Summary
Le présent protocole décrit l’isolement aigu de cellules musculaires lisses cardiaques et vasculaires viables provenant de poissons-zèbres adultes, juvéniles, larvaires et embryonnaires (Danio rerio), adaptés aux études électrophysiologiques.
Abstract
Le poisson zèbre a longtemps été utilisé comme organisme vertébré modèle dans la recherche cardiovasculaire. Les difficultés techniques liées à l’isolement de cellules individuelles à partir des tissus cardiovasculaires du poisson zèbre ont limité l’étude de leurs propriétés électrophysiologiques. Des méthodes antérieures ont été décrites pour la dissection de cœurs de poisson zèbre et l’isolement des myocytes cardiaques ventriculaires. Cependant, l’isolement des myocytes auriculaires et vasculaires du poisson zèbre pour la caractérisation électrophysiologique n’a pas été détaillé. Ce travail décrit des protocoles enzymatiques nouveaux et modifiés qui fournissent régulièrement des cardiomyocytes ventriculaires et auriculaires juvéniles et adultes juvéniles et adultes, ainsi que des cellules vasculaires du muscle lisse (VSM) de l’artériose bulbeuse, adaptées aux expériences de patch-clamp. Il n’y a eu aucune preuve littéraire d’études électrophysiologiques sur des tissus cardiovasculaires de poisson zèbre isolés aux stades embryonnaire et larvaire du développement. Des techniques de dissociation partielle qui permettent des expériences de patch-clamp sur des cellules individuelles de cœurs larvaires et embryonnaires sont démontrées.
Introduction
Le poisson zèbre est un petit poisson téléostéen qui a longtemps été utilisé comme organisme vertébré modèle1 et qui a récemment pris de l’importance en tant que système vertébré viable pour le criblage à haut débit des gènes et des médicaments 2,3. Cependant, l’analyse physiologique des tissus du poisson zèbre n’est pas bien développée. Dans le système cardiovasculaire, des méthodes ont été décrites pour la dissection des cœurs de poisson zèbre4 et l’isolement des myocytes cardiaques ventriculaires 5,6,7. Il existe peu de descriptions détaillées de l’isolement efficace des myocytes auriculaires et aucun rapport de préparations de muscles lisses vasculaires (VSM) pour les études patch-clamp.
Les travaux actuels décrivent une méthodologie pour l’isolement des myocytes cardiaques et vasculaires du poisson zèbre, viable pour les études électrophysiologiques et fonctionnelles. Cette approche comprend des modifications des protocoles précédemment signalés pour l’isolement des myocytes ventriculaires du poisson zèbre 5,6 et adapte les méthodes à partir des isolements de cellules VSM de mammifères8, permettant l’isolement des cellules musculaires lisses vasculairesdu poisson zèbre de l’artériose bulbeuse (BA). Les protocoles permettent d’obtenir des rendements efficaces de cellules auriculaires, ventriculaires et VSM isolées provenant de poissons-zèbres qui peuvent être utilisées de manière fiable dans les études patch-clamp jusqu’à 8 h9.
Malgré leurs larves presque transparentes qui se développent entièrement en dehors de l’organisme parental, l’exploration de leur potentiel ontogénétique promis dans l’étude du développement cardiovasculaire a été limitée par les défis liés à l’extraction et à l’analyse des tissus à un jeune âge. Le présent article aborde cette limitation en démontrant des expériences de patch-clamp sur des cœurs de poissons-zèbres isolés dès 3 jours après la fécondation (dpf), en utilisant une méthode d’extraction adaptéeet publiée 10.
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Protocol
Tous les poissons-zèbres (souche sauvage AB, mâle et femelle) ont été élevés, entretenus et manipulés pour les expériences conformément aux directives du Washington University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).
1. Isolement de l’oreillette, du ventricule et de l’artériel bulbeux du poisson-zèbre adulte, juvénile et larvaire
- Euthanasier les poissons par choc froid, c’est-à-dire en les immergeant dans de l’eau à 4 °C, pendant ~10 s.
- À l’aide d’une pince incurvée, transférer le poisson dans une grande boîte de Petri partiellement remplie de tampon de perfusion (PB) (tableau 1) et placer sous un microscope à dissection.
- Décapita le poisson juste en arrière des yeux, à l’aide d’une paire de ciseaux.
- À l’aide de pinces incurvées (pinces fines pour les larves de poissons), tenez le poisson dans la main non dominante avec le côté ventral faisant face à la lunette de dissection. Avec la deuxième paire de pinces fines (ou superfines pour les larves de poissons) dans la main dominante, déchirez doucement les muscles pectoraux et les nageoires pour révéler les tissus cardiovasculaires (CV) (oreillette, ventricule et artérie bulbeuse, BA) (Figure 1).
- En plaçant la pince fine dans la main dominante, tirez doucement le BA à l’extrémité intersectaire du BA et de l’aorte ventrale.
REMARQUE: Le BA et le cœur sortiront de la cavité corporelle.- Séparez soigneusement le BA de l’aorte en pinçant la pince et en localisant l’extrémité de l’oreillette dans laquelle convergent plusieurs branches veineuses (sinus veineux). À l’aide de la pince fine, « arracher » l’extrémité de l’oreillette du sinus veineux. Cela isole les tissus CV du reste du corps (Figure 1).
2. Dissociation des cardiomyocytes du poisson-zèbre adulte, juvénile et larvaire pour les études électrophysiologiques
- À l’aide de la pince fine, « arracher » l’oreillette et le ventricule du tissu CV isolé à l’étape précédente.
REMARQUE: Le processus permet une dissection propre de chaque tissu avec une contamination croisée minimale et ressemble à la cueillette de fruits d’un arbre.- Faites une légère déchirure dans le ventricule à l’aide de fines pinces pour drainer l’excès de sang, ce qui peut être assuré lorsque le tissu cardiaque prend la couleur saumon pâle du rouge vif.
- Regrouper l’oreillette et le ventricule isolés dans des tubes centrifugés séparés de 1,5 mL contenant un tampon de perfusion (PB; 1,5 mL).
REMARQUE: Pour garantir une dissociation réussie des cardiomyocytes auriculaires (MCA) et des cardiomyocytes ventriculaires (VCM) adultes, quatre oreillettes et trois ventricules sont généralement nécessaires. Dans le cas du poisson-zèbre juvénile (28-90 jours), ce nombre est doublé.- Dans le cas des larves de poisson-zèbre (14-28 jours), prélever autant de tissu que possible de ~30 larves.
- Remplacez le PB dans les tubes par 750 μL de tampon de digestion (DB) (tableau 1) chacun et placez les tubes sur un thermoshaker à 37 °C et 800 tr/min. Laisser digérer les tissus jusqu’à ce qu’ils deviennent translucides (~30 min pour les oreillettes et ~40 min pour les ventricules).
- Terminez la digestion en faisant tourner doucement les tissus dans une mini-centrifugeuse de paillasse (2 000 x g à température ambiante) pendant 3 à 5 s et remplacez le surnageant DB par 750 μL de tampon d’arrêt (SB) chacun (tableau 1).
Remarque : Cette étape de centrifugation est facultative pour l’isolation VCM. - Incuber les tissus granulés dans le SB à température ambiante pendant 15 min.
- Remplacez doucement le SB par 500-750 μL de PB chacun (selon la densité souhaitée des cellules finales) et triturez les tissus (~30 fois) à l’aide d’une pipette Pasteur polie à la flamme pour disperser les cellules.
NOTE: Les cardiomyocytes (CM) sont maintenant prêts pour les études électrophysiologiques et stockés à température ambiante jusqu’à 8 heures. - Pour un échantillonnage uniforme, pipeter doucement les cellules de haut en bas plusieurs fois pour les remettre en suspension avant d’en ajouter une goutte pour les études correspondantes.
3. Dissociation des cellules des muscles lisses vasculaires (VSM) des poissons-zèbres adultes et juvéniles pour des études électrophysiologiques
- Prélever l’artériel bulbeux (AB) des tissus CV en utilisant la même approche que l’étape 2.1 et regrouper cinq BA adultes dans un tube à centrifuger de 1,5 mL contenant un tampon S1 (1,5 mL) (tableau 2). Dans le cas des poissons-zèbres juvéniles, mettre en pool dix BA et, pour les larves âgées de plus de 2 semaines, 30 à 40 BA.
REMARQUE: Il n’est pas pratiquement possible d’isoler les cellules VSM des larves de poisson zèbre de moins de 2 semaines. - Remplacer S1 par 400 μL de tampon S2 (tableau 2) et laisser la papaïne (voir le tableau des matières) digérer les BA sur un thermoshaker à 37 °C et 800 tr/min pendant ~20 min.
- Laisser les BA partiellement digérés se déposer pendant 1 min et remplacer le surnageant S2 par 500 μL de tampon S3 (tableau 2) contenant de la collagénase. Digérer les tissus sur un thermoshaker à 37 °C et 800 rpm pendant 3-5 min.
- Terminez la digestion en faisant tourner doucement les tissus dans une mini-centrifugeuse de paillasse (2 000 x g à température ambiante) pendant 3 à 5 s et en remplaçant le surnageant S3 par 500 μL de S1.
- Triturer doucement les tissus granulés (~15 fois) pour disperser les cellules VSM et les plaquer sur des lamelles de verre de taille appropriée.
NOTE: La taille de la lamelle de couverture est déterminée par la taille de la chambre d’enregistrement à pince de brassage, dans ce cas, 5 x 5 mm ont été utilisés).- Gardez les lamelles de couverture à température ambiante pendant 30 minutes pour que les cellules puissent s’y fixer et les utiliser dans les 6 heures suivantes.
4. Isolement de cœurs de poissons-zèbres embryonnaires pour des études électrophysiologiques
- Ajouter de la tricaïne (150 mg/L; 1 ml par boîte de Petri de 100 mm x 20 mm) à ~300 embryons (2-5 dpf), prélevés dans leurs conditions d’incubation (figure 2A).
- Concentrer les embryons anesthésiés en les transférant dans un tube centrifuge de 5 mL à l’aide d’une pipette de transfert, en retirant l’excès de milieu (E3) du tube centrifuge (figure 2B).
- Laver les embryons avec 3 mL de tampon de perfusion (PB) à froid deux fois et les remettre en suspension dans 2 mL de PB (Figure 2B).
- À l’aide de l’appareil d’isolement cardiaque embryonnaire (figure 2C), prélever ~1 mL des embryons dans l’aiguille de la seringue et les renvoyer immédiatement dans le tube. Répétez ce processus 30 fois, à raison de 1 s par mouvement de seringue (Figure 2C).
- Passez les embryons fragmentés à travers un tamis à crépine cellulaire de 100 μm placé dans un entonnoir et recueillez les cœurs filtrés dans un autre tube à centrifuger de 5 mL. Rincer la seringue avec 1 mL de PB et recueillir ce rinçage dans le tube à travers le tamis (Figure 2C).
- Bien mélanger et séparer dans des tubes à centrifuger de 1,5 mL, chaque tube contenant 1 mL du contenu. Centrifuger tous les tubes sur une mini-centrifugeuse de paillasse pendant 5 s (2 000 x g à température ambiante) et jeter les surnageants.
- Effectuer une remise en suspension en série des pastilles dans les tubes en utilisant 1 mL de PB, c’est-à-dire remettre la pastille en suspension dans un tube en utilisant 1 mL de PB et utiliser ce PB remis en suspension pour remettre la pastille en suspension dans le tube suivant.
- Pipeter doucement les cœurs de haut en bas deux fois avant d’en ajouter une goutte pour les études correspondantes.
5. Études patch-clamp sur des cellules cardiovasculaires isolées
REMARQUE: Des enregistrements de patch-clamp à l’envers et à cellules entières à partir des cellules isolées peuvent être obtenus comme indiqué précédemment pour les courants du canalK ATP dans la cardiovascularisation9 du poisson zèbre.
- Pour les cardiomyocytes adultes et juvéniles, ajouter les cellules dissociées (à partir de l’étape 2) directement dans la chambre d’enregistrement de la suspension. Pour les cellules VSM, placez la lamelle de recouvrement contenant les cellules VSM plaquées (à partir de l’étape 3) dans la chambre d’enregistrement.
- Ajouter des cœurs embryonnaires intacts isolés (à partir de l’étape 4) dans la chambre à partir de la suspension, et faire des enregistrements patch-clamp à partir des myocytes épicardiques (Figure 2D).
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Representative Results
Les protocoles ci-dessus fournissent de manière fiable et systématique suffisamment de myocytes cardiaques et vasculaires de qualité constante pouvant faire l’objet d’études patch-clamp, comme cela a été récemment rapporté dans des études approfondies sur les canaux potassiques sensibles à l’ATP (KATP) chez les poissons zèbres de type sauvage et mutants9. Des traces représentatives d’enregistrements de l’activité de ces canaux KATP à partir de cardiomyocytes isolés sont montrées à la figure 3A-C. Dans le cas de cellules isolées de l’artériose bulbeuse, les cellules musculaires lisses vasculaires ont été confirmées par l’expression11,12 de Tg(tagln:egfp) (Figure 1). Des enregistrements monocanaux réussis ont été obtenus (n = 8 enregistrements à partir de N = 5 préparations) dans des patchs excisés des cœurs embryonnaires (Figure 3D). Des potentiels d’action ont été enregistrés à partir de myocytes ventriculaires et auriculaires adultes isolés dans des cellules entières, en mode de pince de courant, à l’aide d’un amplificateur patch-clamp et d’un numériseur compatible (voir le tableau des matériaux). La solution d’enregistrement extracellulaire pour les mesures du potentiel d’action (AP) contenait NaCl (140 mM), KCl (4 mM), CaCl 2 (1,8 mM), MgCl2 (1 mM), Glucose (10 mM), HEPES (10 mM) et Blebbistatin (0,01 mM, pH 7,4); la solution d’enregistrement intracellulaire contenait KCl (120 mM), EGTA (5 mM), K 2 ATP (5 mM), MgCl 2 (5 mM) et HEPES (10 mM, pH7,2). Les pipettes patch ont été extraites du verre sodocalcique et présentaient des résistances de 3 à 5 MΩ lorsqu’elles étaient remplies d’une solution intracellulaire. Les myocytes ventriculaires présentent des potentiels membranaires hyperpolarisés stables, et les potentiels d’action ont été stimulés par injection de courant à travers la pipette patch (Figure 3E), tandis que les myocytes auriculaires ont présenté un potentiel d’action spontané (Figure 3F). Les propriétés du potentiel d’action sont résumées dans le tableau 3.
Figure 1 : Isolement des cellules artérieuses auriculaires, ventriculaires et bulbeuses. Schéma pour illustrer l’isolement des cellules auriculaires (A), ventriculaires (B) et bulbeuses artérioses (C). Les images représentant chaque type de cellule isolée (en bas) ont des barres d’échelle = 50 μm dans chaque cas. Les cellules BA isolées à partir de lignées de poisson zèbre rapporteur transgénique de cellules musculaires lisses (Tg(tagln:egfp)11,12) sont positives pour la fluorescence verte. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Schéma pour illustrer l’isolement des cœurs embryonnaires. (A) Les embryons fécondés sont retirés de l’étang-reproducteur et placés dans une boîte de Petri contenant de l’eau E3 et maintenus à 28 °C pendant 5 jours au maximum. (B) À l’âge désiré, les embryons sont anesthésiés in situ à l’aide de tricaïne et transférés dans PB dans des tubes de centrifugation de 5 ml pour la dissociation. (C) L’appareil d’isolation cardiaque embryonnaire consiste en une seringue de 10 mL fixée à une aiguille de 19 G montée au-dessus du tube de dissociation sur un support de paillasse, permettant aux mains d’effectuer la trituration. (D) Image du cœur isolé (jour 4) attaché à une pipette à pince patch. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Enregistrements représentatifs de patch-clamp à partir de tissus cardiovasculaires isolés de poissons-zèbres. (A, B) Canaux ATP K sensibles àl’ATP provenant d’enregistrements de patch-clamp excisés de l’intérieur vers l’extérieur de cardiomyocytes auriculaires (A) et ventriculaires (B) isolés de poissons-zèbres adultes. (C) La conductance du canalK ATP a été enregistrée à partir de patch-clamping de cellules entières de cellules VSM isolées de poissons zèbres adultes. (D) Activité d’un seul canal K+ dans les plaques membranaires excisées des cœurs embryonnaires de poisson zèbre (4 dpf). Tous les enregistrements de patchs excisés ont été réalisés avec 140 mM KCl des deux côtés de la membrane, à un potentiel de membrane de -50 mV. Des courants de cellules entières ont été enregistrés avec le potentiel de membrane serré à -70 mV. (E) Exemple d’enregistrement de pince de courant à partir de myocytes ventriculaires isolés. Les potentiels d’action ont été stimulés par l’injection de courant comme indiqué ci-dessous. (F) Exemple d’enregistrement de la pince de courant à partir d’un myocyte auriculaire isolé montrant un potentiel d’action spontanée. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
| TAMPON DE PERFUSION (PB) | 10 mM HEPES, 30 mM Taurine, 5,5 mM Glucose, 10 mM BDM. Faire la solution dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS), ajuster le pH à 7,4 | ||
| TAMPON DE DIGESTION (DB) | PB + 12,5 μM CaCl2 + 5 mg/mL Col II + 5 mg/mL Col IV + 5 ng/mL d’insuline | ||
| ARRÊT DU TAMPON (SB) | PB + 10% FBS + 12,5 μM CaCl2 + 10 mg / ml BSA + 5 ng / mL d’insuline | ||
Tableau 1: Solutions pour l’isolement des cardiomyocytes du poisson zèbre.
| TAMPON S1 | 0,1 % BSA (p/v), 145 mM NaCl, 4 mM KCl, 10 mM HEPES, 10 mM Glucose, 0,05 mM CaCl 2, 1 mM MgCl2, ajusté à pH7,4 en utilisant NaOH | ||
| TAMPON S2 | 2 mL de S1, 4 mg de Papain, 2 mg de DTT | ||
| TAMPON S3 | 2 mL S1, 3 mg Collagénase de type H, 2 mg Inhibiteur de la trypsine, 1 mg Élastase | ||
Tableau 2 : Solutions pour l’isolement des cellules VSM du poisson zèbre.
| Myocytes ventriculaires (n = 3 enregistrements) | |||
| Vm (mV) | APA (mV) | APD50 (ms) | |
| -75,7 ± 3,9 | -119,6 ± 3,8 | 329 ± 163 | |
| Myocytes auriculaires (n = 3 enregistrements) | |||
| Taux AP (min-1) | MDP (mV) | APA (mV) | APD50 (ms) |
| 107,3 ± 32,6 | -71,2 ± 5,1 | 98,4 ± 4,7 | 141 ± 12 |
Tableau 3 : Propriétés du potentiel d’action des cardiomyocytes isolés du poisson zèbre. Enregistré en mode de serrage actuel. Données présentées en moyenne ± S.D. Vm = potentiel membranaire; APA = amplitude du potentiel d’action; APD50 = durée du potentiel d’action jusqu’à 50 % de repolarisation; MDP = potentiel diastolique maximal.
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Discussion
Les méthodes antérieures d’isolement des myocytes ventriculaires du poisson zèbre5,6, visant à générer des myocytes pour la culture ou des études électrophysiologiques, fournissaient des cellules à faible rendement et impliquaient de longues étapes de centrifugations multiples qui nuisaient à la qualité et à la viabilité cellulaires. Les protocoles décrits ici sont fiables, couvrent chacun des tissus cardiovasculaires importants (ventricule, oreillettes et VSM) et, surtout, sont très pratiques pour l’isolement aigu des cellules vivantes. Les approches d’isolement impliquant une canulation du ventricule via le BA13 peuvent être une alternative sophistiquée aux cardiomyocytes ventriculaires, mais nécessitent un degré de dextérité plus élevé et peuvent affecter négativement l’isolement auriculaire. L’approche détaillée dans le protocole actuel offre une alternative simple et efficace.
D’autres considérations pour l’isolement du tissu cardiaque larvaire sont les suivantes : (1) À l’étape 1.4, selon l’âge du poisson et le grossissement disponible, les tissus peuvent être visibles avant même l’ablation des muscles pectoraux, auquel cas les tissus peuvent être directement « arrachés » du poisson sans intervention chirurgicale préalable, puis les tissus non CV peuvent être enlevés à l’aide de pinces superfines ; (2) À l’étape 2.2, pour les larves de moins de 14 jours, les cœurs peuvent être utilisés directement pour des études électrophysiologiques sans avoir besoin de dissociation enzymatique.
Comme indiqué ci-dessus, et généralement vrai pour les méthodes de dissociation enzymatique en général, il s’est avéré important d’utiliser des tampons et des enzymes frais à chaque fois. Cependant, le tampon de perfusion (PB) et le tampon S1 peuvent être préparés à l’avance et stockés à 4-8 ° C pendant 1 mois.
