Summary
본 프로토콜은 전기생리학적 연구에 적합한 성체, 청소년, 유충 및 배아 제브라피쉬(Danio rerio)로부터 생존가능한 심장 및 혈관 평활근 세포의 급성 단리를 기술한다.
Abstract
제브라피쉬는 오랫동안 심혈관 연구에서 모델 척추동물 유기체로 사용되어 왔습니다. 제브라 피쉬 심혈관 조직에서 개별 세포를 분리하는 기술적 어려움은 전기 생리 학적 특성을 연구하는 데 제한적이었습니다. 이전의 방법은 제브라 피쉬 심장의 해부와 심실 심장 근육 세포의 분리에 대해 설명되었습니다. 그러나, 전기 생리 학적 특성화를위한 제브라 피쉬 심방 및 혈관 근육 세포의 분리는 상세하지 않았다. 이 연구는 패치 클램프 실험에 적합한 구근 동맥의 혈관 평활근 (VSM) 세포뿐만 아니라 분리 된 청소년 및 성인 제브라 피쉬 심실 및 심방 심근 세포를 일상적으로 제공하는 새롭고 수정 된 효소 프로토콜을 설명합니다. 배아 및 애벌레 발달 단계에서 분리 된 제브라 피쉬 심혈관 조직에 대한 전기 생리 학적 연구에 대한 문헌적 증거는 없습니다. 유충 및 배아 심장의 개별 세포에 대한 패치 클램프 실험을 허용하는 부분 해리 기술이 시연됩니다.
Introduction
제브라피쉬는 오랫동안 모델 척추동물 유기체1로 사용되어 왔으며 최근에는 유전자 및 약물 2,3의 고처리량 스크리닝을 위한 실행 가능한 척추동물 시스템으로 두각을 나타내고 있는 작은 텔레오스트 물고기입니다. 그러나 제브라 피쉬 조직의 생리 학적 분석은 잘 발달되어 있지 않습니다. 심장 혈관계에서 제브라 피쉬 심장4의 해부와 심실 심장 근육 세포의 분리 5,6,7에 대한 방법이 설명되었습니다. 심방 근육 세포의 효과적인 분리에 대한 자세한 설명은 거의 없으며 패치 클램프 연구를위한 혈관 평활근 (VSM) 준비에 대한보고는 없습니다.
현재의 연구는 전기 생리 학적 및 기능적 연구에 적합한 제브라 피쉬 심장 및 혈관 근육 세포의 분리 방법론을 설명합니다. 이 접근법은 제브라피쉬 심실 근세포 분리 5,6에 대해 이전에 보고된 프로토콜의 수정을 포함하고 포유류 VSM 세포 분리8의 방법을 적용하여 구근 동맥(BA)에서 제브라피쉬 혈관 평활근 세포를 분리할 수 있습니다. 이 프로토콜은 최대 8 h9 동안 패치 클램프 연구에 안정적으로 사용할 수있는 제브라 피쉬에서 분리 된 심방, 심실 및 VSM 세포의 효율적인 수율을 제공합니다.
부모 유기체 외부에서 완전히 발달하는 거의 투명한 유충에도 불구하고 심혈관 발달을 연구하는 데있어 약속 된 개체 유전 학적 잠재력을 탐구하는 것은 어린 나이에 조직을 추출하고 분석하는 데 어려움을 겪었습니다. 현재 기사는 적응되고 발표 된 추출 방법10을 사용하여 수정 후 3 일 (dpf)에 분리 된 제브라 피쉬 심장에 대한 패치 클램프 실험을 시연함으로써 이러한 한계를 해결합니다.
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Protocol
모든 제브라피쉬(야생형 균주 AB, 수컷과 암컷 모두)는 워싱턴 대학교 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)의 지침에 따라 실험을 위해 사육, 유지 및 처리되었습니다.
1. 성체, 청소년 및 유충 제브라 피쉬에서 심방, 심실 및 구근 동맥의 분리
- 냉 충격, 즉 4°C의 물에 ~10초 동안 담가 물고기를 안락사시킵니다.
- 구부러진 집게를 사용하여 생선을 관류 완충액(PB)(표 1)으로 부분적으로 채워진 큰 페트리 접시에 옮기고 해부 현미경 아래에 놓습니다.
- 가위를 사용하여 눈 바로 뒤쪽의 물고기를 참수하십시오.
