Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

בידוד תאי שריר חלק לבביים וכלי דם מדגי זברה בוגרים, צעירים, זחליים ועובריים למחקרים אלקטרופיזיולוגיים

Published: February 9, 2022 doi: 10.3791/63225

Summary

הפרוטוקול הנוכחי מתאר בידוד חריף של תאי שריר לב וכלי דם חלקים בני קיימא מדגי זברה בוגרים, צעירים, זחליים ועובריים (Danio rerio), המתאימים למחקרים אלקטרופיזיולוגיים.

Abstract

דגי זברה משמשים זה זמן רב כאורגניזם מודל של בעלי חוליות בחקר הלב וכלי הדם. הקשיים הטכניים של בידוד תאים בודדים מרקמות הלב וכלי הדם של דגי הזברה מגבילים בחקר התכונות האלקטרופיזיולוגיות שלהם. שיטות קודמות תוארו עבור דיסקציה של לבבות דגי זברה ובידוד של מיוציטים לבביים חדריים. עם זאת, הבידוד של דגי זברה פרוזדורים ומיוציטים וסקולריים לאפיון אלקטרופיזיולוגי לא היה מפורט. עבודה זו מתארת פרוטוקולים אנזימטיים חדשים ומותאמים המספקים באופן שגרתי קרדיומיוציטים חדריים ופרוזדורים מבודדים של דגי זברה צעירים ובוגרים, כמו גם תאי שריר חלק וסקולרי (VSM) מהעורק הבולבוסי, המתאימים לניסויים של מהדק טלאי. לא נמצאו עדויות ספרותיות למחקרים אלקטרופיזיולוגיים על רקמות לב וכלי דם של דגי זברה שבודדו בשלבי התפתחות עובריים וזחליים. הודגמו טכניקות דיסוציאציה חלקיות המאפשרות ניסויים של מהדקי טלאים על תאים בודדים מלב זחלים ועובריים.

Introduction

דגי זברה הם דגי טלוסט קטנים המשמשים זה מכבר כאורגניזם מודל של בעלי חוליות1 ולאחרונה עלו לגדולה כמערכת בעלי חוליות בת קיימא לסינון תפוקה גבוהה של גנים ותרופות 2,3. עם זאת, ניתוח פיזיולוגי של רקמות דג זברה אינו מפותח היטב. במערכת הלב וכלי הדם תוארו שיטות לכריתה של לבבות דגי זברה4 ובידוד של מיוציטים לבביים חדריים 5,6,7. ישנם מעט תיאורים מפורטים של בידוד יעיל של מיוציטים פרוזדורים ואין דיווחים על תכשירים של שריר חלק וסקולרי (VSM) למחקרי מהדק טלאי.

העבודה הנוכחית מתארת מתודולוגיה לבידוד של מיוציטים לבביים וכלי דם של דגי זברה, בת קיימא למחקרים אלקטרופיזיולוגיים ותפקודיים. גישה זו כוללת שינויים בפרוטוקולים שדווחו בעבר לבידוד מיוציטים חדריים של דגי זברה 5,6 ומתאימה שיטות מבידודים של תאי VSM של יונקים8, מה שמאפשר בידוד של תאי שריר חלק של כלי דם של דגי זברה מה-bulbous arteriosus (BA). הפרוטוקולים מביאים לתפוקות יעילות של תאי פרוזדורים, חדרים ו-VSM מבודדים מדגי זברה, שניתן להשתמש בהם באופן אמין במחקרי מהדק טלאים עד 8 שעות9.

למרות הזחלים הכמעט שקופים שלהם המתפתחים לחלוטין מחוץ לאורגניזם ההורי, חקר הפוטנציאל האונטוגנטי המובטח שלהם בחקר התפתחות הלב וכלי הדם הוגבל על ידי אתגרים בחילוץ וניתוח רקמות בגיל צעיר. המאמר הנוכחי נותן מענה למגבלה זו על ידי הדגמת ניסויי הידוק טלאים על לבבות דגי זברה שבודדו כבר 3 ימים לאחר ההפריה (dpf), באמצעות שיטת מיצוימותאמת שפורסמה 10.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל דגי הזברה (זן בר מסוג AB, זכר ונקבה כאחד) גודלו, תוחזקו וטופלו לניסויים בהתאם להנחיות הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת וושינגטון (IACUC).

