För att avancera måste tillväxtkoner utöva dragkrafter mot den yttre miljön. Genereringen av dragkrafter är beroende av aktindynamik och kopplingskoppling. Den aktuella studien beskriver metoder för att analysera aktindynamik, kopplingskoppling och dragkrafter för tillväxtkon framryckning.
För att upprätta funktionella nätverk måste neuroner migrera till sina lämpliga destinationer och sedan förlänga axoner mot sina målceller. Dessa processer beror på framstegen hos tillväxtkoner som ligger vid spetsarna av neuriter. Axonal tillväxtkoner genererar drivkrafter genom att känna av sin lokala mikromiljö och modulera cytoskeletal dynamik och aktin-vidhäftningskoppling (kopplingskoppling). Årtionden av forskning har lett till identifiering av styrmolekyler, deras receptorer och nedströms signalkaskader för reglering av neuronal migration och axonal vägledning; Men de molekylära maskiner som krävs för att generera krafter för att driva tillväxtkonens framryckning och navigering börjar bara klargöras. I framkant av neuronala tillväxtkoner genomgår aktinfilament retrograd flöde, som drivs av aktinpolymerisering och aktomyosinkontraktion. En kopplingskoppling mellan F-aktin retrograde flöde och lim substrat genererar dragkrafter för tillväxt kon framryckning. Denna studie beskriver ett detaljerat protokoll för övervakning F-aktin retrograd flöde genom en enda speckle imaging. Viktigt, i kombination med en F-aktinmarkör Lifeact, kan denna teknik kvantifiera 1) F-aktinpolymeriseringshastigheten och 2) kopplingskopplingseffektiviteten mellan F-aktin retrograde flöde och det självhäftande substratet. Båda är kritiska variabler för att generera krafter för tillväxtkonens framryckning och navigering. Dessutom beskriver denna studie ett detaljerat protokoll av dragkraft mikroskopi, som kan kvantifiera 3) dragkraft genereras av tillväxt koner. Genom att koppla analyserna av single speckle imaging och traction force mikroskopi, kan utredare övervaka den molekylära mekaniken bakom tillväxt kon framsteg och navigering.
I den utvecklande ryggradsdjur hjärnan genomgår nervceller noggrant organiserade migreringar och projekt axoner mot lämpliga synaptiska partners för att upprätta funktionella neuronala nätverk1,2,3. Tillväxtkoner, som är sensoriska och motila strukturer som ligger vid spetsen av neuriter, bestämmer hastigheten och riktningen för neuronal migration och axon utväxt3,4,5. Eftersom nervceller är omgivna av tätt packade miljöer måste tillväxtkoner utöva krafter mot sin miljö för att gå vidare6,7. För att förstå mekanismerna bakom neuronal migration och axonal vägledning, analyser av den molekylära mekaniken för tillväxt kon framsteg är viktiga.
Årtionden av analys har visat att dragkraft för att driva tillväxtkonens framryckning genereras av “kopplingsmekanismen”. denna mekanism tros fungera inte bara i axonal tillväxt kon utan också i den ledande processen tillväxt kon av migrerande nervceller8,9,10,11,12. Aktinfilament (F-aktiner) i tillväxtkoner polymeriserar vid framkanten och depolymeriserar proximally och trycker ut det ledande membranet13,14,15. Den resulterande kraften, i samband med aktomyosinkontraktion, inducerar bakåtrörelse av F-aktiner som kallas retrograd flöde7,11,16,17,18,19,20,21. Kopplings- och cell vidhäftningsmolekyler förmedlar mekanisk koppling mellan F-aktin retrograde flöde och det självhäftande substratet och överför kraften i F-aktinflödet på substratet, vilket genererar dragkraft för tillväxtkonen advance7,8,9,11,12,22 . Samtidigt minskar kopplingen mellan aktin-substrat F-aktinflödet och omvandlar aktinpolymerisation till kraften för att sticka ut det ledande membranet9,10.
Axonal tillväxtkoner känner av lokala kemiska signaler och omvandlar dem till en riktningskraft för tillväxtkonnavigering3,23,24,25. Till exempel stimulerar en axon-molekyl netrin-1 sin receptor som raderas i kolorektal cancer (DCC), och aktiverar Rho guanosintrifosfat (GTP)-bindande proteiner celldelningskontrollprotein 42 (Cdc42) och Ras-relaterade C3 botulinumtoxin substrat 1 (Rac1), och deras nedströms kinas p21-aktiverade kinas 1 (Pak1)26. Cdc42 och Rac1 främjar 1) aktinpolymerisering, och Pak1 fosforyterar en kopplingsmolekyl shootin122,26. Shootin1 interagerar med F-aktin retrograde flöde via ett aktinbindande protein kortaktin27. Shootin1 interagerar också med L1-cells vidhäftningsmolekyl (L1-CAM)20,24. Shootin1 fosforylering ökar bindningstillhörigheten för kortaktin och L1-CAM, och förbättrar shootin1-medierad kopplingskoppling24,27. Inom tillväxtkonen ökar asymmetriska aktiveringar av aktinpolymerisering och kopplingskoppling 3) dragkraft på sidan av netrin-1-källan, vilket genererar riktningsdrivande kraft för tillväxtkonsvarvning (figur 1)24. Intensiv forskning under de senaste decennierna med avseende på neuronal migration och axon vägledning har ökat förståelsen för vägledningsmolekyler, deras receptorer och tillhörande nedströms signaleringskaskader2,10,28,29,30. Men de molekylära maskinerierna för att generera krafter för tillväxtkonens framryckning har just börjat klargöras; Detta kan hänföras till den begränsade användningen av protokollen för mekanobiologiska analyser.