- 구부러진 집게 (애벌레 물고기를위한 미세한 집게)를 사용하여 복부 쪽이 해부 범위를 향하도록 비 지배적 인 손에 물고기를 잡습니다. 두 번째 미세한 집게(유충 물고기의 경우 극세)를 주로 손에 들고 가슴 근육과 지느러미를 부드럽게 찢어 심혈관 조직(심방, 심실 및 구근 동맥, BA)을 드러냅니다(그림 1).
- 지배적 인 손에 미세한 집게를 놓고 BA와 복부 대동맥의 교차 끝에서 BA를 부드럽게 당깁니다.
알림: BA와 심장은 체강에서 나옵니다.- 집게를 꼬집고 여러 정맥 가지가 수렴하는 심방 끝 부분 (부비동 정맥)을 찾아 BA를 대동맥에서 조심스럽게 분리하십시오. 가는 집게를 사용하여 부비동 정맥에서 심방 끝을 '뽑아'냅니다. 이것은 CV 조직을 신체의 나머지 부분과 분리합니다 (그림 1).
2. 전기 생리 학적 연구를위한 성체, 청소년 및 유충 제브라 피쉬의 심근 세포 해리
- 가는 집게를 사용하여 이전 단계에서 분리된 CV 조직에서 심방과 심실을 '뽑아냅니다'.
알림: 이 과정을 통해 교차 오염을 최소화하면서 각 조직을 깨끗하게 해부할 수 있으며 나무에서 과일을 따는 것과 같은 느낌을 줍니다.- 미세한 집게를 사용하여 심실을 부드럽게 찢어 과도한 혈액을 배출하면 심장 조직이 밝은 빨간색에서 옅은 연어 색으로 변할 때 보장 할 수 있습니다.
- 분리된 아트리움과 심실을 관류 완충액(PB; 1.5mL)이 포함된 별도의 1.5mL 원심분리 튜브에 모읍니다.
참고: 성인 제브라피쉬 심방 심근 세포(ACM)와 심실 심근 세포(VCM)의 성공적인 해리를 보장하려면 일반적으로 4개의 심방과 3개의 심실이 필요합니다. 청소년 제브라 피쉬 (28-90 일)의 경우이 숫자는 두 배가됩니다.- 애벌레 제브라 피쉬 (14-28 일)의 경우 ~ 30 마리의 유충에서 가능한 한 많은 조직을 수집하십시오.
- 튜브의 PB를 각각 750μL의 분해 완충액(DB)(표 1)으로 교체하고 튜브를 37°C 및 800rpm의 열쉐이커에 놓습니다. 조직이 반투명해질 때까지 소화를 허용합니다 (심방의 경우 ~ 30 분, 심실의 경우 ~ 40 분).
- 벤치탑 미니 원심분리기(주변 온도에서 2,000 x g )에서 3-5초 동안 조직을 부드럽게 회전시켜 소화를 종료하고 상청액 DB를 각각 750μL의 정지 완충액(SB)으로 교체합니다(표 1).
참고: 이 원심분리 단계는 VCM 절연의 경우 선택 사항입니다. - 펠렛 조직을 SB의 주변 온도에서 15분 동안 배양합니다.
- SB를 각각 500-750μL의 PB로 부드럽게 교체하고(최종 세포의 원하는 밀도에 따라 다름) 화염 광택 파스퇴르 피펫을 사용하여 조직을 분쇄하여(~30배) 세포를 분산시킵니다.
참고: 심근세포(CM)는 이제 전기생리학적 연구를 위한 준비가 되었으며 실온에서 최대 8시간 동안 보관됩니다. - 균일한 샘플링을 위해 세포를 위아래로 부드럽게 몇 번 피펫팅하여 다시 부유시킨 후 해당 연구를 위해 한 방울 추가합니다.
3. 전기생리학적 연구를 위한 성체 및 청소년 제브라피쉬의 혈관 평활근(VSM) 세포 해리
- 단계 2.1과 동일한 접근법을 사용하여 CV 조직에서 구근 동맥(BA)을 뽑고 5개의 성인 BA를 S1 완충액(1.5mL)이 포함된 1.5mL 원심분리 튜브에 풀링합니다(표 2). 어린 제브라 피쉬의 경우 10 개의 BA를 풀링하고 2 주 이상 된 유충의 경우 30-40 BA를 풀링합니다.
