Summary
במאמר זה, תאי אנדותל ריאתיים ראשוניים בודדו וגודלו בתרבית מעכברים ילודים.
Abstract
תאי אנדותל ממלאים תפקידים קריטיים בוויסות טונוס כלי הדם, מערכת החיסון, הקרישה והחדירות. תפקוד לקוי של אנדותל מתרחש במצבים רפואיים כולל סוכרת, טרשת עורקים, אלח דם ופגיעה ריאתית חריפה. יש צורך בשיטה אמינה וניתנת לשחזור לבידוד תאי אנדותל טהורים מעכברים כדי לחקור את תפקידם של תאי אנדותל בפתוגנזה של מצבים אלה ואחרים. בפרוטוקול זה הוכנו תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים ריאתיים מגורי עכברים בני 5-7 ימים. ריאות נקצרות, טחונות ומתעכלות אנזימטית עם collagenase I, ותאים משוחררים מתורבתים בן לילה. לאחר מכן נבחרים תאי אנדותל באמצעות נוגד PECAM1 (CD-31) IgG מצומד לחרוזים מגנטיים, ותאים שוב עוברים תרבית למפגש. לאחר מכן מתרחשת בחירת תאים משנית עם IgG אנטי-ICAM2 (CD-102) מצומד לחרוזים מגנטיים כדי להגביר את טוהר תאי האנדותל, והתאים שוב מתורבתים למפגש. התהליך כולו לוקח בערך 7-10 ימים לפני שניתן להשתמש בתאים לניסויים. פרוטוקול פשוט זה מניב תאי אנדותל טהורים ביותר (טוהר >92%) שניתן להשתמש בהם באופן מיידי במחקרי מבחנה , כולל המחקרים שהתמקדו בייצור ציטוקין אנדותל וכימוקין, אינטראקציות לויקוציטים-אנדותל, מסלולי קרישת אנדותל וחדירות אנדותל. עם נוקאאוטים רבים וקווי עכבר טרנסגניים זמינים, הליך זה גם משאיל את עצמו להבנת תפקודם של גנים ספציפיים המתבטאים על ידי תאי אנדותל בתגובות בריאות ופתולוגיות לפציעה, זיהום ודלקת.
Introduction
העניין בחקר אנדותל כלי הדם גדל לאחרונה, שכן תפקוד לקוי של תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים מתרחש במחלות אנושיות מרובות, כגון שבץ, מחלות לב וכלי דם, סוכרת, פגיעה ריאתית חריפה, אלח דם ופציעות לא זיהומיות 1,2,3,4,5. כדי להגדיר את הפתוגנזה של מצבים אלה ולהבין את תפקידם של גנים ספציפיים בתגובות תאי אנדותל מגנים ולא מווסתים, יש צורך בשיטות אמינות לבידוד ולתרבית תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים בעלי טוהר גבוה מעכברים. בעוד שמחקרים רבים משתמשים בתאי אנדותל אנושיים כגון תאי אנדותל של ורידים טבוריים אנושיים (HUVEC) או תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים של הריאה האנושית (HMVEC), ישנן סיבות רבות לשימוש בתאי אנדותל של עכברים כדי לחקור תפקוד אנדותל ותפקוד לקוי. ראשית, קיימת הטרוגניות ניכרת בתגובות של תאי אנדותל מתורמים אנושיים שונים, מה שמוביל לשונות בתוצאות בין ניסויים בודדים 6,7,8. שנית, השתקת מטרות גנים בשורות תאים אנושיים ראשוניות יכולה גם להוביל לרמות ביטוי חלבון משתנות 9,10. לעומת זאת, קיימת הטרוגניות מינימלית בתגובות של תאי אנדותל של עכבר11, בהנחה שהרקע הגנטי זהה בין קבוצות המחקר. יתר על כן, ניתן להכין מספר גדול של תאי אנדותל של עכברים על ידי איגום ריאות ממספר עכברים יילודים. גורמים אלה מאפשרים תוצאות עקביות וניתנות לשחזור בין ניסויים. לבסוף, זמינותם של עכברים נוקאאוט או עכברים טרנסגניים מספקת גם בידוד של סוגי תאים חסרי חלבונים מעניינים.
האתגרים המשמעותיים בבידוד אוכלוסיות בריאות וטהורות של תאי אנדותל ריאה של עכברים באמצעות שיטות שפורסמו 12,13,14,15,16 הובילו לפיתוח שיטה אמינה ופשוטה יותר לבידוד תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים באיכות גבוהה של ריאות עכברים. יתרונות הפרוטוקול הנוכחי כוללים שימוש בעכברי יילודים, הזמינים בקלות, ומגבילים את גידול בעלי החיים ואת עלויות הדיור. בנוסף, מניסיוננו, יכולת הקיום של תאי אנדותל מעכברים ילודים גבוהה משמעותית מתאי אנדותל שהוכנו מעכברים בוגרים. מכיוון שלעכברים בילודים יש רקמת ריאה קטנה, ניתן לקצור תאי אנדותל על ידי עיכול ריאות שנכרתו לקולגנאז במקום באמצעות החדרת קולגנאז בקנה הנשימה, המומלצת לאיסוף מעכברים בוגרים16. זה גם מקצר את הזמן בין המתת חסד של עכברים לבין הכנסת תאי האנדותל שלהם למדיה של תרביות תאים ולאינקובטור מבלי להשפיע על הטוהר או היבול או על יכולת ההתרבות של תגובות האנדותל. לבסוף, אוכלוסיות תאים טהורים בודדו ללא ציטומטריית זרימה, אשר יכולה לפגוע או להוביל לתפוקות נמוכות יותר של תאי אנדותל14,15,17.