1. בידוד של אטריום, חדר, ו bulbous arteriosus מן דגי זברה בוגרים, צעירים, זחל

  1. להרדים דגים באמצעות הלם קר, כלומר, על ידי טבילה במים 4 מעלות צלזיוס, במשך ~ 10 שניות.
  2. באמצעות מלקחיים מעוקלים, מעבירים את הדגים לתוך צלחת פטרי גדולה מלאה חלקית ב-Perfusion Buffer (PB) (טבלה 1) ומניחים מתחת למיקרוסקופ מנתח.
    1. לערוף את הדג רק אחורית לעיניים, באמצעות זוג מספריים.
  3. באמצעות מלקחיים מעוקלים (מלקחיים עדינים לדגי זחל), החזיקו את הדג ביד הלא דומיננטית כאשר הצד הגחוני פונה להיקף הנתיחה. עם זוג המלקחיים העדינים השני (או Superfine עבור דגי זחל) ביד הדומיננטית, קרעו בעדינות את שרירי החזה והסנפירים כדי לחשוף את רקמות הלב וכלי הדם (CV) (אטריום, חדר, ובולבוס עורקי, BA) (איור 1).
  4. מניחים את המלקחיים העדינים ביד הדומיננטית, מושכים בעדינות את ה-BA בקצה המצטלב של ה-BA ואבי העורקים הגחוני.
    הערה: ה- BA והלב ייצאו מחלל הגוף.
    1. מפרידים בזהירות את ה-BA מאבי העורקים על ידי צביטה של המלקחיים ואיתור קצה האטריום שאליו מתכנסים ענפים ורידיים מרובים (sinus venosus). בעזרת המלקחיים העדינים, 'מורטים' את קצה האטריום מהסינוס ונוס. זה מבודד את רקמות קורות החיים משאר הגוף (איור 1).

2. דיסוציאציה של קרדיומיוציטים מדגי זברה בוגרים, צעירים וזחליים למחקרים אלקטרופיזיולוגיים

  1. באמצעות המלקחיים העדינים, 'למרוט' את האטריום והחדר מתוך רקמת CV שבודדה בשלב הקודם.
    הערה: התהליך מאפשר ניתוח נקי של כל רקמה עם זיהום צולב מינימלי ומרגיש דומה למריטת פרי מעץ.
    1. בצע קרע עדין לתוך החדר באמצעות מלקחיים עדינים כדי לנקז דם עודף, אשר ניתן להבטיח כאשר רקמת הלב הופך צבע סלמון חיוור מאדום בוהק.
  2. לאגד את האטריום והחדר המבודדים לצינורות צנטריפוגה נפרדים של 1.5 מ"ל המכילים חיץ פרפוזיה (PB; 1.5 מ"ל).
    הערה: כדי להבטיח דיסוציאציה מוצלחת של קרדיומיוציטים פרוזדורים של דגי זברה בוגרים (ACMs) וקרדיומיוציטים חדריים (VCMs), בדרך כלל יש צורך בארבעה אטריה ושלושה חדרים. במקרה של דגי זברה צעירים (28-90 יום), מספר זה מוכפל.
    1. במקרה של דגי זברה זחליים (14-28 ימים), לאסוף רקמה רבה ככל האפשר מ ~ 30 זחלים.
  3. החלף את ה- PB בצינורות ב- 750 μL של חיץ עיכול (DB) (טבלה 1) כל אחד והנח את הצינורות על תרמושייקר ב- 37 °C ו- 800 סל"ד. אפשר עיכול של הרקמות עד שהם הופכים שקופים (~ 30 דקות עבור אטריה ו ~ 40 דקות עבור החדרים).
  4. סיים את העיכול על ידי סיבוב עדין של הרקמות בצנטריפוגה קטנה (2,000 x גרם בטמפרטורת הסביבה) במשך 3-5 שניות והחלף את ה-DB הסופר-נאטנטי ב-750 μL של מאגר עצירה (SB) כל אחד (טבלה 1).
    הערה: שלב צנטריפוגה זה הוא אופציונלי לבידוד VCM.
  5. לדגור את הרקמות הכדוריות ב- SB בטמפרטורת הסביבה במשך 15 דקות.
  6. החלף בעדינות את ה- SB ב- 500-750 μL של PB כל אחד (בהתאם לצפיפות הרצויה של התאים הסופיים) וטריטורט את הרקמות (~ 30 פעמים) באמצעות פיפטה פסטר מלוטשת להבה כדי לפזר את התאים.
    הערה: הקרדיומיוציטים (CMs) מוכנים כעת למחקרים אלקטרופיזיולוגיים ומאוחסנים בטמפרטורת החדר עד 8 שעות.
  7. לדגימה אחידה, פיפטו בעדינות את התאים למעלה ולמטה כמה פעמים כדי להחיה מחדש לפני הוספת טיפה מהם למחקרים מתאימים.

