Summary
Denne artikkelen gir detaljerte protokoller for å påføre penetrerende traumatisk hjerneskade (PTBI) til voksen Drosophila og undersøke den resulterende nevrogenesen.
Abstract
De molekylære og cellulære mekanismene som ligger til grunn for nevrogenese som respons på sykdom eller skade, er ikke godt forstått. Å forstå disse mekanismene er imidlertid avgjørende for å utvikle nevrale regenerative terapier. Drosophila melanogaster er en ledende modell for studier av nevral utvikling, men har historisk sett ikke blitt utnyttet til å undersøke voksen hjerneregenerering. Dette er først og fremst fordi den voksne hjernen utviser svært lav mititotisk aktivitet. Likevel, gjennomtrengende traumatisk hjerneskade (PTBI) til den voksne Drosophila sentrale hjernen utløser genereringen av nye nevroner og nye glia. De kraftige genetiske verktøyene som er tilgjengelige i Drosophila kombinert med den enkle, men strenge skadeprotokollen som er beskrevet her, gjør nå voksen Drosophila-hjerne til en robust modell for nevral regenereringsforskning. Her er detaljerte instruksjoner for (1) gjennomtrengende skader på den voksne sentrale hjernen og (2) disseksjon, immunhiistokjemi og avbildning etter skade. Disse protokollene gir svært reproduserbare resultater og vil legge til rette for ytterligere studier for å dissekere mekanismer som ligger til grunn for nevral regenerering.
Introduction
Skade på hjernen og nervesystemet er en viktig årsak til død og funksjonshemming over hele verden. Omtrent 1,5 millioner amerikanere lider av traumatiske hjerneskader (TBI) hvert år1, mens anslagsvis 6 millioner individer i USA alene lider av nevrodegenerative sykdommer, som Parkinsons og Alzheimers sykdom2. Både sykdom og skade på hjernen kan forårsake nevral degenerasjon, noe som fører til sensoriske, kognitive og motoriske feil3. Å utvikle terapeutiske strategier for menneskelig hjernereparasjon har vært vanskelig på grunn av hjernens komplekse fysiologi. Modellorganismer som Drosophila melanogaster gir et enkelt system for å identifisere de grunnleggende mekanismene som ligger til grunn for nevrodegenerasjon og potensielle terapeutiske mål4.
Fruktfluen Drosophila melanogaster har vært en kraftig modellorganisme i mer enn et århundre, og fremmer feltene genetikk, utviklingsbiologi og nevrovitenskap5,6. Drosophila-hjernen består bare av ~ 90 000 nevroner7, en million ganger færre enn den gjennomsnittlige menneskelige hjernen8, men de har mange likheter. Både menneske- og flyhjerner bruker nevrotransmitterne GABA, glutamat, acetylkolin og de biogene aminene dopamin og serotonin9. Drosophila og menneskelige nevroner fungerer også på samme måte, med en felles synaptisk arkitektur og analoge nevrale celletyper10. Den mindre hjernestørrelsen på Drosophila og tilgjengeligheten av avanserte genetikkteknikker, i kombinasjon med bevaring av molekylære, cellulære og fysiologiske mekanismer mellom Drosophila og pattedyr, tillater Drosophila-forskere å stille spørsmål som er upraktiske eller vanskelige å svare på i pattedyrmodeller.
Vår nåværende forståelse av voksen neurogenese i Drosophila, både under homeostase og etter skade, forblir begrenset. Mer er kjent om nevrogenese under normal utvikling. For eksempel opprettes nevroner og glia under utvikling fra forløperceller, kalt nevroblaster10,11. Minst tre forskjellige typer nevroblaster har blitt skilt ut i den sentrale hjernen. Både Type I og Type II avstamnings neuroblaster går ut av cellesyklusen ~ 20-30 timer etter pupariumdannelse12. I kontrast er sopplegemet nevroblaster de siste til å avslutte celledeling og gjøre det via Reaper-avhengig apoptose ~ 85-90 h etter pupariumdannelse13. Etter eclosjon har den voksne Drosophila hjernen få skilleceller (~ 1 celle / hjerne), overveiende glia14. De voksne optiske lobene har sakte syklende nevroblaster som er i stand til nevrogenese15, mens den voksne sentrale hjernen ikke har noen kjente nevroblaster. Mangelen på nevrale forfedre og begrenset celleproliferasjon ligner sterkt situasjonen i den voksne pattedyrhjernen, og understreker den potensielle relevansen av mekanismene for voksen nevrogenese i Drosophila til mennesker.
Oppdagelsen av lave nivåer av voksen neurogenese i de voksne Drosophila optiske lobes etter skade15 førte til hypotesen om at den voksne Drosophila sentrale hjernen også kan være i stand til voksen nevrogenese16. Denne protokollen beskriver å skape en streng, reproduserbar modell av sentral hjerneskade hos voksne Drosophila som kan brukes til å undersøke nevrogenese i den voksne sentrale hjernen. Gitt likhetene mellom menneskelig og Drosophila hjernearkitektur og funksjon, kan disse funnene føre til identifisering av kritiske mål for terapeutisk nevrogenese i skadede og syke menneskelige hjerner.
Protocol
Denne protokollen følger retningslinjene for dyrepleie fra UW-Madison.
1. Generere voksen Drosophila for PTBI
- For standardkorset, plasser 20 virgin y[1] w[1]; UAS-mCD8-GFP;; OK107-GAL417 voksne kvinner og 10 y[1] w[1]17 voksne menn flyr sammen i hetteglass (se Materialfortegnelse) som inneholder mat. For å ha et stort antall synkrone avkom, sett opp 10-20 kryss samtidig. Standardkorset gir opphav til F1 avkom av genotypen: y[1] w[1]; UAS-mCD8-GFP/+;; OK107-GAL4/+.
- Plasser hetteglassene ved 25 °C for parring og egglegging. For å maksimere avkom, overfør foreldre til nye hetteglass hver 2-4 dager, opprettholde de tidligere hetteglassene ved 25 °C. Kast hvert hetteglass 18 dager etter at foreldrene først ble plassert i det for å sikre at det ikke er F2 avkom.
