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Biochemistry

Síntesis de masarimicina, un inhibidor de molécula pequeña del crecimiento bacteriano grampositivo

Published: January 7, 2022 doi: 10.3791/63191
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Department of Science and Technology, Bryant University, 2Center for Health and Behavioral Sciences, Bryant University

Summary

Se presenta un protocolo detallado para preparar la masarimicina de diamida bacteriostática, una sonda de molécula pequeña que inhibe el crecimiento de Bacillus subtilis y Streptococcus pneumoniae al dirigirse a la degradación de la pared celular. Su aplicación como sonda química está demostrada en ensayos de sinergia/antagonismo y estudios morfológicos con B. subtilis y S. pneumoniae.

Abstract

El peptidoglicano (PG) en la pared celular de las bacterias es una estructura macromolecular única que confiere forma y protección del entorno circundante. Un elemento central para comprender el crecimiento y la división celular es el conocimiento de cómo la degradación de PG influye en la biosíntesis y el ensamblaje de la pared celular. Recientemente, se ha reportado el etiquetado metabólico de PG a través de la introducción de azúcares o aminoácidos modificados. Si bien es posible el interrogatorio químico de pasos biosintéticos con inhibidores de moléculas pequeñas, las herramientas de biología química para estudiar la degradación de PG por autolisinas están subdesarrolladas. Las autolisinas bacterianas son una amplia clase de enzimas que están involucradas en la degradación estrechamente coordinada de PG. Aquí, se presenta un protocolo detallado para preparar una sonda de molécula pequeña, masarimicina, que es un inhibidor de la N-acetilglucosaminidasa LytG en Bacillus subtilis, y el metabolismo de la pared celular en Streptococcus pneumoniae. Se proporciona la preparación del inhibidor a través de la síntesis orgánica clásica y asistida por microondas. Se presenta su aplicabilidad como herramienta para estudiar la fisiología Gram-positiva en ensayos biológicos.

Introduction

Peptidoglicano (PG) es un polímero similar a una malla que delinea la forma y estructura celular en bacterias Gram-positivas y Gram-negativas 1,2. Este heteropolímero es una matriz de aminoazúcares reticulados por péptidos cortos 3,4,5,6 con una columna vertebral compuesta por residuos de ácido N-acetilglucosamina (GlcNAc) y ácido N-acetilmurámico (MurNAc) alternados β-(1,4) (Figura 1)1. Unido a la fracción C-3 lactyl de MurNAc está el péptido del tallo. El metabolismo de pg implica un sistema estrechamente coordinado de enzimas biosintéticas y degradativas para incorporar nuevo material en la pared celular 7,8. La degradación de PG se lleva a cabo por enzimas denominadas colectivamente autolisinas9 y clasificadas en función de la especificidad del enlace escindido. Las autolisinas participan en muchos procesos celulares, incluyendo el crecimiento celular, la división celular, la motilidad, la maduración pg, la quimiotaxis, la secreción de proteínas, la competencia genética, la diferenciación y la patogenicidad10,11. Desentrañar las funciones biológicas específicas de las autolisinas individuales puede ser desalentador, debido en parte a la redundancia funcional. Sin embargo, los estudios biofísicos recientes 8,12,13 ycomputacionales 12 han proporcionado una nueva visión de sus roles en el metabolismo de PG. Además, informes recientes han proporcionado más información sobre la síntesis14 ylos 15,16,17 pasos mediados por membrana en el metabolismo de PG. Una comprensión profunda de la relación entre las vías degradativas y sintéticas del metabolismo de PG podría dar lugar a objetivos antibióticos previamente no explotados.

Si bien ha habido avances significativos en la metodología para estudiar la glicobiología en eucariotas, la glicobiología bacteriana y, en particular, el metabolismo de PG no ha avanzado a un ritmo similar. Los enfoques químicos actuales para estudiar el metabolismo de PG incluyen antibióticos marcados fluorescentemente18, sondas fluorescentes19,20 y etiquetado metabólico 21,22,23,24. Estos nuevos enfoques están proporcionando nuevas formas de interrogar el metabolismo de la pared celular bacteriana. Si bien algunas de estas estrategias son capaces de etiquetar PG in vivo, pueden ser específicas de la especie19, o solo funcionan en cepas que carecen de una autolisinaparticular 25. Muchas estrategias de etiquetado de PG están diseñadas para su uso con paredes celulares aisladas26 o con vías de biosíntesis de PG reconstituidas in vitro 20,27,28. El uso de antibióticos marcados fluorescentemente se limita actualmente a pasos biosintéticos y transpeptidación18.

El conocimiento actual de las autolisinas bacterianas y su papel en el metabolismo de la pared celular proviene del análisis bioquímico genético e in vitro 11,29,30,31,32. Si bien estos enfoques han proporcionado una gran cantidad de información sobre esta importante clase de enzimas, descifrar su papel biológico puede ser un desafío. Por ejemplo, debido a la redundancia funcional33, la eliminación de una autolisina en la mayoría de los casos no resulta en la detención del crecimiento bacteriano. Esto es a pesar de su papel implícito en el crecimiento celular y la división 7,12. Otra complicación es que la deleción genética de autolisinas bacterianas puede dar lugar a metafenotipos34. Los metafenotipos surgen de la compleja interacción entre la vía afectada por la deleción genética y otras vías interconectadas. Por ejemplo, un metafenotipo puede surgir a través de un efecto directo, como la falta de una enzima, o un efecto indirecto, como una interrupción de los reguladores.