Denna studie beskriver ett detaljerat protokoll för övervakning av F-aktin retrograd flöde genom en enda speckle imaging16,18. Övervakning av F-actin retrograde flöde har utförts i stor utsträckning med hjälp av superupplösning mikroskopi, spinning-disk confocal mikroskopi och total interferensreflektion fluorescens (TIRF) mikroskopi25,31,32,33,34,35,36,37,38 . Protokollet i den aktuella studien använder dock ett standardeporescensmikroskop och är därmed lätt att anta11,16,18,20,22,23,24,27,39,40,41,42. I kombination med F-aktinmärkning av Lifeact43 möjliggör single speckle imaging kvantifieringar av aktinpolymerisationshastigheten och kopplingskopplingseffektiviteten mellan F-aktin retrograde flöde och det självhäftande substratet39,42. Denna studie beskriver vidare ett detaljerat protokoll för dragkraft mikroskopi med hjälp av en fluorescerande pärla-inbäddad polyakrylamid (PAA) gel11,22,23,24,27,39,41,42,44. Denna metod detekterar och kvantifierar dragkraft under tillväxtkonen genom att övervaka kraftinducerade pärlrörelser44,45. En analyskod för dragkraft med öppen källkod tillhandahålls, och metoden för kvantifiering av dragkraft under tillväxtkonmigrering förklaras i detalj. Med hjälp av single speckle imaging och traction force mikroskopi, förståelse av den molekylära mekaniken bakom tillväxt kon migration och navigering kommer att underlättas. Dessa tekniker är också tillämpliga för att analysera den molekylära mekaniken bakom dendritiska ryggraden utvidgningen, som är känd för att vara viktigt i lärande och minne42.
Protokollen som beskrivs i denna studie använder kommersiellt tillgängliga material och mikroskopiutrustning som rutinmässigt finns i alla laboratorier, institut och universitet. Därför kan prövare enkelt anta den nuvarande single speckle imaging och traction force mikroskopi i sina studier.
Fläckavbildningen kan analysera aktinpolymerisering och kopplingskoppling. Dessutom kan speckle imaging övervaka det bakåtsträvande flödet av kopplingsmolekyler som shootin1 och kortaktin, som interagerar med F-aktin retrograde flöde. Med hjälp av ett TIRF-mikroskop kan även cell vidhäftningsmolekylen L1-CAM:s retrogradeflöde övervakas23,41. L1-CAM genomgår grepp- och glidbeteenden som återspeglar kopplingskopplingseffektiviteten23,41. Även om denna studie använder TMR-HaloTag-systemet för fläckavbildning, finns även andra fluorescerande proteiner, såsom EGFP och monomeriskt rött fluorescerande protein, tillgängliga i analysen16,18,20,23,24,27,39. Det väsentliga för att visualisera aktinfläckar är en låg uttrycksnivå för fluorescerande aktin och belysning av ett minimiområde (figur 2). I detta protokoll förvärvas Lifeact- och HaloTag-aktinsignaler sekventiellt. Eftersom aktin retrograde flödet är relativt långsamt (4,5 ± 0,1 μm/min)24, analys av F-aktin retrograd flöde och aktin polymerisation påverkas inte av sekventiell bild förvärv av olika fluorescerande kanaler (~ 1 s intervall). Lifeact är en allmänt använd F-aktinmarkör, men kan konkurrera med aktinbindande proteiner47. Av ytterligare betydelse kan Lifeact förändra aktindynamiken och därmed påverka F-aktinstrukturer och cellmorfologin47,48,49.
Dragkraftmikroskopi kan upptäcka krafter för att driva tillväxtkonens framryckning. Genom att montera nervcellerna i en extracellulär matris kan utredarna också analysera krafter som genereras i en semi-3D-miljö11. Hög förstoringsavbildning är viktigt för noggrann kvantifiering av dragkraft eftersom tillväxtkoner genererar svaga dragkrafter7. Även om andra metoder med nanopillar eller stresskänsliga biosensorer också används för att mäta dragkraft50,51, är PAA-gelbaserad metod mycket anpassningsbar och möjliggör justering av substratestelhet genom att variera koncentrationerna av akrylamid och bis-akrylamid41,44,52. I detta protokoll framställs PAA-gelen vid en slutlig koncentration av 3,75% akrylamid och 0,03% bis-akrylamid; Youngs modulus är ~270 Pa22 och denna styvhet ligger inom intervallet för hjärnvävnad (100-10 000 Pa)53,54,55. På grund av tjockleken på PAA-gelen (~ 100 μm) begränsar denna metod användningen av högförstoringslinser under mikroskopi. För att få bilder med hög förstoring bör utredarna använda zoomfunktionen i ett konfokalt mikroskop med laserskanning.
