Summary
In dit artikel werden primaire longendotheelcellen geïsoleerd en gekweekt uit neonatale muizen.
Abstract
Endotheelcellen spelen een cruciale rol bij de regulatie van de vasculaire tonus, immuniteit, stolling en permeabiliteit. Endotheeldisfunctie komt voor bij medische aandoeningen, waaronder diabetes, atherosclerose, sepsis en acuut longletsel. Een betrouwbare en reproduceerbare methode om zuivere endotheelcellen van muizen te isoleren is nodig om de rol van endotheelcellen in de pathogenese van deze en andere aandoeningen te onderzoeken. In dit protocol werden longmicrovasculaire endotheelcellen bereid uit 5-7 dagen oude neonatale muizenpups. Longen worden geoogst, gehakt en enzymatisch verteerd met collagenase I, en vrijgegeven cellen worden 's nachts gekweekt. Endotheelcellen worden vervolgens geselecteerd met behulp van anti-PECAM1 (CD-31) IgG geconjugeerd aan magnetische kralen, en cellen worden opnieuw gekweekt tot samenvloeiing. Een secundaire celselectie vindt dan plaats met anti-ICAM2 (CD-102) IgG geconjugeerd aan magnetische kralen om de zuiverheid van de endotheelcellen te verhogen, en de cellen worden opnieuw gekweekt tot samenvloeiing. Het hele proces duurt ongeveer 7-10 dagen voordat de cellen kunnen worden gebruikt voor experimenten. Dit eenvoudige protocol levert zeer zuivere (zuiverheid >92%) endotheelcellen op die onmiddellijk kunnen worden gebruikt voor in vitro studies, waaronder de studies gericht op endotheelcytokine- en chemokineproductie, leukocyt-endotheelinteracties, endotheelstollingsroutes en endotheelpermeabiliteit. Met veel knock-outs en transgene muislijnen beschikbaar, leent deze procedure zich ook voor het begrijpen van de functie van specifieke genen die door endotheelcellen tot expressie worden gebracht in gezonde en pathologische reacties op letsel, infectie en ontsteking.
Introduction
De interesse in het bestuderen van het vasculaire endotheel is onlangs gegroeid, omdat disfunctie van microvasculaire endotheelcellen voorkomt bij meerdere menselijke ziekten, zoals beroerte, hart- en vaatziekten, diabetes, acuut longletsel, sepsis en niet-infectieuze verwondingen 1,2,3,4,5. Om de pathogenese van deze aandoeningen te definiëren en de rol van specifieke genen in beschermende en ontregelde endotheelcelresponsen te begrijpen, is er behoefte aan betrouwbare methoden om microvasculaire endotheelcellen met een hoge zuiverheid van muizen te isoleren en te kweken. Hoewel veel studies menselijke endotheelcellen gebruiken, zoals menselijke navelstreng-endotheelcellen (HUVEC) of menselijke longmicrovasculaire endotheelcellen (HMVEC), zijn er meerdere redenen om endotheelcellen van muizen te gebruiken om endotheelfunctie en disfunctie te bestuderen. Ten eerste is er een aanzienlijke heterogeniteit in de respons van endotheelcellen van verschillende menselijke donoren, wat leidt tot variabiliteit in resultaten tussen individuele experimenten 6,7,8. Ten tweede kan het uitschakelen van gendoelen in primaire menselijke cellijnen ook leiden tot variabele eiwitexpressieniveaus 9,10. Daarentegen is er minimale heterogeniteit in de responsen van endotheelcellen van muizen11, ervan uitgaande dat de genetische achtergrond hetzelfde is tussen studiegroepen. Bovendien kunnen grote aantallen endotheelcellen van muizen worden bereid door longen van verschillende neonatale muizen samen te voegen. Deze factoren zorgen voor meer consistente en reproduceerbare resultaten tussen experimenten. Ten slotte zorgt de beschikbaarheid van knock-out of transgene muizen ook voor de isolatie van celtypen zonder eiwitten van belang.
