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Bioengineering

A Interface Regenerativa do Nervo Periférico do Manguito Muscular para a Amplificação de Sinais Nervosos Periféricos Intactos

Published: January 13, 2022 doi: 10.3791/63222
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1,2, 1,2
1Department of Surgery, Section of Plastic Surgery, The University of Michigan Health System, 2Department of Biomedical Engineering, The University of Michigan, Ann Arbor

Summary

Este manuscrito fornece um método inovador para o desenvolvimento de uma interface biológica do nervo periférico denominada Muscle Cuff Regenerative Peripheral Nerve Interface (MC-RPNI). Esta construção cirúrgica pode amplificar os sinais eferentes motores do nervo periférico associado para facilitar a detecção precisa da intenção motora e o controle potencial de dispositivos exoesqueletos.

Abstract

Os exoesqueletos robóticos ganharam aclamação recente no campo da medicina de reabilitação como uma modalidade promissora para a restauração funcional para aqueles indivíduos com fraqueza nas extremidades. No entanto, seu uso permanece em grande parte confinado a instituições de pesquisa, frequentemente operando como um meio de suporte estático de extremidades, pois os métodos de detecção motora permanecem não confiáveis. As interfaces nervosas periféricas surgiram como uma solução potencial para essa deficiência; no entanto, devido às suas amplitudes inerentemente pequenas, esses sinais podem ser difíceis de diferenciar do ruído de fundo, diminuindo sua precisão geral de detecção motora. Como as interfaces atuais dependem de materiais abióticos, a quebra inerente do material pode ocorrer ao lado da reação do tecido do corpo estranho ao longo do tempo, afetando ainda mais sua precisão. A Interface Nervosa Periférica Regenerativa do Manguito Muscular (MC-RPNI) foi projetada para superar essas complicações observadas. Consistindo de um segmento de enxerto muscular livre preso circunferencialmente a um nervo periférico intacto, o construto se regenera e se torna reinervado pelo nervo contido ao longo do tempo. Em ratos, este construto demonstrou a capacidade de amplificar os potenciais de ação eferentes motores de um nervo periférico até 100 vezes o valor normal através da geração de potenciais de ação muscular compostos (CMAPs). Essa amplificação de sinal facilita a detecção de alta precisão da intenção do motor, potencialmente permitindo a utilização confiável de dispositivos de exoesqueleto.

Introduction

Somente nos Estados Unidos, aproximadamente 130 milhões de pessoas são afetadas por distúrbios neuromusculares e musculoesqueléticos, resultando em mais de US$ 800 bilhões em impacto econômico anual 1,2. Esse grupo de distúrbios é tipicamente secundário à patologia dentro do sistema nervoso, na junção neuromuscular ou dentro do próprio músculo3. Apesar da variedade de origens patológicas, a maioria compartilha algum grau de fraqueza dos membros 1,3. Infelizmente, essa fraqueza é muitas vezes permanente, dadas as limitações na regeneração dos tecidos neurais e musculares, especialmente no contexto de trauma grave 4,5,6.

Os algoritmos de tratamento da fraqueza das extremidades têm se concentrado classicamente em medidas de reabilitação e suporte, muitas vezes contando com o aproveitamento das capacidades dos membros intactos restantes (bengalas, cadeiras de rodas, etc.) 7. Esta estratégia fica aquém, no entanto, para aqueles cuja fraqueza não se limita a uma única extremidade. Com as recentes inovações em tecnologias robóticas, foram desenvolvidos dispositivos exoesqueletos avançados que restauram a funcionalidade das extremidades para aqueles que vivem com fraqueza das extremidades 8,9,10,11,12,13. Esses exoesqueletos robóticos são frequentemente alimentados, dispositivos vestíveis que podem ajudar na iniciação e término do movimento ou manutenção da posição do membro, fornecendo uma quantidade variável de força que pode ser adaptada individualmente para o usuário 8,9,10,11,12,13 . Esses dispositivos são classificados como passivos ou ativos, dependendo de como eles fornecem assistência motora ao usuário: os dispositivos ativos contêm atuadores elétricos que aumentam a potência para o usuário, enquanto os dispositivos passivos armazenam energia dos movimentos do usuário para liberá-la de volta ao usuário quando necessário14. Como os dispositivos ativos têm a capacidade de aumentar as capacidades de energia de um usuário, esses dispositivos são utilizados com muito mais frequência no cenário de fraqueza das extremidades[14].

Para determinar a intenção motora nessa população, os exoesqueletos modernos comumente contam com algoritmos de reconhecimento de padrões gerados a partir da eletromiografia (EMG) dos músculos distais dos membros 8,15,16,17 ou da eletroencefalografia de superfície (EEG) do cérebro18,19,20 . Apesar da promessa dessas modalidades de detecção, ambas as opções têm limitações significativas que impedem a utilização generalizada desses dispositivos. Como o sEEG detecta sinais em nível de microvolt transcranialmente18,19,20, as críticas frequentemente se concentram na incapacidade de diferenciar esses sinais do ruído de fundo 21. Quando o ruído de fundo é semelhante ao sinal de gravação desejado, isso produz baixas relações sinal-ruído (SNRs), resultando em detecção e classificação imprecisas do motor22,23. A detecção precisa do sinal também depende do contato estável e de baixa impedância do couro cabeludo21, que pode ser significativamente afetado pela presença de cabelos grossos/grossos, atividade do usuário e até mesmo sudorese22,24. Em contraste, os sinais EMG são de várias magnitudes maiores em amplitude, facilitando maior precisão de detecção de sinal motor15,18,25. Isso tem um custo, no entanto, pois músculos próximos podem contaminar o sinal, diminuindo os graus de liberdade capazes de serem controlados pelo dispositivo 16,17,25 e uma incapacidade de detectar o movimento muscular profundo25,26,27,28. Mais importante ainda, a EMG não pode ser utilizada como método de controle quando há comprometimento muscular significativo e ausência completa de tecido29.