MERK: 3 sett med avkom ("brød") kan genereres fra hvert sett med foreldre. - Sjekk etter ~ 10 dager, når F1 avkom vil begynne å eclose.
- Plasser hetteglassene ved 25 °C for parring og egglegging. For å maksimere avkom, overfør foreldre til nye hetteglass hver 2-4 dager, opprettholde de tidligere hetteglassene ved 25 °C. Kast hvert hetteglass 18 dager etter at foreldrene først ble plassert i det for å sikre at det ikke er F2 avkom.
- For avledningsstudier, bruk F1 perma-twin hanner15 av genotype: w; FRT40A, UAS-CD2-RFP, UAS-GFP-Mir/FRT40A, UAS-CD8-GFP, UAS-CD2-Mir; tub-GAL80ts/act-GAL4 UAS-flp. For konsistens, gjør dette krysset i samme retning hver gang.
- For å generere perma-tvilling menn, plasser 20 jomfru m; FRT40A, UAS-CD2-RFP, UAS-GFP-Mir; tub-GAL80ts/TM6B kvinner og 10 w; FRT40A, UAS-CD8-GFP, UAS-CD2-Mir; act-GAL4 UAS-flp/TM6B15 voksne menn sammen i hetteglass som inneholder mat.
- Plasser hetteglassene ved 17 °C for parring og egglegging. Overfør foreldre til hetteglass med ny mat hver 7. Kast hvert hetteglass 35 dager etter at foreldrene først ble plassert i det for å sikre at det ikke er F2 avkom.
- Sjekk etter ~ 21 dager, når F1 avkom vil begynne å eclose.
2. Gjennomtrengende traumatisk hjerneskade (PTBI; Figur 1)
- Sorter nylig eclosed F1 fluer. Velg unge menn innen 6 timer etter eklosjon. Legg disse hannene i rene hetteglass som inneholder mat, med 40 eller færre fluer per hetteglass.
MERK: Dette oppnås lettest midt på morgenen ved bedøvelse av fluer på CO2-puten og identifisere voksne hanner som fortsatt har mekonium (synlig som et mørkegrønn sted gjennom bukveggen) i tarmene. - Formating med 5-etynyl-2'-deoksyuridin (EdU) (se Materialfortegnelse) i 6 timer før skaden hvis du planlegger å merke deling av celler med EdU. Se trinn 3 hvis du vil ha mer informasjon.
- Desinfiser Minutien-pinner (se Materialtabellen) i minst 5 minutter ved å plassere ~100 pinner i et 1,5 ml mikrosenterrør fylt med 70 % etanol.
- Desinfiser CO2-puten og en pensel ved å sprøyte 70% etanol og tørk tørr med et rent lofritt vev. Når verktøyene er rene og tørre, overfør 40 eller færre sorterte F1-hanner tilbake til den rene puten.
- Del F1-hannene i 2 grupper på flyputen. En gruppe vil tjene som en kontroll, uskadede fluer. Den andre eksperimentelle gruppen vil bli utsatt for PTBI.
- Bruk tang til å trekke 4-5 nye Minutien-pinner ut av mikrosenterrøret og plasser dem nær kanten av CO2-puten . Under dissekeringsområdet velger du en rett Minutien-pinne med et skarpt punkt.
MERK: Hvis du bruker en enkelt Minutien-pinne til et eksperiment, reduseres variasjonen. Bruk skarpe pinner på nytt. Plasser skadede eller stumpe pinner i et separat 1,5 ml mikrosenterrør som inneholder 70 % etanol for sikker avhending. - Hvis du arbeider med fluer fra standardkorset, slår du på stereomikroskopets lysdiodelampe (LED) utstyrt med de riktige eksitasjons- og utslippsfiltrene for grønt fluorescensprotein (GFP). Dette tillater eksitasjon ved 440-460 nM og tillater visualisering av 500-560 nM.
MERK: Med denne lampen og filtersettet vil cellelegemene i soppkroppen fluoresce grønn gjennom hodesekken (figur 1C). For perma-twin fluer eller fluer av andre genotyper, kan en standard hvitt lysbelysning for stereomikroskopet brukes til å visualisere landemerker på hodeskjæret for å målrette skaden på soppkroppen (figur 1C). - Bruk tangene til å plukke opp og holde den valgte Minutien-pinnen i den ene hånden (for høyrehendte mennesker er dette vanligvis høyre hånd) og penselen i den andre (vanligvis venstre) hånden. Velg en flue fra den eksperimentelle gruppen og plasser flyet slik at du har en dorsal utsikt over hodekapselen med flyets hode til høyre. Plasser børsten på fremre dorsal thorax og skyv forsiktig ned for å stabilisere flyet.
- Sikt Minutien-pinnens spiss mot soppkroppens cellelegemer på høyre side av hodet og penetrer hodekapselen. Hvis du bruker landemerker, må du målrette dorsalhodets kutikulære mellom ocellien og øyets dorsale kant (figur 1).
- Når du har fullført skaden, bruker du penselen til å skyve hodet forsiktig av Minutien-pinnen.
- Hvis du bruker hjernen til RNA-Seq eller qRT-PCR, gjør du en ny skade på venstre side av hodet.
- Gjenta trinn 2.8-2.10 for å skade alle fluene i den eksperimentelle gruppen.
- Når alle fluer er skadet, plasser kontrollen og skadede fluer i merkede, separate hetteglass som inneholder mat. Legg hetteglassene horisontalt (dvs. på sidene) mens fluene gjenoppretter fra anestesi og under etterfølgende aldring for å forhindre at fluer blir fanget i maten.
- Plasser standard kryssfluer ved 25 °C, og perma-twin flyr ved 30 °C til alder.
- For fluer i alderen lenger enn 24 timer, legg dem på ren mat hver 1-2 dager.
3. EdU-merking
- Forbered et lager på 10 mM 5-ethynyl-2'-deoksyuridin (EdU) i dimetylsulfoksid (DMSO). Dette kan oppbevares ved -20 °C i opptil 12 måneder.
- Forbered 200 μL 50 μM EdU i 10% sukrose. Pre-feed flyr med EdU i 6 timer før PTBI.