הפרוטוקול המתוקן הנוכחי מוביל באופן עקבי לתאי אנדותל בעלי טוהר גבוה וקיימא תוך 7-10 ימים שניתן להשתמש בהם באופן מיידי לניסויים במבחנה . בידוד תאים ישירות מבעלי חיים נוקאאוט גם ממזער את המניפולציה של תאים לפני ניסויים. שיטות אלה יכולות לשמש לחקר תפקידם של חלבונים שונים בתפקוד האנדותל כדי לגלות מטרות טיפוליות מבוססות אנדותל למחלות מרובות.
Protocol
כל ההליכים בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת קליפורניה בסן פרנסיסקו. במחקר נעשה שימוש בגורים זכרים מסוג C57BL/6 neonatal mouse pups (גילאי 5-7 ימים). הפרוטוקול כולו אורך 7-10 ימים (איור 1).
1. הכנת תווך תאי אנדותל
- הכינו את המדיום הבסיסי: מדיום הנשר המעובד של דולבקו עם 4,500 מ"ג/ליטר גלוקוז ו-4 מ"מ L-גלוטמין (DMEM) בתוספת 20% (v/v) נסיוב בקר עוברי מומת חום, 100 U/100 מיקרוגרם/מ"ל פניצילין/סטרפטומיצין ו-25 מ"מ HEPES (ראו טבלת חומרים). מסנן סטרילי עם מסנן 22 מיקרומטר. יש לאחסן את המדיום הבסיסי בטמפרטורה של 4°C ולהשתמש בו תוך חודש מההכנה.
- הכן את המדיום המלא: מדיום בסיסי בתוספת 100 מיקרוגרם / מ"ל של הפרין, 100 מיקרוגרם / מ"ל של תוסף צמיחת תאי אנדותל, 1x חומצות אמינו לא חיוניות, ו 1 mM נתרן פירובט (ראה טבלה של חומרים). מסנן סטרילי עם מסנן 22 מיקרומטר. יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C ולהשתמש תוך חודש מההכנה.
2. ציפוי מקדים של חרוזים מגנטיים נגד חולדות13
- ייצור 50 מ"ל של חיץ לשטיפת חרוזים: תמיסה חוצצת פוספט (PBS) בתוספת אלבומין בסרום בקר (BSA) 0.1% (w/v). מסנן סטרילי עם מסנן 22 מיקרומטר ולאחסן ב 4 ° C ולהשתמש בתוך חודש של הכנה.
- מערבבים את החרוזים המגנטיים למשך מספר שניות כדי להשהות מחדש את החרוזים והפיפטה 50 μL של החרוזים (2 x 107 חרוזים) לשני צינורות מיקרוצנטריפוגות 1.5 מ"ל, אחד עבור CD-31 ואחד עבור CD-102 (ראה רשימת חומרים). מוסיפים 1 מ"ל של חיץ שטיפת חרוזים ומערבבים היטב.
הערה: כל הכרכים שהוזכרו שימשו לבידוד תאי אנדותל מ-3-4 גורי עכברים ילודים (בני 5-7 ימים). CD-31 ו-CD-102 הם סמני פני השטח של תאי אנדותל המשמשים לבחירת חרוזים חיסוניים מגנטיים. - מניחים את הצינורות על מפריד מגנטי ומסירים את הסופרנאטנט בעזרת פיפט פסטר זכוכית. יש לחזור על השטיפה 3 פעמים עם 1 מ"ל של חיץ שטיפת חרוזים בכל פעם.
- יש להשהות חרוזים בנפח חרוזים מקורי, 50 μL, עם חיץ לשטיפת חרוזים. לאחר מכן הוסף 5 μL (2.5 מיקרוגרם) של נוגדן (CD-31/CD-102) לכל 50 μL של חרוזים.
- יש לדגור על מתלי חרוזים בסיבוב עדין על מסובב מקצה לקצה למשך הלילה בטמפרטורה של 4°C או למשך 3 שעות בטמפרטורת החדר. יש לחזור על הכביסה 4 פעמים.
- יש להשהות מחדש את ה-immunobeads בנפח המקורי, 50 μL, עם מאגר שטיפת חרוזים ולאחסן בטמפרטורה של 4°C ולהשתמש תוך 1-2 שבועות.
3. בידוד וציפוי של תאי הריאה
- הכינו תמיסת קולגנאז מסוג 1 ביום הבידוד: הוסיפו 25 מ"ג של collagenase מסוג 1 ל-25 מ"ל HBSS (ראו טבלת חומרים). יש לדגור בטמפרטורה של 37°C למשך שעה אחת עם סיבוב עדין ומסנן סטרילי באמצעות מסנן 22 מיקרומטר. יש לחמם את התמיסה בטמפרטורה של 37°C.
