Summary
يصف هذا البروتوكول العزلة الحادة لخلايا العضلات الملساء القلبية والوعائية القابلة للحياة من أسماك الزرد البالغة واليافعة واليرقات والجنينية (Danio rerio) ، وهي مناسبة للدراسات الكهربية.
Abstract
منذ فترة طويلة تستخدم أسماك الزرد ككائن فقاري نموذجي في أبحاث القلب والأوعية الدموية. كانت الصعوبات التقنية لعزل الخلايا الفردية عن أنسجة القلب والأوعية الدموية لأسماك الزرد محدودة في دراسة خصائصها الكهروفسيولوجية. تم وصف الطرق السابقة لتشريح قلوب أسماك الزرد وعزل الخلايا العضلية القلبية البطينية. ومع ذلك ، لم يتم تفصيل عزل الخلايا العضلية الأذينية والوعائية لأسماك الزرد للتوصيف الكهروفسيولوجي. يصف هذا العمل البروتوكولات الأنزيمية الجديدة والمعدلة التي توفر بشكل روتيني خلايا عضلية بطينية وأذينية معزولة من أسماك الزرد الصغرى والبالغة ، بالإضافة إلى خلايا العضلات الملساء الوعائية (VSM) من الشرايين المنتفخة ، وهي مناسبة لتجارب المشبك الرقعة. لم يكن هناك أي دليل أدبي على الدراسات الكهروفسيولوجية على أنسجة القلب والأوعية الدموية لأسماك الزرد المعزولة في مراحل التطور الجنينية واليرقات. يتم عرض تقنيات التفكك الجزئي التي تسمح بتجارب المشبك التصحيحي على الخلايا الفردية من اليرقات والقلوب الجنينية.
Introduction
الزرد هي أسماك تيليوست صغيرة تستخدم منذ فترة طويلة ككائن فقاري نموذجي1 وبرزت مؤخرا كنظام فقاري قابل للحياة لفحص الجينات والأدوية عالية الإنتاجية 2,3. ومع ذلك ، فإن التحليل الفسيولوجي لأنسجة الزرد ليس متطورا بشكل جيد. في نظام القلب والأوعية الدموية ، تم وصف طرق لتشريح قلوب الزرد4 وعزل الخلايا العضلية القلبية البطينية5،6،7. هناك عدد قليل من الأوصاف التفصيلية للعزل الفعال للخلايا العضلية الأذينية ولا توجد تقارير عن استعدادات العضلات الملساء الوعائية (VSM) لدراسات المشبك الرقعي.
يصف العمل الحالي منهجية عزل الخلايا العضلية القلبية والوعائية لأسماك الزرد ، وهي قابلة للتطبيق للدراسات الكهروفسيولوجية والوظيفية. يتضمن هذا النهج تعديلات على البروتوكولات المبلغ عنها سابقا لعزل الخلايا العضلية البطينية لأسماك الزرد 5,6 ويكيف الطرق من عزل خلايا VSM للثدييات8 ، مما يسمح بعزل خلايا العضلات الملساء الوعائية لأسماك الزرد عن الشرايين المنتفخة (BA). تؤدي البروتوكولات إلى غلة فعالة للخلايا الأذينية والبطينية و VSM المعزولة من أسماك الزرد التي يمكن استخدامها بشكل موثوق في دراسات المشبك التصحيحي لمدة تصل إلى 8 ساعاتو 9.
على الرغم من يرقاتها الشفافة تقريبا التي تتطور بالكامل خارج الكائن الحي الأبوي ، إلا أن استكشاف إمكاناتها الجينية الموعودة في دراسة تطور القلب والأوعية الدموية كان محدودا بسبب التحديات في استخراج الأنسجة وتحليلها في سن مبكرة. تتناول المقالة الحالية هذا القيد من خلال إظهار تجارب المشبك التصحيحي على قلوب الزرد المعزولة في وقت مبكر من 3 أيام بعد الإخصاب (dpf) ، باستخدام طريقة استخراج منشورة ومكيفة10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم تربية جميع أسماك الزرد (سلالة من النوع البري AB ، من الذكور والإناث) وصيانتها والتعامل معها للتجارب وفقا للمبادئ التوجيهية للجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوانات بجامعة واشنطن (IACUC).
