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Biochemistry

Synthese von Masarimycin, einem niedermolekularen Inhibitor des grampositiven Bakterienwachstums

Published: January 7, 2022 doi: 10.3791/63191
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Department of Science and Technology, Bryant University, 2Center for Health and Behavioral Sciences, Bryant University

Summary

Es wird ein detailliertes Protokoll zur Herstellung des bakteriostatischen Diamid Masarimycin vorgestellt, einer niedermolekularen Sonde, die das Wachstum von Bacillus subtilis und Streptococcus pneumoniae hemmt, indem sie auf den Abbau der Zellwand abzielt. Seine Anwendung als chemische Sonde wird in Synergie-/Antagonismus-Assays und morphologischen Studien mit B. subtilis und S. pneumoniae nachgewiesen.

Abstract

Peptidoglycan (PG) in der Zellwand von Bakterien ist eine einzigartige makromolekulare Struktur, die Form und Schutz vor der Umgebung verleiht. Zentral für das Verständnis des Zellwachstums und der Zellteilung ist das Wissen, wie der PG-Abbau die Biosynthese und den Zellwandaufbau beeinflusst. Kürzlich wurde über die metabolische Markierung von PG durch die Einführung von modifizierten Zuckern oder Aminosäuren berichtet. Während eine chemische Abfrage von Biosyntheseschritten mit niedermolekularen Inhibitoren möglich ist, sind chemisch-biologische Werkzeuge zur Untersuchung des PG-Abbaus durch Autolysine unterentwickelt. Bakterielle Autolysine sind eine breite Klasse von Enzymen, die am eng koordinierten Abbau von PG beteiligt sind. Hier wird ein detailliertes Protokoll zur Herstellung einer niedermolekularen Sonde, Masarimycin, einem Inhibitor von N-Acetylglucosaminidase LytG in Bacillus subtilis, und des Zellwandstoffwechsels in Streptococcus pneumoniae vorgestellt. Die Herstellung des Inhibitors über mikrowellengestützte und klassische organische Synthese ist vorgesehen. Seine Anwendbarkeit als Werkzeug zur Untersuchung der grampositiven Physiologie in biologischen Assays wird vorgestellt.

Introduction

Peptidoglycan (PG) ist ein netzartiges Polymer, das die Zellform und -struktur sowohl in grampositiven als auch in gramnegativen Bakterien 1,2 beschreibt. Dieses Heteropolymer ist eine Matrix von Aminozuckern, vernetzt durch kurze Peptide 3,4,5,6 mit einem Rückgrat, das aus β-(1,4)-verknüpften alternierenden N-Acetylglucosamin- (GlcNAc) und N-Acetylmuraminsäure (MurNAc)-Resten besteht (Abbildung 1)1. An den C-3-Lactylanteil von MurNAc ist das Stammpeptid gebunden. Der Metabolismus von PG beinhaltet ein eng koordiniertes System von biosynthetischen und abbaubaren Enzymen, um neues Material in die Zellwand einzubauen 7,8. Der Abbau von PG erfolgt durch Enzyme, die zusammen als Autolysine9 bezeichnet und basierend auf der Spezifität der gespaltenen Bindung weiter klassifiziert werden. Autolysine nehmen an vielen zellulären Prozessen teil, einschließlich Zellwachstum, Zellteilung, Motilität, PG-Reifung, Chemotaxis, Proteinsekretion, genetischer Kompetenz, Differenzierung und Pathogenität10,11. Die Entschlüsselung der spezifischen biologischen Funktionen einzelner Autolysine kann entmutigend sein, was zum Teil auf funktionelle Redundanz zurückzuführen ist. Jüngste biophysikalische 8,12,13 und Computerstudien 12 haben jedoch neue Einblicke in ihre Rolle im PG-Stoffwechsel geliefert. Darüber hinaus haben jüngste Berichte weitere Einblicke in die Synthese14 und membranvermittelten 15,16,17 Schritte im PG-Metabolismus gegeben. Ein gründliches Verständnis der Beziehung zwischen abbauenden und synthetischen Signalwegen des PG-Stoffwechsels könnte zu bisher unerschlossenen Antibiotikazielen führen.

Während es signifikante Fortschritte in der Methodik zur Untersuchung der Glykobiologie bei Eukaryoten gegeben hat, ist die bakterielle Glykobiologie und insbesondere der PG-Stoffwechsel nicht mit einer ähnlichen Geschwindigkeit fortgeschritten. Aktuelle chemische Ansätze zur Untersuchung des PG-Stoffwechsels umfassen fluoreszenzmarkierte Antibiotika18, fluoreszierende Sonden 19,20 und metabolische Markierung 21,22,23,24. Diese neuen Ansätze bieten neue Möglichkeiten, den bakteriellen Zellwandstoffwechsel zu hinterfragen. Während einige dieser Strategien in der Lage sind, PG in vivo zu markieren, können sie artspezifisch19 sein oder nur in Stämmen funktionieren, denen ein bestimmtes Autolysin25 fehlt. Viele PG-Markierungsstrategien sind für die Verwendung mit isoliertenZellwänden 26 oder mit in vitro rekonstituierten PG-Biosynthesewegen20,27,28 vorgesehen. Der Einsatz fluoreszierend markierter Antibiotika beschränkt sich derzeit auf biosynthetische Schritte und Transpeptidation18.

Das aktuelle Wissen über bakterielle Autolysine und ihre Rolle im Zellwandstoffwechsel stammt aus genetischen und in vitro biochemischen Analysen 11,29,30,31,32. Während diese Ansätze eine Fülle von Informationen über diese wichtige Klasse von Enzymen geliefert haben, kann die Entschlüsselung ihrer biologischen Rolle eine Herausforderung sein. Zum Beispiel führt die Deletion eines Autolysins aufgrund der funktionellen Redundanz33 in den meisten Fällen nicht dazu, dass das Bakterienwachstum gestoppt wird. Dies ist trotz ihrer impliziten Rolle beim Zellwachstum und der Zellteilung 7,12. Eine weitere Komplikation ist, dass die genetische Deletion von bakteriellen Autolysinen zu Meta-Phänotypen34 führen kann. Meta-Phänotypen entstehen aus dem komplexen Zusammenspiel zwischen dem von der genetischen Deletion betroffenen Signalweg und anderen miteinander verbundenen Wegen. Zum Beispiel kann ein Meta-Phänotyp über einen direkten Effekt wie das Fehlen eines Enzyms oder einen indirekten Effekt wie eine Störung der Regulatoren entstehen.

Derzeit gibt es nur wenige Inhibitoren von Glykosidasenautolysinen wie N-Acetylglucosaminidasen (GlcNAcase) und N-Acetylmuramidasen, die als chemische Sonden verwendet werden können, um den Abbau von PG zu untersuchen. Um dies zu beheben, wurde das Diamid-Masarimycin (früher als fgkc bezeichnet)identifiziert und 35 als bakteriostatischer Inhibitor des Bacillus subtilis-Wachstums charakterisiert, der auf das GlcNAcase LytG32 abzielt (Abbildung 1). LytG ist ein exo-wirkendes GlcNAcase36, ein Mitglied von Cluster 2 innerhalb der Glykosylhydrolasefamilie 73 (GH73). Es ist das wichtigste aktive GlcNAcase während des vegetativen Wachstums32. Unseres Wissens ist Masarimycin der erste Inhibitor eines PG-wirkenden GlcNAcase, der das Zellwachstum hemmt. Zusätzliche Studien von Masarimycin mit Streptococcus pneumoniae ergaben, dass Masarimycin wahrscheinlich den Zellwandstoffwechsel in diesem Organismushemmt 37. Hier wird die Herstellung von Masarimycin zur Verwendung als chemisch-biologische Sonde zur Untersuchung der Physiologie in den grampositiven Organismen B. subtilis und S. pneumoniae berichtet. Es werden Beispiele für die morphologische Analyse der Behandlung der inhibitorischen Konzentration unter dem Minimum mit Masarimycin sowie ein Synergie-/Antagonismus-Assay vorgestellt. Synergie- und Antagonismus-Assays mit Antibiotika mit klar definierten Wirkungsweisen können ein nützlicher Weg sein, um Verbindungen zwischen zellulären Prozessen zu erforschen38,39,40.