Actualmente, solo hay unos pocos inhibidores de las autolisinasas glucosidasas como las N-acetilglucosaminidasas (GlcNAcase) y las N-acetilmuramidasas, que se pueden utilizar como sondas químicas para estudiar la degradación de PG. Para abordar esto, la diamida masarimicina (anteriormente denominada como fgkc) ha sido identificada y caracterizada35 como un inhibidor bacteriostático del crecimiento de Bacillus subtilis que se dirige a la GlcNAcase LytG32 (Figura 1). LytG es una GlcNAcase36 de exoacción, un miembro del grupo 2 dentro de la familia de la glicosilhidralasa 73 (GH73). Es el principal activo de GlcNAcase durante el crecimiento vegetativo32. Hasta donde sabemos, la masarimicina es el primer inhibidor de una GlcNAcase que actúa en PG y que inhibe el crecimiento celular. Estudios adicionales de masarimicina con Streptococcus pneumoniae encontraron que la masarimicina probablemente inhibe el metabolismo de la pared celular en este organismo37. Aquí, la preparación de masarimicina se informa para su uso como una sonda de biología química para estudiar la fisiología en los organismos Gram-positivos B. subtilis y S. pneumoniae. Se presentan ejemplos de análisis morfológico del tratamiento de concentración inhibitoria submámica con masarimicina, así como un ensayo de sinergia/antagonismo. Los ensayos de sinergia y antagonismo utilizando antibióticos con modos de acción bien definidos pueden ser una forma útil de explorar las conexiones entre los procesos celulares 38,39,40.

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Protocol

1. Métodos generales

NOTA: Todos los compuestos se compraron a proveedores estándar y se utilizaron sin purificación adicional.

  1. Realizar cromatografía de capa fina (TLC) sobre una placa de aluminio precubierta con gel de sílice XG F254. Detectar manchas debajo de una lámpara UV, por inmersión en tinción de p-anisaldehído, o por exposición al vapor I2 .
  2. Registre todos los espectros de resonancia magnética nuclear (RMN) en un espectrómetro de 400 MHz.
    NOTA: 1espectro de RMN H y 13de RMN C se hicieron referencia a picos de disolventes residuales. Las constantes de acoplamiento se dan en [Hz] y los cambios químicos en [ppm].
  3. Registre los espectros de espectrometría de masas de ionización química a presión atmosférica (APCI) de masarimicina en un espectrómetro de masas compacto equipado con una sonda de análisis de sólidos atmosféricos.

2. Procedimiento general para la preparación de masarimicina

NOTA: Realice los pasos a continuación en una campana extractora de humos.