3. דיסוציאציה של תאי שריר חלק וסקולרי (VSM) מדגי זברה בוגרים וצעירים למחקרים אלקטרופיזיולוגיים

  1. מריטת בולבוס עורקי (BA) מרקמות CV באותה גישה כמו שלב 2.1 ואיגרת חמישה BAs בוגרים לתוך צינור צנטריפוגה של 1.5 מ"ל המכיל חיץ S1 (1.5 מ"ל) (טבלה 2). במקרה של דגי זברה צעירים, בריכה עשרה BAs, ועבור זחלים מעל שבועיים, בריכה 30-40 BAs.
    הערה: לא ניתן מבחינה מעשית לבודד תאי VSM מזחלי דגי זברה הצעירים משבועיים.
  2. החלף את S1 ב- 400 μL של חיץ S2 (טבלה 2) ואפשר עיכול פפאין ( ראה טבלת חומרים) של ה- BAs על תרמושייקר ב- 37 °C ו- 800 סל"ד למשך ~ 20 דקות.
  3. אפשרו ל-BAs המעכלים חלקית להתיישב למשך דקה אחת והחליפו את ה-S2 הסופר-נאטנטי ב-500 מיקרו-ליטר של חיץ S3 (טבלה 2) המכיל קולגן. לעכל את הרקמות על תרמושייקר ב-37°C וב-800 סל"ד למשך 3-5 דקות.
  4. סיים את העיכול על ידי סיבוב עדין של הרקמות בצנטריפוגה קטנה (2,000 x גרם בטמפרטורת הסביבה) במשך 3-5 שניות והחלפת S3 סופר-נאטנט ב-500 μL של S1.
  5. יש לטרפד בעדינות את הרקמות הכדוריות (~ 15 פעמים) כדי לפזר תאי VSM ולצלחת על כיסויי זכוכית בגודל המתאים.
    הערה: גודל הכיסוי נקבע על ידי גודל תא ההקלטה של מהדק התיקון, במקרה זה, נעשה שימוש ב- 5 x 5 מ"מ).
    1. יש לשמור את הכיסויים בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות כדי שהתאים יתחברו וישתמשו בהם תוך 6 שעות.