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Protocol

1. Allgemeine Methoden

HINWEIS: Alle Compounds wurden von Standardlieferanten bezogen und ohne weitere Reinigung verwendet.

  1. Führen Sie eine Dünnschichtchromatographie (TLC) auf einer mit Kieselgel XG F254 vorbeschichteten Aluminiumplatte durch. Erkennen Sie Flecken unter einer UV-Lampe, durch Eintauchen in p-Anisaldehydflecken oder durch Aussetzen von I2-Dampf.
  2. Zeichnen Sie alle Kernspinresonanzspektren (NMR) auf einem 400-MHz-Spektrometer auf.
    ANMERKUNG: 1 H-NMR- und 13C-NMR-Spektren wurden auf Restlösungsmittelspitzen bezogen. Kopplungskonstanten sind in [Hz] und chemische Verschiebungen in [ppm] angegeben.
  3. Record atmospheric pressure chemical ionization (APCI) Massenspektrometriespektren von Masarimycin auf einem kompakten Massenspektrometer, das mit einer atmosphärischen Feststoffanalysesonde ausgestattet ist.

2. Allgemeines Verfahren zur Herstellung von Masarimycin

HINWEIS: Führen Sie die folgenden Schritte in einem Abzug aus.

  1. Es wird eine 0,1 M Lösung in Methanol jedes Reaktanten hergestellt: Cyclohexylamin, Cyclohexylcarboxaldehyd, O-Iodbenzoesäure und Cyclohexylisocyanid35.
    ACHTUNG: Cyclohexylamin, Cyclohexylisocyanid und Cyclohexylcarboxaldehyd sind brennbar. Sie können Hautkorrosion verursachen und orale, dermale, respiratorische oder reproduktive Toxizität induzieren. Halten Sie Verbindungen von offenen Flammen, heißen Oberflächen und Zündquellen fern. Tragen Sie einen geeigneten Haut- und Augenschutz, arbeiten Sie in einem gut belüfteten Bereich und vermeiden Sie das Einatmen von Dämpfen oder Nebel. Halten Sie die Flaschen zur Lagerung fest verschlossen und lagern Sie sie an einem kühlen, trockenen Ort. Lagern Sie Cyclohexylcarboxaldehyd in einem Exsikkator unter einerN2-Atmosphäre .
  2. Mischen Sie 5 ml Cyclohexylamin (0,1 M Lösung in Methanol) und 5 ml Cyclohexylcarboxaldehyd (0,1 M in Methanol) in einem verschlossenen runden Bodenkolben und rühren Sie die Lösung mit einem magnetischen Rührstab auf einer Rühr-/Kochplatte für 30 min bei 40 °C in einem Sandbad. Überwachen Sie die Temperatur mit einem Thermometer, das etwa 1 cm unter der Sandoberfläche platziert ist.
  3. Nach 30 min werden 5 ml Cyclohexylisocyanid (0,1 m Lösung in Methanol) in die Lösung aus Schritt 2.2 gegeben und weitere 20 min bei 50 °C umgerührt. Zum Schluss werden 5 ml o-Jodbenzoesäure (0,1 m Lösung in Methanol) in das Reaktionsgemisch gegeben und bei 55 °C für 3-5 h weiter gerührt.
  4. Überwachen Sie den Fortschritt der Reaktion regelmäßig durch TLC etwa jede Stunde, nachdem das obige Reaktionsgemisch 3 h lang gerührt wurde.
  5. Schneiden Sie einen 3 cm x 6 cm großen Streifen aus TLC-Platte mit Aluminiumrücken. Zeichne mit einem Bleistift #2 eine Linie etwa 1 cm von unten. Platzieren Sie mit einer Glasmikrokapillare etwa 5 μL der Reaktionsmischung auf der TLC-Platte und lassen Sie sie trocknen.
  6. Zu einem 150-ml-Becherglas fügen Sie genügend mobile Phase (90: 10-Hexan: Isopropanol) hinzu, um den Boden des Becherglases zu bedecken. Legen Sie die obige TLC-Platte vorsichtig mit einer Pinzette in das Becherglas, um sicherzustellen, dass die TLC-Platte gleichmäßig in die mobile Phase eintritt. Decken Sie die Oberseite des Becherglases mit einem Stück Alufolie ab.
    HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die mobile Phase die Linie und die gefleckte Probe nicht bedeckt.
  7. Lassen Sie die mobile Phase die TLC-Platte hinauffahren, bis sie etwa 1 cm unter der Oberseite der Platte liegt. Entfernen Sie die TLC-Platte und zeichnen Sie mit einem Bleistift eine Linie, die die von der mobilen Phase zurückgelegte Strecke angibt. Lassen Sie die TLC-Platte in einem Abzug trocknen.
  8. Nach dem Trocknen legen Sie die TLC-Platte in ein Becherglas, das eine kleine Menge festes I2 enthält, und bedecken Sie das Becherglas mit einem Stück Zinnfolie. Überwachen Sie die TLC auf die Entwicklung von gelben/braunen Flecken. Entfernen Sie nach der Entwicklung die TLC-Platte und markieren Sie die Position der Spots mit einem Bleistift (Ergänzende Abbildung 1).
    HINWEIS: Wenn I2 Flecken nicht markiert sind, löst sich der Fleck im Laufe der Zeit auf. Flecken können auch auf der TLC-Platte durch UV-Licht, p-Anisaldehyd-Färbung oder Kaliumpermanganatfärbung sichtbar gemacht werden (siehe Ergänzende Informationen).
  9. Berechnen Sie dieRf-Werte für alle visualisierten Spots mit der folgenden Formel:
    Rf = Equation 1
  10. Betrachten Sie die Reaktion als abgeschlossen, wenn nur eine Stelle mit Rf = 0,3 auf der TLC-Platte sichtbar ist. Entfernen Sie das Lösungsmittel in einem rotatorischen Verdampfer unter reduziertem Druck und trocknen Sie das Rohprodukt (erhalten als gelblich-braunes Öl) unter einem Hochvakuum, bis das gesamte Methanol verdampft ist.
  11. Lösen Sie das getrocknete Rohprodukt in 30 ml Ethylacetat auf und geben Sie es in einen separaten Trichter. Ethylacetat nacheinander mit 1 M HCl (2 x 30 ml), H2O (30 mL), gesättigterNaHCO3-Lösung (2 x 30 ml),H2O(30 ml) und gesättigter NaCl-Lösung (2 x 30 ml) extrahieren. Verwerfen Sie die wässrigen Schichten.
    HINWEIS: Die Ethylacetatschicht ist die oberste Schicht in jeder der Extraktionen. Schütteln Sie bei jeder Extraktion den Separationstrichter, der das Ethylacetat und die wässrige Lösung (HCl, H2O,NaHCO3 oder NaCl) enthält, kräftig und lassen Sie die Schichten vollständig abscheiden.
  12. Entfernen Sie die Ethylacetatschicht aus dem Separatorientrichter und sammeln Sie sie in einem Erlenmeyerkolben. Fügen Sie einen Spatel voll Na2SO 4 (wasserfrei) hinzu, um Restwasser aus Ethylacetat zu entfernen.
    HINWEIS: Die Ethylacetatlösung gilt als trocken, wennNa2SO4 im Kolben frei läuft und nicht verklumpt. WennNa2 SO4 verklumpt, kann ein zusätzlicher Spatel Na2SO4 hinzugefügt werden.
  13. Filtern Sie die getrocknete Ethylacetatlösung durch #1 Filterpapier, umNa2 SO4 zu entfernen. Waschen Sie das Filterpapier mit einer kleinen Menge Ethylacetat. Geben Sie die gefilterte Ethylacetatlösung in einen runden Bodenkolben und entfernen Sie das Lösungsmittel auf einem rotatorischen Verdampfer unter reduziertem Druck, um Masarimycin als Öl zu erhalten, sobald das gesamte Ethylacetat entfernt wurde.
  14. Das oben erhaltene Masarimycinöl wird in einer minimalen Menge (1-2 ml) von 9:1 Hexan: Isopropanol gelöst und auf einer magnetischen Rührplatte umgerührt, bis die gesamte Verbindung gelöst ist.
  15. Reinigen Sie das gelöste Masarimycin durch Flash-Chromatographie mit einer 12 g Normalphasen-Silica-Flash-Säule.
    1. Gleichen Sie die Blitzsäule mit 10 Säulenvolumina der mobilen Phase (99:1 Hexan: Isopropanol) aus, wobei das Gerät auf eine Durchflussrate von 15 ml/min eingestellt ist.
      HINWEIS: Nachdem das Gleichgewicht abgeschlossen ist, stoppen Sie den Fluss und trennen Sie die Oberseite der Säule vom System.
    2. Ziehen Sie gelöstes Masarimycin mit einer 5-ml-Spritze auf. Verbinden Sie die Spritze direkt mit der Oberseite der Gleichgewichtsblitzsäule und injizieren Sie die Lösung in die Säule. Schließen Sie die belastete Säule wieder an das Blitzchromatographiesystem an und initiieren Sie die Gradientenelution.
    3. Eludes Masarimycin aus der Säule mittels Gradientenelution zu einer Endkonzentration der mobilen Phase von 10:90 Hexan: Isopropanol über 12 Säulenvolumen. Überwachen Sie die Elution von Masarimycin durch Absorption bei 230 und 254 nm.
    4. Sammeln Sie die aus der Säule eluierten Verbindungen durch einen Fraktionssammler, der 20 ml Lösungsmittel pro Fraktion sammelt.
      HINWEIS: Wenn kein Flash-Chromatographie-System verfügbar ist, kann die Reinigung von Masarimycin über eine Schwerkraftkieselsäuresäule mit einer mobilen 3:1 (Hexan: Ethylacetat) Phase durchgeführt werden. Fraktionen, die Masarimycin enthalten, können durch TLC unter Verwendung derselben mobilen Phase identifiziert werden. Die Visualisierung von TLC-Spots erfolgte entweder mit UV-Licht,I-2-Dampf oder Kaliumpermanganat-Färbung.
    5. Identifizierung von Masarimycin-haltigen Fraktionen durch TLC (Schritte 2.5-2.9) oder Massenspektrometrie auf einem kompakten Massenspektrometer, das mit einer atmosphärischen Feststoffanalysesonde ausgestattet ist. Trocknen Sie das Endprodukt unter Vakuum (~0,3 mbar).
      HINWEIS: Masarimycin wird routinemäßig als farbloses Öl oder Feststoff mit einer Ausbeute von 55% -70% in Bezug auf mmol von Cyclohexylcarboxaldehyd, das der Reaktion zugesetzt wird, erhalten. Berechnen Sie die Endausbeute von Masarimycin, indem Sie die Masse des gereinigten Masarimycins erhalten und die theoretische Ausbeute der Reaktion mit der folgenden Formel berechnen:
      % Ausbeute = Equation 2 x 100%
  16. Bestätigen Sie die Struktur von Masarimycin durch NMR.
    1. Lösen Sie ~ 10 mg Masarimycin-Probe in 0,5 mlCDCl 3 auf. Übertragen Sie die Lösung mit einer Pasteur-Pipette auf ein 5-mm-NMR-Rohr und verschließen Sie das Rohr. Legen Sie die NMR-Röhre in das Spektrometer.
    2. Erfassen Sie 1-H- und 13-C-NMR-Spektrenmit voreingestellten Experimenten des Herstellers. Chemische Schichtzuordnungen und repräsentative Spektren sind in den Ergänzungsabbildungen 3-4 enthalten.
  17. Masarimycin trocken oder in DMSO gelöst (25 mM Endkonzentration) bei -20 °C bis zur Anwendung lagern.