- Plasser 200 μL 50 μM EdU i 10% sukrose på et 23 mm rund klasse 3 filterpapir (se Materialbord) i et ellers tomt hetteglass.
- Plasser fluene i hetteglasset. Forsegle deretter hetteglasset med en bomullsplugg.
- Legg hetteglasset horisontalt i en fuktet inkubator ved 25 °C i 6 timer.
- Utfør PTBI som beskrevet i trinn 2.3-2.10.
- Plasser fluene tilbake i hetteglasset som inneholder EdU. Forsegle hetteglasset med en bomullsplugg.
- Legg hetteglasset horisontalt i en fuktig inkubator ved 25 °C i opptil 24 timer. Følg ett av trinnene som er beskrevet nedenfor (trinn 3.8.1-3.8.3).
- Dissekere og fikse hjerner som beskrevet i trinn 4 ved hjelp av fikserings-, vaskebuffer- og blokkeringsbuffer uten azide og med EdU-deteksjonsreaksjonen utført før antistofffarging.
- Overfør fluene til et rent hetteglass som inneholder et nytt filterpapir og 200 μL 50 μM EdU i 10% sukrose. Legg hetteglasset horisontalt i en inkubator på 25 °C. Gjenta hver 24. Deretter dissekerer og fikser du hjerner som beskrevet i trinn 4 ved hjelp av buffere uten azide med EdU-deteksjonsreaksjonen utført før antistofffarging.
- For å pulse-chase etikett med EdU, mate EdU for pulsperioden, overføre fluene hver 24 h til et rent hetteglass som inneholder et nytt filterpapir og 200 μL 50 μM i 10% sukrose. Etter pulsperioden (f.eks. 4 dager), overfør fluene til et hetteglass som inneholder standard Drosophila-mat. Plasser hetteglasset på siden i en 25 °C inkubator i ytterligere 3 dager. Deretter dissekerer og fikser du hjerner som beskrevet i trinn 4 ved hjelp av buffere uten azide med EdU-deteksjonsreaksjonen utført før antistofffarging.
4. Disseksjon, immunhiistokjemi og montering
- Forbered 1,5 ml mikrocentrifugerør med 100 μL fikseringsmiddel: 4 % formaldehyd i PEM (100 mM piperazin-N,N'-bis(2-etanesulfonsyre) [PIPES], 1 mM EGTA, 1 mM MgSO4, pH 7,0) (se Materialtabell) og plasser på is.
MERK: Så mange som 20 hjerner av en enkelt genotype og tilstand kan behandles i et enkelt rør. - Forbered en disseksjonsplate med ett lite basseng (~ 100 μL) på 70% etanol og tre små bassenger med fosfatbufret saltvann (PBS; 100 mM K2HPO4, 140 mM NaCl, pH 7,0).
- Bedøv ~10 kontroll eller eksperimentelle fluer på en CO2-pute som har blitt desinfisert med 70% etanol.
- Skill hodet fra stammen på hver flue ved hjelp av en skalpell.
- Samle hodene med en pensel fuktet i 70% etanol og legg hoder i 2-5 min i etanolbassenget på disseksjonsplaten.
MERK: Dette dehydrerer hjernen litt og gjør dem lettere å dissekere vekk fra hodeskolikken. - Overfør hodene til et ~ 100 μL basseng med PBS og disseker ut hjernen, flytt hver hjerne til et rent ~ 100 μL basseng med PBS. Utfør dette ved hjelp av to par Watchmakers tang for å åpne baksiden av hodes neglebåndet og holde neglebåndet med ett par tang mens du forsiktig lirker hjernen ut av neglebåndet ved hjelp av den lukkede spissen av det andre paret tang.
- Overfør de dissekerte hjernene til et mikrocentrifugerør som inneholder 100 μL av festeløsningen ved hjelp av en P200 pipettor utstyrt med en plastspiss som er kuttet og skråstilt for å tillate inngang av hjernen.
- Fest i 20-25 min ved romtemperatur. Fjern forsiktig løsningen med enten en P200 eller en glasspipette.
- Vask de faste hjernene fire ganger med 1 ml 'PT' (PBS pluss 0,1% Triton X-100), slik at hjernen kan bosette seg i flere minutter mellom hver vask.
MERK: Hvis hjernen ikke legger seg raskt mellom vaskene, vil de sannsynligvis ha fortsatt fettlegeme og / eller luftrør festet. - Blokker prøver i 1 ml PBS pluss 0,1% Triton X-100 og 2% bovint serumalbumin (PBT) i ~ 1 time ved romtemperatur.
- Fjern blokkeringsløsningen og inkuber prøver med 100 μL primær antistoffoppløsning over natten ved 4 °C i PBT. De primære antistoffene som brukes i denne studien er kanin anti-PH3 (1:500) og mus anti-Fasiclin II (1:20) (se Tabell over materialer).
- Vask prøver fem ganger med 1 ml PT, slik at hjernen kan bosette seg i flere minutter mellom hver vask.
- Fjern den endelige vasken og inkuber i 100 μL sekundær antistoffoppløsning over natten ved 4 °C. De sekundære antistoffene som brukes her er antikanin 568 (1:400) og antimus Cy5 (1:100) (se Materialtabell).
- Vask prøver fem ganger med 1 ml PT, slik at hjernen kan bosette seg i flere minutter mellom hver vask. Under den siste vasken, tilsett 4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI; 1:100 av en 10 μM løsning) i 10 min for å farge kjernene. Fjern vasken, og la 50-100 μL i hvert rør.
- Forbered mikroskopskred ved å plassere en enkelt, selvklebende forsterkningsetikett på midten av hvert lysbilde og en 50 μL dråpe anti-fade monteringsmedier i midten av hver etikett (se Materialtabell). Forsterkningsetiketten holder dekslene litt over lysbildene og forhindrer at de monterte hjernene blir altfor flatt.
- Overfør hjernen forsiktig fra hvert mikrosenterrør til et forberedt lysbilde med så lite vaskebuffer som mulig ved hjelp av en P200 utstyrt med en kuttet og skrå plastspiss. Så mange som 10 hjerner kan monteres på et enkelt lysbilde.
