klonları vardı. (E) PTBI sonrası zaman içinde klon sayısı artar.Kontrol yaralanmamış beyinler (n = 13) 2 günde ortalama 10 klona, 2 günlük PTBI beyinlerinde (n = 20) ortalama 23 klona sahiptir (s<0.00002). 7 günde kontrol beyinlerinde beyin başına ortalama 9 klon (n = 18), 7 günlük PTBI beyinlerinde ise beyin başına ortalama 39 klon (n = 16) (p-değeri<0.00000002) vardı. Bu, yaralanma sonrası 2 günde görülen klon sayısından önemli ölçüde daha fazladır (p-value<0.0009). 14 günlük kontrol beyinlerinde, beyin başına ortalama 10 klon vardır, bu da 2 günlük ve 7 günlük kontrollerden önemli ölçüde farklı değildir. Bununla birlikte, PTBI sonrası 14 günde, yaşla eşleşen kontrollerden (p<0.000003) veya 2 günlük PTBI sonrası beyinlerden (p-değer<0.0001) önemli ölçüde daha fazla olan ortalama 66 GFP+ klonu vardır. Hata çubukları SD.'yi yansıtır. (F-M) PTBI beyindeki birden fazla bölgede klon oluşumunu uyarır. Sol taraftaki paneller, PTBI sonrası 14 gün (A, H, J, L) sonrası büyük klonların bulunduğu beyin bölgelerinin şemalarıdır. Sağdaki paneller temsili beyinlerin (G, I, K, M) yüksek büyütmelerini gösterir. Birçok 14 günlük beyinde belirli hedef bölgelere yansıtılan klonlar vardı. Bunlar arasında mantar gövdesi (MB) (F,G), elipsoid gövde (EB) (H,I), anten lob (AL) (J,K) ve lateral boynuz (LH) (L,M) yer aldı. (N) PTBI sonrası zamanla hem klon sayısı hem de klon büyüklüğü artar.Büyük klonlara sahip beyin bölgelerinin oranları kontrollerde ve yaralı beyinlerde 2, 7 ve 14 gün olarak hesaplanmıştır. 2 günde kontrol beyinlerinin ~%8'i (n = 13) AL klonları gösterirken, 2 günlük yaralı beyinlerde AL klonu yoktu (n = 20). 7 günlük kontrol beyinlerinde (n = 18), %6'sında AL, %6'sında EB klonu vardı. PTBI sonrası 7 günde (n = 16), beyinlerin% 6'sının AL klonları,% 6'sının EB klonları ve% 19'unun büyük MB klonları vardı. 14 günde, kontrol beyinleri (n = 9) klonlu belirli bir alan sergilemezken, PTBI beyinlerinin % 47'sinde (n = 15) MB klonları, PTBI beyinlerinin% 20'sinde AL klonları ve PTBI beyinlerinin% 27'sinde EB klonları ve% 27'sinde LH klonları vardı. Bu Şekil Reference16'dan uyarlanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Delici travmatik beyin hasarı (PTBI) sonrasında yenilenme için özet model. Genç yetişkin Drosophila'da, merkezi beyinde kanonik nöroblast genlerinin ekspresyonunun olmadığı sessiz nöroblast benzeri hücreler vardır. PTBI sonrası 24 saat boyunca, sessiz nöroblast benzeri hücreler aktive edilir, nöroblast genlerini ifade eder ve çoğalmaya başlar. PTBI sonrası hem 4 h hem de 24 h'de hücre ölümü dalgası vardır16. 7 günde, çoğalma oranı hala yüksektir ve yeni hücrelerin çoğu olgun hücre kimliklerini benimsemiş, nöron veya glia haline gelmektedir. PTBI sonrası 14 günde, akson ve dendritleri olan yeni nöronların büyük klonları kendi hedef alanlarına doğru şekilde yansıtır. Lokomotor defektleri de 14 gün geri yüklenir, bu da yetişkin Drosophila'nın fonksiyonel ve yapısal olarak yenilenebileceğini düşündürmektedir. Bu Şekil Reference16'dan uyarlanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Discussion
Yetişkin Drosophila beynine nüfuz eden yaralanmalar daha önce 15,17,18 olarak tanımlanmış olsa da, bu yaralanmalar merkezi beyne değil optik loblara odaklanmıştır. Ayrıca, yaralanmaların nasıl gerçekleştirilmesi için ayrıntılı talimatlar şimdiye kadar eksiktir. Bu protokol, PTBI'den sonra yetişkin nörogenez için istatistiksel olarak anlamlı kanıtlar üreten yetişkin Drosophila merkezi beynine nüfuz eden bir yaralanma modelini açıklar.