3. Mikrowellenverfahren zur Herstellung von Masarimycin

  1. Es werden 0,6 Mio. Lösungen von Cyclohexylamin, Cyclohexylcarboxaldehyd, Cyclohexylisocyanid und o-Iodbenzoesäure in Acetonitril hergestellt.
  2. Fügen Sie einen Rührstab und 10 ml Acetonitril zu einer Mikrowellenreaktionsdurchstechflasche aus Glas hinzu.
  3. 2 ml Cyclohexylamin (0,6 M in Acetonitril), 2 ml Cyclohexylcarboxaldehyd (0,6 M in Acetonitril) und 7 ml Acetonitril in die Durchstechflasche geben.
  4. Legen Sie die Mikrowellen-Reaktionsdurchstechflasche in das Mikrowellenkarussell. Rühren Sie die Mischung um, erhitzen Sie sie für 30 min bei 50 ° C bei einer Leistungseinstellung von 400 W und lassen Sie sie auf Raumtemperatur abkühlen.
  5. 2 ml o-Jodbenzoesäure (0,6 M in Methanol) und 2 ml Cyclohexylisocyanid (0,6 M in Acetonitril) in die Durchstechflasche geben. Rühren Sie die Mischung um, erhitzen Sie sie in der Mikrowelle für 40 min bei einer Leistungseinstellung von 400 W auf 100 °C und lassen Sie sie auf Raumtemperatur abkühlen.
  6. Überwachen Sie den Fortschritt der Reaktion mit TLC (90:10 Hexan: Isopropanol) unter Verwendung vonI2-Dampf nach Abschluss von Schritt 3.5.
    HINWEIS: Wenn TLC zeigt, dass die Reaktion unvollständig ist (d. h. mehrere Flecken auf TLC), legen Sie die Reaktionsflasche wieder in die Mikrowelle und stellen Sie die in Schritt 3.5 beschriebenen Mikrowellenbedingungen ein.
  7. Sobald die Reaktion abgeschlossen ist, gießen Sie die Lösung in einen 100 ml Rundbodenkolben und verdampfen Sie sie mit einem Rotationsverdampfer zum Trocknen.
  8. Befolgen Sie die Schritte 2.6-2.16 oben, um die wässrige Aufarbeitung, Reinigung und Charakterisierung von Masarimycin abzuschließen.