A fim de avançar no desenvolvimento de exoesqueletos robóticos, é necessária a detecção consistente e precisa da intenção motora do usuário pretendido. Interfaces que utilizam o sistema nervoso periférico têm surgido como uma técnica de interface promissora, dado o seu acesso relativamente simples e seletividade funcional. Os métodos atuais de interface de nervos periféricos podem ser invasivos ou não invasivos e normalmente se enquadram em uma das três categorias: eletrodos extraneurais 30,31,32,33, eletrodos intrafasciculares 34,35,36 e eletrodos penetrantes37,38,39,40 . Como os sinais dos nervos periféricos geralmente estão no nível de microvolts, pode ser difícil diferenciar esses sinais do ruído de fundo de amplitude semelhante41,42, o que reduz as capacidades gerais de precisão de detecção motora da interface. Essas baixas relações sinal-ruído (SNR) muitas vezes pioram ao longo do tempo devido à piora da impedância do eletrodo 43 produzida pela degradação do dispositivo39,43 ou reação local de corpo estranho produzindo tecido cicatricial ao redor do dispositivo e/ou degeneração axonal local37,44. Embora essas deficiências geralmente possam ser resolvidas com a reoperação e a implantação de uma nova interface nervosa periférica, essa não é uma solução viável a longo prazo, pois as reações associadas a corpos estranhos continuariam a ocorrer.

Para evitar essas reações teciduais locais geradas pela interação dos nervos periféricos com interfaces abióticas, é necessária uma interface incorporando um componente biológico. Para suprir essa deficiência, a Interface Regenerativa de Nervos Periféricos (RNRP) foi desenvolvida para integrar nervos periféricos transectados nos membros residuais daqueles com amputações com dispositivos protéticos45,46,47,48. A fabricação do RPNI envolve o implante cirúrgico de um nervo periférico transectado em um segmento de enxerto de músculo livre autólogo, com revascularização, regeneração e reinervação ocorrendo ao longo do tempo. Através da geração de potenciais de ação muscular compostos de nível mili-volt (CMAPs), o RPNI é capaz de amplificar o sinal de nível de micro-volt de seu nervo contido em várias magnitudes, facilitando a detecção precisa da intenção motora45,48,49. Houve um desenvolvimento considerável do RPNI na última década, com notável sucesso na amplificação e transmissão de sinais nervosos motores eferentes em ambos os ensaios animais50,51 e humanos47, facilitando o controle de dispositivos protéticos de alta precisão com múltiplos graus de liberdade.

Indivíduos com fraqueza nas extremidades, mas nervos periféricos intactos, também se beneficiariam da detecção de alta precisão da intenção motora através de interfaces nervosas periféricas, a fim de controlar dispositivos de exoesqueleto. Como o RPNI foi desenvolvido para integração com nervos periféricos transectados, como em pessoas com amputações, modificações cirúrgicas foram necessárias. Com base na experiência com o RPNI, a Interface Regenerativa do Nervo Periférico do Manguito Muscular (MC-RPNI) foi desenvolvida. Consistindo de um segmento semelhante de enxerto muscular livre como no NPR, ele é fixado circunferencialmente a um nervo periférico intacto (Figura 1). Com o tempo, ele se regenera e se torna reinervado através do brotamento axonal colateral, amplificando e traduzindo esses sinais nervosos motores eferentes em sinais EMG que são várias ordens de magnitude maiores52. Como o MC-RPNI é de origem biológica, evita a inevitável reação de corpo estranho que ocorre com as interfaces nervosas periféricas atualmente em uso52. Além disso, o MC-RPNI confere a capacidade de controlar múltiplos graus de liberdade simultaneamente, pois pode ser colocado em nervos dissecados distalmente para músculos individuais sem cross-talk significativo, como já foi demonstrado anteriormente em RPNIs49. Finalmente, o MC-RPNI pode operar independentemente da função muscular distal, pois é colocado no nervo proximal. Dadas as suas vantagens sobre as interfaces nervosas periféricas atuais, o MC-RPNI é uma promessa substancial para fornecer um método seguro, preciso e confiável de controle do exoesqueleto.

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Protocol

Todos os procedimentos e experimentos em animais foram realizados com a aprovação do Comitê de Cuidados Institucionais e Uso de Animais (IACUC) da Universidade de Michigan. Ratos Fischer F344 e Lewis machos e fêmeas (~200-300 g) aos 3-6 meses de idade são mais frequentemente utilizados em experimentos, mas qualquer cepa pode teoricamente ser utilizada. Se utilizarem ratos doadores em vez de enxertos musculares autólogos, os ratos doadores devem ser isogênicos à cepa experimental. Os ratos têm livre acesso a alimentos e água, tanto no pré quanto no pós-operatório. Após as avaliações do desfecho terminal, a eutanásia é realizada sob anestesia profunda com injeção intracardíaca de cloreto de potássio, seguida por um método secundário de pneumotórax bilateral.