De aanzienlijke uitdagingen bij het isoleren van gezonde en zuivere populaties van muizenlong-endotheelcellen met behulp van gepubliceerde methoden 12,13,14,15,16 leidden tot de ontwikkeling van een betrouwbaardere en eenvoudigere methode om hoogwaardige muislongmicrovasculaire endotheelcellen te isoleren. Voordelen van het huidige protocol zijn onder meer het gebruik van neonatale muizen, die direct beschikbaar zijn, waardoor de veehouderij en huisvestingskosten worden beperkt. Bovendien is in onze ervaring de levensvatbaarheid van endotheelcellen van neonatale muizen aanzienlijk hoger dan endotheelcellen bereid uit volwassen muizen. Omdat neonatale muizen klein longweefsel hebben, kunnen endotheelcellen worden geoogst door weggesneden longen in collagenase te verteren in plaats van tracheale instillatie van collagenase te gebruiken, wat wordt aanbevolen voor verzameling van volwassen muizen16. Dit vermindert ook de tijd tussen het euthanaseren van muizen en het krijgen van hun endotheelcellen in celkweekmedia en de incubator zonder de zuiverheid of opbrengst of de reproduceerbaarheid van endotheelreacties te beïnvloeden. Ten slotte werden zuivere celpopulaties geïsoleerd zonder flowcytometrie, wat kan leiden tot lagere opbrengsten van de endotheelcellen14,15,17.
Het huidige aangepaste protocol leidt consequent tot hoge zuiverheid en levensvatbare endotheelcellen in 7-10 dagen die onmiddellijk kunnen worden gebruikt voor in vitro experimenten. Het isoleren van cellen rechtstreeks van knock-out dieren minimaliseert ook de manipulatie van cellen vóór experimenten. Deze methoden kunnen worden gebruikt om de rol van verschillende eiwitten in de endotheelfunctie te onderzoeken om op endotheel gebaseerde therapeutische doelen voor meerdere ziekten te ontdekken.
Protocol
Alle dierprocedures werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee van de University of California San Francisco. Mannelijke C57BL/6 neonatale muizenpups (leeftijd 5-7 dagen) werden gebruikt voor het onderzoek. Het hele protocol duurt 7-10 dagen (figuur 1).
1. Bereiding van endotheelcelmedium
- Bereid het basale medium: Dulbecco's Modified Eagle Medium met 4.500 mg/L glucose en 4 mM L-Glutamine (DMEM) aangevuld met 20% (v/v) warmte-geïnactiveerd foetaal runderserum, 100 U/100 μg/ml penicilline/streptomycine en 25 mM HEPES (zie tabel met materialen). Steriel filter met 22 μM filter. Bewaar basaal medium bij 4 °C en gebruik het binnen een maand na bereiding.
- Bereid het volledige medium: Basaal medium aangevuld met 100 μg/ml heparine, 100 μg/ml endotheelcelgroeisupplement, 1x niet-essentiële aminozuren en 1 mM natriumpyruvaat (zie materiaaltabel). Steriel filter met 22 μM filter. Bewaren bij 4 °C en binnen een maand na bereiding gebruiken.
2. Voorcoating van anti-rat magnetische kralen13
- Maak 50 ml kralenwasbuffer: Fosfaat-gebufferde oplossing (PBS) aangevuld met 0,1% (m/v) runderserumalbumine (BSA). Steriel filter met 22 μM filter en bewaren bij 4 °C en binnen een maand na bereiding gebruiken.
- Draai de magnetische kralen gedurende enkele seconden om de kralen en pipet 50 μL van de kralen (2 x 107 kralen) opnieuw te laten zweven in twee microcentrifugebuizen van 1,5 ml, één voor CD-31 en één voor CD-102 (zie materiaaltabel). Voeg 1 ml kralenwasbuffer toe en meng goed.
OPMERKING: Alle genoemde volumes werden gebruikt om endotheelcellen te isoleren van 3-4 neonatale muizenpups (5-7 dagen oud). CD-31 en CD-102 zijn de endotheelceloppervlakmarkers die worden gebruikt voor magnetische immunokraalselectie. - Plaats de buizen op een magnetische afscheider en verwijder het supernatant met een glazen Pasteur-pipet. Herhaal de was 3 keer met telkens 1 ml kralenwasbuffer.
- Resuspendie kralen in origineel kraalvolume, 50 μL, met kralenwasbuffer. Voeg vervolgens 5 μL (2,5 μg) antilichaam (CD-31/CD-102) toe aan elke 50 μL kralen.
- Incubeer de kraalsuspensie bij zachte rotatie op een end-over-end rotator gedurende een nacht bij 4 °C of gedurende 3 uur bij kamertemperatuur. Herhaal de was 4 keer.