  1. Prepare una solución de 0,1 M en metanol de cada reactivo: ciclohexilamina, ciclohexil carboxaldehído, ácido o-yodobenzoico y ciclohexilo isocianuro35.
    PRECAUCIÓN: La ciclohexilamina, el ciclohexil isocianuro y el ciclohexil carboxaldehído son inflamables. Pueden causar corrosión en la piel e inducir toxicidad oral, dérmica, respiratoria o reproductiva. Mantenga los compuestos alejados de llamas abiertas, superficies calientes y fuentes de ignición. Use protección adecuada para la piel y los ojos, trabaje en un área bien ventilada y evite la inhalación de vapores o niebla. Para el almacenamiento, mantenga las botellas bien cerradas y guárdelas en un lugar fresco y seco. Almacene el ciclohexil carboxaldehído en un desecador bajo una atmósfera N2 .
  2. Mezcle 5 ml de ciclohexilamina (solución de 0,1 M en metanol) y 5 ml de carboxaldehído de ciclohexilo (0,1 M en metanol) en un matraz de fondo redondo tapado y revuelva la solución con una barra de agitación magnética en una placa agitada / caliente durante 30 min a 40 ° C en un baño de arena. Controle la temperatura con un termómetro colocado aproximadamente 1 cm por debajo de la superficie de arena.
  3. Después de 30 min, agregue 5 ml de ciclohexil isocianuro (solución de 0,1 M en metanol) a la solución del paso 2.2 y revuelva durante 20 minutos adicionales a 50 °C. Por último, agregue 5 ml de ácido o-yodobenzoico (solución de 0,1 M en metanol) a la mezcla de reacción y continúe agitando a 55 ° C durante 3-5 h.
  4. Monitoree el progreso de la reacción periódicamente por TLC aproximadamente cada hora después de que la mezcla de reacción anterior se haya agitado durante 3 h.
  5. Corte una tira de 3 cm x 6 cm de placa TLC con respaldo de aluminio. Usando un lápiz #2, dibuja una línea aproximadamente a 1 cm de la parte inferior. Usando un microcapilar de vidrio, coloque aproximadamente 5 μL de la mezcla de reacción en la placa TLC y deje que se seque.
  6. A un vaso de precipitados de 150 ml, agregue suficiente fase móvil (hexano 90:10: isopropanol) para cubrir el fondo del vaso de precipitados. Usando un par de pinzas, coloque cuidadosamente la placa TLC anterior en el vaso de precipitados asegurándose de que la placa TLC entre en la fase móvil de manera uniforme. Cubra la parte superior del vaso de precipitados con un trozo de papel de aluminio.
    NOTA: Asegúrese de que la fase móvil no cubra la línea y la muestra manchada.
  7. Permita que la fase móvil viaje por la placa TLC hasta que esté aproximadamente 1 cm por debajo de la parte superior de la placa. Retire la placa TLC y, con un lápiz, dibuje una línea que indique la distancia recorrida por la fase móvil. Deje que la placa TLC se seque en una campana extractora de humos.
  8. Una vez seco, coloque la placa TLC en un vaso de precipitados que contenga una pequeña cantidad de sólido I2 y cubra el vaso de precipitados con un trozo de papel de aluminio. Monitoree el TLC para el desarrollo de manchas amarillas / marrones. Una vez desarrollado, retire la placa TLC y marque la ubicación de las manchas con un lápiz (Figura suplementaria 1).
    NOTA: Si no se marcan2 puntos, la mancha se disipará con el tiempo. Las manchas también se pueden visualizar en la placa TLC mediante luz UV, tinción de p-anisaldehído o tinción de permanganato de potasio (consulte Información complementaria).
  9. Calcule los valoresde R f para todos los puntos visualizados utilizando la siguiente fórmula:
    Rf = Equation 1
  10. Considere la reacción completa cuando solo un punto con Rf = 0.3 es visible en la placa TLC. Retire el disolvente en un evaporador rotatorio a presión reducida y seque el producto crudo (obtenido como un aceite de color marrón amarillento) a alto vacío hasta que todo el metanol se evapore.
  11. Disuelva el producto crudo seco en 30 ml de acetato de etilo y transfiéralo a un embudo separador. Extraiga acetato de etilo secuencialmente con 1 M HCl (2 x 30 mL), H2O (30 mL), solución saturada de NaHCO3 (2 x 30 mL), H2O (30 mL) y solución saturada de NaCl (2 x 30 mL). Deseche las capas acuosas.
    NOTA: La capa de acetato de etilo es la capa superior en cada una de las extracciones. Para cada extracción, agite vigorosamente el embudo separador que contiene el acetato de etilo y la solución acuosa (HCl, H2O, NaHCO3 o NaCl) y permita que las capas se separen por completo.
  12. Retire la capa de acetato de etilo del embudo separador y recójala en un matraz Erlenmeyer. Agregue una espátula llena de Na2SO4 (anhidra) para eliminar el agua residual del acetato de etilo.
    NOTA: La solución de acetato de etilo se considera seca cuando Na2SO4 en el matraz corre libremente y no se agrupa. Si Na2SO4 se aglutina, se puede agregar una espátula adicional de Na2SO4 .
  13. Filtre la solución seca de acetato de etilo a través del papel de filtro # 1 para eliminar Na2SO4. Lave el papel de filtro con una pequeña cantidad de acetato de etilo. Coloque la solución de acetato de etilo filtrada en un matraz de fondo redondo y retire el disolvente en un evaporador rotatorio a presión reducida para obtener masarimicina como aceite una vez que se elimine todo el acetato de etilo.
  14. Disuelva el aceite de masarimicina obtenido anteriormente en una cantidad mínima (1-2 ml) de hexano 9: 1: isopropanol y revuelva en una placa de agitación magnética hasta que todo el compuesto se disuelva.
  15. Purificar la masarimicina disuelta mediante cromatografía flash utilizando una columna flash de sílice de fase normal de 12 g.
    1. Equilibre la columna flash con 10 volúmenes de columna de fase móvil (hexano 99:1: isopropanol) con el instrumento ajustado a un caudal de 15 mL/min.
      NOTA: Una vez completado el equilibrio, detenga el flujo y desconecte la parte superior de la columna del sistema.
    2. Extraiga la masarimicina disuelta con una jeringa de 5 ml. Conecte la jeringa directamente a la parte superior de la columna de flash equilibrado e inyecte la solución en la columna. Vuelva a conectar la columna cargada al sistema de cromatografía flash e inicie la elución del gradiente.
    3. Elute masarimycin de la columna utilizando elución de gradiente a una concentración final de fase móvil de 10:90 hexano: isopropanol sobre 12 volúmenes de columna. Controlar la elución de masarimicina vía absorción a 230 y 254 nm.
    4. Recoger los compuestos eluidos de la columna por un colector de fracción que recoge 20 ml de disolvente por fracción.
      NOTA: Si no se dispone de un sistema de cromatografía flash, la purificación de masarimicina se puede realizar a través de una columna de sílice por gravedad con una fase móvil 3:1 (hexano: acetato de etilo). Las fracciones que contienen masarimicina pueden ser identificadas por TLC utilizando la misma fase móvil. La visualización de las manchas de TLC se realizó con luz UV, vapor I2 o tinción de permanganato de potasio.
    5. Identifique las fracciones que contienen masarimicina mediante TLC (pasos 2.5-2.9) o espectrometría de masas en un espectrómetro de masas compacto equipado con una sonda de análisis de sólidos atmosféricos. Secar el producto final al vacío (~0,3 mbar).
      NOTA: La masarimicina se obtiene rutinariamente como un aceite incoloro o sólido con un rendimiento del 55% -70% con respecto a los mmol de ciclohexil carboxaldehído agregado a la reacción. Calcular el rendimiento final de masarimicina obteniendo la masa de la masaromicina purificada y calculando el rendimiento teórico de la reacción utilizando la siguiente fórmula:
      % de rendimiento = Equation 2 x 100%
  16. Confirmar la estructura de la masarimicina mediante RMN.
    1. Disolver ~10 mg de muestra de masarimicina en 0,5 ml de CDCl3. Usando una pipeta Pasteur, transfiera la solución a un tubo de RMN de 5 mm y tapone el tubo. Coloque el tubo de RMN en el espectrómetro.
    2. Adquiera espectros de RMN de 1H y 13C utilizando experimentos preestablecidos por el fabricante. Las asignaciones de turnos químicos y los espectros representativos se proporcionan en las Figuras Suplementarias 3-4.
  17. Almacene la masaromicina seca o disuelta en DMSO (concentración final de 25 mM) a -20 °C hasta su uso.