4. Synergie- und Antagonismus-Assay

  1. Züchten Sie Streptococcus pneumoniae R6 auf Mueller-Hinton (MH) Agarplatten mit 5% (v/v) Schafblut bei 37 °C unter anaeroben Bedingungen. Verwenden Sie in allen Experimenten Zellen der zweiten Passage, die in 5 ml MH-Brühe bei 37 ° C unter anaeroben Bedingungen gezüchtet wurden, bis OD600 ~ 0,4 beträgt.
  2. Setzen Sie die Inhibitoren Masarimycin und Optochin seriellen 1:2-Verdünnungen in entsprechenden Lösungsmitteln aus, wobei die resultierenden Konzentrationen die minimalen Inhibitorkonzentrationswerte (MIC) jedes Inhibitors flankieren.
    1. Machen Sie die anfängliche Verdünnung von Masarimycin in Dimethylsulfoxid (DMSO), bis eine Konzentration von 100 μM erreicht ist. Machen Sie ab diesem Punkt Masarimycin-Verdünnungen in MH-Brühe. Bereiten Sie die Optochin-Stammlösung (3,5 mM) vor, indem Sie handelsübliches Optochin (siehe Materialverzeichnis) in steriler MH-Brühe auflösen.
      HINWEIS: Masarimycin-Stammlösungen wurden bei 25 mM in DMSO hergestellt.
  3. Zu einer sterilen 96-Well-Mikrotiterplatte fügen Sie 2 μL Aliquots jeder Optochinverdünnung zu jeder Reihe der Platte hinzu. Zu derselben Platte fügen Sie 2 μL Aliquots jeder Masarimycin-Verdünnung zu jeder Spalte hinzu, um eine Reihe von Optochin- und Masarimycin-Konzentrationen auf der Platte zu erzeugen (Abbildung 2).
  4. Fügen Sie sterile MH-Brühe (93 μL) zu jeder Vertiefung hinzu, die die oben genannten Inhibitoren enthält. Die Mikrotiterplatten werden mit 5 μL Kultur (OD600 ~0,4) aus Schritt 4.1 beimpft.
    HINWEIS: Die Impfung der 96-Well-Platte erfolgt typischerweise unter anaeroben Bedingungen an einem anaeroben Arbeitsplatz. Das endgültige Volumen im Bohrloch beträgt 100 μL.
  5. Züchten Sie Kulturen für 18 h bei 37 °C unter anaeroben Bedingungen, gefolgt von der Zugabe von 30 μL 0,01% (m/v) Lösung von Resazurin-Natriumsalz. Inkubieren Sie die Platte bei Raumtemperatur für 15 Minuten, um die Bildung und Stabilisierung der Farbe zu ermöglichen.
    HINWEIS: Resazurinlösung wird durch Auflösen der Verbindung in destilliertem Wasser hergestellt und kann bei 4 °C bis zu zwei Wochen gelagert werden.
  6. Lesen Sie die Konzentrationswerte direkt von der Platte ab und weisen Sie die niedrigste Inhibitorkonzentration, für die kein Bakterienwachstum beobachtet wird (blaue Farbe), als [X] zu (siehe Schritt 4.7.1), d.h. die niedrigste inhibitorische Konzentration des Arzneimittels in Gegenwart des Co-Arzneimittels.
    HINWEIS: Positives Bakterienwachstum wird in den Vertiefungen durch den rosa werdenden Resazurinfarbstoff identifiziert. MIC-Werte für jedes Arzneimittel allein (d. h. in Abwesenheit eines Co-Arzneimittels) werden auf ähnliche Weise unter Verwendung des Resazurin-MIC-Assays35 mit jedem Arzneimittel separat bestimmt (Ergänzende Abbildung 5). MICs in S. pneumoniae betragen 7,8 μM bzw. 15,85 μM für Masarimycin bzw. Optochin.
  7. Bestimmen Sie die fraktionierte inhibitorische Konzentration (FIC) und den FIC-Index (FICI) mithilfe der folgenden Gleichungen.
    1. FIC= [X]/MIC x, wobei [X] (aus Schritt 4.6) die niedrigste inhibitorische Konzentration des Arzneimittels in Gegenwart des Co-Arzneimittels und MICx die niedrigste hemmende Konzentration des Arzneimittels in Abwesenheit des Co-Arzneimittels ist.
    2. FICI = FICMasarimycin + FICAntibiotikum
      ANMERKUNG: FIC I < 0,5 = synergistisch, 0,5 <FIC I < 1 = additiv, 1 < FIC I < 4 = gleichgültig,FIC I > 4 = antagonistisch.

5. Morphologische Untersuchung

  1. Züchten Sie Bacillus subtilis 11774 auf Luria-Bertani (LB) Agarplatten (10 g/L Trypton, 5 g/L Hefeextrakt und 5 g/L NaCl) mit 1,5% Bacto-Agar bei 37 °C. Verwenden Sie in allen Experimenten Zellen der zweiten Passage, die in 5 ml LB-Brühe bei 37 ° C bis OD600 = 1 gezüchtet wurden. Züchten Sie S.pneumoniae auf die gleiche Weise wie in Schritt 4.1.
  2. Nach Erhalt einer Zellkulturdichte mit OD 600nm = 1 für B. subtilis oder OD600nm = 0,4 für S. pneumoniae wird Masarimycin mit einer Pipette zu dem als "behandelt" bezeichneten Kulturröhrchen bis zu einer Endkonzentration von 3,8 μM (0,75x MIC für B.subtilis) oder 5,85 μM (0,75x MIC für S.pneumoniae) zugegeben. Fügen Sie dem zweiten Kulturröhrchen mit der Bezeichnung "Steuerung" ein äquivalentes Volumen von DMSO hinzu.
  3. Für B.subtilis legen Sie die Proben 90 min lang in einen Inkubator bei 37 °C mit Schütteln bei 150 U/min. Bei S. pneumoniae die Zellen unter anaeroben Bedingungen ohne Schütteln inkubieren.
  4. Nach 90 min die Kulturen in einem 1:10-Gemisch (v/v) aus Kulturmedien und Fixierpuffer (20 mM HEPES, 1% Formaldehyd (pH 6,8)) bei 4 °C über Nacht chemisch fixieren. Nachdem die Fixierung abgeschlossen ist, tragen Sie 10-20 μL Proben mit einer Pipette auf Glasmikroskopobjektträger auf und lassen Sie sie an der Luft trocknen. Fixieren Sie die luftgetrockneten Proben, indem Sie die Glasobjektträger mit einem Bunsenbrenner erhitzen.
  5. Nach der Hitzefixierung die Proben unter Zugabe von 100 μL 0,1% (m/v) Methylenblau (Lösung in 20% (v/v) Ethanol) färben. Die gebeizten Objektträger für 10 min inkubieren und den überschüssigen Farbstoff mit dH2O wegwaschen. Dann erhitzen Sie die gefärbten Objektträger vorsichtig auf 60 ° C in einem Ofen für 15-20 Minuten, um die Zellen auf eine gemeinsame Fokusebene zu bringen.
  6. Verschließen Sie die gefärbten Proben, indem Sie ein Mikroskop-Deckglas über die gefärbten Zellen legen. Versiegeln Sie dann die Kanten mit Objektträgerzement. Legen Sie den versiegelten Objektträger auf den Mikroskoptisch und bringen Sie das Bild mit 100-facher Vergrößerung mittels Hellfeldmikroskopie in den Fokus.
  7. Legen Sie einen Tropfen Tauchöl auf den Objektträger und bringen Sie das Sichtfeld mit 1000-facher Vergrößerung in den Fokus. Erfassen Sie Mikroaufnahmen mit einer Kamera, die an das Mikroskop und die zugehörige Software angeschlossen ist. Erfassen Sie Bilder mit den Einstellungen für den automatischen Weißabgleich und die Blende in der Software.
    HINWEIS: Alternativ können Bilder mit der Open-Source-Software ImageJ verarbeitet werden.