1. عزل الأذين والبطين والشرايين المنتفخة عن أسماك الزرد البالغة واليافعة واليرقات
- القتل الرحيم للأسماك باستخدام الصدمة الباردة ، أي عن طريق الانغماس في 4 درجات مئوية من الماء ، لمدة 10 ثوان تقريبا.
- باستخدام ملقط منحني ، انقل الأسماك إلى طبق بتري كبير مملوء جزئيا بمخزن التروية العازل (PB) (الجدول 1) وضعه تحت مجهر تشريح.
- قطع رأس السمكة الخلفية للعينين ، باستخدام زوج من المقص.
- باستخدام ملقط منحني (ملقط ناعم لأسماك اليرقات) ، أمسك السمكة في اليد غير المهيمنة مع الجانب البطني الذي يواجه نطاق التشريح. مع الزوج الثاني من الملقط الناعم (أو فائق النعومة للأسماك اليرقية) في اليد المهيمنة ، قم بتمزيق العضلات والزعانف الصدرية بلطف للكشف عن أنسجة القلب والأوعية الدموية (CV) (الأذين والبطين والشرايين المنتفخة ، BA) (الشكل 1).
- وضع الملقط الناعم في اليد المهيمنة، اسحب BA برفق عند الطرف المتقاطع من BA والشريان الأورطي البطني.
ملاحظة: سوف يخرج BA والقلب من تجويف الجسم.- افصل بعناية BA عن الشريان الأورطي عن طريق قرص الملقط وتحديد طرف الأذين الذي تتلاقى فيه فروع وريدية متعددة (الجيوب الأنفية الوريدية). باستخدام الملقط الناعم ، "انتزع" طرف الأذين من الجيوب الأنفية الوريدية. هذا يعزل أنسجة السيرة الذاتية عن بقية الجسم (الشكل 1).
2. انفصال الخلايا العضلية القلبية عن أسماك الزرد البالغة واليافعة واليرقات للدراسات الكهروفسيولوجية
- باستخدام الملقط الناعم ، "انتزع" الأذين والبطين من أنسجة CV المعزولة في الخطوة السابقة.
ملاحظة: تسمح هذه العملية بالتشريح النظيف لكل نسيج مع الحد الأدنى من التلوث المتبادل وتبدو أقرب إلى نتف الفاكهة من شجرة.- قم بعمل تمزق لطيف في البطين باستخدام ملقط ناعم لتصريف الدم الزائد ، والذي يمكن ضمانه عندما يتحول لون أنسجة القلب إلى لون سمك السلمون الباهت من اللون الأحمر الفاتح.
- قم بتجميع الأذين والبطين المعزولين في أنابيب طرد مركزي منفصلة سعة 1.5 مل تحتوي على مخزن مؤقت للتروية (PB ؛ 1.5 مل).
ملاحظة: لضمان الانفصال الناجح لخلايا عضلة القلب الأذينية لأسماك الزرد البالغة (ACMs) والخلايا العضلية القلبية البطينية (VCMs)، عادة ما تكون هناك حاجة إلى أربعة أذينين وثلاثة بطينين. في حالة الزرد الأحداث (28-90 يوما) ، يتضاعف هذا العدد.- في حالة الزرد اليرقي (14-28 يوما) ، اجمع أكبر قدر ممكن من الأنسجة من ~ 30 يرقة.
- استبدل PB في الأنابيب ب 750 ميكرولتر من مخزن الهضم المؤقت (DB) (الجدول 1) لكل منهما وضع الأنابيب على شاكر حراري عند 37 درجة مئوية و 800 دورة في الدقيقة. اسمح بهضم الأنسجة حتى تصبح شفافة (~ 30 دقيقة للأذينين و ~ 40 دقيقة للبطينين).
- قم بإنهاء عملية الهضم عن طريق تدوير الأنسجة بلطف في جهاز طرد مركزي صغير على الطاولة (2000 × g في درجة الحرارة المحيطة) لمدة 3-5 ثانية واستبدل DB الفائق ب 750 ميكرولتر من المخزن المؤقت للإيقاف (SB) لكل منهما (الجدول 1).
