Denne artikkelen gir detaljerte protokoller for å påføre penetrerende traumatisk hjerneskade (PTBI) til voksen Drosophila og undersøke den resulterende nevrogenesen.
De molekylære og cellulære mekanismene som ligger til grunn for nevrogenese som respons på sykdom eller skade, er ikke godt forstått. Å forstå disse mekanismene er imidlertid avgjørende for å utvikle nevrale regenerative terapier. Drosophila melanogaster er en ledende modell for studier av nevral utvikling, men har historisk sett ikke blitt utnyttet til å undersøke voksen hjerneregenerering. Dette er først og fremst fordi den voksne hjernen utviser svært lav mititotisk aktivitet. Likevel, gjennomtrengende traumatisk hjerneskade (PTBI) til den voksne Drosophila sentrale hjernen utløser genereringen av nye nevroner og nye glia. De kraftige genetiske verktøyene som er tilgjengelige i Drosophila kombinert med den enkle, men strenge skadeprotokollen som er beskrevet her, gjør nå voksen Drosophila-hjerne til en robust modell for nevral regenereringsforskning. Her er detaljerte instruksjoner for (1) gjennomtrengende skader på den voksne sentrale hjernen og (2) disseksjon, immunhiistokjemi og avbildning etter skade. Disse protokollene gir svært reproduserbare resultater og vil legge til rette for ytterligere studier for å dissekere mekanismer som ligger til grunn for nevral regenerering.
Skade på hjernen og nervesystemet er en viktig årsak til død og funksjonshemming over hele verden. Omtrent 1,5 millioner amerikanere lider av traumatiske hjerneskader (TBI) hvert år1, mens anslagsvis 6 millioner individer i USA alene lider av nevrodegenerative sykdommer, som Parkinsons og Alzheimers sykdom2. Både sykdom og skade på hjernen kan forårsake nevral degenerasjon, noe som fører til sensoriske, kognitive og motoriske feil3. Å utvikle terapeutiske strategier for menneskelig hjernereparasjon har vært vanskelig på grunn av hjernens komplekse fysiologi. Modellorganismer som Drosophila melanogaster gir et enkelt system for å identifisere de grunnleggende mekanismene som ligger til grunn for nevrodegenerasjon og potensielle terapeutiske mål4.
Fruktfluen Drosophila melanogaster har vært en kraftig modellorganisme i mer enn et århundre, og fremmer feltene genetikk, utviklingsbiologi og nevrovitenskap5,6. Drosophila-hjernen består bare av ~ 90 000 nevroner7, en million ganger færre enn den gjennomsnittlige menneskelige hjernen8, men de har mange likheter. Både menneske- og flyhjerner bruker nevrotransmitterne GABA, glutamat, acetylkolin og de biogene aminene dopamin og serotonin9. Drosophila og menneskelige nevroner fungerer også på samme måte, med en felles synaptisk arkitektur og analoge nevrale celletyper10. Den mindre hjernestørrelsen på Drosophila og tilgjengeligheten av avanserte genetikkteknikker, i kombinasjon med bevaring av molekylære, cellulære og fysiologiske mekanismer mellom Drosophila og pattedyr, tillater Drosophila-forskere å stille spørsmål som er upraktiske eller vanskelige å svare på i pattedyrmodeller.
Vår nåværende forståelse av voksen neurogenese i Drosophila, både under homeostase og etter skade, forblir begrenset. Mer er kjent om nevrogenese under normal utvikling. For eksempel opprettes nevroner og glia under utvikling fra forløperceller, kalt nevroblaster10,11. Minst tre forskjellige typer nevroblaster har blitt skilt ut i den sentrale hjernen. Både Type I og Type II avstamnings neuroblaster går ut av cellesyklusen ~ 20-30 timer etter pupariumdannelse12. I kontrast er sopplegemet nevroblaster de siste til å avslutte celledeling og gjøre det via Reaper-avhengig apoptose ~ 85-90 h etter pupariumdannelse13. Etter eclosjon har den voksne Drosophila hjernen få skilleceller (~ 1 celle / hjerne), overveiende glia14. De voksne optiske lobene har sakte syklende nevroblaster som er i stand til nevrogenese15, mens den voksne sentrale hjernen ikke har noen kjente nevroblaster. Mangelen på nevrale forfedre og begrenset celleproliferasjon ligner sterkt situasjonen i den voksne pattedyrhjernen, og understreker den potensielle relevansen av mekanismene for voksen nevrogenese i Drosophila til mennesker.