Bu PTBI protokolünün tekrarlanabilirliği, kısmen yaralanma hedef bölgesi olarak mantar gövdesinden kaynaklanmaktadır. Mantar gövdesi, büyük ve son derece stereotiplenmiş dizilerde karmaşık dendrit ve akson çardaklara sahip ~ 2200 nörondan oluşan büyüktür18. Mantar vücut nöronlarının hücre gövdeleri beynin yüzeyine yakındır ve yeşil floresan protein (GFP) ifadesi kullanılarak baş kütikülden görselleştirilebilir (Şekil 1C). Mantar vücut öncülleri gelişim sırasında apoptoz uygulanan son nöral kök hücrelerdir13,12,19. Bu nedenle, birçok mantar vücut nöronları eklosyon zamanında oldukça gençtir. Bu, mantar vücudunun diğer beyin bölgelerine göre daha fazla mitotik potansiyele sahip olabileceği hipotezine yol açtı16. Ek olarak, mantar gövdesi öğrenme ve hafıza için kritik öneme sahiptir18. Bu, PTBI tarafından tetiklenen nörogenezin fonksiyonel iyileşmeye yol açıp açmadığını sormanızı sağlar.
Sonuçların tekrarlanabilirliğine katkıda bulunan diğer faktörler arasında tutarlı genotiplerden oluşan aşılmış sineklerin kullanılması, her seferinde aynı yönde haçların gerçekleştirilmesi, yetiştirme ve yaşlanma sıcaklıklarının hassas bir şekilde kontrol edilmesi ve erkek ve dişilerin ayrı ayrı analiz edilmesi sayılabilir. F1 sineklerinin bir çıkınttan kullanılması, spontan mutasyonlar için homozigous beyinlerin analiz etme olasılığını azaltır. Standart çapraz y[1] w[1]; UAS-mCD8-GFP;; OK107-GAL4 yetişkin dişilerden y[1] w[1] yetişkin erkek sinek sinekleri, genotip y[1] w[1]'nin F1 soyuyla sonuçlanır; UAS-mCD8-GFP/+;; OK107-GAL4/+. OK107-GAL4 , mantar gövdesinin tüm içsel nöronlarında ifade edilir ve mantar gövdelerinin ve projeksiyonlarının görselleştirilmesine izin veren membran bağlı muhabir UAS-mCD8-GFP'nin ekspresyonunu yönlendirir. Perma-ikiz haçlar için, soy izleme sistemini kapalı tutmak için haçlar her zaman 17 ° C'de kalmalıdır. Bu, gelişim sırasında hiçbir bölünen hücrenin etiketlenmemesini ve sadece yetişkin kaynaklı nöronların ve gliaların etiketli olmasını sağlar. Bu amaçla, sinek odası 17 ° C'de de korunabilir. Perma-twin sisteminin ilk açıklaması15 18 ° C'de önerilen yetiştirme sinekleri olsa da, bu önemli arka plan etiketlemesine yol açabilir.
Tutarlılık için, PTBI'yi gerçekleştirirken kontrolün YARALANMAMıŞ sinekleri CO2 pedinde tutması da önerilir. Bu, her iki sinek kümesinin de aynı anestezik maruziyete sahip olmasını sağlar. Ek olarak, tekrarlanabilirliğin kafaya tamamen nüfuz etmesi arzu edilir. Bununla birlikte, pimin ucunu pedle bükmemeye dikkat edilmeli ve gelecekteki yaralanmalar için kullanılamaz hale getirilmelidir. Yetenekli uygulayıcılar için PTBI sineklerine istenmeyen çok az zarar vardır. Bununla birlikte, yaralanma sırasında sineği stabilize etmek için toraksa çok fazla basmak ölümcül olabilir. İstenmeyen yaralanmanın boyutunu değerlendirmenin bir yolu, PTBI'nin yaralanma sonrası 24 saat uçtuğu mortaliteyi ölçmektir. Tek taraflı yaralı sinekler için, bu yeni başlayanlar için% 50 veya daha yüksek olabilir. Bu nedenle, gözlemlenen sonuçların PTBI'den kaynaklandığından ve istenmeyen yaralanmalardan kaynaklanmayacağından emin olmak için, yeni başlayanlara birkaç hafta boyunca günlük ~ 20 sinek üzerinde PTBI uygulama yapmaları ve 24 saat mortalite sürekli olarak% 10 < kadar ortaya çıkan beyinleri analiz etmemeleri önerilir.