ملاحظة: خطوة الطرد المركزي هذه اختيارية لعزل VCM. - احتضان الأنسجة الحبيبية في SB في درجة الحرارة المحيطة لمدة 15 دقيقة.
- استبدل SB بلطف ب 500-750 ميكرولتر من PB لكل منها (اعتمادا على الكثافة المطلوبة للخلايا النهائية) وقم بتدوير الأنسجة (~ 30 مرة) باستخدام ماصة باستور مصقولة باللهب لتفريق الخلايا.
ملاحظة: الخلايا العضلية القلبية (CMs) جاهزة الآن للدراسات الكهروفسيولوجية ويتم تخزينها في درجة حرارة الغرفة لمدة تصل إلى 8 ساعات. - للحصول على عينات موحدة ، قم بماصة الخلايا بلطف لأعلى ولأسفل عدة مرات لإعادة تعليقها قبل إضافة قطرة منها للدراسات المقابلة.
3. تفكك خلايا العضلات الملساء الوعائية (VSM) من أسماك الزرد البالغة واليافعة للدراسات الكهروفسيولوجية
- انتزاع الشرايين المنتفخة (BA) من أنسجة CV باستخدام نفس النهج مثل الخطوة 2.1 وتجميع خمسة BAs البالغين في أنبوب طرد مركزي 1.5 مل يحتوي على عازل S1 (1.5 مل) (الجدول 2). في حالة أسماك الزرد اليافعة ، تجمع عشرة BAs ، وبالنسبة لليرقات التي يزيد عمرها عن 2 أسابيع ، تجمع 30-40 BAs.
ملاحظة: ليس من الممكن عمليا عزل خلايا VSM من يرقات الزرد التي تقل عن 2 أسابيع. - استبدل S1 ب 400 ميكرولتر من المخزن المؤقت S2 (الجدول 2) واسمح بهضم غراء (انظر جدول المواد) ل BAs على شاكر حراري عند 37 درجة مئوية و 800 دورة في الدقيقة لمدة 20 دقيقة تقريبا.
- اسمح ل BAs المهضومة جزئيا بالاستقرار لمدة دقيقة واحدة واستبدل S2 الفائق ب 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت S3 (الجدول 2) الذي يحتوي على الكولاجيناز. هضم الأنسجة على شاكر حراري عند 37 درجة مئوية و 800 دورة في الدقيقة لمدة 3-5 دقائق.
- قم بإنهاء عملية الهضم عن طريق تدوير الأنسجة بلطف في جهاز طرد مركزي صغير على الطاولة (2000 × g في درجة الحرارة المحيطة) لمدة 3-5 ثوان واستبدال S3 الفائق ب 500 ميكرولتر من S1.
- قم بتتبع الأنسجة الحبيبية بلطف (~ 15 مرة) لتفريق خلايا VSM واللوحة على أغطية زجاجية ذات حجم مناسب.
ملاحظة: يتم تحديد حجم الغطاء حسب حجم غرفة تسجيل مشبك التصحيح ، في هذه الحالة ، تم استخدام 5 × 5 مم).- احتفظ بالأغطية في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة حتى تعلق الخلايا وتستخدمها خلال ال 6 ساعات التالية.
4. عزل القلوب عن الزرد الجنيني للدراسات الكهروفسيولوجية
- أضف تريكاين (150 مجم / لتر ؛ 1 مل لكل طبق بتري 100 مم × 20 مم) إلى ~ 300 جنين (2-5 dpf) ، تم جمعها من ظروف حضانتها (الشكل 2A).
- ركز الأجنة المخدرة عن طريق نقلها إلى أنبوب طرد مركزي سعة 5 مل باستخدام ماصة نقل ، وإزالة الوسائط الزائدة (E3) من أنبوب جهاز الطرد المركزي (الشكل 2B).
- اغسل الأجنة ب 3 مل من مخزن التروية البارد (PB) مرتين وأعد تعليقه في 2 مل من PB (الشكل 2B).