4. בידוד לבבות מדגי זברה עובריים למחקרים אלקטרופיזיולוגיים

  1. הוסיפו טריקיין (150 מ"ג/ליטר; 1 מ"ל לכל צלחת פטרי בגודל 100 מ"מ x 20 מ"מ) ל~300 עוברים (2-5 dpf), שנאספו מתנאי הדגירה שלהם (איור 2A).
    1. רכז את העוברים המורדמים על-ידי העברתם לצינור צנטריפוגה בגודל 5 מ"ל באמצעות פיפטה של העברה, תוך הסרת מדיה עודפת (E3) מצינור הצנטריפוגה (איור 2B).
  2. שטפו את העוברים ב-3 מ"ל של חיץ פרפוזיה קר (PB) פעמיים והחזירו ל-2 מ"ל של PB (איור 2B).
  3. באמצעות מנגנון בידוד הלב העוברי (איור 2C), משכו ~1 מ"ל של העוברים לתוך מחט המזרק ומיד גרשו אותם בחזרה לתוך הצינור. חזרו על התהליך הזה 30 פעמים, בקצב של 1 שניות לכל תנועת מזרק (איור 2C).
  4. מעבירים את העוברים המקוטעים דרך מסננת תאים בקוטר 100 מיקרומטר הממוקמת במשפך ואוספים את הלבבות המסוננים בצינור צנטריפוגה נוסף של 5 מ"ל. שטפו את המזרק עם 1 מ"ל של PB ואספו את השטיפה הזו גם לתוך הצינור דרך המסננת (איור 2C).
  5. מערבבים היטב ונפרדים לצינורות צנטריפוגה של 1.5 מ"ל, כאשר כל צינור מכיל 1 מ"ל של התכולה. צנטריפוגות כל הצינורות על מיני צנטריפוגה ספסל במשך 5 שניות (2,000 x גרם בטמפרטורת הסביבה) ולהשליך את supernatants.
  6. בצע החייאה סדרתית של הכדורים בצינורות באמצעות 1 מ"ל של PB, כלומר, להשעות את הכדור בצינור אחד באמצעות 1 מ"ל של PB ולהשתמש כי החייאה PB כדי להשעות את הכדור בצינור הבא.
  7. מקטרים בעדינות על הלבבות למעלה ולמטה פעמיים לפני שמוסיפים טיפה מהם למחקרים מתאימים.

5. מחקרי הידוק טלאים על תאים קרדיווסקולריים מבודדים

הערה: ניתן להשיג הקלטות של מהדקי טלאי מבפנים החוצה ותאים שלמים מהתאים המבודדים כפי שדווח בעבר עבור זרמי ערוץK ATP בקרדיווסקולטורה9 של דגי זברה.

  1. עבור קרדיומיוציטים בוגרים וצעירים, הוסף את התאים המנותקים (משלב 2) ישירות לתא ההקלטה מההשעיה. עבור תאי VSM, הנח את מכסה המכסה המכיל את תאי ה- VSM המצופים (משלב 3) לתוך תא ההקלטה.
  2. הוסיפו לבבות עובריים שלמים מבודדים (משלב 4) לתא מהתלייה, ובצעו הקלטות של מהדקי טלאים מהמיוציטים האפיקרדיאליים (איור 2D).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

הפרוטוקולים הנ"ל מספקים באופן אמין ושגרתי מספיק מיוציטים לבביים וכלי דם באיכות עקבית מקובלת למחקרי מהדק טלאי כפי שדווח לאחרונה במחקרים מקיפים של תעלות אשלגן רגיש ל-ATP (K ATP) בסוג בר ודגי זברה מוטנטיים קרדיווסקולטוריים9. עקבות מייצגים של הקלטות של פעילות ערוץK ATP כזו מקרדיומיוציטים מבודדים מוצגים באיור 3A-C. במקרה של תאים שבודדו מ-bulbous arteriosus, תאי השריר החלק של כלי הדם אושרו על-ידי ביטוי Tg(tagln:egfp) 11,12 (איור 1). התקבלו הקלטות חד-ערוציות מוצלחות (n = 8 הקלטות מ-N = 5 תכשירים) במדבקות שנכרתו מהלבבות העובריים (איור 3D). פוטנציאל הפעולה נרשם ממיוציטים חדריים ופרוזדורים של דגי זברה בוגרים מבודדים במצב מהדק זרם של תאים שלמים, באמצעות מגבר מהדק טלאי יחד עם דיגיטייזר תואם (ראו טבלת חומרים). פתרון ההקלטה החוץ-תאי למדידות פוטנציאל הפעולה (AP) הכיל NaCl (140 mM), KCl (4 mM), CaCl 2 (1.8 mM), MgCl2 (1 mM), גלוקוז (10 mM), HEPES (10 mM) ו- Blebbistatin (0.01 mM, pH 7.4); תמיסת ההקלטה התוך-תאית הכילה KCl (120 mM), EGTA (5 mM), K 2 ATP (5 mM), MgCl 2 (5 mM) ו-HEPES (10 mM, pH7.2). פיפטות טלאים נשלפו מזכוכית סודה-סיד והיו בעלות עמידות של 3 - 5 MΩ כאשר מולאו בתמיסה תוך תאית. מיוציטים חדריים מפגינים פוטנציאלים יציבים של ממברנה היפר-קוטבית, ופוטנציאלי פעולה מגורה באמצעות הזרקת זרם דרך פיפטה הטלאי (איור 3E), בעוד שמיוציטים פרוזדורים הפגינו פוטנציאל פעולה ספונטני (איור 3F). מאפיינים פוטנציאליים של פעולה מסוכמים בטבלה 3.