- Bruk tang til å forsiktig omplassere hjernen før du legger en deksle på hvert lysbilde og forsegler lysbildet med neglelakk. Orienter hjernen med enten bakre side opp eller fremre side opp, men bør ikke berøre hverandre.
MERK: Fordi det er vanskelig å få konfektbilder av høy kvalitet gjennom en hel hjerne, bør noen hjerner monteres i hver retning. - Oppbevar preparerte sklier flatt og i mørket ved 4 °C til bildebehandling. For langtidslagring (opptil 1 år) kan lysbilder oppbevares ved -20 °C.
5. Konfomisk bildebehandling
MERK: Bildehjerner som bruker et laserskanningskonfokalt mikroskop med eksitasjonslasere og utslippsfilterbiter som passer til HENHOLDSVIS DAPI og de fluorescerende sekundære antistoffene (dvs. 405 nm, 488 nm og 568 nm, 633 nm).
- Slå på strømmen til mikroskopet, lasere, kontrolleren og datamaskinen.
- Åpne Anskaffelsesprogramvaren.
- I anskaffelsesmodus velger du opptil fire kanaler og angir parameteren for sekvensiell skanning av de ønskede kanalene. Øk lasereffekten for hver kanal til 5-10%.
- Plasser et lysbilde på mikroskopet.
- Velg en hjerne som skal avbildes ved hjelp av epifluorescenstilbehøret (se Materialfortegnelse).
- I anskaffelsesmodus velger du 1024 x 1024 piksler som rammedimensjon.
- I anskaffelsesmodus velger du Z-stack-alternativet, angir at Z-stack skal tas ved 2 μm-seksjoner, og fokuserer gjennom prøven og velger de øverste og nederste brennplanene som skal avbildes.
- Samle Z-stack bilder av hele hjerner ved hjelp av en 20x objektiv og spesifikke hjerneregioner som sopp kroppen ved hjelp av en 60x mål.
6. Dataanalyse
- Kvantifisere spredningscellene og antall perma-tvillingkloner manuelt og/eller ved hjelp av bildeanalyseprogramvaren (se Materialfortegnelser). Når du bruker programvare, velger du områder av interesse (ROIer) med områder på minst 10 μm.
Representative Results
PTBI stimulerer celleproliferasjon
For å bestemme omfanget av nevrogenese etter en sentral hjerne PTBI, ble den proliferative responsen målt hos unge voksne menn samlet og skadet innen 6 timer etter eclosjon. En betydelig økning i spredning ble observert 24 timer etter skade ved bruk av anti-fosfohistone 3 (PH3), en markør for celler som aktivt gjennomgår mitose. Omtrent 3 PH3+-celler i kontroll sentrale hjerner og 11 PH3+-celler i de skadde sentrale hjernene observeres 24 timer etter PTBI (figur 2A-D). De fleste delecellene ligger i nærheten av skadestedet. En annen analyse for celledeling ble brukt til å kvantifisere den kumulative celleproliferasjonen fra en enkelt skade og for å vurdere i hvilken grad de nyopprettede cellene overlevde. 5-ethynyl-2'-deoksyuridin (EdU) er en tymidanalog som kan innlemmes i nylig syntetisert DNA og permanent merke celler som har gjennomgått DNA-syntese. Fluer fikk en 4-dagers puls av EdU, etterfulgt av en 3-dagers jakt. Dette avslørte at de merkede cellene var levedyktige og overlevde minst 3 dager etter spredning. Med 7 dager var det i gjennomsnitt 2 EdU+-celler som kontrollerte sentrale hjerner og i gjennomsnitt 11 EdU+-celler i henholdsvis de skadede sentrale hjernene (figur 2E). Dette ligner på resultatene som er oppnådd 24 timer etter skade ved bruk av PH3-antistoffet. Når celleproliferasjon måles ved 14 dager, var de uskadede kontrollene i gjennomsnitt 1 EdU+ celle per sentral hjerne, mens de skadede hjernene i gjennomsnitt var 29 EdU+ celler (figur 2E), noe som viser at celleproliferasjonen fortsetter minst inn i den andre uken etter en PTBI.
Celleproliferasjon er aldersavhengig
Den største proliferative responsen i den sentrale hjernen ble observert i løpet av de første 24 timer etter eclosjon (figur 3). Ved 7 dager etter eklosjon forårsaker en gjennomtrengende skade fortsatt en betydelig økning i spredning, med et gjennomsnitt på 6 PH3 + celler per sentral hjerne. Likevel, med 14 dager etter eklosjon, reduseres evnen for celler til å dele seg etter PTBI betydelig til 1 delingscelle, lik kontrollhjernen (figur 3). Dermed er potensialet for celleproliferasjon etter PTBI aldersavhengig.
Nyopprettede nevroner kan projisere for å korrigere målområder
For å evaluere nevral regenerering etter PTBI ble perma-twin merkingssystemet15 brukt. Perma-twin avgrensningssporing merker permanent deling av celler og deres avkom med et grønt fluorescerende protein (GFP) eller rødt fluorescerende protein (RFP)15. Flere perma-tvillingkloner ble påvist i skadede prøver, etter 2 dager og 2 uker, enn i kontroller (figur 4A-E). Spesielt var det nye sopplegeme nevroner i ~ 50% av PTBI-hjernene 2 uker etter skade (figur 4N). Disse nye nevronene projiserte sine dendritter på riktig måte til sopplegemet calyx og deres axoner på riktig måte til soppkroppslobene (figur 4D, F, G). Dette indikerer at de nyopprettede cellene kan være funksjonelle nevroner involvert i reparasjon av de skadede sopplegemene. Andre områder av hjernen som så ut til å regenerere inkluderer ellipsoidkroppen (EB) (figur 4H, I), antennelobene (AL) (figur 4J, K) og sidehornet (LH) (figur 4L,M) som hadde store kloner omtrent 26%, 26% og 20% av tiden, henholdsvis (figur 4N). Disse resultatene understreker nytten av dette systemet for undersøkelse av voksen neurogenese. En foreslått modell for hendelsesforløpet etter PTBI og som fører til generering av nye nevroner, er vist i figur 5.