1. Preparação experimental do rato

  1. Anestesiar o rato experimental utilizando uma solução de isoflurano a 5% em oxigênio a 0,8-1,0 L/min em uma câmara de indução. Uma vez que a anestesia adequada é alcançada e confirmada com a ausência de reflexo corneano, coloque o rato em um cone de nariz rebreather com isoflurano reduzido para 1,75%-2,25% para manutenção da anestesia.
  2. Injetar uma solução de 0,02-0,03 mL de carprofeno (50 mg/mL) em 0,2 mL de solução salina estéril com agulha de 27 G no plano subcutâneo entre as omoplatas para analgesia peri e pós-operatória.
  3. Aplique pomada ocular estéril em ambos os olhos para evitar úlceras de córnea enquanto anestesiado.
  4. Usando uma navalha elétrica, raspe a porção lateral dos membros inferiores bilaterais, estendendo-se da articulação do quadril, sobre a coxa e até a superfície dorsal da pata.
  5. Esterilize o local cirúrgico primeiro limpando com uma almofada de preparação de álcool, seguida pela aplicação de solução de povidona-iodo, terminando com uma limpeza final com uma nova almofada de preparação de álcool para remover a solução residual de iodopovidona. Repita este processo de limpeza alternada três vezes para manter a esterilidade.
    NOTA: Isso pode ser um irritante dermatológico; garantir que a maior parte da solução seja removida.

2. Preparação do enxerto muscular

  1. Coloque o rato em uma almofada de aquecimento sob um microscópio cirúrgico com uma sonda de temperatura corporal intraoral de escolha para o monitoramento da temperatura corporal. Manter o isoflurano a 1,75%-2,25% e o oxigénio a 0,8-1,0 L/min.
  2. Faça uma incisão longitudinal ao longo da face anterior do membro posterior do doador desejado, estendendo-se desde logo acima do tornozelo até logo abaixo do joelho com um bisturi #15.
  3. Dissecar através do tecido subcutâneo subjacente usando tesoura de íris afiada para expor a musculatura subjacente e tendões distais apenas proximais à articulação do tornozelo. Tibial anterior (AT) é o maior e mais anterior dos músculos; o músculo extensor longo dos dedos (EDL) pode ser encontrado apenas profundo e posterior a este músculo. Isole o músculo EDL e seu tendão distal da musculatura circundante.
  4. Garantir o isolamento do tendão correto inserindo ambos os dentes de uma pinça ou tesoura da íris sob o tendão distal apenas proximal à articulação do tornozelo. Exerça pressão ascendente sobre o tendão abrindo a fórceps ou a tesoura da íris. Este movimento deve produzir uma extensão simultânea de todos os dedos dos pés simultaneamente. Se ocorrer dorsiflexão isolada do tornozelo, eversão do tornozelo ou dorsiflexão do dedo do pé único, o tendão errado foi isolado.
  5. Realizar uma tenotomia distal do músculo EDL ao nível do tornozelo com tesoura afiada da íris e dissecar o músculo livre dos tecidos circundantes que trabalham proximalmente em direção à sua origem tendínea.
  6. Uma vez visualizado o tendão proximal, realize uma tenotomia proximal utilizando tesoura de íris afiada para liberar o enxerto.
  7. Aparar ambas as extremidades tendíneas do enxerto muscular e cortar até o comprimento desejado com uma tesoura de íris afiada.
    NOTA: Enxertos medindo 8-13 mm têm sido utilizados com sucesso; no entanto, o comprimento mais comum utilizado é de 10 mm.
  8. De um lado do enxerto muscular, faça uma incisão longitudinal ao longo de todo o comprimento aparado para facilitar a colocação do nervo dentro do enxerto muscular e proporcionar o contato do nervo com o endomísio.
  9. Coloque o enxerto muscular preparado em uma gaze umedecida com solução salina para evitar a dessecação do tecido.
  10. Feche a pele que recobre o local doador com sutura crômica 4-0 de forma corrida.

3. Isolamento e preparação do nervo fibular comum

  1. Marque a incisão cirúrgica, que se estenderá de uma linha ~ 5 mm do entalhe ciático, estendendo-se até um pouco inferior à articulação do joelho. Certifique-se de que essa marcação seja inferior e inclinada para longe do fêmur que pode ser palpado abaixo.
  2. Incise através da pele e dos tecidos subcutâneos ao longo da linha de incisão marcada com uma lâmina # 15. Incise cuidadosamente através da fáscia femoral do bíceps subjacente, tomando cuidado para não se estender por toda a profundidade do músculo, pois o nervo ciático fica logo abaixo.
  3. Utilizando uma pequena tesoura de ponta romba ou um hemostático, disseque cuidadosamente através do músculo bíceps femoral.
    NOTA: O nervo ciático viaja neste espaço subjacente ao bíceps, orientado aproximadamente na mesma direção que a incisão marcada na pele. Existem três ramos notáveis do nervo ciático: sural (o mais posterior e o menor dos nervos), tibial (tipicamente mais anterior, mas esse nervo sempre mergulha profundamente na articulação do joelho) e peroneal comum (tipicamente localizado entre tibial e sural, sempre viaja acima da articulação do joelho).
  4. Identifique o nervo fibular comum (PC) e isole-o cuidadosamente dos nervos circundantes usando um par de micropinças e microtesouras. Remova qualquer tecido conjuntivo circundante do meio 2 cm do nervo. Tome cuidado para não esmagar o nervo PC com fórceps neste processo, pois a lesão por esmagamento pode alterar os resultados finais.
  5. Sobre a porção mais central do nervo CP liberado, realize uma janela epineurial removendo 25% do epineúrio ao longo do comprimento do nervo que corresponda ao comprimento desejado do enxerto muscular.
  6. Para realizar isso, segure o epineúrio proximal com micropinças, corte o epineúrio imediatamente subjacente com uma tesoura de microdissecção e remova ~25% do epineúrio que viaja distalmente ao longo do nervo. Tome cuidado para remover este segmento em uma peça, pois várias tentativas podem causar remoção epineurial irregular, aumentando o risco de lesão nervosa.
    NOTA: O tecido nervoso subjacente ao epineúrio terá uma textura semelhante a uma gosma; observando esta qualidade do nervo garante que o plano de tecido correto foi removido.