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Representative Results

Masarimycin ist ein niedermolekularer bakteriostatischer Inhibitor von B. subtilis und S. pneumoniae und hemmt nachweislich das exo-wirkende GlcNAcase LytG in B. subtilis 35,37 und zielt in S. pneumoniae 37 auf die Zellwand ab. Masarimycin kann entweder durch die klassische oder mikrowellengestützte organische Synthese mit Ausbeuten im Bereich von 55% -70% effizient hergestellt werden. Die mikrowellengestützte Synthese hat den Vorteil, dass die Zeit für die Synthese der Verbindung erheblich verkürzt wird. Die mikrowellengestützte Synthese verkürzt die Synthese von 5-6 h (traditionelle Synthese) auf 2-3 h unter Beibehaltung vergleichbarer Ausbeuten. Die Flash-Chromatographie liefert eine schnelle Reinigung von Masarimycin in hoher Reinheit (Ergänzende Abbildungen 1-2). Strukturelle Zuordnungen aus 1H- und 13C-NMR-Spektren sowie repräsentative Spektren sind in den Ergänzungsabbildungen 3-4 enthalten.

Synergie- und Antagonismus-Screens können ein nützliches Werkzeug sein, um funktionelle Verbindungen zwischen zellulären Komponenten (Synergy) aufzudecken und genetische Netzwerke und Mechanismen der Arzneimittelwirkung (Antagonismus) zu untersuchen40. Die Bewertung der Synergie/des Antagonismus mit dem ATPase-Inhibitor Optochin in S. pneumoniae ist in Abbildung 2 dargestellt. Resazurin Microtitre Plate Assay41 bietet eine einfache Anzeige des Wachstums / Nicht-Wachstums des Organismus. Die niedrigste Konzentration der Verbindung zur Hemmung des Bakterienwachstums (blaue Farbe) wird als MIC-Wert in Gegenwart eines Co-Medikaments angenommen. Brunnen mit Bakterienwachstum werden rosa in der Farbe sein. Die Beziehung zwischen Masarimycin und Optochin wurde durch Berechnung des fraktionierten Inhibitorkonzentrationsindex (FICI) unter Verwendung von Gleichungen in Protokollschritt 4.7 bestimmt. DerFIC-I-Wert für die Masarimycin-Optochin-Wechselwirkung wird mit 1,5 berechnet, was auf eine gleichgültige Beziehung basierend auf veröffentlichten Standards42 hinweist. Phänotypische Assays mit Masarimycin in B. subtilis bei Sub-MIC-Konzentrationen zeigten einen wurstähnlichen Phänotyp (Abbildung 3B), der sich von den in der Literatur32 berichteten Phänotypen derΔ-LytG-Mutante unterscheidet und mehreren Autolysin-Knockouts29 ähnlicher ist. Die phänotypische Analyse von S. pneumoniae mit Masarimycin bei sub-MIC-Konzentrationen zeigte einen klumpenden Phänotyp (Abbildung 3D). Dieser klumpende Phänotyp unterscheidet sich von denen, die für S. pneumoniae-Zellwand-wirkende GlcNA-Fälle43,44,45 berichtet wurden.

Figure 1
Abbildung 1: Struktur des Peptidoglykans mit der Spaltstelle des exo-wirkenden N-Acetylglucosaminidase LytG aus Bacillus subtilis. Inset zeigt die Struktur des LytG-Inhibitors Masarimycin. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 2
Abbildung 2: Synergy/Antagonism-Assay zur Untersuchung antagonistischer/synergistischer Beziehungen mit Masarimycin und Optochin in S. pneumoniae. Blaue oder violette Farbe zeigt kein Bakterienwachstum an, während rosa Farbe auf Bakterienwachstum hinweist. Das MIC in Gegenwart von Co-Medikament wird als die niedrigste Konzentration genommen, die kein Bakterienwachstum zeigt (blaue Farbe). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 3
Abbildung 3: Morphologische Analyse. Morphologische Veränderungen von B. subtilis (A,B) und S. pneumoniae (C,D) bei Behandlung mit 0,75x MIC (MIC B.subtilis = 3,8 μM und MICS.pneumoniae = 7,8 μM) Masarimycin. Die Zellen wurden fixiert und mit 0,1% (m/v) Methylenblau gefärbt und durch Hellfeldmikroskopie unter Ölimmersion bei 1000-facher Vergrößerung visualisiert. Diese Zahl wurde von 35 geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Ergänzende Abbildung 1: Repräsentative Dünnschichtchromatographie von Masarimycin nach wässriger Aufarbeitung. Die mobile Phase ist 90:10 Hexan: Isopropanol und Joddampf werden zum Färben von Flecken verwendet. Rf = 0,3 für Masarimycin. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 2: Repräsentatives Flash-Chromatogramm zur Reinigung von Masarimycin. Der Peak bei etwa 1,2 Säulenvolumina enthält Masarimycin. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 3: Repräsentative 1 H NMR von Masarimycin, gelöst in CDCl3 und aufgezeichnet auf einem 400 MHz NMR-Spektrometer. Das Spektrum bezieht sich auf den verbleibendenCHCl-3-Lösungsmittelpeak bei δ = 7,26. Grün eingefädelte Zahlen über chemischen Verschiebungen zeigen Protonenzuordnungen an den entsprechenden Positionen in der Struktur von Masarimycin an (siehe Einschub). Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 4: Repräsentatives 13C NMR-Spektrum von Masarimycin, gelöst in CDCl3 bei 100 MHz. Spektrum bezogen auf denRest-CHCl-3-Lösungsmittelpeak bei δ = 77,36. Zahlen in grün über chemischen Verschiebungen zeigen Kohlenstoffatomzuordnungen an den Positionen in der Struktur von Masarimycin an (siehe Einschub). Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 5: Repräsentativer Resazurin MIC-Assay von Masarimycin gegen B. subtilis. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

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Discussion

Masarimycin ist ein einzelner mikromolarer bakteriostatischer Inhibitor des Wachstums von B. subtilis 35 und S. pneumoniae37. In B. subtilis wurde gezeigt, dass Masarimycin das GlcNAcase LytG35 hemmt, während das genaue molekulare Ziel in der Zellwand von S. pneumoniae nicht identifiziertwurde 37. Die Synthese von Masarimycin entweder mit dem klassischen organischen Synthese- oder Mikrowellenverfahren liefert den Inhibitor in guter Ausbeute und hoher Reinheit. Niedrige Ausbeuten an Masarimycin können typischerweise auf die Oxidation des Cyclohexylcarboxaldehyds zurückgeführt werden. Um dies zu überwinden, wird empfohlen, Cyclohexylcarboxaldehyd unter einer inerten Atmosphäre in einem Exsikkator zu lagern. Die Oxidation des Aldehyds zu der entsprechenden Carbonsäure kann als weißer Feststoff in der Flasche gesehen werden. Der Kauf kleiner Mengen Cyclohexylcarboxaldehyd, ohne es über einen längeren Zeitraum zu lagern, reduziert dieses Problem erheblich.

