Summary
Het huidige protocol beschrijft de acute isolatie van levensvatbare cardiale en vasculaire gladde spiercellen van volwassen, juveniele, larvale en embryonale zebravissen (Danio rerio), geschikt voor elektrofysiologische studies.
Abstract
Zebravissen worden al lang gebruikt als een model gewerveld organisme in cardiovasculair onderzoek. De technische problemen bij het isoleren van individuele cellen uit de cardiovasculaire weefsels van zebravissen zijn beperkend geweest bij het bestuderen van hun elektrofysiologische eigenschappen. Eerdere methoden zijn beschreven voor dissectie van zebravisharten en isolatie van ventriculaire cardiale myocyten. De isolatie van zebravis atriale en vasculaire myocyten voor elektrofysiologische karakterisering was echter niet gedetailleerd. Dit werk beschrijft nieuwe en gemodificeerde enzymatische protocollen die routinematig geïsoleerde juveniele en volwassen zebravisventrikel- en atriale cardiomyocyten bieden, evenals vasculaire gladde spiercellen (VSM) van de bolvormige arteriosus, geschikt voor patch-clamp experimenten. Er is geen literair bewijs van elektrofysiologische studies op cardiovasculaire weefsels van zebravissen geïsoleerd in embryonale en larvale ontwikkelingsstadia. Gedeeltelijke dissociatietechnieken die patch-clamp experimenten op individuele cellen van larvale en embryonale harten mogelijk maken, worden gedemonstreerd.
Introduction
Zebravissen zijn kleine teleostvissen die al lang worden gebruikt als een model gewerveld organisme1 en onlangs op de voorgrond zijn gekomen als een levensvatbaar gewerveld systeem voor high throughput screening van genen en geneesmiddelen 2,3. Fysiologische analyse van zebravisweefsels is echter niet goed ontwikkeld. In het cardiovasculaire systeem zijn methoden beschreven voor dissectie van zebravisharten4 en isolatie van ventriculaire cardiale myocyten 5,6,7. Er zijn weinig gedetailleerde beschrijvingen van de effectieve isolatie van atriale myocyten en geen meldingen van vasculaire gladde spieren (VSM) preparaten voor patch-clamp studies.
Het huidige werk beschrijft de methodologie voor de isolatie van zebravis cardiale en vasculaire myocyten, levensvatbaar voor elektrofysiologische en functionele studies. Deze aanpak omvat wijzigingen van eerder gerapporteerde protocollen voor zebravisventrikelmyocytenisolatie 5,6 en past methoden aan van VSM-celisolaties van zoogdieren8, waardoor de isolatie van zebravis vasculaire gladde spiercellen uit de bolvormige arteriosus (BA) mogelijk wordt. De protocollen resulteren in efficiënte opbrengsten van geïsoleerde atriale, ventriculaire en VSM-cellen van zebravissen die betrouwbaar kunnen worden gebruikt in patchklemstudies tot 8 uur9.
Ondanks hun bijna transparante larven die zich volledig buiten het ouderlijk organisme ontwikkelen, is het verkennen van hun beloofde ontogenetische potentieel bij het bestuderen van cardiovasculaire ontwikkeling beperkt door uitdagingen bij het extraheren en analyseren van weefsels op jonge leeftijd. Het huidige artikel behandelt deze beperking door patch-clamp experimenten te demonstreren op zebravisharten die al 3 dagen na de bevruchting (dpf) zijn geïsoleerd, met behulp van een aangepaste, gepubliceerde extractiemethode10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle zebravissen (wild type stam AB, zowel mannelijk als vrouwelijk) werden grootgebracht, onderhouden en behandeld voor de experimenten volgens de richtlijnen van de Washington University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).
1. Isolatie van atrium, ventrikel en bolvormige arteriosus van volwassen, juveniele en larvale zebravissen
- Euthanaseer vissen met behulp van koude shock, d.w.z. door onder te dompelen in water van 4 °C, gedurende ~ 10 s.
- Breng met behulp van een gebogen tang vissen over in een grote petrischaal die gedeeltelijk gevuld is met perfusiebuffer (PB) (tabel 1) en plaats ze onder een ontleedmicroscoop.