Merkezi beyin PTBI tarafından uyarılan çoğalma miktarını ölçmek için, hem anti-fosfohistone H3 (PH3) immünostaining hem de 5-etirenil-2'-deoksiyridin (EdU) kuruluşu kullanılabilir. Anti-PH3, metafazdan önce ve metafat boyunca hücreleri etiketler ve algılamayı aktif olarak bölünen hücrelerin yalnızca bir kısmıyla sınırlar. Bu nedenle, anti-PH3 boyama çoğalma sadece kısmi bir bakış sağlar. EdU, yeni sentezlenen DNA'ya dahil edilebilen bir timin analogudur. Yaralanmadan önce ve sonra sinekleri besleyerek, yaralanmadan sonra bölünen veya bölünen hücrelerin daha eksiksiz bir resmini elde etmek mümkündür. Bölünen herhangi bir hücrenin kalıcı olarak işaretlenmiş olması, hem yavaşça çevrim yapan hücrelerin tanımlanması hem de ilk çoğalma sonrasında hücrelerin hayatta kalmasının test etmesi için yararlıdır. Belirsiz nedenlerden dolayı, ancak belki de kan-beyin bariyerinin sınırlı geçirgenliği nedeniyle, EdU etiketlemesi verimsizdir ve yetişkin beyninde hücre çoğalmasını az bildirir. Bu, PTBI sonrası 24 saat boyunca hem kontrol hem de deneysel beyinlerdeki benzer sayıda PH3+ ve EdU+ hücresi ile ve perma-ikiz klonlarındaki yeni hücrelerin sadece bir alt kümesinin EdU16'yı içerdiğini gözlemleyerek kanıtlanır. Maksimum etiketleme için, sinekleri EdU ile önceden beslemek önemlidir, çünkü yaralı sinekler PTBI sonrası birkaç saat boyunca beslenmeye devam etmez. Beslenme, EdU çözeltisine gıda boyası eklenerek ve karın kütikülden bağırsaktaki boya miktarı izlenerek değerlendirildi16.
4. adımda beyin diseksiyon protokolü sağlamış olsak da alternatif tekniklerin kullanılabileceği belirtilmelidir. Bunlardan bazıları daha önce yayınlanan protokollerde mevcuttur20,21,22. Drosophila melanogaster, sinir sisteminin bağırsakları ve bileşenleri de dahil olmak üzere birden fazla dokunun alttaki yenilenmesinin altında kalan mekanizmaları incelemek için kullanılabilecek güçlü genetik ve moleküler araçlara sahip düşük maliyetli bir model sunar. Beyin hasarına verilen tepkiyi incelemek için kullanılabilecek yeni ve tekrarlanabilir bir yaralanma modeli burada özetlenmiştir. Bu protokoller kullanılarak elde edilen veriler, yetişkin Drosophila merkezi beyninin proliferatif yeteneği koruduğu ve yaralanmaya yanıt olarak yeni nöronlar ürettiği fikrini desteklemektadır. Bu gözlemler hem yetişkin nörogenezinin kapsamının hem de alttaki moleküler mekanizmalarının daha fazla araştırılmasını garanti eder. Bu sistemde nöral rejenerasyonda yer alan bileşenler belirlendikten sonra, yetişkin Drosophila nörogenez bilgimizi insanlara dönüştürebiliriz.
Disclosures
Yazarların çıkar çatışması yoktur.