Figure 1
איור 1: בידוד של תאי פרוזדורים, חדרי ובולבוסים עורקיים. סכמטי כדי להמחיש את הבידוד של תאי פרוזדורים (A), חדריים (B) ובולבוסים עורקיים (C). התמונות המתארות כל סוג תא מבודד (למטה) כוללות פסי קנה מידה = 50 מיקרומטר בכל מקרה. תאי BA שבודדו מתאי שריר חלקים מהונדסים קווי דגי זברה (Tg(tagln:egfp)11,12) חיוביים לפלואורסצנציה ירוקה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 2
איור 2: סכמטי כדי להמחיש את הבידוד של לבבות עובריים. (A) עוברים מופרים מוסרים ממיכל הרבייה ומונחים בצלחת פטרי המכילה מים E3 ונשמרים בטמפרטורה של 28 מעלות צלזיוס עד 5 ימים. (B) בגיל הרצוי, העוברים מורדמים באתרם באמצעות טריקיין ומועברים ל-PB בצינורות צנטריפוגה של 5 מ"ל לצורך דיסוציאציה. (C) מנגנון בידוד לב עוברי מורכב ממזרק של 10 מ"ל המחובר למחט 19 G המורכבת מעל צינור הדיסוציאציה על מעמד ספסל, ומאפשרת לידיים לבצע את הטריטורציה. (D) תמונה של הלב המבודד (יום 4) מחובר לפיפטה מהדקת טלאי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 3
איור 3: הקלטות מייצגות של מהדקי טלאים מרקמות לב וכלי דם של דגי זברה מבודדים . (A, B) ערוצי K ATP רגישיםל-ATP מהקלטות של קרדיומיוציטים פרוזדורים (A) וחדריים (B) שבודדו מדגי זברה בוגרים. (C) מוליכות ערוץK ATP נרשמה מהידוק טלאי שלם של תאי VSM שבודדו מדגי זברה בוגרים. (D) פעילות ערוץ K+ יחיד במדבקות ממברנה שנכרתו מלבבות עובריים של דגי זברה (4 dpf). כל הקלטות המדבקות שנכרתו נעשו עם 140 mM KCl משני צידי הממברנה, בפוטנציאל ממברנה של -50 mV. זרמים של תאים שלמים נרשמו כאשר פוטנציאל הממברנה מהודק ב -70 mV. (E) דוגמה לרישום מהדק זרם ממיוציט חדרי מבודד. פוטנציאל הפעולה היה מגורה על ידי הזריקה הנוכחית כפי שמוצג להלן. (F) דוגמה להקלטת מהדק זרם ממיוציט פרוזדורים מבודד המציגה פוטנציאל פעולה ספונטני של ירי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

מאגר פרפוזיה (PB) 10 מ"מ HEPES, טאורין 30 מ', 5.5 מ' גלוקוז, 10 מ' BDM. הפוך את התמיסה במי מלח נאגרים בפוספט (PBS), התאם את ה- pH ל- 7.4
חיץ עיכול (DB) PB + 12.5 μM CaCl2 + 5 מ"ג/מ"ל Col II + 5 מ"ג/מ"ל Col IV + 5 ננוגרם/מ"ל אינסולין
מאגר עצירה (SB) PB + 10% FBS + 12.5 μM CaCl2 + 10 מ"ג/מ"ל BSA + 5 ננוגרם/מ"ל אינסולין

טבלה 1: פתרונות לבידוד של קרדיומיוציטים של דגי זברה.