- باستخدام جهاز عزل القلب الجنيني (الشكل 2C) ، اسحب ~ 1 مل من الأجنة إلى إبرة المحقنة وطردها على الفور مرة أخرى إلى الأنبوب. كرر هذه العملية 30 مرة ، بمعدل 1 ثانية لكل حركة حقنة (الشكل 2C).
- مرر الأجنة المجزأة عبر غربال مصفاة خلية 100 ميكرومتر موضوعة في قمع وجمع القلوب المصفاة في أنبوب طرد مركزي آخر سعة 5 مل. شطف حقنة مع 1 مل من PB وجمع هذا الشطف وكذلك في أنبوب من خلال غربال (الشكل 2C).
- تخلط جيدا وتفصل في أنابيب الطرد المركزي 1.5 مل ، مع كل أنبوب يحتوي على 1 مل من المحتويات. قم بطرد جميع الأنابيب الموجودة على جهاز طرد مركزي صغير على الطاولة لمدة 5 ثوان (2000 × جم في درجة الحرارة المحيطة) وتخلص من المواد الخارقة.
- قم بإجراء إعادة تعليق تسلسلية للكريات في الأنابيب باستخدام 1 مل من PB ، أي إعادة تعليق الكريات في أنبوب واحد باستخدام 1 مل من PB واستخدام PB المعاد تعليقه لإعادة تعليق الكريات في الأنبوب التالي.
- قم بماصة القلوب بلطف لأعلى ولأسفل مرتين قبل إضافة قطرة منها للدراسات المقابلة.
5. دراسات المشبك التصحيحي على خلايا القلب والأوعية الدموية المعزولة
ملاحظة: يمكن الحصول على تسجيلات مشبك التصحيح من الداخل إلى الخارج والخلايا الكاملة من الخلايا المعزولة كما تم الإبلاغ عنه سابقا لتيارات قناة KATP في قناة الزرد القلبيةالوعائية 9.
- بالنسبة للخلايا العضلية القلبية للبالغين والأحداث ، أضف الخلايا المنفصلة (من الخطوة 2) مباشرة إلى غرفة التسجيل من التعليق. بالنسبة لخلايا VSM، ضع الغطاء الذي يحتوي على خلايا VSM المطلية (من الخطوة 3) في غرفة التسجيل.
- أضف القلوب الجنينية السليمة المعزولة (من الخطوة 4) إلى الغرفة من التعليق ، وقم بإجراء تسجيلات مشبك التصحيح من الخلايا العضلية فوق القلبية (الشكل 2D).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
توفر البروتوكولات المذكورة أعلاه بشكل موثوق وروتيني ما يكفي من الخلايا العضلية القلبية والوعائية ذات الجودة المتسقة القابلة لدراسات المشبك الرقعة كما ورد مؤخرا في دراسات مكثفة لقنوات البوتاسيوم الحساسة ل ATP (KATP) في نمط الزرد البري والمتحور cardiovasculature9. تظهر الآثار التمثيلية لتسجيلات نشاط قناة KATP من الخلايا العضلية القلبية المعزولة في الشكل 3A-C. في حالة الخلايا المعزولة من الشرايين المنتفخة ، تم تأكيد خلايا العضلات الملساء الوعائية بواسطة تعبير Tg (tagln: egfp) 11,12 (الشكل 1). تم الحصول على تسجيلات ناجحة أحادية القناة (n = 8 تسجيلات من N = 5 تحضيرات) في بقع تم استئصالها من القلوب الجنينية (الشكل 3D). تم تسجيل إمكانات العمل من الخلايا العضلية البطينية والأذينية المعزولة لأسماك الزرد البالغة في وضع المشبك الحالي كامل الخلية ، باستخدام مضخم صوت مشبك التصحيح إلى جانب جهاز تحويل رقمي متوافق (انظر جدول المواد). واحتوى حل التسجيل خارج الخلية لقياسات إمكانات العمل (AP) على كلوريد الصوديوم (140 ملليمتر)، وKCl (4 ملليمتر)، وCaCl 2 (1.8 ملليمتر)، وMgCl2 (1 ملليمتر)، والجلوكوز (10 ملليمتر)، وHEPES (10 ملليمتر)، وبليبيستاتين (0.01 ملليمتر، والرقم الهيدروجيني 7.4)؛ يحتوي حل التسجيل داخل الخلايا على KCl (120 mM) و EGTA (5 mM) و K 2 ATP (5 mM) و MgCl 2 (5 mM) و HEPES (10 mM و pH7.2). تم سحب ماصات التصحيح من زجاج الصودا والجير وكان لها مقاومة من 3 إلى 5 MΩ عند ملئها بمحلول داخل الخلايا. تظهر الخلايا العضلية البطينية إمكانات غشائية مفرطة الاستقطاب مستقرة ، وتم تحفيز إمكانات العمل عن طريق الحقن الحالي من خلال ماصة التصحيح (الشكل 3E) ، في حين أظهرت الخلايا العضلية الأذينية إطلاق محتمل للفعل التلقائي (الشكل 3F). ويرد في الجدول 3 موجز للخصائص المحتملة للإجراء.