Acknowledgments
Stacey Rimkus ve Becky Katzenberger'e teknik yardım için ve Eduardo Moreno'ya perma-twin hisselerini paylaştıkları için minnettarız. Barry Ganetzky ve David Wassarman'a şüphesiz bilimi geliştiren canlı tartışmalar için ve Kent Mok, Cayla Guerra ve Bailey Spiegelberg'e laboratuvara katkılarından dolayı teşekkür ederiz. FasII antikorları Corey Goodman tarafından geliştirilmiş ve NIH NICHD tarafından oluşturulan ve Iowa Üniversitesi, Biyoloji Bölümü, Iowa City, IA 52242'de sürdürülen Gelişimsel Çalışmalar Hybridoma Bankası'ndan elde edilmiştir. Bu çalışmada kullanılan Drosophila suşlarının çoğu Bloomington Drosophila Stock Center'dan (BDSC; NIH P40OD018537). Bu çalışma NIH T32 GM007133 (KLC) tarafından desteklendi; NIH NS090190 (GBF); NIH NS102698 (GBF); Wisconsin Üniversitesi Lisansüstü Okulu (GBF); ve UW-Madison Bilim ve MühendislikTe Kadın Liderlik Enstitüsü (WISELI) (GBF).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #11 disposable scalpels | Santa Cruz Biotechnology | sc-395923 | used for separating Drosophila heads from trunks prior to brain dissection |
| 150 mm diameter black Sylgard dishes | Dow | 1696157 | made in the laboratory with reagents from Dow; used for brain dissection |
| 18 mm coverslips | any | for mounting brains on microscope slides | |
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI) | ThermoFisher | D1306 | for immunohistochemistry |
| 70% Ethanol | made from 95% ethanol sourced variously | ||
| anti-mouse Cy5 | Jackson ImmunoResearch | 715-175-151 | for immunohistochemistry |
| anti-rabbit 568 | ThermoFisher | A11036 | for immunohistochemistry |
| bovine serum albumin (BSA) | SIgma Aldrich | A7030 | for immunohistochemisty |
| Clear nail polish | any | for sealing coverslips | |
| Click-It EdU labeling kit | InVitrogen | C10640 | to detect newly synthesized DNA |
| CO2 bubbler | Genesee Scientific | 59-181 | for anesthesia |
| CO2 pad | Genesee Scientific | 59-114 | for anesthesia |
| CO2 regulator and supply | any | for anesthesia | |
| Confocal microscope | any | for imaging fixed, stained and mounted brains | |
| cotton plugs | Genesee Scientific | 51-101 | for EdU labeling |
| Drosophila vials | Genesee Scientific | 32-109 | for EdU labeling |
| Fix buffer (Pipes, EGTA, Magnesium; PEM) | components sourced from various companies | for fixing adult brains; 100 mM piperazine-N,N’-bis(2-ethanesulfonic acid) [PIPES], 1 mM EGTA, 1 mM MgSO4, pH 7.0 | |
| Formaldehyde | Sigma Aldrich | 252549 | for fixing adult brains, added to PEM |
| Grade 3 round Whatman filters, 23 mm round | Tisch Scientific | 1003-323 | for EdU labeling |
| Microfuge tubes | any | for fixing and staining reactions and for storing Minutien pins | |
| Microscope slides | any | for mounting brains | |
| Minutien pins | Fine Science Tools | 26002-10 | for brain injury; 12.5 μm diameter tip and 100 μm diameter rod |
| mouse anti-Fasiclin II | Developmental Studies Hybridoma Bank | 1D4-s | for immunohistochemistry |
| NIGHTSEA stereo microscope fluorescence adaptor | Electron Microscopy Sciences | SFA-GR | fluorescence setup for dissecting microscope |
| P20, P200 and P1000 pipettors and tips | any | for measuring solutions | |
| phosphate buffered saliine (PBS) | components sourced from various companies | for dissecting brains and making immunohistochemistry blocking and washing solutions; 100 mM of K2HPO4, 140 mM of NaCl, pH 7.0 | |
| phosphate buffered saline with 0.1% Triton X-100 (PT) | components sourced from various companies | for washing dissected brains | |
| phosphate buffered saline with 0.1% Triton X-100 + 2% bovine serum albumin (PBT) | components sourced from various companies | blocking solution for immunohistochemistry and for diluting antibodies | |
| rabbit anti-PH3 | Santa Cruz Biotechnology, Inc | sc-8656-R | for immunohistochemistry |
| Reinforcement labels | Avery | 5721 | to maintain space between the microscope slide and the coverslip |
| Size 0 paintbrushes | any | to manipulate and stabilize adult Drosophila during injury | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | 93443 | |
| Two pair of #5 watchmakers forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | used to hold the Minutien pins and for brain dissections |
| Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | mounting medium for microscope slides |
References
- Thurman, D., et al. Report to Congress: Traumatic brain injury in the United States. , Available from: https://www.cdc.gov/traumaticbraininjury/pubs/tbi_report_to_congress.html (1999).
- NIEHS. , Available from: https://www.nih.gov/research/supported/health/neurodegenerative/index.cfm (2021).
- Morton, N. V., Wehman, P. Psychosocial and emotional sequelae of individuals with traumatic brain injury: A literature review and recommendations. Brain Injury. 9 (1), 81-92 (2017).
- Bonini, N. M., Berger, S. L. The sustained impact of model organisms-in genetics and epigenetics. Genetics. 205, 1-4 (2017).
- Brace, E. J., DiAntonio, A.
- Hao, Y., Collins, C. Intrinsic mechanisms for axon regeneration: insights from injured axons in Drosophila. Current Opinion in Genetics & Development. 44, 84-91 (2017).
- Chiang, A. S., et al. Three-dimensional reconstruction of brain-wide wiring networks in Drosophila at single-cell resolution. Current Biology. 21 (1), 1-11 (2011).
- Meinertzhagen, I. A. The organisation of invertebrate brains: cells, synapses and circuits. Acta Zoologica. 91 (1), 64-71 (2010).
- Bellen, H. J., Tong, C., Tsuda, H. 100 years of Drosophila research and its impact on vertebrate neuroscience: A history lesson for the future. Nature Reviews Neuroscience. 11 (7), 514-522 (2010).
- Lessing, D., Bonini, N. M. Maintaining the brain: insight into human neurodegeneration from Drosophila melanogaster mutants. Nature Reviews Genetics. 10 (6), 359-370 (2009).
- Boone, J. Q., Doe, C. Q. Identification of Drosophila type II neuroblast lineages containing transit amplifying ganglion mother cells. Developmental Neurobiology. 68 (9), 1185-1195 (2008).
- Ito, K., Hotta, Y. Proliferation pattern of postembryonic neuroblasts in the brain of Drosophila melanogaster. Developmental Biology. 149 (1), 134-148 (1992).
- Siegrist, S. E., Haque, N. S., Chen, C. H., Hay, B. A., Hariharan, I. K. Inactivation of both Foxo and reaper promotes long-term adult neurogenesis in Drosophila. Current Biology. 20 (7), 643-648 (2010).
- von Trotha, J. W., Egger, B., Brand, A. H. Cell proliferation in the Drosophila adult brain revealed by clonal analysis and bromodeoxyuridine labelling. Neural Development. 4, 9 (2009).
- Fernandez-Hernandez, I., Rhiner, C., Moreno, E.
- Crocker, K. L., et al.
- Plavicki, J., Mader, S., Pueschel, E., Peebles, P., Boekhoff-Falk, G. Homeobox gene distal-less is required for neuronal differentiation and neurite outgrowth in the Drosophila olfactory system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (5), 1578-1583 (2012).
- Aso, Y. The neuronal architecture of the mushroom body provides a logic for associative learning. Elife. 3, 04577 (2014).
- Ito, K., Awano, W., Suzuki, K., Hiromi, Y., Yamamoto, D. The Drosophila mushroom body is a quadruple structure of clonal units each of which contains a virtually identical set of neurones and glial cells. Development. 124 (4), 761-771 (1997).
- Tito, A. J., Cheema, S., Jiang, M., Zhang, S. A. Simple one-step dissection protocol for whole-mount preparation of adult Drosophila brains. Journal of Visualized Experiments. (118), e55128 (2016).
- Kelly, S. M., Elchert, A., Kahl, M. Dissection and immunofluorescent staining of mushroom body and photoreceptor neurons in adult Drosophila melanogaster brains. Journal of Visualized Experiments. (129), e56174 (2017).
- Arain, U., Valentino, P., Islam, I. M., Erclik, T. Dissection, immunohistochemistry and mounting of larval and adult Drosophila brains for optic lobe visualization. Journal of Visualized Experiments. (170), e61273 (2021).