3. Procedimiento de microondas para la preparación de masarimicina

  1. Preparar 0,6 M de soluciones de ciclohexilamina, ciclohexil carboxaldehído, ciclohexil isocianuro y ácido o-yodobenzoico en acetonitrilo.
  2. Agregue una barra de agitación y 10 ml de acetonitrilo a un vial de reacción de microondas de vidrio.
  3. Añadir 2 ml de ciclohexilamina (0,6 M en acetonitrilo), 2 ml de ciclohexilo carboxaldehído (0,6 M en acetonitrilo) y 7 ml de acetonitrilo al vial.
  4. Coloque el vial de reacción de microondas en el carrusel de microondas. Revuelva la mezcla, caliéntela durante 30 minutos a 50 ° C a una potencia de 400 W y deje que se enfríe a temperatura ambiente.
  5. Añadir 2 ml de ácido o-yodobenzoico (0,6 M en metanol) y 2 ml de ciclohexil isocianuro (0,6 M en acetonitrilo) al vial. Revuelva la mezcla, caliéntela a 100 °C en el microondas durante 40 minutos a una potencia de 400 W y deje que se enfríe a temperatura ambiente.
  6. Monitorear el progreso de la reacción por TLC (hexano 90:10: isopropanol) usando vapor I2 después de la finalización del paso 3.5.
    NOTA: Si TLC muestra que la reacción es incompleta (es decir, múltiples puntos en TLC), coloque el vial de reacción de nuevo en el microondas y establezca las condiciones de microondas descritas en el paso 3.5.
  7. Una vez que se complete la reacción, vierta la solución en un matraz de fondo redondo de 100 ml y evapore hasta que se seque con un evaporador rotatorio.
  8. Siga los pasos 2.6-2.16 anteriores para completar el análisis acuoso, la purificación y la caracterización de la masarimicina.

4. Ensayo de sinergia y antagonismo

  1. Cultivar Streptococcus pneumoniae R6 en placas de agar Mueller-Hinton (MH) que contengan 5% (v/v) de sangre de oveja a 37 °C en condiciones anaeróbicas. En todos los experimentos, use células de segundo paso cultivadas en 5 ml de caldo MH a 37 ° C en condiciones anaeróbicas hasta que OD600 sea ~ 0.4.
  2. Someter los inhibidores masarimicina y optoquina a diluciones seriales 1:2 en disolventes respectivos, con las concentraciones resultantes flanqueando los valores mínimos de concentración inhibitoria (CMI) de cada inhibidor.
    1. Realizar la dilución inicial de masarimicina en dimetilsulfóxido (DMSO) hasta alcanzar una concentración de 100 μM. A partir de este punto, haga diluciones de masarimicina en caldo MH. Preparar la solución madre de optoquina (3,5 mM) disolviendo optoquina disponible comercialmente (ver Tabla de Materiales) en caldo MH estéril.
      NOTA: Las soluciones de masarimicina se fabricaron a 25 mM en DMSO.
  3. A una placa estéril de microtitulación de 96 pocillos, agregue 2 alícuotas μL de cada dilución de optoquina a cada fila de la placa. A la misma placa, agregue 2 alícuotas μL de cada dilución de masarimicina a cada columna para crear una matriz de concentraciones de optoquina y masarimicina en la placa (Figura 2).
  4. Agregue caldo MH estéril (93 μL) a cada pocillo que contenga los inhibidores anteriores. Inocular las placas de microtitulación con 5 μL de cultivo (OD600 ~ 0.4) a partir del paso 4.1.
    NOTA: La inoculación de la placa de 96 pocillos se realiza típicamente en condiciones anaeróbicas en una estación de trabajo anaeróbica. El volumen final en el pozo es de 100 μL.
  5. Cultivar cultivos durante 18 h a 37 °C en condiciones anaeróbicas, seguido de la adición de 30 μL de solución al 0,01% (m/v) de sal sódica de resazurina sódica. Incubar la placa a temperatura ambiente durante 15 min para permitir la formación y estabilización del color.
    NOTA: La solución de resazurina se prepara disolviendo el compuesto en agua destilada y se puede almacenar a 4 °C durante un máximo de dos semanas.
  6. Lea directamente los valores de concentración de la placa y asigne la concentración de inhibidor más baja para la cual no se observa crecimiento bacteriano (color azul) como [X] (ver paso 4.7.1), es decir, la concentración inhibitoria más baja del fármaco en presencia del co-fármaco.
    NOTA: El crecimiento bacteriano positivo se identifica en los pozos por el tinte de resazurin que se vuelve rosa. Los valores de MIC para cada fármaco solo (es decir, en ausencia de co-fármaco) se determinan de manera similar utilizando el ensayo de resazurin MIC35 con cada fármaco por separado (Figura suplementaria 5). Los CMI en S. pneumoniae son de 7,8 μM y 15,85 μM para masarimicina y optoquina, respectivamente.
  7. Determinar la concentración inhibitoria fraccional (FIC) y el índice FIC (FICI) utilizando las siguientes ecuaciones.
    1. FIC= [X]/MICx, donde [X] (a partir del paso 4.6) es la concentración inhibitoria más baja del fármaco en presencia del co-fármaco, y MICx es la concentración inhibitoria más baja del fármaco en ausencia del co-fármaco.
    2. FICI= FICmasarimicina +antibiótico FIC
      NOTA: FICI < 0.5 = sinérgico, 0.5 < FICI < 1 = aditivo, 1 < FICI < 4 = indiferente, FICI > 4 = antagónico.