4. Fabricação da construção MC-RPNI

  1. Remova o enxerto muscular da gaze umedecida com solução salina e coloque-o sob a porção central do nervo CP, onde a janela epineurial foi criada. Gire o nervo 180° para que a seção da janela epineurial entre em contato com o músculo intacto e não subjaz à eventual linha de sutura.
  2. Usando um 8-0 sutura de nylon, sutura do epineúrio do nervo PC tanto proximalmente quanto distalmente ao enxerto muscular dentro do sulco criado na etapa 2.8 usando suturas simples interrompidas para fixar o epineúrio ao endomísio.
    NOTA: Coloque estes pontos, garantindo que o músculo está no comprimento normal de repouso. Alongar ou comprimir demais o músculo pode afetar as capacidades de regeneração e sinalização mais tarde.
  3. Envolva circunferencialmente as bordas do enxerto muscular ao redor do nervo agora protegido e a sutura no lugar utilizando simples 8-0 interrompido pontos de nylon (~ 4-6, dependendo do comprimento).
  4. Uma vez que a hemostasia é alcançada, feche a fáscia do bíceps femoral sobre o construto com sutura crômica 5-0 de forma corrida.
  5. Feche a pele sobrejacente de forma a correr com uma sutura crômica 4-0.
  6. Limpe a área cirúrgica com uma almofada de preparação de álcool e aplique pomada antibiótica.
  7. Termine o anestésico inalatório e coloque o rato em uma gaiola limpa isolada de companheiros de gaiola e deixe se recuperar com comida e água ad lib.
  8. Uma vez que o rato tenha se recuperado adequadamente, coloque-o de volta com companheiros de gaiola em uma gaiola limpa.
    NOTA: Esses construtos requerem maturação de três meses no mínimo para produzir amplificação adequada do sinal nervoso.

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Representative Results

A fabricação cirúrgica MC-RPNI é considerada uma falha perioperatória se os ratos não sobreviverem à emergência da anestesia cirúrgica ou desenvolverem uma infecção dentro de uma semana após a operação. Pesquisas anteriores indicaram que um período de maturação de 3 meses resultará em amplificação de sinal confiável a partir deste construto42,45,48,49. Nesse momento ou posteriormente, pode ocorrer exposição cirúrgica dos construtos e avaliação. Se a fabricação do MC-RPNI for bem-sucedida, o músculo revascularizado deve ser prontamente visível no local de implantação do MC-RPNI original (Figura 2B). Os MC-RPNIs bem-sucedidos também se contrairão após a estimulação do nervo proximal (Vídeo 1). Às vezes, cicatrizes significativas e enxerto muscular atrófico podem estar presentes (Figura 2C), indicando uma falha de revascularização/regeneração tipicamente secundária a um enxerto muito grande, manuseio inadequado ou lesão tecidual perioperatória. Esses enxertos atróficos geralmente têm algum grau de contração após a estimulação do nervo proximal, mas produzem menor amplificação de sinal. No geral, é considerada uma falha de fabricação se, após a exposição, o MC-RPNI for encontrado desalojado do nervo ou não tiver contração após a estimulação do nervo proximal.

A análise histológica desses construtos deve demonstrar tecido nervoso e muscular viável sem fibrose ou cicatriz significativa (Figura 3). A imuno-histoquímica também pode ser realizada para confirmar a presença de junções neuromusculares inervadas com neurofilamento como marcador nervoso geral em combinação com alfa-bungarotoxina como marcador para receptores de acetilcolina pós-sinápticos (Figura 4). Se o nervo implantado alvo não conseguir inervar o componente muscular do MC-RPNI, a imunocoloração não demonstraria nenhum broto do nervo motor colateral atravessando a construção, nem quaisquer junções neuromusculares inervadas.

Testes eletrofisiológicos podem ser realizados nesses construtos a qualquer momento após a maturação, com resultados publicados demonstrando sinais estáveis especificamente no MC-RPNI aos 3 meses52 e até 3 anos em RPNIs em humanos47. Os esquemas de testes eletrofisiológicos podem variar de acordo com a área de interesse e equipamentos disponíveis (Figura 5), mas as avaliações são mais comumente realizadas com o fornecimento de estimulação máxima ao nervo proximal com um eletrodo de gancho seguido de um registro dos potenciais compostos de ação muscular (CMAPs) gerados no MC-RPNI (Tabela 1 ). Os eletrodos de gravação podem variar de acordo com a preferência do usuário, mas o adesivo/almofada epimisial, a sonda bipolar epimisial e os eletrodos bipolares penetrantes têm sido usados experimentalmente com sucesso. A amplitude nervosa composta média (CNAP) registrada no nervo PC após mais estimulação do nervo proximal foi de 119,47 μV ± 14,87 μV. A amplitude média do CMAP registrada no MC-RPNI após estimulação semelhante do nervo CP proximal foi de 3,28 mV ± 0,49 mV, resultando em amplificação do sinal nervoso de 11-87x, com um fator de amplificação médio geral de 31,8 ± 7,70. Essas formas de onda CMAP geradas são semelhantes em aparência ao músculo nativo, apoiando ainda mais que elas se tornaram reinervadas por seu nervo contido (Figura 6B).