- Resuspendie van de immunobeads in het oorspronkelijke volume, 50 μL, met bead wash buffer en bewaren bij 4 °C en binnen 1-2 weken gebruiken.
3. Isolatie en plating van de longcellen
- Bereid type 1 collagenase-oplossing op de dag van isolatie: voeg 25 mg type 1 collagenase toe aan 25 ml HBSS (zie materiaaltabel). Incubeer bij 37 °C gedurende 1 uur met zachte rotatie en steriel filter met behulp van een filter van 22 μM. Houd de oplossing warm bij 37 °C.
- Injecteer 5-7 dagen oude muizenjongen intramusculair met heparine (25 μL/muis, 1.000 E/ml) 10 min voor euthanasie om endotheelcelactivering en stolselvorming te minimaliseren14,15.
- Euthanaseer de muispup met onthoofding met een scherpe schaar volgens de AVMA-richtlijnen voor euthanasie 2020. Pin vervolgens de muis vast aan een snijbord met ventrale kant naar boven.
- Spuit het karkas met 70% ethanol en leg vervolgens de thoracale holte bloot door eerst het diafragma te snijden en vervolgens superieur naar boven te snijden langs de gehele zijwanden van de borst. Het reflecteren van de ribbenkast van toen legt het hart en de longen bloot.
OPMERKING: Gebruik een kleinere tang en schaar voor deze stap gezien de kleine omvang van neonatale muizen en zorg ervoor dat u het hart of de longen niet doorboort, omdat dit zal leiden tot onvoldoende bloedverwijdering uit de longen. - Bevestig een naald van 25 G aan een spuit van 10 ml en injecteer 5 ml koude DMEM in de rechterkamer van het hart om bloed uit de longen te verwijderen. De longen worden wit.
- Verwijder de longen uit de thoracale holte, één lob per keer, door de lobben distaal van de overeenkomstige bronchiën te snijden.
- Bundel alle longkwabben in een conische buis van 50 ml die voorgevuld is met 20 ml ijskoud basaal medium (vanaf stap 1.1).
- Herhaal stap 3.2-3.7 met de andere muizenpups en bundel alle longkwabben in dezelfde conische buis van 50 ml.
- Roer de buis voorzichtig met de hand gedurende 10-15 s om overtollige rode bloedcellen te wassen die visueel worden gewaardeerd op het oppervlak van de longen.
OPMERKING: Het is niet nodig om al het bloed uit of rond de longen te verwijderen; Dit verbetert echter de zuiverheid. Elke verdere weefselbehandeling moet in een steriele kap worden uitgevoerd. - Gebruik een celzeef om de longen uit de media te verwijderen en breng het weefsel over naar een steriele, wegwerpbare weefselkweekschaal met een diameter van 100 mm en gehakt met een gesteriliseerde schaar.
- Breng het gehakte weefsel over in de 50 ml conische buis met 25 ml voorverwarmde collagenase-oplossing (stap 3.1). Roer zachtjes op een roterende mixer gedurende 45 minuten bij 37 °C.
OPMERKING: Overdigestie gedurende zelfs 60 minuten kan leiden tot lagere opbrengsten. - Bevestig een spuit van 20 ml aan een stompe canule van 15 G (zie materiaaltabel) en tritueer de suspensie 10-15 keer om het weefsel op te breken tot een cellulaire suspensie. Wees krachtig, maar vermijd overschuimen.
OPMERKING: Er zullen geen zichtbare delen van de long meer zijn en in plaats daarvan zal de suspensie troebel zijn na voltooiing van deze stap. - Filtreer de suspensie door een 70 μm celzeef in een verse conische buis van 50 ml. Spoel verder de conische buis die wordt gebruikt voor de spijsvertering en de celzeef met een extra 15 ml basaal medium.
- Centrifugeer de cellulaire suspensie gedurende 8 minuten bij 400 x g bij 4 °C.
- Verwijder het supernatant met een glazen Pasteur-pipet en resuspensie van de pellet in 2 ml volledig medium. Breng over in een T-75-kolf en voeg 8 ml volledige mediumcultuur bij 37 °C toe in een bevochtigde couveuse van 5% CO2 .
- Was de volgende dag kolven tweemaal met 10 ml Hank's Balanced Salt Solution zonder calcium en magnesium (HBSS/CMF) (zie materiaaltabel) en voeg 10 ml compleet medium toe.
OPMERKING: Na 2-3 dagen is de cultuur 90-95% confluent en klaar voor primaire immunobead-isolatie.