- Onthoofd de vis net achter de ogen, met behulp van een schaar.
- Gebruik een gebogen tang (fijne tang voor larvale vissen) en houd de vis in de niet-dominante hand met de ventrale kant naar de dissectiekijker gericht. Met het tweede paar fijne tangen (of superfijn voor larvale vissen) in de dominante hand, scheurt u voorzichtig de borstspieren en vinnen open om de cardiovasculaire (CV) weefsels (atrium, ventrikel en bolvormige arteriosus, BA) te onthullen (figuur 1).
- Plaats de fijne tang in de dominante hand en trek voorzichtig aan de BA aan de kruisende punt van de BA en de ventrale aorta.
OPMERKING: De BA en het hart komen uit de lichaamsholte.- Scheid de BA zorgvuldig van de aorta door in de tang te knijpen en de punt van het atrium te lokaliseren waarin meerdere veneuze takken samenkomen (sinus venosus). 'Pluk' met behulp van de fijne tang de punt van het atrium van de sinus venosus. Dit isoleert de CV weefsels van de rest van het lichaam (Figuur 1).
2. Dissociatie van cardiomyocyten van volwassen, juveniele en larvale zebravissen voor elektrofysiologisch onderzoek
- Gebruik de fijne tang om het atrium en de ventrikel uit het cv-weefsel te 'plukken' dat in de eerdere stap is geïsoleerd.
OPMERKING: Het proces zorgt voor een schone dissectie van elk weefsel met minimale kruisbesmetting en voelt aan als het plukken van fruit uit een boom.- Maak een zachte scheur in de ventrikel met behulp van een fijne tang om overtollig bloed af te voeren, wat kan worden gegarandeerd wanneer het hartweefsel bleke zalmkleur van felrood wordt.
- Pool het geïsoleerde atrium en de ventrikel in afzonderlijke centrifugebuizen van 1,5 ml met perfusiebuffer (PB; 1,5 ml).
OPMERKING: Om een succesvolle dissociatie van volwassen zebravis atriale cardiomyocyten (ACM's) en ventriculaire cardiomyocyten (VCM's) te garanderen, zijn meestal vier atria en drie ventrikels nodig. In het geval van juveniele zebravissen (28-90 dagen) wordt dit aantal verdubbeld.- In het geval van larvale zebravissen (14-28 dagen), verzamel zoveel mogelijk weefsel van ~ 30 larven.
- Vervang de PB in de buizen door elk 750 μL Digestion Buffer (DB) (Tabel 1) en plaats de buizen op een thermoshaker bij 37 °C en 800 rpm. Laat de weefsels verteren totdat ze doorschijnend worden (~ 30 min voor de boezems en ~ 40 min voor de ventrikels).
- Beëindig de spijsvertering door de weefsels voorzichtig te draaien in een benchtop minicentrifuge (2.000 x g bij omgevingstemperatuur) gedurende 3-5 s en vervang het supernatant DB door elk 750 μL stopbuffer (SB) (tabel 1).
OPMERKING: Deze centrifugatiestap is optioneel voor VCM-isolatie. - Incubeer de gepelletiseerde weefsels in de RVB bij omgevingstemperatuur gedurende 15 minuten.
- Vervang de SB voorzichtig door 500-750 μL PB elk (afhankelijk van de gewenste dichtheid van de uiteindelijke cellen) en trituur de weefsels (~ 30 keer) met behulp van een vlamgepolijste Pasteur-pipet om de cellen te verspreiden.
OPMERKING: De cardiomyocyten (CM's) zijn nu klaar voor elektrofysiologisch onderzoek en worden tot 8 uur bij kamertemperatuur bewaard. - Voor uniforme bemonstering pipetteert u de cellen een paar keer voorzichtig op en neer om te resuspenderen voordat u er een druppel van toevoegt voor overeenkomstige onderzoeken.
3. Dissociatie van vasculaire gladde spiercellen (VSM) van volwassen en juveniele zebravissen voor elektrofysiologisch onderzoek
- Pluk bolvormige arteriosus (BA) uit de CV-weefsels met dezelfde aanpak als stap 2.1 en bundel vijf volwassen BA's in een centrifugebuis van 1,5 ml met S1-buffer (1,5 ml) (tabel 2). In het geval van juveniele zebravissen, pool tien BA's en, voor larven ouder dan 2 weken, pool 30-40 BAs.
OPMERKING: Het is praktisch niet haalbaar om VSM-cellen te isoleren van zebravislarven jonger dan 2 weken. - Vervang S1 door 400 μL S2-buffer (tabel 2) en laat papaïne (zie materiaaltabel) de BA's op een thermoshaker bij 37 °C en 800 tpm gedurende ~20 min verteren.
- Laat de gedeeltelijk verteerde BA's 1 min bezinken en vervang het supernatant S2 door 500 μL S3-buffer (tabel 2) met collagenase. Verteer de weefsels op een thermoshaker bij 37 °C en 800 tpm gedurende 3-5 minuten.
- Beëindig de spijsvertering door de weefsels voorzichtig af te draaien in een benchtop minicentrifuge (2.000 x g bij omgevingstemperatuur) gedurende 3-5 s en supernatant S3 te vervangen door 500 μL S1.
- Trakteer de gepelletiseerde weefsels voorzichtig (~ 15 keer) om VSM-cellen en -plaat op glazen afdekplaten van de juiste grootte te verspreiden.
OPMERKING: De grootte van de coverslip wordt bepaald door de grootte van de patch-clamp opnamekamer, in dit geval werd 5 x 5 mm gebruikt).- Bewaar de coverslips gedurende 30 minuten op kamertemperatuur zodat de cellen ze binnen de volgende 6 uur kunnen hechten en gebruiken.
4. Isolatie van harten van embryonale zebravissen voor elektrofysiologisch onderzoek
- Voeg tricaïne (150 mg/l; 1 ml per petrischaal van 100 mm x 20 mm) toe aan ~300 embryo's (2-5 dpf), verzameld uit hun incubatieomstandigheden (figuur 2A).
- Concentreer de verdoofde embryo's door ze met behulp van een transferpipet over te brengen naar een centrifugebuis van 5 ml, waarbij overtollige media (E3) uit de centrifugebuis worden verwijderd (figuur 2B).
- Was de embryo's tweemaal met 3 ml koude perfusiebuffer (PB) en resuspenseer in 2 ml PB (figuur 2B).
- Trek met behulp van het embryonale hartisolatieapparaat (figuur 2C) ~ 1 ml van de embryo's in de spuitnaald en verdrijf ze onmiddellijk terug in de buis. Herhaal dit proces 30 keer, met een snelheid van 1 s per spuitbeweging (figuur 2C).
- Laat de gefragmenteerde embryo's door een celzeef van 100 μm in een trechter gaan en verzamel de gefilterde harten in een andere centrifugebuis van 5 ml. Spoel de spuit af met 1 ml PB en vang deze spoeling ook op in de buis door de zeef (figuur 2C).
- Meng goed en scheid in centrifugebuizen van 1,5 ml, waarbij elke buis 1 ml van de inhoud bevat. Centrifugeer alle buizen op een benchtop minicentrifuge gedurende 5 s (2.000 x g bij omgevingstemperatuur) en gooi de supernatanten weg.
- Voer seriële resuspensie van de pellets in de buizen uit met behulp van 1 ml PB, d.w.z. resuspensieer de pellet in één buis met behulp van 1 ml PB en gebruik die geresuspendeerde PB om de pellet in de volgende buis te resuspenderen.
- Pipetteer de harten twee keer voorzichtig op en neer voordat je er een druppel van toevoegt voor overeenkomstige studies.
5. Patch-clamp studies op geïsoleerde cardiovasculaire cellen
OPMERKING: Inside-out en whole-cell patch-clamp opnames van de geïsoleerde cellen kunnen worden verkregen zoals eerder gemeld voor KATP-kanaalstromen in zebravis cardiovasculatuur9.
- Voeg voor volwassen en juveniele cardiomyocyten de gedissocieerde cellen (vanaf stap 2) rechtstreeks toe aan de opnamekamer vanuit suspensie. Voor VSM-cellen plaatst u de coverslip met de vergulde VSM-cellen (uit stap 3) in de opnamekamer.
- Voeg geïsoleerde intacte embryonale harten (vanaf stap 4) toe aan de kamer van suspensie en maak patch-clamp-opnames van de epicardiale myocyten (figuur 2D).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De bovenstaande protocollen bieden betrouwbaar en routinematig voldoende cardiale en vasculaire myocyten van consistente kwaliteit die vatbaar zijn voor patch-clamp-studies zoals onlangs gerapporteerd in uitgebreide studies van ATP-gevoelige kalium (KATP) kanalen in wild-type en mutante zebravis cardiovasculatuur9. Representatieve sporen van opnames van dergelijke KATP-kanaalactiviteit van geïsoleerde cardiomyocyten zijn weergegeven in figuur 3A-C. In het geval van cellen geïsoleerd uit bulbeuze arteriosus, werden de vasculaire gladde spiercellen bevestigd door Tg(tagln:egfp) expressie11,12 (figuur 1). Succesvolle eenkanaalsopnamen werden verkregen (n = 8 opnames van N = 5 preparaten) in patches die uit de embryonale harten werden weggesneden (figuur 3D). Actiepotentialen werden geregistreerd van geïsoleerde volwassen zebravisventrikel- en atriale myocyten in de hele cel, stroomklemmodus, met behulp van een patchklemversterker samen met een compatibele digitizer (zie Materiaaltabel). De extracellulaire opnameoplossing voor de actiepotentiaal (AP) metingen bevatte NaCl (140 mM), KCl (4 mM), CaCl2 (1,8 mM), MgCl2 (1 mM), Glucose (10 mM), HEPES (10 mM) en Blebbistatin (0,01 mM, pH 7,4); de intracellulaire opnameoplossing bevatte KCl (120 mM), EGTA (5 mM), K2ATP (5 mM), MgCl2 (5 mM) en HEPES (10 mM, pH 7,2). Patchpipetten werden getrokken uit sodakalkglas en hadden weerstanden van 3 - 5 MΩ wanneer ze werden gevuld met intracellulaire oplossing. Ventriculaire myocyten vertonen stabiele hyperpolariseerde membraanpotentialen en actiepotentialen werden gestimuleerd via stroominjectie door de patchpipet (figuur 3E), terwijl atriale myocyten spontane actiepotentialen vertoonden (figuur 3F). Actiepotentiaaleigenschappen zijn samengevat in tabel 3.
Figuur 1: Isolatie van atriale, ventriculaire en bolvormige arteriosuscellen. Schematisch om de isolatie van atriale (A), ventriculaire (B) en bulbeuze arteriosus (C) cellen te illustreren. De afbeeldingen van elk geïsoleerd celtype (onder) hebben schaalbalken = 50 μm in elk geval. BA-cellen geïsoleerd uit gladde spiercellen transgene reporter zebravislijnen (Tg(tagln:egfp)11,12) zijn positief voor groene fluorescentie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Schematisch om de isolatie van embryonale harten te illustreren. (A) Bevruchte embryo's worden uit de kweektank verwijderd en in een petrischaaltje met E3-water geplaatst en gedurende maximaal 5 dagen op 28 °C gehouden. (B) Op de gewenste leeftijd worden embryo's in situ verdoofd met behulp van tricaïne en overgebracht naar PB in centrifugebuizen van 5 ml voor dissociatie. C) Embryonaal hartisolatieapparaat bestaat uit een spuit van 10 ml die is bevestigd aan een naald van 19 G die boven de dissociatiebuis op een bankstandaard is gemonteerd, zodat de handen de trituratie kunnen uitvoeren. (D) Afbeelding van het geïsoleerde hart (dag 4) bevestigd aan een patch-clamp pipet. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Representatieve patch-clamp opnames van geïsoleerde zebravis cardiovasculaire weefsels. (A, B) ATP-gevoelige KATP kanalen van inside-out weggesneden patch-clamp opnames van atriale (A) en ventriculaire (B) cardiomyocyten geïsoleerd uit volwassen zebravissen. (C) KATP-kanaalgeleiding werd geregistreerd door hele cel patch-clamping van VSM-cellen geïsoleerd van volwassen zebravissen. (D) Activiteit van één K+- kanaal in membraanpleisters die zijn weggesneden uit embryonale harten van zebravissen (4 dpf). Alle uitgesneden patchopnames werden gemaakt met 140 mM KCl aan beide zijden van het membraan, bij -50 mV membraanpotentiaal. Hele-celstromen werden geregistreerd met de membraanpotentiaal geklemd op -70 mV. (E) Voorbeeld stroomklemregistratie van geïsoleerde ventriculaire myocyten. Actiepotentialen werden gestimuleerd door de huidige injectie zoals hieronder weergegeven. (F) Voorbeeld stroomklemregistratie van geïsoleerde atriale myocyten die spontane actiepotentiaal afvuren laat zien. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| PERFUSIEBUFFER (PB) | 10 mM HEPES, 30 mM Taurine, 5,5 mM Glucose, 10 mM BDM. Maak de oplossing in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS), stel de pH in op 7,4 | ||
| DIGESTIEBUFFER (DB) | PB + 12,5 μM CaCl2 + 5 mg/ml Col II + 5 mg/ml Col IV + 5 ng/ml insuline | ||
| STOPBUFFER (SB) | PB + 10% FBS + 12,5 μM CaCl2 + 10 mg/ml BSA + 5 ng/ml insuline | ||
Tabel 1: Oplossingen voor isolatie van cardiomyocyten van zebravissen.
| S1 BUFFER | 0,1% BSA (w/v), 145 mM NaCl, 4 mM KCl, 10 mM HEPES, 10 mM Glucose, 0,05 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, aangepast aan pH 7,4 met NaOH | ||
| S2 BUFFER | 2 ml S1, 4 mg papaïne, 2 mg DTT | ||
| S3 BUFFER | 2 ml S1, 3 mg collagenase type H, 2 mg trypsineremmer, 1 mg elastase | ||
Tabel 2: Oplossingen voor isolatie van VSM-cellen van zebravissen.
| Ventriculaire myocyten (n = 3 opnames) | |||
| Vm (mV) | APA (mV) | APD50 (ms) | |
| -75,7 ± 3,9 | -119,6 ± 3,8 | 329 ± 163 | |
| Atriale myocyten (n = 3 opnames) | |||
| AP-snelheid (min-1) | MDP (mV) | APA (mV) | APD50 (ms) |
| 107,3 ± 32,6 | -71,2 ± 5,1 | 98,4 ± 4,7 | 141 ± 12 |
Tabel 3: Actie potentiële eigenschappen van geïsoleerde zebravis cardiomyocyten. Opgenomen in de huidige klemmodus. Gegevens weergegeven als gemiddelde ± S.D. Vm = membraanpotentiaal; APA = actiepotentiaalamplitude; APD50 = duur van het actiepotentiaal tot 50% repolarisatie; MDP = maximale diastolische potentiaal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Eerdere methoden voor het isoleren van zebravisventrikelmyocyten 5,6, gericht op het genereren van myocyten voor kweek- of elektrofysiologische studies, leverden cellen met een lagere opbrengst en omvatten lange stappen van meerdere centrifugaties die de celkwaliteit en levensvatbaarheid nadelig beïnvloedden. De hier beschreven protocollen zijn betrouwbaar, bestrijken elk van de belangrijke cardiovasculaire weefsels (ventrikel, boezems en VSM) en zijn belangrijk voor acute isolatie van levende cellen. Isolatiebenaderingen met cannulatie van de ventrikel via de BA13 kunnen een geavanceerd alternatief zijn voor ventriculaire cardiomyocyten, maar vereisen een hogere mate van behendigheid en kunnen een negatieve invloed hebben op atriale isolatie. De aanpak die in het huidige protocol wordt beschreven, biedt een eenvoudig en efficiënt alternatief.
Aanvullende overwegingen voor larvale hartweefselisolatie zijn: (1) In stap 1.4, afhankelijk van de leeftijd van de vis en de beschikbare vergroting, kunnen de weefsels zichtbaar zijn, zelfs voordat de borstspieren worden verwijderd, in welk geval de weefsels direct uit de vis kunnen worden "geplukt" zonder voorafgaande operatie, en dan kunnen de niet-CV-weefsels worden verwijderd met behulp van een superfijne tang; (2) In stap 2.2 kunnen de harten voor larven jonger dan 14 dagen rechtstreeks worden gebruikt voor elektrofysiologisch onderzoek zonder dat enzymatische dissociatie nodig is.
Zoals hierboven vermeld, en typisch geldt voor enzymatische dissociatiemethoden in het algemeen, is het belangrijk gebleken om elke keer verse buffers en enzymen te gebruiken. Perfusiebuffer (PB) en S1-buffer kunnen echter van tevoren worden bereid en gedurende 1 maand bij 4-8 °C worden bewaard.
Succesvolle weefselisolatietijd mag niet langer zijn dan ~ 90 s per vis en weefsels mogen niet worden blootgesteld aan lucht. Wanneer dissociatie langer duurt, wordt de celkwaliteit (d.w.z. overleving) verminderd. Bij het tritureren van weefsels moet ervoor worden gezorgd dat er geen luchtbellen ontstaan, wat ook de celkwaliteit vermindert. VSM-celisolatie is gevoelig voor de vertering door collagenase in S3-buffer. Na de eerste 3 minuten van de spijsvertering moet de buis elke minuut uit de thermoshaker worden gehaald en worden onderzocht op zwevende verwijde en doorschijnende weefsels. Zodra weefselfragmentatie duidelijk is, moet de verteringsstap worden gestopt.
Het is belangrijk op te merken dat deze protocollen niet uitgebreid zijn geoptimaliseerd voor het isoleren van calciumtolerante cardiomyocyten, zoals vereist zou zijn voor contractiliteitsstudies. Zoals aangetoond, kan echter een betrouwbare registratie van cardiomyocytenactiepotentialen worden bereikt in aanwezigheid van fysiologische extracellulaire calciumconcentraties 7,14. Blebbistatine, opgenomen om excitatie en contractie te ontkoppelen en de giga-Ohm-afdichtingsvorming en opname-efficiëntie in deze experimenten te verbeteren, is eerder aangetoond dat het de AP-parameters in intacte zebravisharten niet significant beïnvloedt14. Voor elektrofysiologie is de absolute opbrengst van cellen ook niet routinematig snelheidsbeperkend. Dit protocol is niet geoptimaliseerd voor opbrengst, zoals nodig kan zijn voor biochemische studies van geïsoleerde cellen. Toch is de opbrengst die met deze methoden wordt bereikt zeer geschikt voor elektrofysiologische studies en waarschijnlijk meerdere andere benaderingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen te hebben.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door NIH-subsidies HL140024 aan CGN en HL150277 aan CMC. Figuur 1 en figuur 2 zijn gemaakt met BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL Centrifuge Tubes | Eppendorf | 22364111 | |
| 10 mL Syringe | Fisher Scientific | 14-955-459 | |
| 19 Guage Needle | BD | 305187 | |
| 2,3-Butanedione Monoxime (BDM) | Sigma-Aldrich | B0753 | |
| 5 mL Centrifuge Tubes | Sigma-Aldrich | EP0030119479 | For embryonic heart isolation |
| Axopatch 200B amplifier and Digidata 1200 digitizer | Molecular Devices | Used for action potential recordings | |
| Benchtop Mini Centrifuge | Southern Labware | MLX-106 | |
| Blebbistatin | Sigma-Aldrich | 203390 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C4901 | |
| Cell-Strainer Sieve | Cole-Parmer | EW-06336-71 | 100 μm sieve for embryonic heart isolation |
| Collagenase Type H | Sigma-Aldrich | C8051 | |
| Collagenase Type II | Worthington | LS004176 | |
| Collagenase Type IV | Worthington | LS004188 | |
| Curved Forceps | Fisher Scientific | 16-100-110 | |
| DTT | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | 324626 | |