Para garantir que a fabricação do MC-RPNI não cause impacto funcional negativo, testes eletrofisiológicos e de força muscular podem ser realizados em músculos inervados distalmente. A maioria dos testes foi realizada no músculo EDL ipsilateral, pois é facilmente acessível para teste e é inervado pelo nervo fibular comum (o EDL contralateral é colhido para fabricação de MC-RPNI e, portanto, não avaliado). Os CMAPs gerados pelo músculo EDL fisiológico após a estimulação proximal do nervo CP geralmente variam de 20-30 mV52. Ao realizar este teste em ratos com MC-RPNIs implantados, os CMAPs EDL não são significativamente diferentes, com média de 24,27 mV ± 1,34 mV. Além disso, ao comparar as formas de onda CMAP geradas entre esses dois grupos, elas são notavelmente semelhantes (Figura 6C). Como medida adicional da função muscular distalmente inervada, o teste de força muscular do músculo de interesse pode ser realizado (Tabela 2). Após a estimulação do nervo CP proximal, a força tetânica máxima média de EDL gerada em indivíduos com MC-RPNI é de 2451 mN ± 115 mN, semelhante à força média de 2497 mN ± 122 mN obtida do músculo EDL em indivíduos controle52.

O objetivo geral do MC-RPNI é amplificar o sinal de nível de microvolt do nervo contido em várias magnitudes, aumentando a relação SNR e, assim, facilitando a detecção precisa da intenção do motor. Esta amplificação tem sido demonstrada para ocorrer de forma confiável na faixa de 10-20 vezes 52, com experimentos mais recentes atingindo fatores de amplificação de mais de50 vezes; portanto, se um construto não fornece um nível semelhante de amplificação, ele é considerado sub-ótimo. Resultados sub-ótimos podem tipicamente ser atribuídos a problemas no nível do enxerto muscular no MC-RPNI, pois a regeneração incompleta e, portanto, a reinervação podem resultar em um CMAP inferior ao padrão, diminuindo as habilidades gerais de amplificação do construto. A forma de onda gerada é tipicamente atenuada, com uma aparência visivelmente anormal. Se o enxerto muscular falhar completamente, o sinal medido no componente muscular pode ser inexistente (secundário a tecido cicatricial significativo) ou espelhar o CNAP gerado no nervo a montante.

Figure 1
Figura 1: Esquema ilustrativo do MC-RPNI. O nervo periférico alvo pode ser visto em amarelo dentro do enxerto muscular circundante. O MC-RPC é capaz de amplificar os potenciais de ação eferentes motores de seu nervo contido no nível de microvolts através da geração de potenciais de ação muscular compostos (CMAPs) de várias magnitudes maiores. Isso facilita a detecção da intenção do motor que é facilmente diferenciada do ruído de fundo. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: MC-RPNI in vivo. O MC-RPC é fabricado usando um enxerto muscular extensor longo dos dedos autólogo (EDL) colhido do membro contralateral. É então circunferencialmente fixado ao nervo fibular comum, com um exemplo de MC-RPNI delineado em branco (A) no momento da fabricação inicial. Este mesmo MC-RPNI é novamente retratado em (B) no momento da avaliação do endpoint 3 meses seguintes. O MC-RPC tem coloração semelhante à do músculo circundante e reteve uma boa parte do volume. Um exemplo de um enxerto muscular atrófico é mostrado em (C). O MC-RPC tem uma aparência semelhante à cicatriz circundante e ao tecido conjuntivo e perdeu um volume considerável. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Histologia MC-RPNI. (A) H&E de uma seção transversal MC-RPNI com M indicando o componente muscular, e N, o nervo. (B) Secção transversal do músculo EDL distipicamente inervado ipsilateral em um rato com um MC-RPNI. (C) Secção transversal do músculo EDL em um rato controle sem um MC-RPNI. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Imunocoloração do MC-RPNI. A imagem no canto superior esquerdo mostra uma seção longitudinal de um espécime MC-RPNI com núcleos anotados em azul (DAPI) e tecido nervoso em verde (neurofilamento). Um close-up de outro MC-RPNI é mostrado no canto inferior direito com múltiplas junções neuromusculares presentes (alfa-bungarotoxina em vermelho para receptores de acetilcolina). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: Configuração da avaliação eletrofisiológica do desfecho. O teste eletrofisiológico requer no mínimo três eletrodos: (1) um eletrodo de aterramento - não retratado; (2) um eletrodo bipolar estimulante do nervo; e (3) um eletrodo de gravação bipolar. Nesta configuração, um eletrodo de gancho estimulante bipolar pode ser visto em branco à direita da imagem colocada no nervo fibular comum. O eletrodo de sonda bipolar de gravação é colocado no MC-RPNI distal. Os sinais são então gravados a partir do MC-RPNI após a estimulação do nervo proximal no eletrodo do gancho até que os CMAPs máximos sejam alcançados. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura 6: Formas de onda eletrofisiológicas padrão. Esses gráficos mostram formas de onda típicas capturadas durante a análise eletrofisiológica de um rato com um MC-RPNI implantado após a estimulação do nervo CP proximal. (A) Em azul, um CNAP (*) registrado a partir do nervo CP proximal ao MC-RPNI é retratado. O artefato do sistema é indicado com um (**). (B) O CMAP representativo registrado a partir do MC-RPNI seguindo o CNAP gerado em (A). (C) A forma de onda CMAP resultante registrada a partir do músculo EDL disprovisional inervado ipsilateralmente. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

ID do Rato Peso do Rato (g) Amplitude do nervo CNAP (μV) Amplitude do MC-RPNI CMAP (MV) Fator de amplificação do sinal nervoso Latência (ms)
1 421 123.3 1.4 11.35 0.8
2 368 65.6 1.6 24.39 1.05
3 390 110.7 4.5 40.65 1.45
4 482 217.2 3.61 16.62 0.95
5 417 144.6 1.39 9.61 0.9
6 417 156.1 3.4 21.78 0.95
7 381 82 7.2 87.8 0.9
8 393 87.9 2.3 26.17 1.15
9 378 87.8 4.2 47.84 1
10 459 n/a 5.3 n/a 1.55
11 380 n/a 2.1 n/a 0.75
12 415 n/a 2.4 n/a 1