- הזריקו לגורי עכברים בני 5-7 ימים תוך שרירית עם הפרין (25 μL/עכבר, 1,000 U/mL) 10 דקות לפני המתת חסד כדי למזער את הפעלת תאי האנדותל ואת היווצרות הקריש14,15.
- הרדימו את גור העכבר באמצעות עריפת ראש באמצעות מספריים חדים בהתאם להנחיות AVMA לשנת 2020 להמתת חסד. לאחר מכן, הצמד את העכבר ללוח דיסקציה עם צד הגחון כלפי מעלה.
- רססו את הפגר באתנול 70%, ואז חשפו את חלל בית החזה על ידי חיתוך הסרעפת תחילה ולאחר מכן חיתוך עליון כלפי מעלה לאורך כל הקירות הרוחביים של החזה. החזרת כלוב הצלעות אז חושפת את הלב והריאות.
הערה: השתמש במלקחיים ומספריים קטנים יותר עבור שלב זה בהתחשב בגודל הקטן של עכברים ילודים, וודא לא לחדור את הלב או הריאות כמו זה יוביל להסרת דם מספקת מן הריאות. - חבר מחט 25 גרם למזרק 10 מ"ל, והזריק 5 מ"ל DMEM קר לחדר הימני של הלב כדי להסיר דם מהריאות. הריאות יהפכו ללבנות.
- הסר את הריאות מחלל בית החזה, אונה אחת בכל פעם, על ידי חיתוך האונות הדיסטליות לסמפונות המתאימות.
- אגרו את כל אונות הריאה לתוך צינור חרוטי של 50 מ"ל ממולא מראש ב-20 מ"ל של מדיום בזאלי קר כקרח (משלב 1.1).
- חזור על שלבים 3.2-3.7 עם גורי העכבר האחרים, תוך איגום כל אונות הריאה לאותו צינור חרוטי של 50 מ"ל.
- בעדינות לעורר את הצינור ביד במשך 10-15 שניות כדי לשטוף כל עודף תאי דם אדומים מוערך חזותית על פני השטח של הריאות.
הערה: אין צורך להסיר את כל הדם מתוך או סביב הריאות; עם זאת, זה משפר את הטוהר. כל טיפול נוסף ברקמות צריך להיעשות במכסה מנוע סטרילי. - השתמשו במסננת תאים כדי להסיר את הריאות מהתקשורת, והעבירו את הרקמה לצלחת תרבית רקמה סטרילית חד פעמית בקוטר 100 מ"מ וטחנו במספריים מעוקרים.
- מעבירים את הרקמה הטחונה לצינור החרוטי 50 מ"ל עם 25 מ"ל של תמיסת קולגנאז מחוממת מראש (שלב 3.1). מערבבים בעדינות על מיקסר מסתובב במשך 45 דקות ב-37°C.
הערה: עיכול יתר אפילו במשך 60 דקות יכול להוביל לתפוקות נמוכות יותר. - חברו מזרק בנפח 20 מ"ל לצינורית קהה במשקל 15 גרם (ראו טבלת חומרים) ושלשו את התרחיף 10-15 פעמים כדי לפרק את הרקמה לתרחיף תאי. היו נמרצים, אך הימנעו מהקצפה מוגזמת.
הערה: לא יהיו עוד חתיכות נראות לעין של הריאה, ובמקום זאת, המתלה יהיה מעונן עם השלמת שלב זה. - סנן את המתלה דרך מסננת תאים של 70 מיקרומטר לתוך צינור חרוטי טרי של 50 מ"ל. יתר על כן, לשטוף את הצינור החרוטי המשמש לעיכול ואת מסננת התא עם 15 מ"ל נוספים של מדיום בסיסי.
- צנטריפוגה את המתלה התאי ב 400 x גרם במשך 8 דקות ב 4 ° C.
- מוציאים את supernatant עם צינור פסטר זכוכית לתלות מחדש את הגלולה ב 2 מ"ל של מדיום שלם. מעבירים לבקבוק T-75 ומוסיפים 8 מ"ל של תרבית בינונית מלאה ב 37 ° C באינקובטור לח, 5% CO2 .
- למחרת, שטפו פעמיים צלוחיות עם 10 מ"ל של תמיסת המלח המאוזנת של האנק ללא סידן ומגנזיום (HBSS/CMF) (ראו טבלת חומרים) והוסיפו 10 מ"ל מדיום שלם.
הערה: לאחר 2-3 ימים, התרבית תהיה 90-95% שוטפת ומוכנה לבידוד חיסוני ראשוני.
4. בידוד חיסוני ראשוני וגידול תאי אנדותל
- יש לשטוף תאי אנדותל דבקים פעמיים עם 10 מ"ל HBSS/CMF. הוסף 2 מ"ל של תמיסת היפרדות תאים ללא טריפסין (ראה טבלת חומרים) ודגור ב 37 ° C במשך ~ 5 דקות. ודא שכל התאים הורמו מהצלוחית.