참고 : 2 주 미만의 제브라 피쉬 유충에서 VSM 세포를 분리하는 것은 실질적으로 불가능합니다. - S1을 400μL의 S2 버퍼(표 2)로 교체하고 37°C 및 800rpm의 열쉐이커에서 ~20분 동안 BA의 파파인( 재료 표 참조) 분해를 허용합니다.
- 부분적으로 소화된 BA를 1분 동안 가라앉히고 상청액 S2를 콜라게나제가 함유된 S3 완충액(표 2) 500μL로 교체합니다. 37°C 및 800rpm의 열쉐이커에서 3-5분 동안 조직을 소화합니다.
- 벤치탑 미니 원심분리기(주변 온도에서 2,000 x g )에서 조직을 3-5초 동안 부드럽게 회전시키고 상청액 S3를 500μL의 S1로 교체하여 소화를 종료합니다.
- 펠렛 조직을 부드럽게 분쇄하여(~15배) VSM 세포를 분산시키고 적절한 크기의 유리 커버슬립에 플레이트합니다.
알림: 커버슬립 크기는 패치 클램프 기록 챔버의 크기에 따라 결정됩니다(이 경우 5 x 5mm가 사용됨).- 커버슬립을 실온에서 30분 동안 보관하여 셀이 부착되어 다음 6시간 이내에 사용할 수 있도록 합니다.
4. 전기 생리 학적 연구를위한 배아 제브라 피쉬에서 심장 분리
- 배양 조건에서 수집한 ~300개의 배아(2-5dpf)에 트리카인(150mg/L, 100mm x 20mm 페트리 접시당 1ml)을 추가합니다(그림 2A).
- 이송 피펫을 사용하여 마취된 배아를 5mL 원심분리 튜브로 옮겨 농축하고 원심분리 튜브에서 과도한 배지(E3)를 제거합니다(그림 2B).
- 3mL의 저온 관류 완충액(PB)으로 배아를 두 번 세척하고 2mL의 PB에 재현탁합니다(그림 2B).
- 배아 심장 격리 장치(그림 2C)를 사용하여 ~1mL의 배아를 주사기 바늘에 넣고 즉시 튜브로 다시 배출합니다. 주사기 동작당 1초의 속도로 이 과정을 30회 반복합니다(그림 2C).
- 단편화된 배아를 깔때기에 놓인 100μm 세포 여과기 체를 통과시키고 여과된 심장을 다른 5mL 원심분리 튜브에 수집합니다. 1mL의 PB로 주사기를 헹구고 이 헹굼도 체를 통해 튜브에 모읍니다(그림 2C).
- 잘 섞어 1.5mL 원심분리 튜브로 분리하고 각 튜브에 내용물 1mL가 들어 있습니다. 벤치탑 미니 원심분리기의 모든 튜브를 5초(주변 온도에서 2,000 x g ) 동안 원심분리하고 상층액을 폐기합니다.
- 1mL의 PB를 사용하여 튜브에서 펠릿의 연속 재현탁을 수행, 즉 1mL의 PB를 사용하여 한 튜브에 펠릿을 재현탁하고 그 재현탁된 PB를 사용하여 다음 튜브에 펠릿을 재현탁합니다.
- 해당 연구를 위해 하트를 한 방울 추가하기 전에 하트를 위아래로 부드럽게 두 번 피펫팅합니다.
5. 분리된 심혈관 세포에 대한 패치 클램프 연구
참고: 분리된 세포의 내부 외부 및 전체 세포 패치 클램프 기록은 제브라피쉬 심혈관계9의 KATP 채널 전류에 대해 이전에 보고된 대로 얻을 수 있습니다.
- 성인 및 청소년 심근 세포의 경우, 해리 된 세포 (2 단계에서)를 현탁액에서 기록 챔버에 직접 추가하십시오. VSM 셀의 경우 도금된 VSM 셀(3단계)이 포함된 커버슬립을 기록 챔버에 넣습니다.
- 분리된 온전한 배아 심장(4단계에서)을 현탁액에서 챔버에 추가하고 심외막 근세포에서 패치 클램프 기록을 만듭니다(그림 2D).