5. Estudio morfológico

  1. Cultive Bacillus subtilis 11774 en placas de agar Luria-Bertani (LB) (10 g/L de triptona, 5 g/L de extracto de levadura y 5 g/L de NaCl) que contengan 1,5% de agar Bacto a 37 °C. En todos los experimentos, use células de segundo paso cultivadas en 5 ml de caldo LB a 37 ° C hasta OD600 = 1. Cultive S.pneumoniae de la misma manera que en el paso 4.1.
  2. Después de obtener una densidad de cultivo celular con OD600nm = 1 para B. subtilis, o OD600nm = 0.4 para S. pneumoniae, agregue masarimicina usando una pipeta al tubo de cultivo etiquetado como "tratado" a una concentración final de 3.8 μM (0.75x MIC para B.subtilis), o 5.85 μM (0.75x MIC para S.pneumoniae). Al segundo tubo de cultivo etiquetado como "control", agregue un volumen equivalente de DMSO.
  3. Para B.subtilis, coloque las muestras en una incubadora a 37 °C durante 90 min con agitación a 150 rpm. Para S. pneumoniae, incubar las células sin temblar en condiciones anaeróbicas.
  4. Después de 90 min, fije químicamente los cultivos en una mezcla 1:10 (v/v) de medios de cultivo y tampón de fijación (20 mM HEPES, 1% de formaldehído (pH 6.8)) a 4 °C durante la noche. Una vez completada la fijación, aplique 10-20 μL de muestras a los portaobjetos de microscopio de vidrio con una pipeta y deje que se sequen al aire. Fije las muestras secas al aire calentando los portaobjetos de vidrio con un quemador Bunsen.
  5. Después de la fijación térmica, tiñe las muestras con la adición de 100 μL de azul de metileno al 0,1% (m/v) (solución en etanol al 20% (v/v)). Incubar los portaobjetos manchados durante 10 min y lavar el exceso de tinte con dH2O. Luego, caliente suavemente los toboganes teñidos a 60 ° C en un horno durante 15-20 minutos para llevar las células a un plano focal común.
  6. Selle las muestras teñidas colocando una cubierta de microscopio sobre las células teñidas. Luego, selle los bordes con cemento de portaobjetos de microscopio. Coloque el portaobjetos sellado del microscopio en el escenario del microscopio y enfoque la imagen con un aumento de 100x mediante microscopía de campo brillante.
  7. Coloque una gota de aceite de inmersión en el portaobjetos del microscopio y enfoque el campo de visión con un aumento de 1000x. Adquirir micrografías utilizando una cámara conectada al microscopio y su software asociado. Adquiera imágenes utilizando el balance de blancos automático y la configuración de apertura en el software.
    NOTA: Alternativamente, las imágenes se pueden procesar utilizando el software de código abierto ImageJ.

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Representative Results

La masarimicina es un inhibidor bacteriostático de molécula pequeña de B. subtilis y S. pneumoniae y se ha demostrado que inhibe la GlcNAcase LytG de acción exo-acción en B. subtilis35,37 y se dirige a la pared celular en S. pneumoniae37. La masarimicina se puede preparar de manera eficiente mediante la síntesis orgánica clásica o asistida por microondas con rendimientos en el rango del 55% al 70%. La síntesis asistida por microondas tiene la ventaja de una reducción significativa en el tiempo para sintetizar el compuesto. La síntesis asistida por microondas acorta la síntesis de 5-6 h (síntesis tradicional) a 2-3 h mientras mantiene rendimientos comparables. La cromatografía flash proporciona una rápida purificación de masarimicina en alta pureza (Figuras suplementarias 1-2). Las asignaciones estructurales de losespectros de RMN de 1 H y 13C junto con los espectros representativos se proporcionan en las Figuras Suplementarias 3-4.