הערה: יש להשתמש בתמיסת ניתוק ללא טריפסין במקום טריפסין מכיוון שטריפסין יכול לשבש את סמן היצמדות פני השטח של התא CD-31. - הוסף 8 מ"ל של תווך בסיסי כדי לנטרל את תמיסת ניתוק התא ולהעביר את התוכן לצינור חרוטי 15 מ"ל. יש לסחוט כלפי מטה במהירות של 400 x גרם במשך 4 דקות בטמפרטורת החדר.
- מוציאים את הסופרנאטנט בעזרת פיפט פסטר זכוכית ומרחפים תאים ב-2 מ"ל של מדיום בזאלי. העבר את תרחיף התא 2 מ"ל לצינור פוליסטירן תחתון עגול של 5 מ"ל (ראה טבלת חומרים).
- מערבולת חרוזים מצופים נגד CD-31 למשך מספר שניות כדי להשעות מחדש את החרוזים ולהוסיף 30 מיקרוליטר של חרוזים לכל 2 מ"ל של תרחיף תאים. הדקו את המכסה.
- יש לדגור על הצינור למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר על מסובב מקצה לקצה. לאחר מכן מניחים את הצינורות על מפריד מגנטי ומשאירים למשך 2 דקות.
- בעדינות באמצעות זכוכית פסטר, לשאוף את supernatant. הסר את הצינור מהמגנט, השהה מחדש את גלולת תא החרוז על ידי הוספת 3 מ"ל של מדיום בסיסי לצינור, ופיפטה למעלה ולמטה מספר פעמים.
- החליפו את הצינור על המפריד המגנטי למשך 2 דקות, ולאחר מכן שאפו בזהירות את הסופרנאטנט באמצעות פיפט פסטר זכוכית.
- יש לחזור על השטיפות (שלב 4.6-4.7) לפחות 4 פעמים עד שהסופרנאטנט נראה צלול.
- לאחר השטיפה הסופית, להשעות מחדש את גלולת תא החרוז ב 3 מ"ל מדיום צמיחה להשלים ולהעביר אותו צלוחיות T-75. הוסף 7 מ"ל של מדיום הגידול השלם, ודגר ב 37 ° C באינקובטור לח 5% CO2 .
- למחרת לשטוף תאים עם HBSS/CMF, ולאחר מכן להוסיף 10 מ"ל של מדיום שלם טרי. יש להחליף את המדיה ב-10 מ"ל של מדיום שלם טרי כל 2-3 ימים עד למפגש של 90-95%.
הערה: ברגע שהתאים נפגשים ~90-95%, מה שלוקח ~3-4 ימים, התרבית מוכנה לבידוד חיסוני משני.
5. בידוד חיסוני משני ותרבית תאי אנדותל
- יש לשטוף תאי אנדותל דבקים פעמיים עם 10 מ"ל HBSS/CMF. הוסף 2 מ"ל של תמיסת ניתוק תאים ללא טריפסין ודגור ב 37 ° C במשך ~ 5 דקות. ודא שכל התאים הורמו מהצלוחית.
- הוסף 8 מ"ל של תווך בסיסי כדי לנטרל תמיסת ניתוק תאים ולהעביר לצינור חרוטי 15 מ"ל. יש לסחוט כלפי מטה במהירות של 400 x גרם במשך 4 דקות בטמפרטורת החדר.
- מוציאים את הסופרנאטנט בעזרת צינור פסטר זכוכית ומרחפים מחדש את התאים ב -2 מ"ל של מדיום בסיסי. מעבירים את מתלה התאים 2 מ"ל לצינור פוליסטירן תחתון עגול 5 מ"ל.
- מערבולת נגד CD-102 חרוזים מצופים במשך כמה שניות כדי להשעות מחדש את החרוזים ולהוסיף 30 μL של חרוזים עבור כל 2 מ"ל של תרחיף התא. הדקו את המכסה.
- דוגרים על הצינור במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר על מסובב מקצה לקצה. מניחים את הצינורות על מפריד מגנטי ומשאירים למשך 2 דקות. לאחר מכן שאפו בעדינות את הסופרנאטנט באמצעות פיפט פסטר זכוכית.
- הסר את הצינור מהמגנט, השהה מחדש את גלולת תא החרוז על ידי הוספת 3 מ"ל של מדיום בסיסי לצינור, ופיפטה למעלה ולמטה מספר פעמים.
- החליפו את הצינור על המפריד המגנטי למשך 2 דקות לפני שתשאפו בזהירות את הסופרנאטנט באמצעות פיפט פסטר זכוכית.
- יש לחזור על השטיפות (שלב 5.6-5.7) 4 פעמים או יותר עד שהסופרנאטנט נראה צלול.
- לאחר השטיפה הסופית, להשעות מחדש את גלולת תא החרוז ב 3 מ"ל מדיום צמיחה להשלים ולהעביר אותו צלוחיות T-75. הוסף 7 מ"ל מדיום גידול מלא, ודגור ב 37 ° C באינקובטור לח 5% CO2 .