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Representative Results
상기 프로토콜은 야생형 및 돌연변이 제브라피쉬 심혈관구조에서 ATP 민감성 칼륨(KATP) 채널에 대한 광범위한 연구에서 최근에 보고된 바와 같이 패치 클램프 연구에 적합한 일관된 품질의 충분한 심장 및 혈관 근세포를 안정적이고 일상적으로 제공합니다9. 단리된 심근세포로부터의 이러한K ATP 채널 활성의 기록의 대표적인 흔적이 도 3A-C에 도시되어 있다. 구근 동맥으로부터 분리된 세포의 경우, 혈관 평활근 세포를 Tg(tagln:egfp) 발현11,12로 확인하였다(도 1). 성공적인 단일 채널 기록은 배아 심장에서 적출 된 패치에서 얻어졌다 (N = 5 제제에서 n = 8 녹음). 활동 전위는 분리 된 성인 제브라 피쉬 심실 및 심방 근육 세포에서 호환 가능한 디지타이저와 함께 패치 클램프 증폭기를 사용하여 전체 세포, 전류 클램프 모드에서 기록되었습니다 (재료 표 참조). 활동 전위 (AP) 측정을 위한 세포외 기록 용액은 NaCl (140 mM), KCl (4 mM), CaCl2 (1.8 mM),MgCl2 (1 mM), 포도당 (10 mM), 헤페스 (10 mM), 및 블레비스타틴 (0.01 mM, pH 7.4); 세포내 기록 용액은 KCl (120 mM), EGTA (5 mM), K2 ATP (5 mM),MgCl2(5 mM), 및 hepes (10 mM, pH 7.2)를 함유하였다. 패치 피펫은 소다 석회 유리에서 추출되었으며 세포 내 용액으로 채워질 때 3-5MΩ의 저항을 가졌습니다. 심실 근세포는 안정적인 과분극 막 전위를 나타내며 패치 피펫을 통한 전류 주입을 통해 활동 전위가 자극된 반면(그림 3E), 심방 근세포는 자발적인 활동 전위 발화를 나타냈습니다(그림 3F). 활동 전위 속성은 표 3에 요약되어 있습니다.
그림 1: 심방, 심실 및 구근 동맥 세포의 분리. 심방 (A), 심실 (B) 및 구근 동맥 (C) 세포의 분리를 설명하기위한 개략도. 분리된 각 세포 유형(하단)을 묘사한 이미지는 각 경우에 스케일 바 = 50μm입니다. 평활근 세포 형질전환 리포터 제브라피쉬 라인(Tg(tagln:egfp)11,12)으로부터 분리된 BA 세포는 녹색 형광에 대해 양성이다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 배아 심장의 분리를 설명하는 개략도. (A) 수정 된 배아를 사육 탱크에서 꺼내어 E3 물이 들어있는 페트리 접시에 넣고 최대 5 일 동안 28 ° C에서 유지합니다. (B) 원하는 나이에 배아는 트리카인을 사용하여 현장에서 마취되고 해리를 위해 5mL 원심분리 튜브에서 PB로 옮겨집니다. (C) 배아 심장 격리 장치는 벤치 스탠드의 해리 튜브 위에 장착 된 19G 바늘에 부착 된 10mL 주사기로 구성되어 손이 분쇄를 수행 할 수 있습니다. (D) 패치 클램프 피펫에 부착 된 분리 된 심장 (4 일째)의 이미지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 분리된 제브라피쉬 심혈관 조직의 대표적인 패치 클램프 기록. (A, B) 성인 제브라 피쉬에서 분리 된 심방 (A) 및 심실 (B) 심근 세포의 내부 절제 패치 클램프 기록에서 ATP 민감성 KATP 채널. (c) KATP 채널 전도도는 성체 제브라피쉬로부터 분리된 VSM 세포의 전체 세포 패치 클램핑으로부터 기록되었다. (D) 제브라 피쉬 배아 심장에서 절제 된 막 패치의 단일 K + 채널 활성 (4 dpf). 모든 절제된 패치 기록은 -50mV 막 전위에서 막의 양쪽에 140mM KCl로 이루어졌다. 전체 세포 전류는 막 전위가 -70 mV에서 클램핑된 상태에서 기록되었습니다. (E) 단리된 심실 근세포로부터의 전류-클램프 기록의 예. 활동 전위는 아래와 같이 전류 주입에 의해 자극되었습니다. (f) 자발적 활동 전위 발화를 보여주는 분리된 심방 근세포로부터의 전류-클램프 기록의 예. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 관류 버퍼 (PB) | 10 mM 헤페스, 30 mM 타우린, 5.5 mM 포도당, 10 mM BDM. 인산염 완충 식염수(PBS)에 용액을 만들고 pH를 7.4로 조정합니다. | ||
| 소화 완충액(DB) | PB + 12.5 μM CaCl2 + 5 밀리그램 / mL 콜 II + 5 밀리그램 / mL 콜 IV + 5 응 / mL 인슐린 | ||
| 버퍼 중지 (SB) | PB + 10 % FBS + 12.5 μM CaCl2 + 10 mg / ml BSA + 5 ng / mL 인슐린 | ||
표 1 : 제브라 피쉬 심근 세포의 분리를위한 용액.