Die NMR-Zuordnung der Masarimycin-Struktur wird durch das Vorhandensein einer Mischung aus cis- und trans-Formen der Amidbindung sowie von Atropisomern um den o-Iodphenylring herum erschwert, was zu mehreren Peaks führt. Dies kann zu einer chemischen Verschiebung der Protonen führen, die über 1 ppm verteilt ist, wodurch die Zuordnungen35 erschwert werden. Infolgedessen ist die teilweise Zuordnung von NMR-chemischen Verschiebungen für 1H- und 13C-NMR-Spektren zusammen mit repräsentativen Spektren in den Ergänzungsabbildungen 3-4 enthalten. Wenn es aufgrund der Mischung von Isomeren schwierig ist, Masarimycin chemische Verschiebungen von 1H und 13C zuzuordnen, können 2-dimensionale NMR-Experimente verwendet werden. Korrelationsspektroskopie (COSY) kann verwendet werden, um Protonenspinsysteme zu identifizieren, während heteronukleare Einzelquantenkohärenzspektroskopie (HSQC) NMR-Experimente verwendet werden können, um Proton-Kohlenstoff-Einzelbindungskorrelationen zu identifizieren. Nach der Reinigung kann Masarimycin bei -20 °C als Öl gelagert oder in DMSO in einer Konzentration von 25 mM gelöst werden, bis es benötigt wird. Es wird empfohlen, in kleinen Aliquots zu lagern, um die Anzahl der Frost-Tau-Zyklen zu reduzieren. Nach wiederholten Frost-Tau-Zyklen der Verbindung sollte die Masarimycin-Stammlösung von TLC überprüft werden, um den Abbau zu überwachen.

Synergie- und Antagonismus-Screens können eine effektive Strategie sein, um Signalweg-Interaktionen zu identifizieren und können verwendet werden, um die Wirkungsweise kleiner Moleküle zu verstehen. Abbildung 2 zeigt ein Beispiel für einen Synergie-/Antagonismus-Assay mit S. pneumonia R6 unter Verwendung von Masarimycin und dem ATPase-Inhibitor Optochin (beachten Sie, dass das Synergie-/Antagonismus-Screening bei B. subtilis noch eine laufende Untersuchung ist). Zur Reproduzierbarkeit wurden Zellen der zweiten Passage verwendet und auf eine OD600nm von nicht mehr als 0,4 gezüchtet. EinFIC I von 1,5 wurde für die Wechselwirkung zwischen Masarimycin und Optochin beobachtet, was auf eine gleichgültige Beziehung zwischen dem Antibiotikapaar hinweist. Die gleichgültige Beziehung zwischen Masarimycin und Optochin deutet auf keine offensichtliche Wechselwirkung zwischen den Signalwegen hin, auf die diese Antibiotika abzielen. Während diese Assays nützliche Informationen über Arzneimittelwechselwirkungen liefern können, ist es wichtig zu beachten, dass Synergie- / Antagonismus-Assays mit biologischen Replikaten und der Verwendung der konservativeren Cutoffs, wie in Odds42 beschrieben, durchgeführt werden sollten. Dies hilft, die Überinterpretation der beobachteten geringfügigen synergistischen oder antagonistischen Beziehungen zu verhindern.

Die phänotypische Analyse von B. subtilis-Zellen, die mit Sub-MIC-Masarimycin behandelt wurden (Abbildung 3B), zeigt einen Phänotyp, der sich von Phänotypen unterscheidet, die für die genetische Deletion von LytG32 gemeldet wurden, und den Phänotypen von B. subtilis-Stämmen mit multiplen Autolysin-Deletionenähnlicher ist 29. Diese Diskrepanz im Phänotyp ist faszinierend, denn während die In-vitro-Hemmung von LytG35 demontiert wurde, hat eineΔ-LytG-Mutante keinen beobachtbaren Phänotyp32. Diese Diskrepanz lässt sich zum Teil durch Unterschiede in der genetischen und chemischen Inaktivierung erklären46,47. Die beobachteten Unterschiede in der chemischen oder genetischen Inaktivierung von LytG sind eine faszinierende Frage, die derzeit untersucht wird. S. pneumoniae-Zellen, die mit Masarimycin behandelt wurden, zeigten einen Phänotyp (Abbildung 3D), der sich von der genetischen Deletion des entsprechenden GlcNAcase (GH73, Cluster 2) LytB 37,43,44,48 unterscheidet. Diese morphologische Diskrepanz unterstreicht die Herausforderungen bei der Zuordnung der Wirkungsweise oder der Zuschreibung des biologischen Ziels von niedermolekularen Inhibitoren. Morphologische Phänotypen können aus einer komplexeren Reihe von Wechselwirkungen entstehen, die sich von einer einzigen genetischen Deletion oder einer chemischen Inaktivierung eines Zellwand-wirkenden Enzyms unterscheiden. Diese Meta-Phänotypen34 können durch komplexe Wechselwirkungen über direkte (Fehlen eines Enzyms) oder indirekte (Verlust von Regulatoren) Mechanismen entstehen.

Nach unserem besten Wissen ist Masarimycin der erste Inhibitor eines bakteriellen Autolysins, der eine Hemmung des Bakterienwachstums nachweist (Ergänzende Abbildung 5). Es ist ein bakteriostatischer Schmalspektrum-Inhibitor des Wachstums in B. subtilis und S.pneumoniae. Dieses enge Spektrum ist eine Einschränkung für multispezies-vergleichende Studien des Zellwandstoffwechsels zwischen Gram-positiven und Gram-negativen Organismen. Dieses enge Spektrum ist zum Teil auf Unterschiede in einigen der Glykosylhydrolase-Autolysine zurückzuführen, die während des vegetativen Wachstums zwischen Gram-positiven (GlcNAcase) und Gram-negativen (lytische Transglykosylase) Organismen verwendet werden. Insbesondere unter Verwendung von niedermolekularen Inhibitoren wie Masarimycin zur Hemmung von PG-Autolysinen können GlcNAcases einen orthogonalen Ansatz zur traditionellen Genetik zur Aufklärung der Autolysinfunktion bieten. Masarimycin hat einen deutlichen Vorteil gegenüber einigen chemisch-biologischen Methoden, da es in mehr als einer Spezies (B. subtilis und S. pneumoniae) verwendet werden kann. Es kann vergleichende Untersuchungen des Zellwandstoffwechsels zwischen stäbchenförmigen (B. Subtilis) und Kokkoid (S. pneumoniae) Arten. Der weniger koregulierte Zellwandstoffwechsel und die Zellteilung in S. pneumoniae bilden einen Kontrapunkt im strenger regulierten System der stäbchenförmigen Spezies49,50. Zukünftige Anwendungen dieser Technik werden darin bestehen, das molekulare Ziel in S.pneumoniae zu identifizieren und die Unterschiede zwischen genetischer und chemischer Inaktivierung von Autolysinen in S.pneumoniae und B. subtilis zu untersuchen.

Kritische Schritte im Protokoll
Es ist wichtig, auf die effektive Konzentration von Masarimycin in biologischen und biochemischen Assays zu achten. Aufgrund seiner hydrophoben Natur können Konzentrationen über 250 μM (65x MIC in B. subtilis) zu Löslichkeits- und Aggregationsproblemen führen, die sich auf die Interpretation biologischer Daten auswirken können. Die richtige Kontrolle der Wirkung des Fahrzeugs (d. h. DMSO) in allen Experimenten ist unerlässlich.

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Disclosures

Reid, C. W. verfügt über geistiges Eigentum, das spezifische Anwendungen von Masarimycin betrifft.