الشكل 1: عزل الخلايا الشريانية الأذينية والبطينية والمنتفخة. مخطط لتوضيح عزل الخلايا الأذينية (A) والبطينية (B) والخلايا الشريانية المنتفخة (C). تحتوي الصور التي تصور كل نوع من أنواع الخلايا المعزولة (أسفل) على أشرطة مقياس = 50 ميكرومتر في كل حالة. خلايا BA المعزولة من خطوط الزرد المراسل المعدلة وراثيا لخلايا العضلات الملساء (Tg(tagln:egfp)11,12) إيجابية للتألق الأخضر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: مخطط لتوضيح عزلة القلوب الجنينية. (أ) تتم إزالة الأجنة المخصبة من خزان التكاثر ووضعها في طبق بتري يحتوي على ماء E3 والحفاظ عليها عند 28 درجة مئوية لمدة تصل إلى 5 أيام. (ب) في السن المرغوب فيها، يتم تخدير الأجنة في الموقع باستخدام التريكاين ونقلها إلى PB في أنابيب طرد مركزي سعة 5 مل للانفصال. (ج) يتكون جهاز عزل القلب الجنيني من حقنة سعة 10 مل متصلة بإبرة 19 جم مثبتة فوق أنبوب التفكك على حامل مقعد ، مما يسمح لليدين بإجراء عملية التثليث. (د) صورة للقلب المعزول (اليوم 4) متصلة بماصة مشبك رقعة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: تسجيلات تمثيلية لمشبك الرقعة من أنسجة القلب والأوعية الدموية المعزولة لأسماك الزرد. (A، B) قنوات K ATP الحساسة لATP من الداخل إلى الخارج من تسجيلات المشبك الرقعة المقطوعة للخلايا العضلية القلبية الأذينية (A) والبطينية (B) المعزولة من أسماك الزرد البالغة. (ج) تم تسجيل توصيل قناة KATP من لقط رقعة الخلية الكاملة لخلايا VSM المعزولة من أسماك الزرد البالغة. (د) نشاط قناة K+ واحدة في بقع الغشاء التي تم استئصالها من القلوب الجنينية لأسماك الزرد (4 dpf). تم إجراء جميع تسجيلات التصحيح المستأصل باستخدام 140 mM KCl على جانبي الغشاء ، عند جهد غشاء -50 mV. تم تسجيل تيارات الخلية الكاملة مع تثبيت إمكانات الغشاء عند -70 mV. (ه) مثال على تسجيل المشبك الحالي من الخلايا العضلية البطينية المعزولة. تم تحفيز إمكانات العمل عن طريق الحقن الحالي كما هو موضح أدناه. (و) مثال على تسجيل المشبك الحالي من الخلايا العضلية الأذينية المعزولة التي تبين إمكانية إطلاق النار التلقائي للفعل. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| المخزن المؤقت للتروية (PB) | 10 ملم هيبس، 30 ملم توراين، 5.5 ملم جلوكوز، 10 ملم بي دي إم. اصنع المحلول في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) ، واضبط الرقم الهيدروجيني على 7.4 | ||
| المخزن المؤقت للهضم (ديسيبل) | PB + 12.5 ميكرومتر كلوريد الصوديوم2 + 5 ملغم / مل كول الثاني + 5 ملغ / مل كول الرابع + 5 نانوغرام / مل الأنسولين | ||
| إيقاف المخزن المؤقت (SB) | PB + 10٪ FBS + 12.5 ميكرومتر كلوريد الصوديوم2 + 10 ملغ / مل BSA + 5 نانوغرام / مل الأنسولين | ||
الجدول 1: حلول لعزل الخلايا العضلية القلبية لأسماك الزرد.