| S1 버퍼 | 0.1 % BSA (w / v), 145 mM NaCl, 4 mM KCl, 10 mM HEPES, 10 mM 포도당, 0.05 mM CaCl2, 1 mMMgCl2, NaOH를 사용하여 pH 7.4로 조정 | ||
| S2 버퍼 | 2 mL S1, 4 mg 파파인, 2 mg DTT | ||
| S3 버퍼 | 2 mL S1, 3 mg 콜라게나제 유형 H, 2 mg 트립신 억제제, 1 mg 엘라스타제 | ||
표 2: 제브라피쉬 VSM 세포의 분리를 위한 솔루션.
| 심실 근육 세포 (n = 3 기록) | |||
| 브이엠 (mV) | APA (mV) | APD50 (밀리초) | |
| -75.7 ± 3.9 | -119.6 ± 3.8 | 329 ± 163 | |
| 심방 근육 세포 (n = 3 기록) | |||
| 철갑탄 속도(최소-1) | 민주노총 (mV) | APA (mV) | APD50 (밀리초) |
| 107.3 ± 32.6 | -71.2 ± 5.1 | 98.4 ± 4.7 | 141 ± 12 |
표 3 : 분리 된 제브라 피쉬 심근 세포의 활동 전위 특성. 전류 클램프 모드에서 기록됩니다. 평균으로 표시된 데이터 ± S.D. Vm = 막 전위; APA = 활동 전위 진폭; APD50 = 50 % 재분극에 대한 활동 전위 지속 시간; MDP = 최대 이완기 잠재력.
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Discussion
배양 또는 전기 생리 학적 연구를 위해 근육 세포를 생성하는 것을 목표로하는 제브라 피쉬 심실 근육 세포 5,6을 분리하기위한 이전 방법은 낮은 수율의 세포를 제공하고 세포 품질 및 생존력에 악영향을 미치는 다중 원심 분리의 긴 단계를 포함했습니다. 여기에 설명 된 프로토콜은 신뢰할 수 있으며 중요한 심혈관 조직 (심실, 심방 및 VSM) 각각을 다루며 중요한 것은 살아있는 세포의 급성 분리에 매우 실용적입니다. BA13을 통한 심실의 캐뉼레이션을 포함하는 분리 접근법은 심실 심근 세포에 대한 정교한 대안이 될 수 있지만 더 높은 수준의 손재주가 필요하며 심방 분리에 부정적인 영향을 미칠 수 있습니다. 현재 프로토콜에 자세히 설명된 접근 방식은 간단하고 효율적인 대안을 제공합니다.
유충 심장 조직 분리에 대한 추가 고려 사항은 다음과 같습니다 : (1) 1.4 단계에서, 물고기의 나이와 사용 가능한 배율에 따라, 가슴 근육을 제거하기 전에도 조직이 보일 수 있습니다.이 경우 조직은 사전 수술없이 물고기에서 직접 "뽑아낼"수 있으며, CV가 아닌 조직은 초 미세 집게를 사용하여 제거 할 수 있습니다. (2) 2.2 단계에서 14 일 미만의 유충의 경우 효소 해리없이 전기 생리 학적 연구에 심장을 직접 사용할 수 있습니다.
위에서 언급한 바와 같이, 일반적으로 효소 해리 방법의 경우, 매번 새로운 완충액과 효소를 사용하는 것이 중요하다는 것이 입증되었습니다. 그러나 관류 완충액(PB) 및 S1 완충액은 미리 준비하여 4-8°C에서 1개월 동안 보관할 수 있습니다.