Las pantallas de sinergia y antagonismo pueden ser una herramienta útil para revelar conexiones funcionales entre componentes celulares (sinergia) e investigar redes genéticas y mecanismos de acción farmacológica (antagonismo)40. La evaluación de la sinergia/antagonismo con el inhibidor de la ATPasa optoquina en S. pneumoniae se presenta en la Figura 2. El ensayo de placa de microtitulación de resazurina41 proporciona una lectura fácil del crecimiento / no crecimiento del organismo. La concentración más baja de compuesto para inhibir el crecimiento bacteriano (color azul) se toma como el valor MIC en presencia de un co-fármaco. Los pozos con crecimiento bacteriano serán de color rosa. La relación entre masarimicina y optoquina se determinó calculando el índice de concentración del inhibidor fraccional (FICI) utilizando ecuaciones en el paso de protocolo 4.7. El valor FICI para la interacción masarimicina-optoquina se calcula en 1,5, lo que indica una relación indiferente basada en los estándares publicados42. Los ensayos fenotípicos que utilizaron masarimicina en B. subtilis a concentraciones sub-MIC presentaron un fenotipo similar a la salchicha (Figura 3B) que difiere de los fenotipos reportados del mutante ΔlytG en la literatura32 y se asemeja más a los knockouts múltiples de autolisina29. El análisis fenotípico de S. pneumoniae con masarimicina a concentraciones sub-MIC presentó un fenotipo aglutinante (Figura 3D). Este fenotipo aglutinante es distinto de los reportados para las GlcNAcases de Acción de la pared celular de S. pneumoniae 43,44,45.

Figure 1
Figura 1: Estructura del peptidoglicano que muestra el sitio de escisión de la N-acetil glucosaminidasa exo-acción LytG de Bacillus subtilis. El recuadro muestra la estructura del inhibidor de LytG masarimicina. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Ensayo de sinergia/antagonismo para explorar las relaciones antagónicas/sinérgicas con masarimicina y optoquina en S. pneumoniae. El color azul o púrpura indica que no hay crecimiento bacteriano, mientras que el color rosa indica crecimiento bacteriano. El MIC en presencia de co-fármaco se toma como la concentración más baja que no muestra crecimiento bacteriano (color azul). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Análisis morfológico. Cambios morfológicos en B. subtilis (A,B) y S. pneumoniae (C,D) cuando se tratan con 0,75x MIC (MICB.subtilis = 3,8 μM y MICS.pneumoniae = 7,8 μM) masarimicina. Las células se fijaron y teñieron con azul de metileno al 0,1% (m/v) y se visualizaron mediante microscopía de campo brillante bajo inmersión de aceite a un aumento de 1000x. Esta cifra se ha modificado de 35. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura complementaria 1: Cromatografía representativa en capa delgada de masarimicina post desagrado acuoso. La fase móvil es 90:10 hexano: el isopropanol y el vapor de yodo se utilizan para manchar manchas. Rf = 0,3 para masarimicina. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura complementaria 2: Cromatograma flash representativo para la purificación de masarimicina. El pico en aproximadamente 1,2 volúmenes de columna contiene masarimicina. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura suplementaria 3: RMN representativa de 1H de masaromicina disuelta en CDCl3 y registrada en un espectrómetro de RMN de 400 MHz. El espectro se refiere al pico residual de disolvente CHCl3 en δ = 7.26. Los números en verde por encima de los desplazamientos químicos indican asignaciones de protones en las posiciones correspondientes en la estructura de la masaromicina (ver recuadro). Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura suplementaria 4: Espectro representativo de RMN de 13C de masarimicina disuelta en CDCl3 a 100 MHz. Espectro referenciado al pico residual de disolvente CHCl3 en δ = 77.36. Los números en verde por encima de los cambios químicos indican asignaciones de átomos de carbono en las posiciones en la estructura de la masarimicina (ver recuadro). Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura complementaria 5: Ensayo representativo de resazurin MIC de masarimicina contra B. subtilis. Haga clic aquí para descargar este archivo.

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Discussion

La masarimicina es un único inhibidor bacteriostático micromolar del crecimiento de B. subtilis35 y S. pneumoniae37 . En B. subtilis, se ha demostrado que la masarimicina inhibe la GlcNAcase LytG35, mientras que no se ha identificado la diana molecular precisa en la pared celular de S. pneumoniae 37. La síntesis de masarimicina utilizando la síntesis orgánica clásica o el procedimiento de microondas proporciona el inhibidor en buen rendimiento y alta pureza. Los bajos rendimientos de masarimicina generalmente se pueden atribuir a la oxidación del ciclohexil carboxaldehído. Para superar esto, se recomienda almacenar ciclohexil carboxaldehído bajo una atmósfera inerte en un desecador. La oxidación del aldehído al ácido carboxílico correspondiente se puede ver como un sólido blanco en la botella. Comprar pequeñas cantidades de ciclohexil carboxaldehído sin almacenarlo durante períodos prolongados reduce en gran medida este problema.

La asignación de RMN de la estructura de masarimicina se complica por la presencia de una mezcla de formas cis y trans del enlace amida, así como atropisómeros alrededor del anillo de o-yodofenilo que da como resultado múltiples picos. Esto puede resultar en un cambio químico de protones repartido en 1 ppm, lo que complica las asignaciones35. Como resultado, la asignación parcial de los cambios químicos de RMN para los espectros de RMN de 1H y 13C junto con espectros representativos se proporcionan en las Figuras Suplementarias 3-4. Si hay dificultad para asignar cambios químicos de 1H y 13C para la masarimicina debido a la mezcla de isómeros, se pueden utilizar experimentos de RMN en 2 dimensiones. La espectroscopia correlacionada (COSY) se puede utilizar para identificar sistemas de espín de protones, mientras que los experimentos de RMN de espectroscopia de coherencia cuántica única heteronuclear (HSQC) se pueden utilizar para identificar correlaciones de enlace único protón-carbono. Una vez purificada, la masarimicina puede almacenarse a -20 °C como aceite o disolverse en DMSO a una concentración de 25 mM hasta que sea necesario. Se recomienda almacenar en pequeñas alícuotas para reducir el número de ciclos de congelación-descongelación. Después de repetidos ciclos de congelación-descongelación del compuesto, la solución madre de masarimicina debe ser revisada por TLC para monitorear cualquier degradación.