Acknowledgments

Die Forschung wurde von der National Science Foundation unter der Fördernummer 2009522 unterstützt. Die NMR-Analyse von Masarimycin wurde durch den National Science Foundation Major Research Instrumentation Program Award unter der Fördernummer 1919644 unterstützt. Alle Meinungen, Erkenntnisse, Schlussfolgerungen oder Empfehlungen, die in diesem Material zum Ausdruck gebracht werden, sind die der Autoren und spiegeln nicht unbedingt die Ansichten der National Science Foundation wider.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Iodobenzoic acid SIGMA-ALDRICH I7675-25G corrosive, irritant, light yellow to orange-brown powder
2-Propanol SIGMA-ALDRICH 109827-4L flammable, irritant, colorless liquid
Acetonitrile SIGMA-ALDRICH 34851-4L flammable, irritant, colorless liquid
Aluminum backed silica plates Sorbtech 4434126 silica gel XG F254 on aluminum backed plates
chloroform-d SIGMA-ALDRICH 151823-50G solvent for NMR
Compact Mass Spectrometer Advion-Interchim Advion CMS compact mass spectrometer equiped with APCI source and atmospheric solids analysis probe
Corning Costar 96 well flat bottom plates-sterile fisher chemical 07-200-90 for synergy/antagonism assays
cover slips fisher chemical 12-547 for microscopy
Cyclohexanecarboxaldehyde CHEM-IMPEX INT'L INC. 24451 flammable, irritant, colorless to pink liquid
Cyclohexyl isocyanide SIGMA-ALDRICH 133302-5G irritant, colorless liquid, extremly unpleasant odor
Cyclohexylamine SIGMA-ALDRICH 240648-100ML corrosive, flammable, irritant, colorless liquid unless contaminated
Ethyl acetate SIGMA-ALDRICH 537446-4L flammable, irritant, colorless liquid
flash silica cartridge (12g) Advion-Interchim PF-50SIHP-F0012 pack of flash silica columns (12g) for purification of masarimycin
formaldehyde SIGMA-ALDRICH F8775-25ML fixing agent for microscopy
HEPES SIGMA-ALDRICH H8651-25G buffer for microscopy fixing solution
Hexane, mixture of isomers SIGMA-ALDRICH 178918-4L environmentally damaging, flammable, irritant, health hazard, colorless liquid
High performance compact mass spectrometer Advion expression Atmospheric Solids Analysis Probe (ASAP), low resolution
High Vac eppendorf Vacufuge plus vacuum aided by centrifugal force and temperature
Hydrochloric acid SIGMA-ALDRICH 258148-2.5L corrosive, irritant, colorless liquid
hydrochloric acid SIGMA-ALDRICH 320331-2.5L strong acid
immersion oil fisher chemical 12-365-19 for microscopy
Iodine, resublimed crystals Alfa Aesar 41955 environmentally damaging, irritant, health hazard, dark grey/purple crystals
Mestre Mnova MestreLab Research software for processing NMR spectra
Methanol SIGMA-ALDRICH 439193-4L flammable, toxic, health hazard, colorless liquid
methylene blue SIGMA-ALDRICH M9140-25G microscopy stain for staining cell walls
meuller-hinton agar plates + 5% sheep blood fisher chemical B21176X growth media for Streptococcus pneumoniae
meuller-hinton broth fisher chemical DF0757-17-6 growth media for Streptococcus pneumoniae
microscope slides fisher chemical 22-310397 for microscopy
Microwave Synthesis Labstation MILESTONE START SYNTH device that requires the ventilation of a fume hood, equipped with synthesis carousel
NMR tubes SIGMA-ALDRICH Z562769-5EA 5mm NMR tubes 600 MHz
Nuclear Magnetic Resonance (NMR) Bruker Ascend 400 large superconducting magnet (400MHz)
optochin fisher chemical AAB21627MC ethylhydrocupreine hydrochloride
petrie plates Celltreat 229695 for preparing agar plates for bacterial growth
Primo Star Bright field/Phase contrast Microscope with ERc5s camera Zeiss for morphology studies
puriFlash interchim XS520plus flash chromatography purification system
resazurin SIGMA-ALDRICH R7017-1G for synergy/antagonism assays
Rotary Evaporator Heidolph Hei-VAP Value "The Collegiate" solvent evaporator
Sodium bicarbonate SIGMA-ALDRICH S6014-500G irritant, white powder
Sodium chloride fisher chemical S271-1 crystalline, colorless
Sodium chloride SIGMA-ALDRICH S5886-500G for growth of B.subtilis and preparation of LB media
Sodium sulfate SIGMA-ALDRICH 7985592-500G anhydrous, granular, white
tryptone fisher chemical BP1421-500 for growth of B.subtilis and preparation of LB media
Whitney DG250 Workstation Microbiology International DG250 anaerobic workstation. Anaerobic gas mixture used: 5% hydrogen, 10% carbon dioxide, balance nitrogen
yeast extract fisher chemical BP1422-500 for growth of B.subtilis and preparation of LB media
Zen Lite (blue) software Zeiss for acquiring micrographs