Tabela 1: Análise eletrofisiológica do desfecho dos MC-RPNIs. Uma seleção de resultados obtidos de ratos submetidos à análise de desfecho aos 3 (Ratos 1-9) e 6 (Ratos 10-12) meses após a fabricação. Após a estimulação proximal do nervo fibular comum (PC), os potenciais de ação nervosa composta (CNAPs) foram registrados no nervo CP a jusante e os potenciais de ação muscular composta (CMAPs) foram registrados no MC-RPNI a jusante. O fator de amplificação para cada teste pode ser visto na coluna à direita. Nota: para Ratos 10-12, o CNAP proximal ao MC-RPNI não pôde ser medido dadas as limitações anatômicas que resultaram da fabricação do MC-RPNI muito perto da decolagem do nervo CP do nervo ciático. A amplitude média do CNAP registrada foi de 119,47 μV ± 14,87 μV, enquanto a amplitude média do CMAP foi de 3,28 mV ± 0,49 mV, produzindo um fator de amplificação médio de 31,8 ± 7,70.

ID do Rato Twitch Máximo (mN) V Tetania Máxima (mN) V Hz Lo (milímetro)
1 927.13 3 2668.29 3 80 30.64
2 768.22 3.5 2677.85 3.5 80 31.15
3 646.99 3 2164.84 3 80 28.36
4 863.62 3.5 3109.67 3.5 150 31.07
5 774.48 1.5 2723.24 2 80 28.83
6 558.19 4 1930.22 4 120 29.46
7 753.97 1 2605.64 1 100 31.13
8 768.38 2 2897.08 2 100 31.86
9 559.9 1.5 1984.17 1.5 100 31.11
10 600.6 5.5 2416.09 5.5 80 32.51
11 770.27 5.5 2496.89 5.5 80 31.89
12 672.22 2.5 1740.04 2.5 50 31.34

Tabela 2: Análise da força muscular de ratos com MC-RPNIs implantados. O teste de força muscular foi realizado no músculo extensor longo dos dedos ipsilaterais (EDL) para determinar se o MC-RPNI teve algum impacto na função muscular inervada distalmente. Após a estimulação nervosa proximal da PC, foram registrados traçados de força e calculada a força ativa relevante para o teste de interesse. L o foi definido comoo comprimento de repouso muscular ideal que produziu força máxima. A força média de contração máxima registrada em ratos com MC-RPNIs implantados foi de 722,0 mN ± 32,11 mN e a força tetânica máxima média registrada foi de 2451 mN ± 115 mN, semelhante aos valores obtidos dos animais controle (contração máxima: 822,2 mN ± 41,11 mN; tetania máxima: 2497 mN ± 122 mN).

Vídeo 1: Contração MC-RPNI após estimulação elétrica do nervo proximal. Após a estimulação elétrica do nervo proximal fornecida pelo eletrodo de gancho à direita, a contração muscular visível do MC-RPNI pode ser vista no centro. Clique aqui para baixar este vídeo.

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Discussion

O MC-RPC é uma nova construção que permite a amplificação dos potenciais de ação eferentes de um nervo motor periférico intacto, a fim de controlar com precisão um dispositivo de exoesqueleto. Especificamente, o MC-RPNI confere um benefício particular àqueles indivíduos com fraqueza nas extremidades causada por doença muscular significativa e / ou ausência de músculo onde os sinais EMG não podem ser registrados. Reduzir a função muscular já comprometida seria devastador nessa população; no entanto, o MC-RPNI tem a capacidade de fornecer essa amplificação do sinal nervoso sem prejuízo do músculo inervado distalmente52 (Tabela 1 e Tabela 2). Naqueles indivíduos com doença muscular ou do neurônio motor inferior, os nervos sensoriais periféricos geralmente não são afetados pelo processo da doença53. Como a sensação é preservada, é imperativo manter o nervo em continuidade e evitar lesões, e o MC-RPNI parece evitar qualquer prejuízo para alvos distalmente inervados como um todo com base na histologia (Figura 3), imuno-histoquímica (Figura 4) e avaliação da função muscular (Tabela 2).

O MC-RPC baseia-se no conceito de brotamento axonal colateral do nervo periférico contido, conceito prontamente demonstrado tanto em pesquisas anteriores52 quanto na técnica cirúrgica bem descrita de neurorrafia end-to-side54,55. Para garantir a reinervação adequada do enxerto muscular durante a fabricação do MC-RPNI e evitar o impacto negativo nos alvos inervados distalmente, o manuseio meticuloso do nervo é imperativo. Durante a dissecção do nervo, o trauma pode ser evitado através do manuseio conciso do epineúrio ou do tecido conjuntivo apenas. No entanto, o potencial de lesão nervosa na fabricação de MC-RPNI é o mais alto durante a etapa da janela epineurial. Para evitar a transecção acentuada das fibras nervosas, recomenda-se realizar esta etapa apenas sob um microscópio cirúrgico de alta potência (pelo menos 5x) após várias oportunidades de prática em ratos não experimentais. Esta etapa pode levar várias tentativas de dominar, e não é recomendado primeiro executar esta etapa em ratos destinados à análise experimental. Teoricamente, o neuroma em continuidade é uma complicação que pode ocorrer após a fabricação do MC-RPNI, especialmente na presença de trauma nervoso significativo. No entanto, esta complicação não foi encontrada ao longo dos muitos anos em desenvolvimento.