Las pantallas de sinergia y antagonismo pueden ser una estrategia efectiva para identificar las interacciones de las vías y se pueden usar para comprender el modo de acción de las moléculas pequeñas. La Figura 2 muestra un ejemplo de un ensayo de sinergia/antagonismo con S. pneumonia R6 utilizando masaromicina y el inhibidor de la ATPasa optoquina (nótese que el cribado de sinergia/antagonismo en B. subtilis es todavía una investigación en curso). Para la reproducibilidad, se utilizaron células de segundo paso y se cultivaron a un OD600nm de no más de 0.4. Se observóun FIC I de 1,5 para la interacción entre masarimicina y optoquina, lo que indica una relación indiferente entre el par de antibióticos. La relación indiferente entre masarimicina y optoquina indica que no hay interacción aparente entre las vías a las que se dirigen estos antibióticos. Si bien estos ensayos pueden proporcionar información útil sobre las interacciones medicamentosas, es importante tener en cuenta que los ensayos de sinergia / antagonismo deben realizarse con réplicas biológicas y el uso de los puntos de corte más conservadores como se describe en Odds42. Esto ayuda a prevenir la sobreinterpretación de las relaciones sinérgicas o antagónicas menores observadas.

El análisis fenotípico de células de B. subtilis tratadas con masarimicina sub-MIC (Figura 3B) indica un fenotipo que difiere de los fenotipos reportados para la deleción genética de lytG32 y se asemeja más a los fenotipos de cepas de B. subtilis con múltiples deleciones de autolisina29. Esta discrepancia en el fenotipo es intrigante porque mientras que la inhibición in vitro de LytG se ha desmontado35, un mutante ΔlytG no tiene fenotipo32 observable. Esta discrepancia puede explicarse en parte por las diferencias en la inactivación genética y química46,47. Las diferencias observadas en la inactivación química o genética de LytG es una pregunta intrigante que actualmente está bajo investigación. Las células de S. pneumoniae tratadas con masarimicina presentaron un fenotipo (Figura 3D) distinto de la deleción genética de la correspondiente GlcNAcase (GH73, grupo 2) LytB 37,43,44,48. Esta discrepancia morfológica pone de relieve los desafíos en la asignación del modo de acción o la atribución del objetivo biológico de los inhibidores de moléculas pequeñas. Los fenotipos morfológicos pueden surgir de un conjunto más complejo de interacciones que no sean una sola deleción genética o la inactivación química de una enzima que actúa en la pared celular. Estos metafenotipos34 pueden surgir de interacciones complejas a través de mecanismos directos (falta de una enzima) o indirectos (pérdida de reguladores).

Hasta donde sabemos, la masarimicina es el primer inhibidor de una autolisina bacteriana que demuestra la inhibición del crecimiento bacteriano (Figura suplementaria 5). Es un inhibidor bacteriostático de espectro estrecho del crecimiento en B. subtilis y S.pneumoniae. Este espectro estrecho es una limitación para los estudios comparativos de múltiples especies del metabolismo de la pared celular entre organismos Gram-positivos y Gram-negativos. Este estrecho espectro se debe en parte a las diferencias en algunas de las autolisinas glicosilhidrolasa utilizadas durante el crecimiento vegetativo entre los organismos Gram-positivos (GlcNAcase) y Gram-negativos (transglicosilasa lítica). El uso de inhibidores de moléculas pequeñas como la masarimicina para inhibir las autolisinas PG, en particular, GlcNAcases puede proporcionar un enfoque ortogonal a la genética tradicional para dilucidar la función de la autolisina. La masarimicina tiene una clara ventaja sobre algunos métodos de biología química, ya que se puede utilizar en más de una especie (B. subtilis y S. pneumoniae). Puede permitir estudios comparativos del metabolismo de la pared celular entre varillas en forma de bastón (B. subtilis) y especies de cocoides (S. pneumoniae). El metabolismo y la división de la pared celular menos corregulados en S. pneumoniae proporcionan un contrapunto en el sistema más estrictamente regulado de las especies en forma de bastón49,50. Las aplicaciones futuras de esta técnica serán identificar la diana molecular en S.pneumoniae y explorar las diferencias entre la inactivación genética y química de las autolisinas en S.pneumoniae y B. subtilis.

Pasos críticos en el protocolo
Es importante prestar atención a la concentración efectiva de masarimicina en ensayos biológicos y bioquímicos. Debido a su naturaleza hidrofóbica, las concentraciones superiores a 250 μM (65x MIC en B. subtilis) pueden dar lugar a problemas de solubilidad y agregación que pueden afectar la interpretación de los datos biológicos. Controlar adecuadamente el efecto del vehículo (es decir, DMSO) en todos los experimentos es esencial.

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Disclosures

Reid, C. W. tiene propiedad intelectual que involucra aplicaciones específicas de masarimicina.