- למחרת לשטוף תאים עם HBSS/CMF, ולאחר מכן להוסיף 10 מ"ל של מדיום שלם טרי. יש להחליף את המדיה ב-10 מ"ל של מדיום שלם טרי כל 2-3 ימים עד למפגש של 90-95%. ברגע שתאי האנדותל נפגשים במלואם, הם מוכנים לניסויים. אין להשתמש בתאים מעבר למעבר השישי מכיוון שהזדקנות עלולה להתרחש, וסוגי תאים אחרים עשויים להשתלט.
6. אישור סמני פני השטח של תאי האנדותל על ידי ציטומטריית זרימה
- לאחר שימוש בתמיסת ניתוק תאים נטולת טריפסין כדי לנתק את התאים, יש להשהות מחדש את גלולת התא ל-1 x 105 תאים/מ"ל ו-aliquot 100 μL של תרחיף התא לשלושה צינורות מיקרוצנטריפוגות של 1.5 מ"ל, המסומנים 1, 2 ו-3.
- לשטוף תאים עם 1 מ"ל של 1x PBS. צנטריפוגה ב 500 x גרם במשך 2 דקות ב 4 ° C. הסירו את מאגר הכביסה וחזרו על הפעולה פעמיים.
- להשעות מחדש את גלולת התא ב 100 μL של 1x PBS. לצינור 1, הוסף 1 μL של נוגדן CD-31 מצומד נגד עכבר (PECAM-1) (לדוגמה: נוגדן CD-31 נגד עכבר phycoerythrin (PE) ו- 1 μL של נוגדן CD-102 מצומד נגד עכבר (ICAM-2) (לדוגמה: נוגדן CD102 נגד עכבר פלואורסצאין (FITC) (ראה טבלת חומרים). לצינור 2, הוסף את פקדי האיזוטיפ המתאימים. צינור מס' 3 יישאר ללא כתמים.
- דוגרים על הצינורות על קרח ובחושך למשך 30-45 דקות.
- הוסף 1 מ"ל PBS לכל צינור, מערבול בעדינות, וצנטריפוגה ב 500 x גרם במשך 2 דקות ב 4 ° C. הסירו את הכביסה וחזרו על הפעולה שלוש פעמים. השהה מחדש את הגלולה הסופית ב 500 μL של PBS.
- שמור את הצינורות מכוסים ברדיד אלומיניום ב 4 ° C עד לניתוח. הניתוח צריך להסתיים תוך 3-4 שעות.
- קבל נתוני זרימה באמצעות ציטומטר. השתמש בדגימה לא מוכתמת כבקרה שלילית כדי להגדיר כראוי מתח לייזר בהתאם לאוטופלואורסצנטיות של התא. שער אוכלוסיית תאים כוללת עם חלקה מפוזרת קדימה וחלקת פיזור צדדית.
הערה: לאחר אי הכללת תאים כפולים, תאים חיוביים כפולים CD31+ CD102+ מוגדרים כתאי אנדותל.
Representative Results
הפרוטוקול הפשוט הזה מאפשר לבודד, לגדל בתרבית ולאפיין תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים של עכברים במשך 7-10 ימים (איור 1). בקצרה, הריאות נכרתו ומתעכלות אנזימטית לפני הציפוי. מיד לאחר הציפוי, תאי אנדותל ותאים אחרים יצופו במדיה של תרביות תאים. עד למחרת, תאי האנדותל והתאים המזהמים יידבקו לצלחת, ויש צורך בטכניקת שטיפה נמרצת כדי להסיר פסולת ואת התאים הצפים. ברגע שהתאים מגיעים למפגש, מתבצעת בחירת האימונובחרוז הראשונה. התאים החיוביים ל-CD-31 מתחילים לגדול במבנה מרוצף אבן (איור 2). תאים שאין להם מורפולוגיה מרוצפת או שגדלו יתר על המידה הם מזהמים ולא תאי אנדותל 13,14,15,16.
לאחר מכן מתבצעת בחירה חיסונית שנייה באמצעות חרוזים מצופים נגד CD-102 כדי להגביר את טוהר תאי האנדותל, בדומה לפרוטוקולים אחרים13,16. תאים שגדלו למפגש לאחר ברירה חיסונית שנייה יכולים לשמש לניסויים. מיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות (FACS) משמש כדי לאשר שאוכלוסיית התאים חיובית ל-CD-31 ול-CD-102 (איור 3).
תאי אנדותל אלה יכולים לשמש ליישומים רבים, כגון חקר מסלולים דלקתיים של אנדותל ותפקוד מחסום האנדותל. לדוגמה, נצפה כי טיפול בציטומיקס מורין (IFNg, TNFa ו-IL1b, כל אחד ב-10 ננוגרם/מ"ל) גרם לייצור IL-6 על-ידי תאי אנדותל (איור 4A). לאחר מכן נעשה שימוש ב-ECIS (Electric Cell-Substrate Impedance Sensing)18 למדידת התנגדות טרנסאנדותל (TER) לזרימת הזרם החשמלי על פני חד-שכבות של תאי אנדותל של ריאות מורין. נצפה כי התאים שטופלו בציטומיקס הובילו לירידה ב-TER (איור 4B), אשר עולה בקנה אחד עם חדירות אנדותל מוגברת. דוגמאות אלה ממחישות כיצד תאי אנדותל שהוכנו באמצעות פרוטוקול זה יכולים לחקור תהליכים אנדותל שונים. זה מאפשר לחוקרים לחקור בקלות רבה יותר גנים בעלי עניין בתאי אנדותל, בהתחשב במספר ההולך וגדל של עכברים זמינים ועכברים טרנסגניים.