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References

  1. Vollmer, W., Blanot, D., de Pedro, M. A. Peptidoglycan structure and architecture. FEMS Microbiology Review. 32 (2), 149-167 (2008).
  2. Munita, J. M., Bayer, A. S., Arias, C. A. Evolving resistance among Gram-positive pathogens. Clinical Infectious Diseases. 61, suppl-2 48-57 (2015).
  3. Vollmer, W., Bertsche, U. Murein (peptidoglycan) structure, architecture and biosynthesis in Escherichia coli. Biochimica Biophysica Acta. 1778 (9), 1714-1734 (2008).
  4. Vollmer, W., Höltje, J. -V. The architecture of the murein (peptidoglycan) in Gram-negative bacteria: vertical scaffold or horizontal layer(s). Journal of Bacteriology. 186 (18), 5978-5987 (2004).
  5. Clarke, A. J. Compositional analysis of peptidoglycan by high-performance anion-exchange chromatography. Analytical Biochemistry. 212 (2), 344-350 (1993).
  6. Kim, S. J., Chang, J., Singh, M. Peptidoglycan architecture of Gram-positive bacteria by solid-state NMR. Biochimica Biophysica Acta. 1848, 350-362 (2014).
  7. Koch, A. L., Doyle, R. J. Inside-to-outside growth and turnover of the wall of gram-positive rods. Journal of Theoretical Biology. 117 (1), 137-157 (1985).
  8. Beeby, M., Gumbart, J. C., Roux, B., Jensen, G. J. Architecture and assembly of the Gram-positive cell wall. Molecular Microbiology. 88 (4), 664-672 (2013).
  9. Shockman, G. D., Daneo-Moore, L., Kariyama, R., Massidda, O. Bacterial walls, peptidoglycan hydrolases, autolysins, and autolysis. Microbial Drug Resistance. 2 (1), 95-98 (1996).
  10. Dijkstra, A. J., Keck, W. Peptidoglycan as a barrier to transenvelope transport. Journal of Bacteriology. 178 (19), 5555-5562 (1996).
  11. Blackman, S. A., Smith, T. J., Foster, S. J. The role of autolysins during vegetative growth of Bacillus subtilis 168. Microbiology. 144, 73-82 (1998).
  12. Misra, G., Rojas, E. R., Gopinathan, A., Huang, K. C. Mechanical consequences of cell-wall turnover in the elongation of a Gram-positive bacterium. Biophysical Journal. 104 (11), 2342-2352 (2013).
  13. Wheeler, R., et al. Bacterial cell enlargement requires control of cell wall stiffness mediated by peptidoglycan hydrolases. mBio. 6 (4), 00660 (2015).
  14. Taguchi, A., Kahne, D., Walker, S. Chemical tools to characterize peptidoglycan synthases. Current Opinion in Chemical Biology. 53, 44-50 (2019).
  15. Welsh, M. A., Schaefer, K., Taguchi, A., Kahne, D., Walker, S. Direction of chain growth and substrate preferences of shape, elongation, division, and sporulation-family peptidoglycan glycosyltransferases. Journal of the American Chemial Society. 141 (33), 12994-12997 (2019).
  16. Rubino, F. A., et al. Detection of transport intermediates in the peptidoglycan flippase MurJ identifies residues essential for conformational cycling. Journal of the American Chemical Society. 142 (12), 5482-5486 (2020).
  17. Sjodt, M., et al. Structure of the peptidoglycan polymerase RodA resolved by evolutionary coupling analysis. Nature. 556 (7699), 118-121 (2018).
  18. Tiyanont, K., et al. Imaging peptidoglycan biosynthesis in Bacillus subtilis with fluorescent antibiotics. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 103 (29), 11033-11038 (2006).
  19. Lebar, M. D., et al. Reconstitution of peptidoglycan cross-linking leads to improved fluorescent probes of cell wall synthesis. Journal of the American Chemical Society. 136 (31), 10874-10877 (2014).
  20. Do, T., Page, J. E., Walker, S. Uncovering the activities, biological roles, and regulation of bacterial cell wall hydrolases and tailoring enzymes. Journal of Biological Chemistry. 295 (10), 3347-3361 (2020).
  21. Liang, H., et al. Metabolic labelling of the carbohydrate core in bacterial peptidoglycan and its applications. Nature Communications. 8, 15015 (2017).
  22. DeMeester, K. E., et al. Metabolic incorporation of N-acetyl muramic acid probes into bacterial peptidoglycan. Current Protocol in Chemical Biology. 11 (4), 74 (2019).
  23. Lazor, K. M., et al. Use of Bioorthogonal N-acetylcysteamine (SNAc) analogues and peptidoglycan O-acetyltransferase B (PatB) to label peptidoglycan. The FASEB Journal. 32, 630 (2018).
  24. Wang, Y., Leimkuhler-Grimes, C. Fluorescent labeling of the carbohydrate backbone of peptidoglycan to track degradation in vivo. The FASEB Journal. 29, (2015).
  25. Kuru, E., et al. In probing of newly synthesized peptidoglycan in live bacteria with fluorescent D-amino acids. Angewandte Chemie International Edition. 51 (50), 12519-12523 (2012).
  26. Zhou, R., Chen, S., Recsei, P. A dye release assay for determination of lysostaphin activity. Analytical Biochemistry. 171 (1), 141-144 (1988).
  27. Qiao, Y., et al. Lipid II overproduction allows direct assay of transpeptidase inhibition by β-lactams. Nature Chemical Biology. 13 (7), 793-798 (2017).
  28. Lebar, M. D., et al. Forming cross-linked peptidoglycan from synthetic Gram-negative lipid II. Journal of the American Chemical Society. 135 (12), 4632-4635 (2013).
  29. Chen, R., Guttenplan, S. B., Blair, K. M., Kearns, D. B. Role of the D-dependent autolysins in Bacillus subtilis population heterogeneity. Journal of Bacteriology. 191 (18), 5775-5784 (2009).
  30. Yukie, S., Miki, K., Yoshio, N., Kuniaki, T., Yoshihisa, Y. Identification and characterization of an autolysin-encoding gene of Streptococcus mutans. Infection and Immunity. 73 (6), 3512-3520 (2005).
  31. Domenech, M., García, E., Moscoso, M. In vitro destruction of Streptococcus pneumoniae biofilms with bacterial and phage peptidoglycan hydrolases. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 55 (9), 4144-4148 (2011).
  32. Horsburgh, G. J., Atrih, A., Williamson, M. P., Foster, S. J. LytG of Bacillus subtilis is a novel peptidoglycan hydrolase: the major active glucosaminidase. Biochemistry. 42 (2), 257-264 (2003).
  33. Vermassen, A., et al. Cell wall hydrolases in bacteria: insight on the diversity of cell wall amidases, glycosidases and peptidases toward peptidoglycan. Frontiers in Microbiology. 10, 331 (2019).
  34. Martin-Galiano, A. J., Yuste, J., Cercenado, M. I., de la Campa, A. G. Inspecting the potential physiological and biomedical value of 44 conserved uncharacterised proteins of Streptococcus pneumoniae. BMC Genomics. 15, 652 (2014).
  35. Nayyab, S., et al. Diamide inhibitors of the Bacillus subtilis N-acetylglucosaminidase LytG that exhibit antibacterial activity. ACS Infectioius Diseases. 3 (6), 421-427 (2017).
  36. Lipski, A., et al. Structural and biochemical characterization of the β-N-acetylglucosaminidase from Thermotoga maritima: Toward rationalization of mechanistic knowledge in the GH73 family. Glycobiology. 25 (3), 319-330 (2014).
  37. Haubrich, B. A., et al. Inhibition of Streptococcus pneumoniae autolysins highlight distinct differences between chemical and genetic inactivation. bioRxiv. , 300541 (2020).
  38. Farha, M. A., et al. Inhibition of WTA synthesis blocks the cooperative action of PBPs and sensitizes MRSA to β-lactams. ACS Chemical Biology. 8 (1), 226-233 (2013).
  39. Lehár, J., et al. Chemical combination effects predict connectivity in biological systems. Molecular Systems Biology. 3 (1), 80 (2007).
  40. Farha, M. A., et al. Antagonism screen for inhibitors of bacterial cell wall biogenesis uncovers an inhibitor of undecaprenyl diphosphate synthase. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 112 (35), 11048-11053 (2015).
  41. Palomino, J. C., et al. Resazurin microtiter assay plate: simple and inexpensive method for detection of drug resistance in Mycobacterium tuberculosis. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 46 (8), 2720-2722 (2002).
  42. Odds, F. C. Synergy, antagonism, and what the chequerboard puts between them. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 52 (1), 1 (2003).
  43. Arrigucci, R., Pozzi, G. Identification of the chain-dispersing peptidoglycan hydrolase LytB of Streptococcus gordonii. PLoS One. 12 (4), 0176117 (2017).
  44. Bai, X. -H., et al. Structure of pneumococcal peptidoglycan hydrolase LytB reveals insights into the bacterial cell wall remodeling and pathogenesis. of Biological Chemistry. 289 (34), 23403-23416 (2014).
  45. Garcia, P., Gonzalez, M. P., Garcia, E., Lopez, R., Garcia, J. L. LytB, a novel pneumococcal murein hydrolase essential for cell separation. Molecular Microbiology. 31 (4), 1275-1281 (1999).
  46. Giladi, M., Altman-Price, N., Levin, I., Levy, L., Mevarech, M. FolM, a new chromosomally encoded dihydrofolate reductase in Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 185 (23), 7015-7018 (2003).
  47. Chua, P. R., et al. Effective killing of the human pathogen Candida albicans by a specific inhibitor of non-essential mitotic kinesin Kip1p. Molecular Microbiology. 65 (2), 347-362 (2007).
  48. Rico-Lastres, P., et al. Substrate recognition and catalysis by LytB, a pneumococcal peptidoglycan hydrolase involved in virulence. Scientific Reports. 5, 16198 (2015).
  49. Vollmer, W., et al. The cell wall of Streptococcus pneumoniae. Microbiology Spectrum. 7 (3), (2019).
  50. Massidda, O., Nováková, L., Vollmer, W. From models to pathogens: how much have we learned about Streptococcus pneumoniae cell division. Environmental Microbiology. 15 (12), 3133-3157 (2013).

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Biochemie Ausgabe 179 Peptidoglykan Stoffwechsel Autolysin chemische Biologie Inhibitor Zellwand
Synthese von Masarimycin, einem niedermolekularen Inhibitor des grampositiven Bakterienwachstums
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Gallati, M., Point, B., Reid, C. W.… More

Gallati, M., Point, B., Reid, C. W. Synthesis of Masarimycin, a Small Molecule Inhibitor of Gram-Positive Bacterial Growth. J. Vis. Exp. (179), e63191, doi:10.3791/63191 (2022).

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