Figur 1: Gjennomtrengende traumatisk hjerneskade (PTBI) til den voksne Drosophila sentrale hjernen. (A) Skjematisk på utsiden av et voksent flyhode. Dette er en frontal utsikt. Dermed er høyre side av dyret til betrakterens venstre. (B) Skjematisk for interiøret i et voksen Drosophila-hode med skadebanen angitt i grått. Dette er en bakre utsikt. Således, i dette bildet og etterfølgende figurer, er høyre side av hjernen til høyre. Sentral hjerne PTBI påvirker flere hjernestrukturer, inkludert soppkroppen (grønn) og vev utenfor hjernen, inkludert fettlegemet (blå) og hemocytter (rød). CB = sentral hjerneregion. OL= optisk lobe region. (C) Dorsal syn på et levende voksent hode der sopplegemer (pilspisser) er merket med et grønt fluorescerende protein (GFP). Dette er 'standard genotype' (se tekst for detaljer). PTBI-protokollen resulterer reprodusinerende i skade på sopplegemene. Dette tallet er tilpasset fra Referanse16. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: PTBI stimulerer celleproliferasjon. Skjemaene Uskadet kontroll (A) og PTBI (B). De blå boksene øverst til høyre angir hjerneområdene som vises ved høyere forstørrelse i paneler (C) og (D). (C,D) PH3 antistoff (rødt) ble brukt til å analyse celleproliferasjon 24 timer etter skade. I kontrollhjerner (C) er det få PH3+ celler og ingen i nærheten av MB. I PTBI-hjerner (D) er det imidlertid PH3+-celler i nærheten av MB. (E) Kvantifisering av spredningsceller. Tallene reflekterer spredningsceller gjennom hele hjernen, ikke bare i nærheten av soppkroppen. Ved 24 timer hadde uskadede kontrollhjerner i gjennomsnitt 3 PH3+ celler/hjerne (n = 11 hjerner, 28 celler), mens 24 timer post-PTBI hadde hjerner i gjennomsnitt 11 PH3+ celler/hjerne (n = 17 hjerner, 181 celler). På 7 dager har uskadede kontroller få EdU+-celler, med et gjennomsnitt på 2 EdU+-celler/hjerne (n = 15 hjerner, 24 celler), mens 7-dagers post-PTBI-hjerner i gjennomsnitt hadde 11 EdU+-celler/hjerne (n = 22 hjerner, 238 celler). Ved 14 dager har uskadede kontroller i gjennomsnitt 1 EdU+ celle/hjerne (n = 8 hjerner,11 celler), mens 14-dagers post-PTBI hjerner har et gjennomsnitt på 29 EdU + celler / hjerne (n = 14 hjerner, 400 celler). For dette settet med eksperimenter ble unge voksne menn innen 6 timer med eclosjon brukt. Ubetalte t-tester av kontroll- og PTBI-prøver ved 3-punkts avkastningsverdiene p<0,0001, p<0001 og p<0,0002. Feilfelt gjenspeiler standardavviket (SD). Dette tallet er tilpasset fra Referanse16. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Den proliferative responsen på PTBI avtar med alderen. For å undersøke om alder påvirker mengden celleproliferasjon som oppstår etter skade, ble nylig lukkede voksne menn sammenlignet med dyr i alderen 7 dager, 14 dager og 28 dager før PTBI, ved hjelp av anti-PH3 for å analysecelleproliferasjon 24 timer etter skade. Fluer skadet innen 6 timer eclosjon hadde i gjennomsnitt 11 PH3+ celler/hjerne (n = 17 hjerner, 182 celler) sammenlignet med et gjennomsnitt på 3 PH3+ celler/hjerne i alderstilpassede kontroller (n = 11 hjerner, 28 celler). Fluer i alderen til 7 dager, deretter utsatt for PTBI, hadde i gjennomsnitt 6 PH3 + celler / hjerne (n = 11 hjerner, 65 celler) sammenlignet med alderstilpassede kontroller med et gjennomsnitt på 2 PH3 + celler / hjerne (n = 5 hjerner, 12 celler). Når fluer var i alderen 14 dager før PTBI og analyserte 24 timer senere, var det i gjennomsnitt 1 PH3 + celle / hjerne (n = 8 hjerner, 11 celler) som ligner alderstilpassede kontroller, som også i gjennomsnitt var 1 PH3 + celle / hjerne (n = 4 hjerner, 2 celler). 28-dagers uskadet kontroll (n = 4, 1 celle) og PTBI (n = 3, 1 celle) flyr begge i gjennomsnitt 0 PH3 + celler / hjerne. Ubetalte t-tester for PTBI for å kontrollere sammenligninger på disse 4-tidspunktene er henholdsvis p<0.0001, p<0,04, p<0,07 og p<0,84. Dette tallet er tilpasset fra Referanse16. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Perma-twin lineage tracing demonstrerer hjerneregenerering og passende målretting av aksoner etter PTBI. Perma-twin lineage-tracing system15 ble brukt til å analysere neurogenese etter PTBI. Dette systemet merker permanent deling av celler og avkom med et grønt fluorescerende protein (GFP) eller rødt fluorescerende protein (RFP). Fluer ble oppdrettet ved 17 °C for å holde systemet av under utbyggingen. F1 menn som bærer perma-tvillingtransgenes ble samlet på eklosjon, deretter skadet og plassert ved 30 °C for å komme seg i 2 eller 14 dager. (A) I 2-dagers uskadede kontroller er det noen GFP + celler spredt over hele hjernen. (B) Ved 14 dager er det relativt få GFP+-celler til stede i kontrollsentralhjernen. (C) Til sammenligning har 2-dagers skadede hjerner flere GFP+-celler som har en tendens til å klynge seg nær skaden (pilspiss). (D) Etter 14 dager etter skaden er det store kloner i nærheten av skadestedet. Noen av disse klonene har axoner som projiserer langs soppkroppskanalene (pilspiss). Bare GFP-kanalen vises her. rfp+-klonene i PTBI-prøvene. (E) Antall kloner øker over tid etter PTBI.Control uskadede hjerner (n = 13) har i gjennomsnitt 10 kloner på 2 dager, mens 2-dagers PTBI hjerner (n = 20) har et gjennomsnitt på 23 kloner (p<0.00002). Ved 7 dager hadde kontrollhjerner i gjennomsnitt 9 kloner per