איור 1: סכמטי לבידוד של תאי אנדותל ריאתיים מורינים. ריאות של גורי יילודים בני 5-7 ימים נקצרים וטחונים. רקמה טחונה עוכלה אנזימטית עם collagenase I. תרחיף התא מצופה ותרבית במשך 2-3 ימים. לאחר מכן התאים עוברים בידוד חיסוני ראשוני עם חרוזים מצופים CD-31 ועוברים תרבית למשך 3-4 ימים נוספים. בידוד חיסוני שני עם חרוזים מצופים CD-102 לפני תרבית עוד 2-3 ימים. התאים מוכנים כעת לניסויים פונקציונליים. התמונה נוצרה על ידי כלי איור מבוסס אינטרנט, Biorender. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: מורפולוגיה של תאי אנדותל הריאה של מורין. תאי אנדותל ריאתיים מורינים בתרבית מציגים מורפולוגיה מרוצפת. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: ניתוח תאי אנדותל לפי ציטומטריית זרימה. (A) כל האירועים מוצגים באופן חזותי בתרשים נקודות של פיזור קדימה (FSC) ופיזור צד (SSC). (B) אישור תרשים פיזור של תאי אנדותל ריאה מורין חיובי לשני האנטיגנים של פני השטח של התא האנדותל, CD-31 ו-CD-102. (C) היסטוגרמה של דגימת האיזוטיפ והדגימה המוכתמת בנוגדן ספציפי CD-31/CD-102. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: ציטומיקס משרה ייצור תאי אנדותל ריאתיים IL-6 וחדירות תאי אנדותל. תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים של ריאות מורין מעכברי C57BL/6 טופלו בציטומיקס (IFNg, TNFa ו-IL1b, כל אחד ב-10 ננוגרם/מ"ל). (A) רמות IL-6 כומתו אז בסופרנאטים של תרבית ב-15 שעות (**p<0.01, n = 4 בארות/מצב). (B) נעשה שימוש בחישת עכבת תא חשמלי כדי למדוד את ההתנגדות הטרנסאנדותלית (TER) שוב ושוב במשך 15 שעות. הנתונים נורמלו להתנגדות מיד לפני הוספת הציטומיקס כמתוכנן ונותחו על ידי ניתוח דו-כיווני של שונות (ANOVA) ואחריו Tukey לאחר מבחן19 (**p<0.01, n = 4 בארות/מצב). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
Discussion
פרוטוקול פשוט זה משאיל את עצמו לתאי אנדותל בעלי טוהר גבוה מריאות מורין. למרות שהזמן הכולל מתחילתו ועד סופו הוא 7-10 ימים, זמן הידיים הוא סביב 3-4 שעות. בהשוואה לשיטות אחרות13,14,15,16, הפרוטוקול הנוכחי מתייעל, תוך שמירה על צעדים חיוניים מבלי להתפשר על תפוקה וטוהר.
ראוי לציין כמה היבטים קריטיים של פרוטוקול זה. ראשית, חשוב להשתמש בגורים ילודים ולא בעכברים בוגרים. מניסיוננו, תאי אנדותל מעכברים בוגרים אינם מתרבים בקלות כמו תאים של גורים ילודים, והם מוצפים בקלות על ידי תאים בעלי מורפולוגיה דמוית ציר התואמת פיברובלסטים או תאי גזע מזנכימליים15,16. הסבר אפשרי אחד להבדל הוא שהתפתחות הריאות היא בשלב הנאדיות בעכברים ילודים, המאופיין בהתרבות מהירה יותר של תאי אנדותל20. ייתכן שיש גם מידה מסוימת של הזדקנות עם גיל21. גם זמן העיכול האנזימטי צריך להיות מדויק, שכן תת-עיכול עלול להוביל לתרחיף חד-תאי בעל תפוקה נמוכה. לעומת זאת, עיכול יתר יכול להוביל לכמות משמעותית של מוות תאי. קבענו כי הזמן האופטימלי לעיכול collagenase נקבע להיות 45 דקות. לאחר מכן מגיעה דיסוציאציה מכנית עם צינורית קהה. החדרת collagenase intratracheal במהלך עיכול אנזימטי דווח גם14,15; עם זאת, זה יכול להיות זמן רב ומוביל לעיכול לא שלם במהלך העבודה הנוכחית. לבסוף, פרוטוקולים מסוימים ממשיכים ישירות לבידוד חיסוני מיד לאחר עיכול אנזימטי13,16. מצאנו כי תרבית התאים מהריאה המנותקת בתווך במשך יום או יומיים לפני ביצוע בחירת האימונובחרוז מגדילה באופן משמעותי את התשואה של תאי אנדותל בני קיימא וטהורים מאוד. זה עשוי להיות קשור למהירות של הכנסת תאים מבודדים למדיום תרבית הרקמה, מה שמוביל לפחות מוות תאי בשלבים המוקדמים לאחר ההסרה מהעכברים, צפיפות זריעה ראשונית גבוהה יותר, וזמן לתאי האנדותל להיצמד ולהתרבות לפני בידוד האימונובחרוז הראשון.