Oppdagelsen av lave nivåer av voksen neurogenese i de voksne Drosophila optiske lobes etter skade15 førte til hypotesen om at den voksne Drosophila sentrale hjernen også kan være i stand til voksen nevrogenese16. Denne protokollen beskriver å skape en streng, reproduserbar modell av sentral hjerneskade hos voksne Drosophila som kan brukes til å undersøke nevrogenese i den voksne sentrale hjernen. Gitt likhetene mellom menneskelig og Drosophila hjernearkitektur og funksjon, kan disse funnene føre til identifisering av kritiske mål for terapeutisk nevrogenese i skadede og syke menneskelige hjerner.
Selv om gjennomtrengende skader på den voksne Drosophila-hjernen har blitt beskrevet tidligere15,17,18, fokuserte disse skadene på optiske lober og ikke den sentrale hjernen. Videre mangler detaljerte instruksjoner for hvordan du utfører skadene så langt. Denne protokollen beskriver en modell for gjennomtrengende skade på den voksne Drosophila sentrale hjernen som reproduserer statistisk signifikante bevis for voksen neurogenese etter PTBI.
Reproduserbarheten av denne PTBI-protokollen skyldes delvis soppkroppen som skademålregionen. Soppkroppen er stor, bestående av ~ 2200 nevroner med komplekse dendrit- og axon arbors i store og svært stereotype arrays18. Cellelegemene til sopplegeme nevroner ligger nær hjernens overflate og kan visualiseres gjennom hodeskjæret ved hjelp av uttrykket av grønt fluorescerende protein (GFP) (figur 1C). Forløpere for sopplegemer er de siste nevrale stamcellene som gjennomgår apoptose under utvikling13,12,19. Dermed er mange sopplegeme nevroner ganske unge på tidspunktet for eklosjon. Dette førte til hypotesen om at soppkroppen kunne ha mer mititotisk potensial enn andre hjerneregioner16. I tillegg er soppkroppen kritisk for læring og hukommelse18. Dette gjør det mulig å spørre om PTBI-utløst nevrogenese fører til funksjonell utvinning.
Andre faktorer som bidrar til reproduserbarheten av resultatene inkluderer bruk av utkryssede fluer av konsistente genotyper, utføre kryss i samme retning hver gang, nøyaktig kontrollere oppdretts- og aldringstemperaturen, og analysere menn og kvinner separat. Bruk av F1-fluer fra en outcross reduserer sannsynligheten for å analysere hjerner homozygot for spontane mutasjoner. Standardkorset av y[1] w[1]; UAS-mCD8-GFP;; OK107-GAL4 voksne kvinner til y[1] w[1] voksne mannlige fluer resulterer i F1 avkom av genotypen y[1] w[1]; UAS-mCD8-GFP/+;; OK107-GAL4/+. OK107-GAL4 uttrykkes i alle iboende nevroner i soppkroppen og driver uttrykk for den membranbundne reporteren UAS-mCD8-GFP som tillater visualisering av sopplegemer og deres projeksjoner. For perma-twin kryss, kryss må forbli ved 17 °C til enhver tid for å holde avledningssporingssystemet slått av. Dette sikrer at ingen delingsceller er merket under utvikling, og at bare voksenfødte nevroner og glia er merket. Til dette formål kan flyrommet også opprettholdes ved 17 °C. Selv om den første beskrivelsen av perma-twin-systemet15 anbefalte oppdrettsfluer ved 18 °C, kan dette føre til betydelig bakgrunnsmerking.