hjerne (n = 18), mens 7-dagers PTBI-hjerner i gjennomsnitt hadde 39 kloner per hjerne (n = 16) (p-verdi<0,000000002). Dette er betydelig mer enn antall kloner sett på 2 dager etter skade (p-verdi<0,0009). I 14-dagers kontrollhjerner er det i gjennomsnitt 10 kloner per hjerne, noe som ikke er vesentlig forskjellig fra 2-dagers og 7-dagers kontroller. Men etter 14 dager etter PTBI er det i gjennomsnitt 66 GFP+-kloner, som er betydelig mer enn enten alderstilpassede kontroller (p<0,0000003) eller 2-dagers post-PTBI-hjerner (p-verdi<0,0001). Feilstenger reflekterer SD. (F-M) PTBI stimulerer klonedannelse i flere regioner i hjernen. Paneler på venstre side er skjemaer av hjerneregioner der store kloner ble funnet 14 dager etter PTBI (A, H, J, L). Paneler til høyre viser høye forstørrelser av representative hjerner (G, I, K, M). Mange 14-dagers hjerner hadde kloner som projiserte til bestemte målområder. Disse inkluderte soppkroppen (MB) (F, G), ellipsoidkroppen (EB) (H, I), antenneloben (AL) (J, K) og sidehornet (LH) (L, M). (N) Både klonenummer og klonestørrelse øker med tiden etter PTBI.Andelen hjerneregioner med store kloner ble beregnet til 2, 7 og 14 dager i kontroller og skadede hjerner. Ved 2 dager viste ~ 8% av kontrollhjernene (n = 13) AL-kloner, mens det ikke var al-kloner i 2-dagers skadede hjerner (n = 20). I 7-dagers kontrollhjerner (n = 18) hadde 6 % AL og 6 % hadde EB-kloner. Etter 7 dager etter PTBI (n = 16), hadde 6% av hjernene også AL-kloner, 6% hadde EB-kloner og 19% hadde store MB kloner. Ved 14 dager viste kontrollhjerner (n = 9) ingen spesifikke områder med kloner, mens 47% av PTBI-hjernene (n = 15) hadde MB kloner, 20% av PTBI-hjernene hadde AL-kloner, og 27% av PTBI-hjernene hadde EB-kloner, og 27% hadde LH-kloner. Dette tallet er tilpasset fra Referanse16. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Oppsummeringsmodell for regenerering etter gjennomtrengende traumatisk hjerneskade (PTBI). Hos unge voksne Drosophila er det passiv nevroblastrelignende celler i den sentrale hjernen som mangler uttrykk for kanoniske nevroblastergener. Ved 24 timer etter PTBI aktiveres de passive nevroblastomlignende cellene, uttrykker nevroblastergener og har begynt å spre seg. Ved både 4 timer og 24 timer etter PTBI er det en bølge av celledød16. På 7 dager er spredningsraten fortsatt høy, og mange av de nye cellene har vedtatt modne celleidentiteter, blitt nevroner eller glia. På 14 dager etter PTBI, store kloner av nye nevroner med axoner og dendritter riktig projiserer til sine respektive målområder. Locomotoriske feil gjenopprettes også med 14 dager, noe som tyder på at voksne Drosophila kan regenerere funksjonelt og strukturelt. Dette tallet er tilpasset fra Referanse16. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Discussion
Selv om gjennomtrengende skader på den voksne Drosophila-hjernen har blitt beskrevet tidligere15,17,18, fokuserte disse skadene på optiske lober og ikke den sentrale hjernen. Videre mangler detaljerte instruksjoner for hvordan du utfører skadene så langt. Denne protokollen beskriver en modell for gjennomtrengende skade på den voksne Drosophila sentrale hjernen som reproduserer statistisk signifikante bevis for voksen neurogenese etter PTBI.
Reproduserbarheten av denne PTBI-protokollen skyldes delvis soppkroppen som skademålregionen. Soppkroppen er stor, bestående av ~ 2200 nevroner med komplekse dendrit- og axon arbors i store og svært stereotype arrays18. Cellelegemene til sopplegeme nevroner ligger nær hjernens overflate og kan visualiseres gjennom hodeskjæret ved hjelp av uttrykket av grønt fluorescerende protein (GFP) (figur 1C). Forløpere for sopplegemer er de siste nevrale stamcellene som gjennomgår apoptose under utvikling13,12,19. Dermed er mange sopplegeme nevroner ganske unge på tidspunktet for eklosjon. Dette førte til hypotesen om at soppkroppen kunne ha mer mititotisk potensial enn andre hjerneregioner16. I tillegg er soppkroppen kritisk for læring og hukommelse18. Dette gjør det mulig å spørre om PTBI-utløst nevrogenese fører til funksjonell utvinning.
Andre faktorer som bidrar til reproduserbarheten av resultatene inkluderer bruk av utkryssede fluer av konsistente genotyper, utføre kryss i samme retning hver gang, nøyaktig kontrollere oppdretts- og aldringstemperaturen, og analysere menn og kvinner separat. Bruk av F1-fluer fra en outcross reduserer sannsynligheten for å analysere hjerner homozygot for spontane mutasjoner. Standardkorset av y[1] w[1]; UAS-mCD8-GFP;; OK107-GAL4 voksne kvinner til y[1] w[1] voksne mannlige fluer resulterer i F1 avkom av genotypen y[1] w[1]; UAS-mCD8-GFP/+;; OK107-GAL4/+. OK107-GAL4 uttrykkes i alle iboende nevroner i soppkroppen og driver uttrykk for den membranbundne reporteren UAS-mCD8-GFP som tillater visualisering av sopplegemer og deres projeksjoner. For perma-twin kryss, kryss må forbli ved 17 °C til enhver tid for å holde avledningssporingssystemet slått av. Dette sikrer at ingen delingsceller er merket under utvikling, og at bare voksenfødte nevroner og glia er merket. Til dette formål kan flyrommet også opprettholdes ved 17 °C. Selv om den første beskrivelsen av perma-twin-systemet15 anbefalte oppdrettsfluer ved 18 °C, kan dette føre til betydelig bakgrunnsmerking.