| المخزن المؤقت S1 | 0.1٪ BSA (ث / v) ، 145 mM كلوريد الصوديوم ، 4 mM KCl ، 10 mM HEPES ، 10 mM الجلوكوز ، 0.05 mM CaCl 2 ، 1 mM MgCl2 ، تم تعديلها إلى الرقم الهيدروجيني 7.4 باستخدام NaOH | ||
| المخزن المؤقت S2 | 2 مل S1، 4 ملغ غراء، 2 ملغ DTT | ||
| المخزن المؤقت S3 | 2 مل S1، 3 ملغ كولاجيناز من النوع H، 2 ملغ مثبط التربسين، 1 ملغ إيلاستيز | ||
الجدول 2: حلول لعزل خلايا VSM من أسماك الزرد.
| الخلايا العضلية البطينية (n = 3 تسجيلات) | |||
| Vm (mV) | APA (mV) | APD50 (مللي ثانية) | |
| -75.7 ± 3.9 | -119.6 ± 3.8 | 329 ± 163 | |
| الخلايا العضلية الأذينية (n = 3 تسجيلات) | |||
| AP السعر (الحد الأدنى-1) | MDP (mV) | APA (mV) | APD50 (مللي ثانية) |
| 107.3 ± 32.6 | -71.2 ± 5.1 | 98.4 ± 4.7 | 141 ± 12 |
الجدول 3: الخصائص المحتملة للعمل من الخلايا العضلية القلبية المعزولة لأسماك الزرد. مسجل في وضع المشبك الحالي. البيانات المعروضة كمتوسط ± S.D. Vm = جهد الغشاء. APA = سعة العمل المحتملة ؛ APD50 = مدة العمل المحتملة لإعادة الاستقطاب بنسبة 50٪ ؛ MDP = أقصى إمكانات انبساطي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
كانت الطرق السابقة لعزل الخلايا العضلية البطينية لأسماك الزرد 5,6 ، التي تهدف إلى توليد الخلايا العضلية للزراعة أو الدراسات الكهروفسيولوجية ، توفر خلايا ذات عائد أقل وتنطوي على خطوات طويلة من أجهزة الطرد المركزي المتعددة التي تؤثر سلبا على جودة الخلية وقابليتها للحياة. البروتوكولات الموصوفة هنا موثوقة ، وتغطي كل من أنسجة القلب والأوعية الدموية الهامة (البطين ، الأذينين ، و VSM) ، والأهم من ذلك أنها عملية تماما للعزل الحاد للخلايا الحية. يمكن أن تكون أساليب العزل التي تنطوي على تقليب البطين عبر BA13 بديلا متطورا للخلايا العضلية القلبية البطينية ولكنها تتطلب درجة أعلى من البراعة وقد تؤثر سلبا على العزلة الأذينية. ويوفر النهج المفصل في البروتوكول الحالي بديلا بسيطا وفعالا.
الاعتبارات الإضافية لعزل أنسجة القلب اليرقية هي: (1) في الخطوة 1.4 ، اعتمادا على عمر الأسماك والتكبير المتاح ، قد تكون الأنسجة مرئية حتى قبل إزالة العضلات الصدرية ، وفي هذه الحالة يمكن "انتزاع" الأنسجة مباشرة من الأسماك دون جراحة مسبقة ، ومن ثم يمكن إزالة الأنسجة غير CV باستخدام ملقط فائق النعومة ؛ (2) في الخطوة 2.2 ، بالنسبة لليرقات التي تقل أعمارها عن 14 يوما ، يمكن استخدام القلوب مباشرة للدراسات الكهروفسيولوجية دون الحاجة إلى التفكك الإنزيمي.