For konsistens anbefales det også å holde kontrollen uskadede fluer på CO2-puten når man utfører PTBI. Dette sikrer at begge sett med fluer har identisk bedøvelseseksponering. I tillegg er det ønskelig for reproduserbarhet å trenge helt inn i hodet. Det må imidlertid tas hensyn til ikke å bøye spissen av pinnen mot puten, noe som gjør den ubrukelig for fremtidige skader. For dyktige utøvere er det lite utilsiktet skade på PTBI fluer. Likevel kan det være dødelig å trykke for hardt på thoraxen for å stabilisere flyet under skade. En måte å vurdere omfanget av den utilsiktede skaden er å kvantifisere dødeligheten av PTBI fluer 24 timer etter skade. For ensidig skadede fluer kan dette være 50% eller høyere for nybegynnere. Derfor, for å sikre at observerte resultater skyldes PTBI og ikke til utilsiktet skade, anbefales det at nybegynnere praktiserer å administrere PTBI på ~ 20 fluer daglig over flere uker og ikke analysere de resulterende hjernene før 24 h dødelighet er konsekvent <10%.
For å kvantifisere mengden spredning stimulert av sentral hjerne PTBI, kan både anti-fosfohistone H3 (PH3) immunstaining og 5-ethynyl-2′-deoxyuridine (EdU) inkorporering brukes. Anti-PH3 merker celler før og gjennom metafase, og begrenser deteksjonen til bare en brøkdel av de aktivt delte cellene. Dermed gir anti-PH3 farging bare et delvis glimt av spredning. EdU er en tymidanalog som kan innlemmes i nylig syntetisert DNA. Ved å mate fluer EdU før og etter skade, er det mulig å få et mer komplett bilde av cellene som enten deler eller har delt seg etter skaden. Det faktum at celler som deler seg permanent er permanent merket, er nyttig både for identifisering av sakte sykkelceller og analyse overlevelsen av celler etter første spredning. Av uklare grunner, men kanskje på grunn av begrenset permeabilitet av blod-hjernebarrieren, er EdU-merking ineffektiv og underrapporterer celleproliferasjon i den voksne hjernen. Dette fremgår av tilsvarende antall PH3+ og EdU + celler i både kontroll og eksperimentelle hjerner ved 24 timer post-PTBI og ved å observere at bare en undergruppe av nye celler i perma-tvilling kloner innlemme EdU16. For maksimal merking er det viktig å forhåndsmate fluene med EdU fordi skadede fluer ikke gjenopptar fôring i flere timer etter PTBI. Fôring ble vurdert ved å legge til matfarging til EdU-løsningen og overvåke mengden fargestoff i tarmen gjennom bukskjæret16.
Det skal bemerkes at selv om vi har gitt en hjerne disseksjonsprotokoll i trinn 4, kan alternative teknikker brukes. Flere av disse er tilgjengelige i tidligere publiserte protokoller20,21,22. Drosophila melanogaster tilbyr en rimelig modell med kraftige genetiske og molekylære verktøy som kan brukes til å studere mekanismene som ligger til grunn for regenerering av flere vev, inkludert tarmen og komponentene i nervesystemet. En ny og reproduserbar skademodell som kan brukes til å studere responsen på hjerneskade er skissert her. Data innhentet ved hjelp av disse protokollene støtter ideen om at den voksne Drosophila sentrale hjernen beholder den proliferative evnen, og genererer nye nevroner som svar på skade. Disse observasjonene garanterer videre undersøkelse av både omfanget av voksen neurogenese og dens underliggende molekylære mekanismer. Når komponentene som er involvert i nevral regenerering er identifisert i dette systemet, kan vi konvertere vår kunnskap om voksen Drosophila neurogenesis til mennesker.
The authors have nothing to disclose.