성공적인 조직 분리 시간은 물고기 당 ~ 90 초를 초과해서는 안되며 조직은 공기에 노출되어서는 안됩니다. 해리가 오래 걸리면 세포 품질 (즉, 생존)이 감소합니다. 조직을 분쇄 할 때 기포가 발생하지 않도록주의해야하며 이는 또한 세포 품질을 저하시킵니다. VSM 세포 분리는 S3 완충액에서 콜라게나제에 의한 소화에 민감하다. 소화의 처음 3 분 후에, 튜브는 매 분마다 열 쉐이커에서 꺼내어 부유 확장 및 반투명 조직을 검사해야합니다. 조직 단편화가 명백해지면 소화 단계를 중단해야 합니다.
이러한 프로토콜은 수축성 연구에 필요한 것처럼 칼슘 내성 심근 세포를 분리하는 데 광범위하게 최적화되지 않았다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 그러나, 도시된 바와 같이, 심근 세포 활동 전위의 신뢰성있는 기록은 생리 학적 세포 외 칼슘 농도 7,14의 존재 하에서 달성 될 수있다. 여기 및 수축을 분리하고 이러한 실험에서 기가-옴 밀봉 형성 및 기록 효율을 개선하기 위해 포함된 블레비스타틴은 이전에 손상되지 않은 제브라피쉬 하트14에서 AP 매개변수에 유의한 영향을 미치지 않는 것으로 나타났습니다. 전기 생리학의 경우, 세포의 절대 수율도 일상적으로 속도를 제한하지 않습니다. 이 프로토콜은 분리된 세포의 생화학적 연구에 필요할 수 있는 수율에 최적화되지 않았습니다. 그럼에도 불구하고 이러한 방법으로 달성 한 수율은 전기 생리 학적 연구 및 여러 다른 접근법에 적합합니다.
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Disclosures
저자는 경쟁하는 재정적 이익이 없다고 선언합니다.
Acknowledgments
이 작업은 CGN에 대한 NIH 보조금 HL140024 및 CMC에 HL150277에 의해 지원되었습니다. 그림 1과 그림 2는 BioRender.com 로 만들어졌습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL Centrifuge Tubes | Eppendorf | 22364111 | |
| 10 mL Syringe | Fisher Scientific | 14-955-459 | |
| 19 Guage Needle | BD | 305187 | |
| 2,3-Butanedione Monoxime (BDM) | Sigma-Aldrich | B0753 | |
| 5 mL Centrifuge Tubes | Sigma-Aldrich | EP0030119479 | For embryonic heart isolation |
| Axopatch 200B amplifier and Digidata 1200 digitizer | Molecular Devices | Used for action potential recordings | |
| Benchtop Mini Centrifuge | Southern Labware | MLX-106 | |
| Blebbistatin | Sigma-Aldrich | 203390 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C4901 | |
| Cell-Strainer Sieve | Cole-Parmer | EW-06336-71 | 100 μm sieve for embryonic heart isolation |
| Collagenase Type H | Sigma-Aldrich | C8051 | |
| Collagenase Type II | Worthington | LS004176 | |
| Collagenase Type IV | Worthington | LS004188 | |
| Curved Forceps | Fisher Scientific | 16-100-110 | |
| DTT | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | 324626 | |
| Elastase | Worthington | LS003118 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| Fine Forceps | Dumont | Style #5 | Ceramic-coated forceps for adult and juvenile CV tissue isolation (Need two) |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I2643 | |
| K2ATP | Sigma-Aldrich | A8937 | |
| Large Petri Dish | Sigma-Aldrich | P5981 | For dissociation |
| Magnesium Chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Micro-Hematocrit Capillary Tubes | Kimble Chase | 41A2502 | Soda lime glass for patch pipettes |
| Papain | Worthington | LS003118 | |
| Pasteur Pipettes | Fisher Scientific | 13-678-6A | |
| Petri Dish | Sigma-Aldrich | P5606 | 100 mm x 20 mm, for embryonic heart isolation |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | 806552 | |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | For adult and juvenile zebrafish decapitation |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| Super Fine Forceps | Dumont | Style #SF | For isolating larval CV tissues (Need two) |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | |
| Thermoshaker | ThermoFisher Scientific | 13687711 | |
| Tricaine Methanesulfonate (MS222) | For anaesthetizing zebrafish larvae | ||
| Trypsin Inhibitor | Sigma-Aldrich | T6522 |
References
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