For konsistens anbefales det også å holde kontrollen uskadede fluer på CO2-puten når man utfører PTBI. Dette sikrer at begge sett med fluer har identisk bedøvelseseksponering. I tillegg er det ønskelig for reproduserbarhet å trenge helt inn i hodet. Det må imidlertid tas hensyn til ikke å bøye spissen av pinnen mot puten, noe som gjør den ubrukelig for fremtidige skader. For dyktige utøvere er det lite utilsiktet skade på PTBI fluer. Likevel kan det være dødelig å trykke for hardt på thoraxen for å stabilisere flyet under skade. En måte å vurdere omfanget av den utilsiktede skaden er å kvantifisere dødeligheten av PTBI fluer 24 timer etter skade. For ensidig skadede fluer kan dette være 50% eller høyere for nybegynnere. Derfor, for å sikre at observerte resultater skyldes PTBI og ikke til utilsiktet skade, anbefales det at nybegynnere praktiserer å administrere PTBI på ~ 20 fluer daglig over flere uker og ikke analysere de resulterende hjernene før 24 h dødelighet er konsekvent <10%.
For å kvantifisere mengden spredning stimulert av sentral hjerne PTBI, kan både anti-fosfohistone H3 (PH3) immunstaining og 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) inkorporering brukes. Anti-PH3 merker celler før og gjennom metafase, og begrenser deteksjonen til bare en brøkdel av de aktivt delte cellene. Dermed gir anti-PH3 farging bare et delvis glimt av spredning. EdU er en tymidanalog som kan innlemmes i nylig syntetisert DNA. Ved å mate fluer EdU før og etter skade, er det mulig å få et mer komplett bilde av cellene som enten deler eller har delt seg etter skaden. Det faktum at celler som deler seg permanent er permanent merket, er nyttig både for identifisering av sakte sykkelceller og analyse overlevelsen av celler etter første spredning. Av uklare grunner, men kanskje på grunn av begrenset permeabilitet av blod-hjernebarrieren, er EdU-merking ineffektiv og underrapporterer celleproliferasjon i den voksne hjernen. Dette fremgår av tilsvarende antall PH3+ og EdU + celler i både kontroll og eksperimentelle hjerner ved 24 timer post-PTBI og ved å observere at bare en undergruppe av nye celler i perma-tvilling kloner innlemme EdU16. For maksimal merking er det viktig å forhåndsmate fluene med EdU fordi skadede fluer ikke gjenopptar fôring i flere timer etter PTBI. Fôring ble vurdert ved å legge til matfarging til EdU-løsningen og overvåke mengden fargestoff i tarmen gjennom bukskjæret16.
Det skal bemerkes at selv om vi har gitt en hjerne disseksjonsprotokoll i trinn 4, kan alternative teknikker brukes. Flere av disse er tilgjengelige i tidligere publiserte protokoller20,21,22. Drosophila melanogaster tilbyr en rimelig modell med kraftige genetiske og molekylære verktøy som kan brukes til å studere mekanismene som ligger til grunn for regenerering av flere vev, inkludert tarmen og komponentene i nervesystemet. En ny og reproduserbar skademodell som kan brukes til å studere responsen på hjerneskade er skissert her. Data innhentet ved hjelp av disse protokollene støtter ideen om at den voksne Drosophila sentrale hjernen beholder den proliferative evnen, og genererer nye nevroner som svar på skade. Disse observasjonene garanterer videre undersøkelse av både omfanget av voksen neurogenese og dens underliggende molekylære mekanismer. Når komponentene som er involvert i nevral regenerering er identifisert i dette systemet, kan vi konvertere vår kunnskap om voksen Drosophila neurogenesis til mennesker.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Vi er takknemlige til Stacey Rimkus og Becky Katzenberger for teknisk assistanse og til Eduardo Moreno for å dele perma-twin aksjer. Vi vil takke Barry Ganetzky og David Wassarman for livlige diskusjoner som utvilsomt forbedret vitenskapen og Kent Mok, Cayla Guerra og Bailey Spiegelberg for deres bidrag til laboratoriet. FasII-antistoffene ble utviklet av Corey Goodman og hentet fra Developmental Studies Hybridoma Bank, opprettet av NIH NIH og vedlikeholdt ved University of Iowa, Institutt for biologi, Iowa City, IA 52242. De fleste Drosophila-stammene som ble brukt i denne studien ble hentet fra Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC; NIH P40OD018537). Dette arbeidet ble støttet av NIH T32 GM007133 (KLC); NIH NS090190 (GBF); NIH NS102698 (GBF); Universitetet i Wisconsin Graduate School (GBF); og UW-Madison Women in Science and Engineering Leadership Institute (WISELI) (GBF).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #11 disposable scalpels | Santa Cruz Biotechnology | sc-395923 | used for separating Drosophila heads from trunks prior to brain dissection |
| 150 mm diameter black Sylgard dishes | Dow | 1696157 | made in the laboratory with reagents from Dow; used for brain dissection |
| 18 mm coverslips | any | for mounting brains on microscope slides | |
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI) | ThermoFisher | D1306 | for immunohistochemistry |
| 70% Ethanol | made from 95% ethanol sourced variously | ||
| anti-mouse Cy5 | Jackson ImmunoResearch | 715-175-151 | for immunohistochemistry |
| anti-rabbit 568 | ThermoFisher | A11036 | for immunohistochemistry |
| bovine serum albumin (BSA) | SIgma Aldrich | A7030 | for immunohistochemisty |
| Clear nail polish | any | for sealing coverslips | |
| Click-It EdU labeling kit | InVitrogen | C10640 | to detect newly synthesized DNA |
| CO2 bubbler | Genesee Scientific | 59-181 | for anesthesia |
| CO2 pad | Genesee Scientific | 59-114 | for anesthesia |
| CO2 regulator and supply | any | for anesthesia | |
| Confocal microscope | any | for imaging fixed, stained and mounted brains | |
| cotton plugs | Genesee Scientific | 51-101 | for EdU labeling |
| Drosophila vials | Genesee Scientific | 32-109 | for EdU labeling |