Vi er takknemlige til Stacey Rimkus og Becky Katzenberger for teknisk assistanse og til Eduardo Moreno for å dele perma-twin aksjer. Vi vil takke Barry Ganetzky og David Wassarman for livlige diskusjoner som utvilsomt forbedret vitenskapen og Kent Mok, Cayla Guerra og Bailey Spiegelberg for deres bidrag til laboratoriet. FasII-antistoffene ble utviklet av Corey Goodman og hentet fra Developmental Studies Hybridoma Bank, opprettet av NIH NIH og vedlikeholdt ved University of Iowa, Institutt for biologi, Iowa City, IA 52242. De fleste Drosophila-stammene som ble brukt i denne studien ble hentet fra Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC; NIH P40OD018537). Dette arbeidet ble støttet av NIH T32 GM007133 (KLC); NIH NS090190 (GBF); NIH NS102698 (GBF); Universitetet i Wisconsin Graduate School (GBF); og UW-Madison Women in Science and Engineering Leadership Institute (WISELI) (GBF).
#11 disposable scalpels | Santa Cruz Biotechnology | sc-395923 | used for separating Drosophila heads from trunks prior to brain dissection |
150 mm diameter black Sylgard dishes | Dow | 1696157 | made in the laboratory with reagents from Dow; used for brain dissection |
18 mm coverslips | any | for mounting brains on microscope slides | |
4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI) | ThermoFisher | D1306 | for immunohistochemistry |
70% Ethanol | made from 95% ethanol sourced variously | ||
anti-mouse Cy5 | Jackson ImmunoResearch | 715-175-151 | for immunohistochemistry |
anti-rabbit 568 | ThermoFisher | A11036 | for immunohistochemistry |
bovine serum albumin (BSA) | SIgma Aldrich | A7030 | for immunohistochemisty |
Clear nail polish | any | for sealing coverslips | |
Click-It EdU labeling kit | InVitrogen | C10640 | to detect newly synthesized DNA |
CO2 bubbler | Genesee Scientific | 59-181 | for anesthesia |
CO2 pad | Genesee Scientific | 59-114 | for anesthesia |
CO2 regulator and supply | any | for anesthesia | |
Confocal microscope | any | for imaging fixed, stained and mounted brains | |
cotton plugs | Genesee Scientific | 51-101 | for EdU labeling |
Drosophila vials | Genesee Scientific | 32-109 | for EdU labeling |
Fix buffer (Pipes, EGTA, Magnesium; PEM) | components sourced from various companies | for fixing adult brains; 100 mM piperazine-N,N’-bis(2-ethanesulfonic acid) [PIPES], 1 mM EGTA, 1 mM MgSO4, pH 7.0 | |
Formaldehyde | Sigma Aldrich | 252549 | for fixing adult brains, added to PEM |
Grade 3 round Whatman filters, 23 mm round | Tisch Scientific | 1003-323 | for EdU labeling |
Microfuge tubes | any | for fixing and staining reactions and for storing Minutien pins | |
Microscope slides | any | for mounting brains | |
Minutien pins | Fine Science Tools | 26002-10 | for brain injury; 12.5 μm diameter tip and 100 μm diameter rod |
mouse anti-Fasiclin II | Developmental Studies Hybridoma Bank | 1D4-s | for immunohistochemistry |
NIGHTSEA stereo microscope fluorescence adaptor | Electron Microscopy Sciences | SFA-GR | fluorescence setup for dissecting microscope |
P20, P200 and P1000 pipettors and tips | any | for measuring solutions | |
phosphate buffered saliine (PBS) | components sourced from various companies | for dissecting brains and making immunohistochemistry blocking and washing solutions; 100 mM of K2HPO4, 140 mM of NaCl, pH 7.0 | |
phosphate buffered saline with 0.1% Triton X-100 (PT) | components sourced from various companies | for washing dissected brains | |
phosphate buffered saline with 0.1% Triton X-100 + 2% bovine serum albumin (PBT) | components sourced from various companies | blocking solution for immunohistochemistry and for diluting antibodies | |
rabbit anti-PH3 | Santa Cruz Biotechnology, Inc | sc-8656-R | for immunohistochemistry |
Reinforcement labels | Avery | 5721 | to maintain space between the microscope slide and the coverslip |
Size 0 paintbrushes | any | to manipulate and stabilize adult Drosophila during injury | |
Triton X-100 | Sigma Aldrich | 93443 | |
Two pair of #5 watchmakers forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | used to hold the Minutien pins and for brain dissections |
Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | mounting medium for microscope slides |