كما ذكر أعلاه ، وعادة ما ينطبق ذلك على طرق التفكك الأنزيمي بشكل عام ، فقد ثبت أنه من المهم استخدام المخازن المؤقتة والإنزيمات الطازجة في كل مرة. ومع ذلك ، يمكن إعداد المخزن المؤقت للتروية (PB) و S1 Buffer مقدما وتخزينهما عند 4-8 درجات مئوية لمدة شهر واحد.
يجب ألا يتجاوز وقت عزل الأنسجة الناجح ~ 90 ثانية لكل سمكة ، ويجب ألا تتعرض الأنسجة للهواء. عندما يستغرق الانفصال وقتا أطول ، يتم تقليل جودة الخلية (أي البقاء على قيد الحياة). عند ترقيم الأنسجة ، يجب توخي الحذر لتجنب توليد فقاعات الهواء ، مما يقلل أيضا من جودة الخلايا. عزل الخلايا VSM حساس لعملية الهضم بواسطة الكولاجيناز في المخزن المؤقت S3. بعد أول 3 دقائق من الهضم ، يجب إخراج الأنبوب من الخلاط الحراري كل دقيقة وفحصه بحثا عن الأنسجة المتوسعة والشفافة العائمة. بمجرد ظهور تجزئة الأنسجة ، يجب إيقاف خطوة الهضم.
من المهم ملاحظة أن هذه البروتوكولات ليست محسنة على نطاق واسع لعزل الخلايا العضلية القلبية التي تتحمل الكالسيوم ، كما هو مطلوب لدراسات الانقباض. ومع ذلك ، كما هو موضح ، يمكن تحقيق تسجيل موثوق به لإمكانات عمل الخلايا العضلية القلبية في وجود تركيزات الكالسيوم الفسيولوجية خارج الخلية 7,14. وقد تبين سابقا أن بليبيستاتين ، المضمن لفصل الإثارة والانكماش ، وتحسين تكوين ختم جيجا أوم وكفاءة التسجيل في هذه التجارب ، لا يؤثر بشكل كبير على معلمات AP في قلوب أسماك الزرد السليمة14. بالنسبة للفيزيولوجيا الكهربية ، فإن العائد المطلق للخلايا لا يحد من المعدل بشكل روتيني. لم يتم تحسين هذا البروتوكول من أجل الغلة ، كما قد يكون ضروريا للدراسات الكيميائية الحيوية للخلايا المعزولة. ومع ذلك ، فإن العائد الذي تم تحقيقه باستخدام هذه الطرق مناسب تماما للدراسات الكهروفسيولوجية ومن المحتمل أن تكون هناك طرق أخرى متعددة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ولا يعلن صاحبا البلاغ عن أي مصالح مالية متنافسة.
Acknowledgments
تم دعم هذا العمل من خلال منح المعاهد الوطنية للصحة HL140024 إلى CGN و HL150277 إلى CMC. تم إنشاء الشكل 1 والشكل 2 مع BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL Centrifuge Tubes | Eppendorf | 22364111 | |
| 10 mL Syringe | Fisher Scientific | 14-955-459 | |
| 19 Guage Needle | BD | 305187 | |
| 2,3-Butanedione Monoxime (BDM) | Sigma-Aldrich | B0753 | |
| 5 mL Centrifuge Tubes | Sigma-Aldrich | EP0030119479 | For embryonic heart isolation |
| Axopatch 200B amplifier and Digidata 1200 digitizer | Molecular Devices | Used for action potential recordings | |
| Benchtop Mini Centrifuge | Southern Labware | MLX-106 | |
| Blebbistatin | Sigma-Aldrich | 203390 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C4901 | |
| Cell-Strainer Sieve | Cole-Parmer | EW-06336-71 | 100 μm sieve for embryonic heart isolation |
| Collagenase Type H | Sigma-Aldrich | C8051 | |
| Collagenase Type II | Worthington | LS004176 | |
| Collagenase Type IV | Worthington | LS004188 | |
| Curved Forceps | Fisher Scientific | 16-100-110 | |
| DTT | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | 324626 | |
| Elastase | Worthington | LS003118 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| Fine Forceps | Dumont | Style #5 | Ceramic-coated forceps for adult and juvenile CV tissue isolation (Need two) |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I2643 | |
| K2ATP | Sigma-Aldrich | A8937 | |
| Large Petri Dish | Sigma-Aldrich | P5981 | For dissociation |
| Magnesium Chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Micro-Hematocrit Capillary Tubes | Kimble Chase | 41A2502 | Soda lime glass for patch pipettes |