מאגר S1 0.1% BSA (w/v), 145 mM NaCl, 4 mM KCl, 10 mM HEPES, 10 mM גלוקוז, 0.05 mM CaCl 2, 1 mM MgCl2, מותאם ל- pH 7.4 באמצעות NaOH
מאגר S2 2 מ"ל S1, 4 מ"ג פפאין, 2 מ"ג DTT
מאגר S3 2 מ"ל S1, 3 מ"ג קולגן מסוג H, 2 מ"ג מעכב טריפסין, 1 מ"ג אלסטאז

טבלה 2: פתרונות לבידוד תאי VSM של דגי זברה.

מיוציטים חדריים (n = 3 הקלטות)
Vm (mV) APA (mV) APD50 (מילישנייה)
-75.7 ± 3.9 -119.6 ± 3.8 329 ± 163
מיוציטים פרוזדורים (n = 3 הקלטות)
תעריף AP (מינימום-1) MDP (mV) APA (mV) APD50 (מילישנייה)
107.3 ± 32.6 -71.2 ± 5.1 98.4 ± 4.7 141 ± 12

טבלה 3: תכונות פוטנציאליות פעולה של קרדיומיוציטים של דגי זברה מבודדים. הוקלט במצב מהדק נוכחי. הנתונים המוצגים כממוצע ± S.D. Vm = פוטנציאל הממברנה; APA = משרעת פוטנציאל פעולה; APD50 = משך פוטנציאל הפעולה ל-50% רפולריזציה; MDP = פוטנציאל דיאסטולי מקסימלי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

שיטות קודמות לבידוד מיוציטים חדריים של דגי זברה5,6, שמטרתן ליצור מיוציטים למחקרים תרבית או אלקטרופיזיולוגיים, סיפקו תאים בעלי תפוקה נמוכה יותר וכללו שלבים ארוכים של צנטריפוגות מרובות שהשפיעו לרעה על איכות התאים ועל כדאיותם. הפרוטוקולים המתוארים כאן אמינים, מכסים כל אחת מרקמות הלב וכלי הדם המשמעותיות (חדר, אטריה ו- VSM), וחשוב מכך הם מעשיים למדי לבידוד חריף של תאים חיים. גישות בידוד הכוללות קנולציה של החדר באמצעות BA13 יכולות להיות חלופה מתוחכמת לקרדיומיוציטים חדריים, אך דורשות רמה גבוהה יותר של מיומנות ועלולות להשפיע לרעה על בידוד פרוזדורים. הגישה המפורטת בפרוטוקול הנוכחי מספקת חלופה פשוטה ויעילה.

שיקולים נוספים לבידוד רקמות לב זחליות הם: (1) בשלב 1.4, בהתאם לגיל הדג ולהגדלה הזמינה, הרקמות עשויות להיות גלויות לעין עוד לפני הסרת שרירי החזה, ובמקרה כזה ניתן "למרוט" את הרקמות ישירות מהדג ללא ניתוח מקדים, ואז ניתן להסיר את הרקמות שאינן CV באמצעות מלקחיים דקים; (2) בשלב 2.2, עבור זחלים מתחת לגיל 14 יום, הלבבות יכולים לשמש ישירות למחקרים אלקטרופיזיולוגיים ללא צורך בדיסוציאציה אנזימטית.

כפי שצוין לעיל, ובדרך כלל נכון לגבי שיטות דיסוציאציה אנזימטיות באופן כללי, הוכח כחשוב להשתמש במאגרים ואנזימים טריים בכל פעם. עם זאת, ניתן להכין מראש מאגר פרפוזיה (PB) ומאגר S1 ולאחסן אותם בטמפרטורה של 4-8 מעלות צלזיוס למשך חודש אחד.