| Fix buffer (Pipes, EGTA, Magnesium; PEM) | components sourced from various companies | for fixing adult brains; 100 mM piperazine-N,N’-bis(2-ethanesulfonic acid) [PIPES], 1 mM EGTA, 1 mM MgSO4, pH 7.0 | |
| Formaldehyde | Sigma Aldrich | 252549 | for fixing adult brains, added to PEM |
| Grade 3 round Whatman filters, 23 mm round | Tisch Scientific | 1003-323 | for EdU labeling |
| Microfuge tubes | any | for fixing and staining reactions and for storing Minutien pins | |
| Microscope slides | any | for mounting brains | |
| Minutien pins | Fine Science Tools | 26002-10 | for brain injury; 12.5 μm diameter tip and 100 μm diameter rod |
| mouse anti-Fasiclin II | Developmental Studies Hybridoma Bank | 1D4-s | for immunohistochemistry |
| NIGHTSEA stereo microscope fluorescence adaptor | Electron Microscopy Sciences | SFA-GR | fluorescence setup for dissecting microscope |
| P20, P200 and P1000 pipettors and tips | any | for measuring solutions | |
| phosphate buffered saliine (PBS) | components sourced from various companies | for dissecting brains and making immunohistochemistry blocking and washing solutions; 100 mM of K2HPO4, 140 mM of NaCl, pH 7.0 | |
| phosphate buffered saline with 0.1% Triton X-100 (PT) | components sourced from various companies | for washing dissected brains | |
| phosphate buffered saline with 0.1% Triton X-100 + 2% bovine serum albumin (PBT) | components sourced from various companies | blocking solution for immunohistochemistry and for diluting antibodies | |
| rabbit anti-PH3 | Santa Cruz Biotechnology, Inc | sc-8656-R | for immunohistochemistry |
| Reinforcement labels | Avery | 5721 | to maintain space between the microscope slide and the coverslip |
| Size 0 paintbrushes | any | to manipulate and stabilize adult Drosophila during injury | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | 93443 | |
| Two pair of #5 watchmakers forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | used to hold the Minutien pins and for brain dissections |
| Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | mounting medium for microscope slides |
References
- Thurman, D., et al. Report to Congress: Traumatic brain injury in the United States. , Available from: https://www.cdc.gov/traumaticbraininjury/pubs/tbi_report_to_congress.html (1999).
- NIEHS. , Available from: https://www.nih.gov/research/supported/health/neurodegenerative/index.cfm (2021).
- Morton, N. V., Wehman, P. Psychosocial and emotional sequelae of individuals with traumatic brain injury: A literature review and recommendations. Brain Injury. 9 (1), 81-92 (2017).
- Bonini, N. M., Berger, S. L. The sustained impact of model organisms-in genetics and epigenetics. Genetics. 205, 1-4 (2017).
- Brace, E. J., DiAntonio, A.
- Hao, Y., Collins, C. Intrinsic mechanisms for axon regeneration: insights from injured axons in Drosophila. Current Opinion in Genetics & Development. 44, 84-91 (2017).
- Chiang, A. S., et al. Three-dimensional reconstruction of brain-wide wiring networks in Drosophila at single-cell resolution. Current Biology. 21 (1), 1-11 (2011).
- Meinertzhagen, I. A. The organisation of invertebrate brains: cells, synapses and circuits. Acta Zoologica. 91 (1), 64-71 (2010).
- Bellen, H. J., Tong, C., Tsuda, H. 100 years of Drosophila research and its impact on vertebrate neuroscience: A history lesson for the future. Nature Reviews Neuroscience. 11 (7), 514-522 (2010).
- Lessing, D., Bonini, N. M. Maintaining the brain: insight into human neurodegeneration from Drosophila melanogaster mutants. Nature Reviews Genetics. 10 (6), 359-370 (2009).
- Boone, J. Q., Doe, C. Q. Identification of Drosophila type II neuroblast lineages containing transit amplifying ganglion mother cells. Developmental Neurobiology. 68 (9), 1185-1195 (2008).
- Ito, K., Hotta, Y. Proliferation pattern of postembryonic neuroblasts in the brain of Drosophila melanogaster. Developmental Biology. 149 (1), 134-148 (1992).
- Siegrist, S. E., Haque, N. S., Chen, C. H., Hay, B. A., Hariharan, I. K. Inactivation of both Foxo and reaper promotes long-term adult neurogenesis in Drosophila. Current Biology. 20 (7), 643-648 (2010).
- von Trotha, J. W., Egger, B., Brand, A. H. Cell proliferation in the Drosophila adult brain revealed by clonal analysis and bromodeoxyuridine labelling. Neural Development. 4, 9 (2009).
- Fernandez-Hernandez, I., Rhiner, C., Moreno, E.
- Crocker, K. L., et al.
- Plavicki, J., Mader, S., Pueschel, E., Peebles, P., Boekhoff-Falk, G. Homeobox gene distal-less is required for neuronal differentiation and neurite outgrowth in the Drosophila olfactory system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (5), 1578-1583 (2012).
- Aso, Y. The neuronal architecture of the mushroom body provides a logic for associative learning. Elife. 3, 04577 (2014).
- Ito, K., Awano, W., Suzuki, K., Hiromi, Y., Yamamoto, D. The Drosophila mushroom body is a quadruple structure of clonal units each of which contains a virtually identical set of neurones and glial cells. Development. 124 (4), 761-771 (1997).
- Tito, A. J., Cheema, S., Jiang, M., Zhang, S. A. Simple one-step dissection protocol for whole-mount preparation of adult Drosophila brains. Journal of Visualized Experiments. (118), e55128 (2016).
- Kelly, S. M., Elchert, A., Kahl, M. Dissection and immunofluorescent staining of mushroom body and photoreceptor neurons in adult Drosophila melanogaster brains. Journal of Visualized Experiments. (129), e56174 (2017).
- Arain, U., Valentino, P., Islam, I. M., Erclik, T. Dissection, immunohistochemistry and mounting of larval and adult Drosophila brains for optic lobe visualization. Journal of Visualized Experiments. (170), e61273 (2021).