A maioria dos experimentos realizados com o MC-RPNI foi realizada no nervo fibular comum, dada a sua relativa facilidade de acesso, bem como a avaliação de alvos inervados distalmente. Teoricamente, qualquer nervo periférico com um componente motor poderia ser substituído. Os axônios sensoriais puros podem ser utilizados, pois o tecido muscular tem componentes sensoriais (fibras fusiformes, órgãos tendinosos de Golgi, etc.), mas esses experimentos não foram conduzidos até agora, e os resultados são difíceis de prever. Para o componente do enxerto muscular do MC-RPNI, os enxertos variam de 20-150 mg, dependendo do comprimento do enxerto e da idade do rato, e qualquer enxerto muscular de tamanho semelhante pode ser utilizado com sucesso. A regeneração do enxerto muscular depende, em parte, da capacidade de revascularização, e enxertos grandes/espessos têm maior probabilidade de sofrer necrose e fibrose, afetando a capacidade geral de sinalização56. Pesquisas realizadas especificamente em RPNIs indicaram sucesso na regeneração muscular e manutenção da amplificação do sinal em enxertos de até 300 mg56. Com relação à raça de ratos, Lewis e Fischer são recomendados, pois sabe-se que a maioria dos outros ratos utilizados para fins experimentais se automutila secundária à lesão nervosa57,58.

No geral, as experiências atuais com a fabricação de MC-RPNI produziram uma taxa de falha de <5%. As falhas de construção mais comuns observadas são tipicamente atribuídas ao segmento do enxerto muscular, após o que, na exposição, nota-se que elas são atróficas ou desalojadas do nervo. Os MC-RPNIs desalojados geralmente resultam de sutura inadequada no momento da fabricação, levando à "abertura" do enxerto muscular circunferencialmente envolto e eventual extrusão parcial do nervo contido. No entanto, esses MC-RPNIs geralmente retêm algum grau (embora reduzido) de capacidades de amplificação de sinal, pois uma parte do enxerto ainda permanece presa ao nervo. Os MC-RPNIs atróficos são óbvios na exposição, pois não têm a aparência típica do músculo esquelético, muitas vezes indistinguível do tecido cicatricial com coloração rosa claro a cinza / branco (Figura 2C). A atrofia do tecido muscular pode resultar de muitos fatores, incluindo infecção, enxerto muscular muito grande / espesso, anemia por perda aguda de sangue, lesão muscular e / ou nervosa durante a fabricação, bem como a falha das suturas de fixação epineurial causando pistonização do enxerto no nervo, reduzindo a revascularização. No teste eletrofisiológico, os MC-RPNIs atróficos geralmente produzem pouca ou nenhuma amplificação de sinal; se estiver usando eletrodos de alta sensibilidade, os registros do CNAP do nervo subjacente podem ser gravados através do músculo atrófico. Se for observada atrofia significativa em vários indivíduos experimentais, deve-se retornar ao protocolo e determinar quais etapas requerem ajuste. É claro que, se nenhum sinal for registrado ao realizar avaliações, é importante solucionar problemas e não assumir que a construção é uma falha. A solução de problemas da configuração do dispositivo é primordial, pois a falta de sinais pode ser secundária a eletrodos danificados (recomenda-se impedância <16 Ω), configuração incorreta de eletrodos ou até mesmo estimulação inadequada do nervo proximal (alguns nervos requerem estimulação elétrica de 0,5-5 mA para começar a produzir CMAPs no MC-RPNI a jusante).

Os métodos atuais de interface homem-máquina para uso de exoesqueleto naqueles com fraqueza nas extremidades normalmente dependem de registros obtidos de nervos periféricos ou EMG do tecido muscular. Como discutido anteriormente, o MC-RPNI confere benefício significativo no que diz respeito ao controle do exoesqueleto para aqueles indivíduos com tecido muscular gravemente danificado ou ausente onde os registros EMG não são possíveis29. O MC-RPC também oferece uma vantagem sobre as opções atuais de interface de nervos periféricos, incluindo eletrodos extraneurais 30,31,32,33, eletrodos intrafasciculares 34,35,36 e eletrodos penetrantes37,38,39,40 . Como os sinais nervosos inerentes estão comumente no nível de microvolts, o MC-RPNI tem a capacidade de amplificar esses sinais nervosos mais de 30 vezes, facilitando a detecção precisa da intenção motora a partir do ruído de fundo e, assim, permitindo o controle confiável do exoesqueleto. Com o uso crônico, os métodos atuais baseados em eletrodos acabam lutando para superar as complicações inerentes à longevidade do material in vivo e à reação de corpo estranho, complicações que o MC-RPNI é capaz de evitar, dada a sua origem biológica. Com o tempo, essas reações de corpo estranho resultam em danos teciduais, formação de tecido cicatricial e eventual desmielinização e degeneração axonal. Experimentos conduzidos até seis meses não revelaram nenhuma evidência de lesão neuronal, cicatriz ou fibrose/degeneração do tecido muscular inervado distalmente (Figura 3) e, em combinação com a estabilidade do RPNI observada em seres humanos durante um período de observação de três anos47, é razoável concluir que os MC-RPNIs poderiam interagir com sucesso com nervos periféricos na escala de anos a décadas.