זמן בידוד רקמות מוצלח לא יעלה על ~ 90 שניות לדג, ואין לחשוף רקמות לאוויר. כאשר דיסוציאציה נמשכת זמן רב יותר, איכות התאים (כלומר הישרדות) מופחתת. כאשר triturating רקמות, יש לנקוט בזהירות כדי למנוע יצירת בועות אוויר, אשר גם מפחית את איכות התא. בידוד תאי VSM רגיש לעיכול על ידי קולגןאז במאגר S3. לאחר 3 הדקות הראשונות של העיכול, יש להוציא את הצינור מהתרמושייקר בכל דקה ולבדוק אם יש רקמות מורחבות ושקופות צפות. ברגע שפיצול הרקמות נראה לעין, יש להפסיק את שלב העיכול.

חשוב לציין כי פרוטוקולים אלה אינם מותאמים באופן נרחב לבידוד קרדיומיוציטים עמידים לסידן, כפי שיידרש במחקרי התכווצות. עם זאת, כפי שמוצג, הקלטה אמינה של פוטנציאל פעולה cardiomyocyte ניתן להשיג בנוכחות ריכוזי סידן חוץ תאיים פיזיולוגיים 7,14. Blebbistatin, שנכלל כדי לנתק עירור והתכווצות, ולשפר את היווצרות כלבי הים של giga-Ohm ואת יעילות ההקלטה בניסויים אלה, הוכח בעבר כלא משפיע באופן משמעותי על פרמטרי AP בלבבות דגי זברהשלמים 14. עבור אלקטרופיזיולוגיה, התפוקה המוחלטת של תאים גם אינה מגבילה קצב באופן שגרתי. פרוטוקול זה לא עבר אופטימיזציה לתשואה, כפי שעשוי להיות נחוץ למחקרים ביוכימיים של תאים מבודדים. ובכל זאת, התשואה שהושגה בשיטות אלה מתאימה היטב למחקרים אלקטרופיזיולוגיים וככל הנראה לגישות רבות אחרות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי מענקי NIH HL140024 ל- CGN ו- HL150277 ל- CMC. איור 1 ואיור 2 נוצרו עם BioRender.com.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL Centrifuge Tubes Eppendorf 22364111
10 mL Syringe Fisher Scientific 14-955-459
19 Guage Needle BD 305187
2,3-Butanedione Monoxime (BDM) Sigma-Aldrich B0753
5 mL Centrifuge Tubes Sigma-Aldrich EP0030119479 For embryonic heart isolation
Axopatch 200B amplifier and Digidata 1200 digitizer Molecular Devices Used for action potential recordings
Benchtop Mini Centrifuge Southern Labware MLX-106
Blebbistatin Sigma-Aldrich 203390
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A9418
Calcium Chloride Sigma-Aldrich C4901
Cell-Strainer Sieve Cole-Parmer EW-06336-71 100 μm sieve for embryonic heart isolation
Collagenase Type H Sigma-Aldrich C8051
Collagenase Type II Worthington LS004176
Collagenase Type IV Worthington LS004188
Curved Forceps Fisher Scientific 16-100-110
DTT Sigma-Aldrich D0632
EGTA Sigma-Aldrich 324626
Elastase Worthington LS003118
Fetal Bovine Serum (FBS) Sigma-Aldrich F2442
Fine Forceps Dumont Style #5 Ceramic-coated forceps for adult and juvenile CV tissue isolation (Need two)
Glucose Sigma-Aldrich G8270
HEPES Sigma-Aldrich H3375
Insulin Sigma-Aldrich I2643
K2ATP Sigma-Aldrich A8937
Large Petri Dish Sigma-Aldrich P5981 For dissociation
Magnesium Chloride Sigma-Aldrich M8266
Micro-Hematocrit Capillary Tubes Kimble Chase 41A2502 Soda lime glass for patch pipettes
Papain Worthington LS003118
Pasteur Pipettes Fisher Scientific 13-678-6A
Petri Dish Sigma-Aldrich P5606 100 mm x 20 mm, for embryonic heart isolation
Phosphate-Buffered Saline (PBS) Sigma-Aldrich 806552
Potassium Chloride Sigma-Aldrich P3911
Scissors Fine Science Tools 14090-09 For adult and juvenile zebrafish decapitation
Sodium Chloride Sigma-Aldrich S9888
Sodium Hydroxide Sigma-Aldrich S8045
Super Fine Forceps Dumont Style #SF For isolating larval CV tissues (Need two)
Taurine Sigma-Aldrich T0625
Thermoshaker ThermoFisher Scientific 13687711
Tricaine Methanesulfonate (MS222) For anaesthetizing zebrafish larvae
Trypsin Inhibitor Sigma-Aldrich T6522