Acknowledgments

La investigación fue apoyada por la Fundación Nacional de Ciencias bajo la subvención número 2009522. El análisis de RMN de masaromicina fue apoyado por el premio del programa de instrumentación de investigación principal de la Fundación Nacional de Ciencias bajo el número de subvención 1919644. Cualquier opinión, hallazgo y conclusión, o recomendación expresada en este material son las de los autores y no reflejan necesariamente los puntos de vista de la National Science Foundation.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Iodobenzoic acid SIGMA-ALDRICH I7675-25G corrosive, irritant, light yellow to orange-brown powder
2-Propanol SIGMA-ALDRICH 109827-4L flammable, irritant, colorless liquid
Acetonitrile SIGMA-ALDRICH 34851-4L flammable, irritant, colorless liquid
Aluminum backed silica plates Sorbtech 4434126 silica gel XG F254 on aluminum backed plates
chloroform-d SIGMA-ALDRICH 151823-50G solvent for NMR
Compact Mass Spectrometer Advion-Interchim Advion CMS compact mass spectrometer equiped with APCI source and atmospheric solids analysis probe
Corning Costar 96 well flat bottom plates-sterile fisher chemical 07-200-90 for synergy/antagonism assays
cover slips fisher chemical 12-547 for microscopy
Cyclohexanecarboxaldehyde CHEM-IMPEX INT'L INC. 24451 flammable, irritant, colorless to pink liquid
Cyclohexyl isocyanide SIGMA-ALDRICH 133302-5G irritant, colorless liquid, extremly unpleasant odor
Cyclohexylamine SIGMA-ALDRICH 240648-100ML corrosive, flammable, irritant, colorless liquid unless contaminated
Ethyl acetate SIGMA-ALDRICH 537446-4L flammable, irritant, colorless liquid
flash silica cartridge (12g) Advion-Interchim PF-50SIHP-F0012 pack of flash silica columns (12g) for purification of masarimycin
formaldehyde SIGMA-ALDRICH F8775-25ML fixing agent for microscopy
HEPES SIGMA-ALDRICH H8651-25G buffer for microscopy fixing solution
Hexane, mixture of isomers SIGMA-ALDRICH 178918-4L environmentally damaging, flammable, irritant, health hazard, colorless liquid
High performance compact mass spectrometer Advion expression Atmospheric Solids Analysis Probe (ASAP), low resolution
High Vac eppendorf Vacufuge plus vacuum aided by centrifugal force and temperature
Hydrochloric acid SIGMA-ALDRICH 258148-2.5L corrosive, irritant, colorless liquid
hydrochloric acid SIGMA-ALDRICH 320331-2.5L strong acid
immersion oil fisher chemical 12-365-19 for microscopy
Iodine, resublimed crystals Alfa Aesar 41955 environmentally damaging, irritant, health hazard, dark grey/purple crystals
Mestre Mnova MestreLab Research software for processing NMR spectra
Methanol SIGMA-ALDRICH 439193-4L flammable, toxic, health hazard, colorless liquid
methylene blue SIGMA-ALDRICH M9140-25G microscopy stain for staining cell walls
meuller-hinton agar plates + 5% sheep blood fisher chemical B21176X growth media for Streptococcus pneumoniae
meuller-hinton broth fisher chemical DF0757-17-6 growth media for Streptococcus pneumoniae
microscope slides fisher chemical 22-310397 for microscopy
Microwave Synthesis Labstation MILESTONE START SYNTH device that requires the ventilation of a fume hood, equipped with synthesis carousel
NMR tubes SIGMA-ALDRICH Z562769-5EA 5mm NMR tubes 600 MHz
Nuclear Magnetic Resonance (NMR) Bruker Ascend 400 large superconducting magnet (400MHz)
optochin fisher chemical AAB21627MC ethylhydrocupreine hydrochloride
petrie plates Celltreat 229695 for preparing agar plates for bacterial growth
Primo Star Bright field/Phase contrast Microscope with ERc5s camera Zeiss for morphology studies
puriFlash interchim XS520plus flash chromatography purification system
resazurin SIGMA-ALDRICH R7017-1G for synergy/antagonism assays
Rotary Evaporator Heidolph Hei-VAP Value "The Collegiate" solvent evaporator
Sodium bicarbonate SIGMA-ALDRICH S6014-500G irritant, white powder
Sodium chloride fisher chemical S271-1 crystalline, colorless
Sodium chloride SIGMA-ALDRICH S5886-500G for growth of B.subtilis and preparation of LB media
Sodium sulfate SIGMA-ALDRICH 7985592-500G anhydrous, granular, white
tryptone fisher chemical BP1421-500 for growth of B.subtilis and preparation of LB media
Whitney DG250 Workstation Microbiology International DG250 anaerobic workstation. Anaerobic gas mixture used: 5% hydrogen, 10% carbon dioxide, balance nitrogen
yeast extract fisher chemical BP1422-500 for growth of B.subtilis and preparation of LB media
Zen Lite (blue) software Zeiss for acquiring micrographs

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Bioquímica Número 179 Peptidoglicano metabolismo autolisina biología química inhibidor pared celular
Síntesis de masarimicina, un inhibidor de molécula pequeña del crecimiento bacteriano grampositivo
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Gallati, M., Point, B., Reid, C. W.… More

Gallati, M., Point, B., Reid, C. W. Synthesis of Masarimycin, a Small Molecule Inhibitor of Gram-Positive Bacterial Growth. J. Vis. Exp. (179), e63191, doi:10.3791/63191 (2022).

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