| Elastase | Worthington | LS003118 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| Fine Forceps | Dumont | Style #5 | Ceramic-coated forceps for adult and juvenile CV tissue isolation (Need two) |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I2643 | |
| K2ATP | Sigma-Aldrich | A8937 | |
| Large Petri Dish | Sigma-Aldrich | P5981 | For dissociation |
| Magnesium Chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Micro-Hematocrit Capillary Tubes | Kimble Chase | 41A2502 | Soda lime glass for patch pipettes |
| Papain | Worthington | LS003118 | |
| Pasteur Pipettes | Fisher Scientific | 13-678-6A | |
| Petri Dish | Sigma-Aldrich | P5606 | 100 mm x 20 mm, for embryonic heart isolation |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | 806552 | |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | For adult and juvenile zebrafish decapitation |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| Super Fine Forceps | Dumont | Style #SF | For isolating larval CV tissues (Need two) |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | |
| Thermoshaker | ThermoFisher Scientific | 13687711 | |
| Tricaine Methanesulfonate (MS222) | For anaesthetizing zebrafish larvae | ||
| Trypsin Inhibitor | Sigma-Aldrich | T6522 |
References
- Vascotto, S. G., Beckham, Y., Kelly, G. M. The zebrafish's swim to fame as an experimental model in biology. Biochemistry and Cell Biology. 75 (5), 479-485 (1997).
- Love, D. R., Pichler, F. B., Dodd, A., Copp, B. R., Greenwood, D. R. Technology for high-throughput screens: The present and future using zebrafish. Current Opinion in Biotechnology. 15 (6), 564-571 (2004).
- Keßler, M., Rottbauer, W., Just, S. Recent progress in the use of zebrafish for novel cardiac drug discovery. Expert Opinion on Drug Discovery. 10 (11), 1231-1241 (2015).
- Singleman, C., Holtzman, N. G. Heart dissection in larval, juvenile and adult zebrafish, Danio rerio. Journal of Visualized Experiments. (55), e3165 (2011).
- Brette, F., et al. Characterization of isolated ventricular myocytes from adult zebrafish (Danio rerio). Biochemical and Biophysical Research Communications. 374 (1), 143-146 (2008).
- Sander, V., Sune, G., Jopling, C., Morera, C., Izpisua Belmonte, J. C. Isolation and in vitro culture of primary cardiomyocytes from adult zebrafish hearts. Nature protocol. 8, 800-809 (2013).
- Nemtsas, P., Wettwer, E., Christ, T., Weidinger, G., Ravens, U. Adult zebrafish heart as a model for human heart? An electrophysiological study. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 48 (1), 161-171 (2010).
- Huang, Y., et al. Cardiovascular consequences of KATP overactivity in Cantu syndrome. JCI insight. 3 (15), 137799 (2018).
- Singareddy, S. S., et al. ATP-sensitive potassium channels in zebrafish cardiac and vascular smooth muscle. The Journal of Physiology. , (2021).
- Burns, C. G., MacRae, C. A. Purification of hearts from zebrafish embryos. BioTechniques. 40 (3), 274-282 (2006).
- Seiler, C., Abrams, J., Pack, M. Characterization of zebrafish intestinal smooth muscle development using a novel sm22α-b promoter. Developmental Dynamics. 239, 2806-2812 (2010).
- Yang, X. Y., et al. Whole amount in situ hybridization and transgene via microinjection in zebrafish. Shi Yan Sheng Wu Xue Bao. 36 (3), 243-247 (2003).
- Kompella, S. N., Brette, F., Hancox, J. C., Shiels, H. A. Phenanthrene impacts zebrafish cardiomyocyte excitability by inhibiting IKr and shortening action potential duration. The Journal of General Physiology. 153 (2), 202012733 (2021).
- Jou, C. J., Spitzer, K. W., Tristani-Firouzi, M. Blebbistatin effectively uncouples the excitation-contraction process in zebrafish embryonic heart. Cellular Physiology and Biochemistry. 25 (4-5), 419-424 (2010).