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vascotto, S. G., Beckham, Y., Kelly, G. M. The zebrafish's swim to fame as an experimental model in biology. Biochemistry and Cell Biology. 75 (5), 479-485 (1997).
  2. Love, D. R., Pichler, F. B., Dodd, A., Copp, B. R., Greenwood, D. R. Technology for high-throughput screens: The present and future using zebrafish. Current Opinion in Biotechnology. 15 (6), 564-571 (2004).
  3. Keßler, M., Rottbauer, W., Just, S. Recent progress in the use of zebrafish for novel cardiac drug discovery. Expert Opinion on Drug Discovery. 10 (11), 1231-1241 (2015).
  4. Singleman, C., Holtzman, N. G. Heart dissection in larval, juvenile and adult zebrafish, Danio rerio. Journal of Visualized Experiments. (55), e3165 (2011).
  5. Brette, F., et al. Characterization of isolated ventricular myocytes from adult zebrafish (Danio rerio). Biochemical and Biophysical Research Communications. 374 (1), 143-146 (2008).
  6. Sander, V., Sune, G., Jopling, C., Morera, C., Izpisua Belmonte, J. C. Isolation and in vitro culture of primary cardiomyocytes from adult zebrafish hearts. Nature protocol. 8, 800-809 (2013).
  7. Nemtsas, P., Wettwer, E., Christ, T., Weidinger, G., Ravens, U. Adult zebrafish heart as a model for human heart? An electrophysiological study. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 48 (1), 161-171 (2010).
  8. Huang, Y., et al. Cardiovascular consequences of KATP overactivity in Cantu syndrome. JCI insight. 3 (15), 137799 (2018).
  9. Singareddy, S. S., et al. ATP-sensitive potassium channels in zebrafish cardiac and vascular smooth muscle. The Journal of Physiology. , (2021).
  10. Burns, C. G., MacRae, C. A. Purification of hearts from zebrafish embryos. BioTechniques. 40 (3), 274-282 (2006).
  11. Seiler, C., Abrams, J., Pack, M. Characterization of zebrafish intestinal smooth muscle development using a novel sm22α-b promoter. Developmental Dynamics. 239, 2806-2812 (2010).
  12. Yang, X. Y., et al. Whole amount in situ hybridization and transgene via microinjection in zebrafish. Shi Yan Sheng Wu Xue Bao. 36 (3), 243-247 (2003).
  13. Kompella, S. N., Brette, F., Hancox, J. C., Shiels, H. A. Phenanthrene impacts zebrafish cardiomyocyte excitability by inhibiting IKr and shortening action potential duration. The Journal of General Physiology. 153 (2), 202012733 (2021).
  14. Jou, C. J., Spitzer, K. W., Tristani-Firouzi, M. Blebbistatin effectively uncouples the excitation-contraction process in zebrafish embryonic heart. Cellular Physiology and Biochemistry. 25 (4-5), 419-424 (2010).

Tags

ביולוגיה גיליון 180
בידוד תאי שריר חלק לבביים וכלי דם מדגי זברה בוגרים, צעירים, זחליים ועובריים למחקרים אלקטרופיזיולוגיים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Singareddy, S. S., McClenaghan, C.,More

Singareddy, S. S., McClenaghan, C., Roessler, H. I., Tryon, R., Nichols, C. G. Isolation of Cardiac and Vascular Smooth Muscle Cells from Adult, Juvenile, Larval and Embryonic Zebrafish for Electrophysiological Studies. J. Vis. Exp. (180), e63225, doi:10.3791/63225 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter