For at fremme skal vækst kegler udøve trækkraft mod det ydre miljø. Generationen af trækkraft er afhængig af actin dynamik og kobling kobling. Den foreliggende undersøgelse beskriver metoder til analyse actin dynamik, kobling kobling og trækkraft kræfter for vækst kegle forhånd.
For at etablere funktionelle netværk skal neuroner migrere til deres relevante destinationer og derefter udvide axoner mod deres målceller. Disse processer afhænger af fremskridtene i vækst kegler, der ligger ved spidsen af neurites. Axonal vækst kegler generere drivkræfter ved at fornemme deres lokale mikromiljø og modulerende cytoskeletal dynamik og actin-adhesion kobling (kobling kobling). Årtiers forskning har ført til identifikation af vejledningsmolekyler, deres receptorer og downstream-signaleringskaskader til regulering af neuronal migration og axonal vejledning; men de molekylære maskiner, der kræves for at generere kræfter til at drive vækst kegle forhånd og navigation er lige begyndt at blive belyst. På forkant med neuronal vækst kegler, actin filamenter gennemgå tilbageskridt flow, som er drevet af actin polymerisering og actomyosin sammentrækning. En kobling kobling mellem F-actin retrograd flow og klæbende substrat genererer trækkraft kræfter for vækst kegle forhånd. Denne undersøgelse beskriver en detaljeret protokol til overvågning af F-actin retrograd flow af enkelt speckle imaging. Det er vigtigt, at når den kombineres med en F-actin-markør Lifeact, kan denne teknik kvantificere 1) F-actin polymeriseringshastigheden og 2) koblingskoblingens effektivitet mellem F-actin retrograd flow og klæbesubstratet. Begge er kritiske variabler for at generere kræfter til vækst kegle forhånd og navigation. Derudover beskriver denne undersøgelse en detaljeret protokol af trækkraftmikroskopi, som kan kvantificere 3) trækkraft genereret af vækst kegler. Således, ved at koble analyser af enkelt speckle imaging og trækkraft mikroskopi, kan efterforskere overvåge den molekylære mekanik underliggende vækst kegle forhånd og navigation.
I den udviklende hvirveldyrhjerne gennemgår neuroner kunstfærdigt organiserede migrationer og projektakser mod passende synaptiske partnere for at etablere funktionelle neuronale netværk1,2,3. Vækst kegler, som er sensoriske og motile strukturer placeret på spidsen af neurites, bestemme hastigheden og retningen af neuronal migration og axon udvækst3,4,5. Da neuroner er omgivet af tætpakkede miljøer, må vækstke udøve kræfter mod deres miljø for at komme videre6,7. For at forstå de mekanismer, der ligger til grund for neuronal migration og axonal vejledning, er analyser af molekylær mekanik for vækstkeglefremrykning afgørende.
Årtiers analyse har vist, at trækkraft til at drive vækst kegle forhånd er genereret af ‘kobling’ mekanisme; denne mekanisme menes at fungere ikke kun i den axonale vækstkegle, men også i den førende procesvækstkegle af migrerende neuroner8,9,10,11,12. Nemlig actin filamenter (F-actins) i vækst kegler polymerisere på forkant og depolymerize proximally, skubbe ud den førende membran13,14,15. Den resulterende kraft, i forbindelse med actomyosin sammentrækning, fremkalder bagudgående bevægelse af F-actins kaldet retrograd flow7,11,16,17,18,19,20,21. Koblings- og celle vedhæftningsmolekyler formidler mekanisk kobling mellem F-actin retrograd flow og det klæbende substrat og overfører kraften af F-actin flow på substratet, hvorved trækkraften for vækstkegle forhånd7,8,9,11,12,22 . Samtidig reducerer actin-substratkoblingen F-actin-strømningshastigheden og konverterer actin polymerisering til kraften for at stikke den førende membran 9,10.
Axonal vækst kegler fornemme lokale kemiske signaler og transduce dem i en retningsbestemt drivkraft for vækst kegle navigation3,23,24,25. For eksempel stimulerer et axon-styremolekyle netrin-1 sin receptor slettet i kolorektal cancer (DCC) og aktiverer Rho guanosin triphosphat (GTP)-bindende proteiner celledelingskontrolprotein 42 (Cdc42) og Ras-relateret C3 botulinum toksin substrat 1 (Rac1) og deres downstream kinase p21-aktiveret kinase 1 (Pak1)26. Cdc42 og Rac1 fremme 1) actin polymerisering, og Pak1 fosforylerer en kobling molekyle shootin122,26. Shootin1 interagerer med F-actin retrograd flow via en actin-bindende protein cortactin27. Shootin1 interagerer også med L1 celle vedhæftning molekyle (L1-CAM)20,24. Shootin1 fosforylering øger de bindende tilhørsforhold til cortactin og L1-CAM, og forbedrer shootin1-medieret 2) kobling24,27. Inden for vækstkeglen øges asymmetriske aktiveringer af actin polymerisering og koblingskobling 3) trækkraft på siden af netrin-1-kilden, hvilket skaber retningsbestemt drivkraft for vækstkegledrejning (figur 1)24. Intensiv forskning i løbet af de sidste par årtier med hensyn til neuronal migration og axon vejledning har øget forståelsen af vejledning molekyler, deres receptorer, og tilhørende downstream signalering kaskader2,10,28,29,30. Men de molekylære bemaskiner til at generere kræfter til vækst kegle forhånd er lige begyndt at blive belyst; dette kan tilskrives den begrænsede anvendelse af protokollerne til mekanobiologiske analyser.
Den foreliggende undersøgelse beskriver en detaljeret protokol til overvågning af F-actin retrograd flow af enkelt speckle imaging16,18. Overvågning af F-actin retrograd flow er blevet udført i vid udstrækning ved hjælp af super-opløsning mikroskopi, spinning-disk konfokal mikroskopi og total interferens refleksion fluorescens (TIRF) mikroskopi25,31,32,33,34,35,36,37,38 . Protokollen i denne undersøgelse bruger imidlertid et standard epifluorescencemikroskop og kan således let antages11,16,18,20,22,23,24,27,39,40,41,42. Når det kombineres med F-actin mærkning af Lifeact43, enkelt speckle imaging giver mulighed for kvantificeringer af actin polymerisering sats og kobling kobling effektivitet mellem F-actin tilbagegradering flow og klæbemiddel substrat39,42. Denne undersøgelse beskriver endvidere en detaljeret protokol af trækkraftmikroskopi ved hjælp af en fluorescerende perle-indlejret polyacrylamid (PAA) gel11,22,23,24,27,39,41,42,44. Denne metode registrerer og kvantificerer trækkraft under vækstkeglen ved at overvåge kraftinducerede perlebevægelser44,45. Der leveres en open source traction force-analysekode, og metoden til kvantificering af trækkraft under migration af vækstkegle forklares i detaljer. Ved hjælp af enkelt speckle imaging og trækkraft mikroskopi, forståelse af molekylær mekanik underliggende vækst kegle migration og navigation vil blive lettet. Disse teknikker er også anvendelige til analyse af molekylær mekanik underliggende dendritiske rygsøjlen udvidelsen, som er kendt for at være vigtigt i læring og hukommelse42.
De protokoller, der er beskrevet i denne undersøgelse, bruger kommercielt tilgængelige materialer og mikroskopiudstyr, der rutinemæssigt findes i alle laboratorier, institutter og universiteter. Derfor kan efterforskere nemt vedtage den nuværende enkelt speckle imaging og trækkraft mikroskopi i deres undersøgelser.
Speckle imaging kan analysere actin polymerisering og kobling kobling. Derudover kan speckle imaging overvåge retrograd strømmen af kobling molekyler såsom shootin1 og cortactin, som interagerer med F-actin retrograd flow. Ved hjælp af et TIRF-mikroskop kan tilbageskridtet af celle vedhæsionsmolekylet L1-CAM også overvåges23,41; L1-CAM gennemgår greb og slip adfærd, der afspejler kobling kobling effektivitet23,41. Selv om denne undersøgelse anvender TMR-HaloTag-systemet til speckle imaging, andre fluorescerende proteiner, såsom EGFP og monomerisk rød fluorescerende protein, er også tilgængelige i analysen16,18,20,23,24,27,39. Det væsentlige for visualisering af actin speckles er et lavt udtryksniveau af fluorescerende actin og belysning af et minimumsområde (figur 2). I denne protokol, Lifeact og HaloTag-actin signaler er sekventielt erhvervet. Fordi actin retrograd flow er relativt langsom (4,5 ± 0,1 μm/min)24, analyse af F-actin retrograd flow og actin polymerisering er upåvirket af sekventiel billedopsamling af forskellige fluorescerende kanaler (~ 1 s interval). Lifeact er en meget udbredt F-actin markør, men kan konkurrere med actin bindende proteiner47. Af yderligere betydning kan Lifeact ændre actin dynamikken og derved påvirke F-actin strukturer og cellemorfologi47,48,49.
Trækkraft mikroskopi kan opdage kræfter til at drive vækst kegle forhånd. Ved at montere neuronerne i en ekstracellulær matrix kan efterforskere også analysere kræfter genereret i et semi-3D-miljø11. Høj forstørrelse billeddannelse er vigtig for præcis kvantificering af trækkraft, fordi vækst kegler generere svage trækkraft7. Selv om andre metoder med nanopillars eller stress-følsomme biosensorer også anvendes til at måle trækkraft50,51, PAA gel-baseret metode er meget tilpasningsdygtig og giver mulighed for justering af substrat stivhed ved at variere koncentrationerne af acrylamid og bis-acrylamid41,44,52. I denne protokol fremstilles PAA gelen i en endelig koncentration på 3,75% acrylamid og 0,03% bis-acrylamid; Young’s modulus er ~ 270 Pa22 og denne stivhed er inden for området hjernevæv (100-10.000 Pa)53,54,55. På grund af tykkelsen af PAA gel (~ 100 μm), denne metode begrænser brugen af høj forstørrelse linser under mikroskopi. For at opnå billeder med høj forstørrelse skal efterforskerne bruge zoomfunktionen i et laserscanningsmikroskop.
Afslutningsvis vil jeg sige, at den nuværende speckle imaging og traction force mikroskopi muliggør kvantitative analyser af de vigtigste begivenheder i kraft generationer. Disse oplysninger vil være uvurderlige for at forbedre forståelsen af de mekanismer, der ligger til grund for vækst kegle avancement og navigation.
The authors have nothing to disclose.
Denne forskning blev delvist støttet af AMED under bevillingsnummer 21gm0810011h0005 (N.I. og Y.S.), JSPS KAKENHI (JP19H03223, N.I.) og JSPS Grants-in-Aid for Early-Career Scientists (JP19K16258, T.M.), Osaka Medical Research Foundation for Uhelbredelige Sygdomme (T.M.) og NAIST Next Generation Interdisciplinary Research Project (Y.S.).
0.5% trypan blue stain solution | Nacalai | 29853-34 | |
3-aminopropyltrimethyoxysilane | Sigma | 281778-100ML | |
Acrylamide monomer | Nacalai | 00809-85 | |
Ammonium persulphate | Cytiva | 17-1311-1 | |
Axio Observer Z1 | Zeiss | 431007-9902-000 | Epi-fluorescence microscope (single speckle imaging) |
B-27 supplement (50x) | Thermo Fisher Scientific | 17504-044 | |
Bovine serum albmine | Sigma | A7906-10G | |
C-Apochromat 63x/1.2 W Corr | Zeiss | 421787-9970-799 | Objective lens (traction force microscopy) |
Coverslip (diameter 18 mm) | Matsunami | C018001 | |
D-glucose | Nacalai | 16806-25 | |
DNaseI | Sigma | DN25-100MG | |
Fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 10270-106 | |
Fiji | Open source software package | https://imagej.net/software/fiji/ | |
FluoSpheres carboxylate-modified 0.2 mm, red (580/605), 2% solid | Thermo Fisher Scientific | F8810 | carboxylate-modified microspheres |
Glass bottom dish (14 mm diameter) | Matsunami | D1130H | |
Glass bottom dish (27 mm diameter) | Matsunami | D1140H | |
Glutaraldehyde solution | Sigma | G5882-10X10ML | |
HaloTag TMR ligand | Promega | G8251 | |
HBO103 W/2 | Osram | 4050300382128 | Mercury lamp (single speckle imaging) |
Image Processing Toolbox | MathWork | https://www.mathworks.com/products/image.html | |
Laminin solution from mouse EHS tumor | Wako | 120-05751 | |
Leibovitz’s L-15 medium | Thermo Fisher Scientific | 11415064 | |
L-glutamine | Nacalai | 16919-42 | |
LSM710 | Zeiss | N/A | Conforcal laser microscope (traction force microscopy) |
MATLAB2018a | MathWork | https://www.mathworks.com/products/new_products/release2018a.html | |
Mouse C57BL/6 | Japan SLC | N/A | |
Mouse neuron nucleofector kit | Lonza | VPG-1001 | |
N,N,N’,N’-tetramethylethylenediamine (TEMED) | Nacalai | 33401-72 | |
N,N’-methylenebisacrylamide | Nacalai | 22402-02 | |
Neurobasal medium | Thermo Fisher Scientific | 21103-049 | |
Nucleofector I | Amaxa | AAD-1001 | Electroporation apparatus |
ORCA Flash 4.0 V2 | Hamamatsu | C11440-22CU | CMOS camera (single speckle imaging) |
Papain | Nacalai | 26036-34 | |
Parallel Computing Toolbox | MathWork | https://www.mathworks.com/products/parallel-computing.html | |
pEGFP-C1 | Clontech | 1528177 | |
Penicillin-streptomycin (100x) | Nacalai Tesque | 26253-84 | |
pFN21A-HaloTag-actin | (Minegishi et al., 2018) | N/A | |
Phosphate buffered saline (PBS) pH 7.4 (10x) | Thermo Fisher Scientific | 70011-044 | |
Plan-Apochromat 100x/1.4 Oil | Zeiss | 420790-9901-000 | Objective lens (single speckle imaging) |
pmNeonGreen-N1-Lifeact | (Kastian et al., 2021) | N/A | |
Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma | P6407-5MG | |
Slulfo-SAMPHA | Thermo Fisher Scientific | 22589 | |
Sodium dodecyl sulfate | Nacalai | 08933-05 | |
Sodium hydrate (NaOH) | Nacalai | 31511-05 | |
Steel ball | Sako tekkou | N/A | Microshpere to determin PAA gel rigidity. 0.6 mm diameter, 7.87 g/cm3. |
ZEN2009 | Zeiss | https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/microscope-software/zen.html#introduction | Image acquisition software (traction force microscopy) |
ZEN2012 | Zeiss | https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/microscope-software/zen.html#introduction | Image acquisition software (single speckle imaging) |