Le temps d’isolement des tissus ne doit pas dépasser ~90 s par poisson, et les tissus ne doivent pas être exposés à l’air. Lorsque la dissociation prend plus de temps, la qualité cellulaire (c’est-à-dire la survie) est réduite. Lors de la trituration des tissus, il faut veiller à éviter de générer des bulles d’air, ce qui réduit également la qualité des cellules. L’isolement cellulaire VSM est sensible à la digestion par la collagénase dans le tampon S3. Après les 3 premières minutes de digestion, le tube doit être retiré du thermoshaker toutes les minutes et examiné pour détecter la présence de tissus dilatés et translucides flottants. Une fois que la fragmentation tissulaire est apparente, l’étape de digestion doit être arrêtée.
Il est important de noter que ces protocoles ne sont pas largement optimisés pour isoler les cardiomyocytes tolérants au calcium, comme cela serait requis pour les études de contractilité. Cependant, comme indiqué, un enregistrement fiable des potentiels d’action des cardiomyocytes peut être obtenu en présence de concentrations physiologiques extracellulaires de calcium 7,14. Il a déjà été démontré que la blébbistatine, incluse pour découpler l’excitation et la contraction, améliorer la formation de joints giga-ohms et l’efficacité de l’enregistrement dans ces expériences, n’affectait pas de manière significative les paramètres AP dans les cœurs intacts de poisson-zèbre14. Pour l’électrophysiologie, le rendement absolu des cellules n’est pas non plus systématiquement limitatif de débit. Ce protocole n’a pas été optimisé pour le rendement, comme cela pourrait être nécessaire pour les études biochimiques de cellules isolées. Néanmoins, le rendement obtenu avec ces méthodes est bien adapté aux études électrophysiologiques et probablement à de multiples autres approches.
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Disclosures
Les auteurs ne déclarent aucun intérêt financier concurrent.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par les subventions NIH HL140024 à CGN et HL150277 à CMC. Les figures 1 et 2 ont été créées avec BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL Centrifuge Tubes | Eppendorf | 22364111 | |
| 10 mL Syringe | Fisher Scientific | 14-955-459 | |
| 19 Guage Needle | BD | 305187 | |
| 2,3-Butanedione Monoxime (BDM) | Sigma-Aldrich | B0753 | |
| 5 mL Centrifuge Tubes | Sigma-Aldrich | EP0030119479 | For embryonic heart isolation |
| Axopatch 200B amplifier and Digidata 1200 digitizer | Molecular Devices | Used for action potential recordings | |
| Benchtop Mini Centrifuge | Southern Labware | MLX-106 | |
| Blebbistatin | Sigma-Aldrich | 203390 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C4901 | |
| Cell-Strainer Sieve | Cole-Parmer | EW-06336-71 | 100 μm sieve for embryonic heart isolation |
| Collagenase Type H | Sigma-Aldrich | C8051 | |
| Collagenase Type II | Worthington | LS004176 | |
| Collagenase Type IV | Worthington | LS004188 | |
| Curved Forceps | Fisher Scientific | 16-100-110 | |
| DTT | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | 324626 | |
| Elastase | Worthington | LS003118 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| Fine Forceps | Dumont | Style #5 | Ceramic-coated forceps for adult and juvenile CV tissue isolation (Need two) |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I2643 | |
| K2ATP | Sigma-Aldrich | A8937 | |
| Large Petri Dish | Sigma-Aldrich | P5981 | For dissociation |
| Magnesium Chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Micro-Hematocrit Capillary Tubes | Kimble Chase | 41A2502 | Soda lime glass for patch pipettes |
| Papain | Worthington | LS003118 | |
| Pasteur Pipettes | Fisher Scientific | 13-678-6A | |
| Petri Dish | Sigma-Aldrich | P5606 | 100 mm x 20 mm, for embryonic heart isolation |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | 806552 | |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | For adult and juvenile zebrafish decapitation |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| Super Fine Forceps | Dumont | Style #SF | For isolating larval CV tissues (Need two) |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | |
| Thermoshaker | ThermoFisher Scientific | 13687711 | |
| Tricaine Methanesulfonate (MS222) | For anaesthetizing zebrafish larvae | ||
| Trypsin Inhibitor | Sigma-Aldrich | T6522 |
References
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