מגבלות ההכנה והניתוח של תאי אנדותל עכבר הן כדלקמן. כל עכבר מספק רק מספר מוגבל של תאים שיש להשתמש בהם בכמה מעברים. ניתן להתגבר על בעיה זו על ידי איגום עיכול ריאות ממספר עכברים. למרבה הצער, איננו מצליחים במאמצינו לשמר ולהפשיר את התאים לשימוש עתידי. למרות מגבלות אלה, לתאי אנדותל של עכברים יש כמה יתרונות. הם יכולים להיות מועילים, במיוחד במצבים שבהם לא ניתן להשתמש בתאי אנדותל אנושיים (למשל, נוקאאוט גנים), כאשר נדרשים מחקרים משלימים כדי לאמת תוצאות עם תאים אנושיים, או כאשר ההטרוגניות של תגובות של תאי אנדותל מתורמים אנושיים שונים הופכת את יכולת השחזור בין ניסויים לבעייתית6. אוכלוסיית תאי אנדותל הומוגנית מעכברים זהים גנטית מאפשרת רבייה בין ניסויים לחקר גנים ומסלולים ספציפיים בתנאי רקע יציבים.
תאי אנדותל של עכברים יכולים לשמש ליישומים מרובים כדי לספק תובנות לגבי הפעלת אנדותל ותפקוד לקוי בתהליכי מחלה שונים. לדוגמה, תאי אנדותל ממלאים תפקיד אינטגרלי באלח דם, ותורמים לתגובות מועילות ופתולוגיות באמצעות תפקידם בהפעלת דלקת מקומית ומערכתית, קידום סחר והפעלה של לויקוציטים ברקמות, ויסות קרישה וויסות חדירות האנדותל 2,22,23. פרוטוקול פשוט זה מספק תאי אנדותל ברי קיימא ופונקציונליים שניתן להשתמש בהם בבדיקות עבור כל אחד מתהליכי אנדותל אלה.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי NIH T32GM008440 (JH/EW) ו- NIH R01AI058106 (JH). אנו מכירים בליבת הציטומטריה של זרימת UCSF Parnassus (RRID:SCR_018206) הנתמכת בחלקה על ידי Grant NIH P30 DK063720 ועל ידי NIH S10 Instrumentation Grant S10 1S10OD021822-01.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 mL conicals | Corning Life Sciences | 430829 | |
| Accutase Cell Detachment Solution | Innovative Cell Technologies, Inc | AT-104 | |
| BD PrecisionGlide Needle 25 G x 5/8" | Becton Disckinson | 305122 | |
| BioRender.com | BioRender | ||
| Blunt Cannula 15 G x 1-1/2" | Covidien | 8881202314 | |
| CD-102 Rat anti-mouse (3C4 (MIC2/4)) | BD Biosciences | 553326 | |
| CD-31 Rat anti-mouse (MEC 13.3) | BD Biosciences | 557355 | |
| Collagenase, Type 1 | Worthington Biochemical Corp | LS004194 | |
| DMEM, high glucose | Gibco | 11965092 | |
| Dynabeads Sheep Anti-Rat IgG | Invitrogen | 11035 | |
| Endothelial Cell Growth Supplment | EMD Millipore Corp | 02-102 | |
| Falcon cell strainers (70 µm) | Corning Life Sciences | 352350 | |
| Fetal Bovine Serum, heat inactivated | Gibco | 10082-147 | |
| Fine Scissors | Fine Science Tools | 14060-09 | |
| Fine Scissors | Fine Science Tools | 14060-10 | |
| Fisherbrand Disposable Borosilicate Glass Pasteur Pipets | Fisher Scientific | 13-678-20B | |
| FITC Rat Anti-mouse CD102 (3C4) | BD Biosciences | 557444 | |
| FITC Rat IgG2a, κ Isotype Control (R35-95) | BD Biosciences | 553929 | |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11050-10 | |
| HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red | Gibco | 14175095 | |
| Heparin Sodium Injections (1,000 Units/mL) | Medline | 0409-2720-02 | |
| Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma | H3393 | |
| HEPES (1 M) | Gibco | 15630106 | |
| Nonessential amino acids (100x) | Gibco | 11140050 | |
| PE Rat Anti-mouse CD31 (MEC 13.3) | BD Biosciences | 553373 | |
| PE Rat IgG2a, κ Isotype Control R35-95) | BD Biosciences | 553930 | |
| Penicillin Streptomycin (10,000 U/mL, 10,000 µg/mL) | Gibco | 15140122 | |
| Recombinant Murine IFN-γ | Peprotech | 315-05 | |
| Recombinant Murine IL-1β | Peprotech | 211-11B | |
| Recombinant Murine TNF-α | Peprotech | 315-01A | |
| Round bottom polystyrene test tubes | Corning Life Sciences | 352058 | |
| Semken Forceps | Fine Science Tools | 11008-13 | |
| Sodium pyruvate (100 mM) | Gibco | 11360070 | |
| Stericup Quick Release-GP Sterile Vacuum Filtration System, 250 mL | Millipore | S2GPU02RE | |
| Steriflip-GP Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit | Milipore | SCGP00525 | |
| Sterile syringe (10 mL) | Fisher Scientific | 14-955-459 | |
| Sterile syringe (20 mL) | Fisher Scientific | 14-955-460 | |
| T-75 cell culture flask with vent cap, CellBIND treated | Corning Life Sciences | 3290 |
References
- Maniatis, N. A., Orfanos, S. E. The endothelium in acute lung injury/acute respiratory distress syndrome. Current Opinion Critical Care. 14 (1), 22-30 (2008).
- Khakpour, S., Wilhelmsen, K., Hellman, J. Vascular endothelial cell Toll-like receptor pathways in sepsis. Innate Immunity. 21 (8), 827-846 (2015).
- Tuttolomondo, A., Daidone, M., Pinto, A. Endothelial dysfunction and inflammation in ischemic stroke pathogenesis. Current Pharmaceutical Design. 26 (34), 4209-4219 (2020).
- Roberts, A. C., Porter, K. E. Cellular and molecular mechanisms of endothelial dysfunction in diabetes. Diabetes and Vascular Disease Research. 10 (6), 472-482 (2013).
- Widmer, R. J., Lerman, A. Endothelial dysfunction and cardiovascular disease. Global Cardiology Science and Practice. 2014 (3), 291-308 (2014).
- Joffre, J., et al. Catecholaminergic vasopressors reduce toll-like receptor agonist-induced microvascular endothelial cell permeability but not cytokine production. Critical Care Medicine. 49 (3), 315-326 (2021).
- Yan, J., Nunn, A. D., Thomas, R. Selective induction of cell adhesion molecules by proinflammatory mediators in human cardiac microvascular endothelial cells in culture. International Journal of Clinical and Experimental Medicine. 3 (4), 315-331 (2010).
- Bouïs, D., Hospers, G. A., Meijer, C., Molema, G., Mulder, N. H. Endothelium in vitro: A review of human vascular endothelial cell lines for blood vessel-related research. Angiogenesis. 4 (2), 91-102 (2001).
- Nolte, A., et al. Optimized basic conditions are essential for successful siRNA transfection into primary endothelial cells. Oligonucleotides. 19 (2), 141-150 (2009).
- Auguste, D. T., et al. Triggered release of siRNA from poly(ethylene glycol)-protected, pH-dependent liposomes. Journal of Controlled Release. 130 (3), 266-274 (2008).
- Gumkowski, F., Kaminska, G., Kaminski, M., Morrissey, L. W., Auerbach, R. Heterogeneity of mouse vascular endothelium. In vitro studies of lymphatic, large blood vessel and microvascular endothelial cells. Blood Vessels. 24 (1-2), 11-23 (1987).
- Alphonse, R. S., et al. The isolation and culture of endothelial colony-forming cells from human and rat lungs. Nature Protocols. 10 (11), 1697-1708 (2015).
- Lim, Y. -C., Luscinskas, F. W. Isolation and culture of murine heart and lung endothelial cells for in vitro model systems. Methods in Molecular Biology. 341, 141-154 (2006).
- Cao, G., Abraham, V., DeLisser, H. M. Isolation of endothelial cells from mouse lung. Current Protocols in Toxicoly. 61, 1-9 (2014).
- Fehrenbach, M. L., Cao, G., Williams, J. T., Finklestein, J. M., Delisser, H. M. Isolation of murine lung endothelial cells. American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 296 (6), 1096-1103 (2009).
- Wang, J., Niu, N., Xu, S., Jin, Z. G. A simple protocol for isolating mouse lung endothelial cells. Scientific Reports. 9 (1), 1458 (2019).
- Sutermaster, B. A., Darling, E. M. Considerations for high-yield, high-throughput cell enrichment: fluorescence versus magnetic sorting. Scientific Reports. 9 (1), 227 (2019).
- Szulcek, R., Bogaard, H. J., van Nieuw Amerongen, G. P. Electric cell-substrate impedance sensing for the quantification of endothelial proliferation, barrier function, and motility. Journal of Visualized Experiments. (85), e51300 (2014).
- Wong, E., et al. ERK1/2 has divergent roles in lps-induced microvascular endothelial cell cytokine production and permeability. Shock. 55 (3), 349-356 (2020).
- Domm, W., Misra, R. S., O'Reilly, M. A. Affect of early life oxygen exposure on proper lung development and response to respiratory viral infections. Frontiers in Medicine (Lausanne). 2, 55 (2015).
- Jia, G., Aroor, A. R., Jia, C., Sowers, J. R. Endothelial cell senescence in aging-related vascular dysfunction. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Basis of Disease. 1865 (7), 1802-1809 (2019).
- Joffre, J., Hellman, J., Ince, C., Ait-Oufella, H. Endothelial responses in sepsis. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 202 (3), 361-370 (2020).
- Aird, W. C. The role of the endothelium in severe sepsis and multiple organ dysfunction syndrome. Blood. 101 (10), 3765-3777 (2003).