O MC-RPC destina-se a ser utilizado para o controle do exoesqueleto em uma variedade de patologias, incluindo aquelas que surgem no nível do sistema nervoso, bem como do próprio músculo. Por exemplo, patologias baseadas no músculo podem incluir condições que variam de trauma, distrofia muscular, miopatias inflamatórias e miastenia gravis. Apesar do profundo dano muscular e fraqueza que podem resultar nessas condições 1,2,3, a maioria possui neurônios motores inferiores funcionais que facilitariam a reinervação do MC-RPNI e a detecção da intenção motora. Para as condições que resultam em doença muscular generalizada (distrofia muscular, etc.), é certamente possível que o componente do enxerto muscular livre possa ser afetado, limitando assim o potencial de amplificação. No entanto, dado que a detecção de uma única unidade motora (10-400 μV)59 pode fornecer amplificação de sinais de nervos periféricos, é razoável supor que o MC-RPNI conteria unidades motoras suficientes dentro de sua área menor e definida para facilitar o controle do exoesqueleto nessa população. Uma limitação significativa do construto, no entanto, está naquelas patologias que resultam em neurônios motores superiores e/ou inferiores significativamente reduzidos, como acidente vascular cerebral, lesão medular, atrofia muscular espinhal (AME) e esclerose lateral amiotrófica (ELA). Sem uma população adequada de fibras nervosas periféricas para reinervar o MC-RPNI, ele não pode regenerar e fornecer amplificação de sinal, levando à falha do edifício. Experimentos estão sendo realizados para determinar a população mínima de fibras nervosas periféricas funcionais necessárias para a função MC-RPNI adequada.

O antecessor do MC-RPNIs, o RPNI, mostrou um sucesso imensurável com o controle preciso de próteses motorizadas em seres humanos através da amplificação e gravação de sinais gerados a partir de nervos periféricos transectados. Mais notavelmente, é capaz de fazê-lo na escala de meses a anos sem reoperação ou recalibração do dispositivo protético. Queixas comuns com os métodos atuais de interface homem-máquina para o centro de controle do exoesqueleto sobre a contaminação do sinal por cross-talk e a necessidade de recalibração frequente em métodos dependentes de EMG26,27,28 e instabilidade da interface nervosa periférica ao longo do tempo necessitando de cirurgias secundárias37,39,44 . O MC-RRNNI, no entanto, é capaz de evitar essas complicações, dada a sua composição biológica, bem como as capacidades estratégicas de posicionamento. É imperativo estabelecer uma compreensão completa desse construto, a fim de pavimentar o caminho para o uso em seres humanos e a eventual utilização generalizada de dispositivos exoesqueletos precisos e confiáveis naqueles que vivem com fraqueza nas extremidades.

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Disclosures

Os autores não têm divulgações.

Acknowledgments

Os autores agradecem a Jana Moon por seu gerenciamento de laboratório especializado e assistência técnica e a Charles Hwang por sua experiência em imagem. Os experimentos neste artigo foram parcialmente financiados através de doações da Fundação de Cirurgia Plástica para SS (3135146.4), bem como o Instituto Nacional de Saúde Infantil e Desenvolvimento Humano sob o Número de Prêmio 1F32HD100286-01 para SS, e o Instituto Nacional de Artrite e Doenças Musculoesqueléticas e de Pele dos Institutos Nacionais de Saúde sob o Número de Prêmio P30 AR069620.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
#15 Scalpel Aspen Surgical, Inc Ref 371115 Rib-Back Carbon Steel Surgical Blades (#15)
2-N-thin film load cell (S100) Strain Measurement Devices, Inc SMD100-0002 Measures force generated by the attached muscle
4-0 Chromic Suture Ethicon SKU# 1654G P-3 Reverse Cutting Needle
5-0 Chromic Suture Ethicon SKU# 687G P-3 Reverse Cutting Needle
8-0 Monofilament Suture AROSurgical T06A08N14-13 Black polyamide monofilament suture on a threaded tapered needle
Experimental Rats Envigo F344-NH-sd Rats are Fischer F344 Strain
Fine Forceps - mirror finish Fine Science Tools 11413-11 Fine tipped forceps with mirror finish ideal for handling delicate structures like nerves
Fluriso (Isofluorane) VetOne 13985-528-40 Inhalational Anesthetic
Force Measurement Jig Red Rock n/a Custom designed force measurement jig that allows for immobilization of hindlimb to allow for accurate muscle force recording
MATLAB software Mathworks, Inc PR-MATLAB-MU-MW-707-NNU Calculates active force for each recorded force trace from passive and total force measurements
Nicolet Viasys EMG EP System Nicolet MFI-NCL-VIKING-SELECT-2CH-EMG Portable EMG and nerve signal recording system capable of simultaneous 2 channel recordings from nerve and/or muscle
Oxygen Cryogenic Gases UN1072 Standard medical grade oxygen canisters
Potassium Chloride APP Pharmaceuticals 63323-965-20 Injectable form, 2 mEq/mL
Povidone Iodine USP MediChoice 65517-0009-1 10% Topical Solution, can use one bottle for multiple surgical preps
Puralube Vet Opthalmic Ointment Dechra 17033-211-38 Corneal protective ointment for use during procedure
Rimadyl (Caprofen) Zoetis, Inc. NADA# 141-199 Injectable form, 50 mg/mL
Stereo Microscope Leica Model M60 User can adjust magnification to their preference
Surgical Instruments Fine Science Tools Various User can choose instruments according to personal preference or from what is currently available in their lab
Triple Antibiotic Ointment MediChoice 39892-0830-2 Ointment comes in sterile, disposable packets
Vannas Spring Scissors - 2mm cutting edge Fine Science Tools 15000-04 Curved micro-dissection scissors used to perform the epineurial window
VaporStick 3 Surgivet V7015 Anesthesia tower with space for isofluorane and oxygen canister
Webcol Alcohol Prep Coviden Ref 6818 Alcohol prep wipes; use a new wipe for each prep

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