| Papain | Worthington | LS003118 | |
| Pasteur Pipettes | Fisher Scientific | 13-678-6A | |
| Petri Dish | Sigma-Aldrich | P5606 | 100 mm x 20 mm, for embryonic heart isolation |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | 806552 | |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | For adult and juvenile zebrafish decapitation |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| Super Fine Forceps | Dumont | Style #SF | For isolating larval CV tissues (Need two) |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | |
| Thermoshaker | ThermoFisher Scientific | 13687711 | |
| Tricaine Methanesulfonate (MS222) | For anaesthetizing zebrafish larvae | ||
| Trypsin Inhibitor | Sigma-Aldrich | T6522 |
References
- Vascotto, S. G., Beckham, Y., Kelly, G. M. The zebrafish's swim to fame as an experimental model in biology. Biochemistry and Cell Biology. 75 (5), 479-485 (1997).
- Love, D. R., Pichler, F. B., Dodd, A., Copp, B. R., Greenwood, D. R. Technology for high-throughput screens: The present and future using zebrafish. Current Opinion in Biotechnology. 15 (6), 564-571 (2004).
- Keßler, M., Rottbauer, W., Just, S. Recent progress in the use of zebrafish for novel cardiac drug discovery. Expert Opinion on Drug Discovery. 10 (11), 1231-1241 (2015).
- Singleman, C., Holtzman, N. G. Heart dissection in larval, juvenile and adult zebrafish, Danio rerio. Journal of Visualized Experiments. (55), e3165 (2011).
- Brette, F., et al. Characterization of isolated ventricular myocytes from adult zebrafish (Danio rerio). Biochemical and Biophysical Research Communications. 374 (1), 143-146 (2008).
- Sander, V., Sune, G., Jopling, C., Morera, C., Izpisua Belmonte, J. C. Isolation and in vitro culture of primary cardiomyocytes from adult zebrafish hearts. Nature protocol. 8, 800-809 (2013).
- Nemtsas, P., Wettwer, E., Christ, T., Weidinger, G., Ravens, U. Adult zebrafish heart as a model for human heart? An electrophysiological study. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 48 (1), 161-171 (2010).
- Huang, Y., et al. Cardiovascular consequences of KATP overactivity in Cantu syndrome. JCI insight. 3 (15), 137799 (2018).
- Singareddy, S. S., et al. ATP-sensitive potassium channels in zebrafish cardiac and vascular smooth muscle. The Journal of Physiology. , (2021).
- Burns, C. G., MacRae, C. A. Purification of hearts from zebrafish embryos. BioTechniques. 40 (3), 274-282 (2006).
- Seiler, C., Abrams, J., Pack, M. Characterization of zebrafish intestinal smooth muscle development using a novel sm22α-b promoter. Developmental Dynamics. 239, 2806-2812 (2010).
- Yang, X. Y., et al. Whole amount in situ hybridization and transgene via microinjection in zebrafish. Shi Yan Sheng Wu Xue Bao. 36 (3), 243-247 (2003).
- Kompella, S. N., Brette, F., Hancox, J. C., Shiels, H. A. Phenanthrene impacts zebrafish cardiomyocyte excitability by inhibiting IKr and shortening action potential duration. The Journal of General Physiology. 153 (2), 202012733 (2021).
- Jou, C. J., Spitzer, K. W., Tristani-Firouzi, M. Blebbistatin effectively uncouples the excitation-contraction process in zebrafish embryonic heart. Cellular Physiology and Biochemistry. 25 (4-5), 419-424 (2010).