Sammanfattningsvis möjliggör den nuvarande speckle imaging och traction force mikroskopi kvantitativa analyser av de viktigaste händelserna i kraft generationer. Denna information kommer att vara ovärderlig för att förbättra förståelsen av de mekanismer som ligger till grund för tillväxtkonens framsteg och navigering.
The authors have nothing to disclose.
Denna forskning stöddes delvis av AMED under bidragsnummer 21gm0810011h0005 (N.I. och Y.S.), JSPS KAKENHI (JP19H03223, N.I.) och JSPS Grants-in-Aid for Early-Career Scientists (JP19K16258, T.M.), Osaka Medical Research Foundation for Incurable Diseases (T.M.)
0.5% trypan blue stain solution | Nacalai | 29853-34 | |
3-aminopropyltrimethyoxysilane | Sigma | 281778-100ML | |
Acrylamide monomer | Nacalai | 00809-85 | |
Ammonium persulphate | Cytiva | 17-1311-1 | |
Axio Observer Z1 | Zeiss | 431007-9902-000 | Epi-fluorescence microscope (single speckle imaging) |
B-27 supplement (50x) | Thermo Fisher Scientific | 17504-044 | |
Bovine serum albmine | Sigma | A7906-10G | |
C-Apochromat 63x/1.2 W Corr | Zeiss | 421787-9970-799 | Objective lens (traction force microscopy) |
Coverslip (diameter 18 mm) | Matsunami | C018001 | |
D-glucose | Nacalai | 16806-25 | |
DNaseI | Sigma | DN25-100MG | |
Fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 10270-106 | |
Fiji | Open source software package | https://imagej.net/software/fiji/ | |
FluoSpheres carboxylate-modified 0.2 mm, red (580/605), 2% solid | Thermo Fisher Scientific | F8810 | carboxylate-modified microspheres |
Glass bottom dish (14 mm diameter) | Matsunami | D1130H | |
Glass bottom dish (27 mm diameter) | Matsunami | D1140H | |
Glutaraldehyde solution | Sigma | G5882-10X10ML | |
HaloTag TMR ligand | Promega | G8251 | |
HBO103 W/2 | Osram | 4050300382128 | Mercury lamp (single speckle imaging) |
Image Processing Toolbox | MathWork | https://www.mathworks.com/products/image.html | |
Laminin solution from mouse EHS tumor | Wako | 120-05751 | |
Leibovitz’s L-15 medium | Thermo Fisher Scientific | 11415064 | |
L-glutamine | Nacalai | 16919-42 | |
LSM710 | Zeiss | N/A | Conforcal laser microscope (traction force microscopy) |
MATLAB2018a | MathWork | https://www.mathworks.com/products/new_products/release2018a.html | |
Mouse C57BL/6 | Japan SLC | N/A | |
Mouse neuron nucleofector kit | Lonza | VPG-1001 | |
N,N,N’,N’-tetramethylethylenediamine (TEMED) | Nacalai | 33401-72 | |
N,N’-methylenebisacrylamide | Nacalai | 22402-02 | |
Neurobasal medium | Thermo Fisher Scientific | 21103-049 | |
Nucleofector I | Amaxa | AAD-1001 | Electroporation apparatus |
ORCA Flash 4.0 V2 | Hamamatsu | C11440-22CU | CMOS camera (single speckle imaging) |
Papain | Nacalai | 26036-34 | |
Parallel Computing Toolbox | MathWork | https://www.mathworks.com/products/parallel-computing.html | |
pEGFP-C1 | Clontech | 1528177 | |
Penicillin-streptomycin (100x) | Nacalai Tesque | 26253-84 | |
pFN21A-HaloTag-actin | (Minegishi et al., 2018) | N/A | |
Phosphate buffered saline (PBS) pH 7.4 (10x) | Thermo Fisher Scientific | 70011-044 | |
Plan-Apochromat 100x/1.4 Oil | Zeiss | 420790-9901-000 | Objective lens (single speckle imaging) |
pmNeonGreen-N1-Lifeact | (Kastian et al., 2021) | N/A | |
Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma | P6407-5MG | |
Slulfo-SAMPHA | Thermo Fisher Scientific | 22589 | |
Sodium dodecyl sulfate | Nacalai | 08933-05 | |
Sodium hydrate (NaOH) | Nacalai | 31511-05 | |
Steel ball | Sako tekkou | N/A | Microshpere to determin PAA gel rigidity. 0.6 mm diameter, 7.87 g/cm3. |
ZEN2009 | Zeiss | https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/microscope-software/zen.html#introduction | Image acquisition software (traction force microscopy) |
ZEN2012 | Zeiss | https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/microscope-software/zen.html#introduction | Image acquisition software (single speckle imaging) |