4. Primaire immunobead isolatie en kweken van endotheelcellen
- Was adherente endotheelcellen tweemaal met 10 ml HBSS/CMF. Voeg 2 ml trypsinevrije celloslatingsoplossing toe (zie materiaaltabel) en incubeer gedurende ~5 minuten bij 37 °C. Zorg ervoor dat alle cellen uit de kolf zijn getild.
OPMERKING: In plaats van trypsine moet een trypsinevrije loslatingsoplossing worden gebruikt, omdat trypsine de hechtingsmarker CD-31 van het celoppervlak kan verstoren. - Voeg 8 ml basaal medium toe om de celloslatingsoplossing te neutraliseren en breng de inhoud over naar een conische buis van 15 ml. Draai 4 minuten op 400 x g bij kamertemperatuur.
- Verwijder het supernatant met behulp van een glazen Pasteur-pipet en resuspensie cellen in 2 ml basaal medium. Breng de 2 ml celsuspensie over in een polystyreenbuis met ronde bodem van 5 ml (zie materiaaltabel).
- Vortex anti-CD-31 gecoate kralen gedurende enkele seconden om de kralen te resuspenderen en voeg 30 μL kralen toe voor elke 2 ml celsuspensie. Zet het deksel vast.
- Incubeer de buis gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur op een end-over-end rotator. Plaats vervolgens de buizen op een magnetische afscheider en laat 2 minuten staan.
- Gebruik voorzichtig een glazen Pasteur-pipet en zuig het supernatant op. Verwijder de buis van de magneet, resuspendien de kraalcelkorrel door 3 ml basaal medium aan de buis toe te voegen en pipetteer meerdere keren op en neer.
- Vervang de buis op de magnetische afscheider gedurende 2 minuten en zuig het supernatant voorzichtig op met behulp van een glazen Pasteur-pipet.
- Herhaal de wasbeurten (stap 4.6-4.7) minstens 4 keer totdat het supernatant helder lijkt.
- Na de laatste wasbeurt, resuspendeerde de kraalcelkorrel in 3 ml volledig groeimedium en breng het over in een T-75 kolf. Voeg 7 ml van het volledige groeimedium toe en incubeer bij 37 °C in een bevochtigde 5% CO 2-incubator.
- Was de volgende dag cellen met HBSS/CMF en voeg vervolgens 10 ml vers medium toe. Vervang media door 10 ml vers compleet medium om de 2-3 dagen tot 90-95% confluent.
OPMERKING: Zodra cellen ~ 90-95% confluent zijn, wat ~ 3-4 dagen duurt, is de cultuur klaar voor secundaire immunobead-isolatie.
5. Secundaire immunobead isolatie en kweken van endotheelcellen
- Was adherente endotheelcellen tweemaal met 10 ml HBSS/CMF. Voeg 2 ml trypsinevrije celloslatingsoplossing toe en incubeer bij 37 °C gedurende ~5 min. Zorg ervoor dat alle cellen uit de kolf zijn getild.
- Voeg 8 ml basaal medium toe om de celloslatingsoplossing te neutraliseren en breng over in een conische buis van 15 ml. Draai 4 minuten op 400 x g bij kamertemperatuur.
- Verwijder het supernatant met behulp van een glazen Pasteur-pipet en resuspensie van de cellen in 2 ml basaal medium. Breng de 2 ml celsuspensie over in een 5 ml ronde bodempolystyreenbuis.
- Vortex anti-CD-102 gecoate kralen gedurende enkele seconden om de kralen te resuspenderen en voeg 30 μL kralen toe voor elke 2 ml celsuspensie. Zet het deksel vast.
- Incubeer de buis gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur op een end-over-end rotator. Plaats de buizen op een magnetische afscheider en laat 2 minuten staan. Zuig vervolgens het supernatant voorzichtig aan met behulp van een glazen Pasteur-pipet.
- Verwijder de buis van de magneet, resuspendien de kraalcelkorrel door 3 ml basaal medium aan de buis toe te voegen en pipetteer meerdere keren op en neer.
- Vervang de buis op de magnetische afscheider gedurende 2 minuten voordat u het supernatant voorzichtig aanzuigt met behulp van een glazen Pasteur-pipet.
- Herhaal wasbeurten (stap 5.6-5.7) 4 keer of meer totdat het supernatant helder lijkt.
- Na de laatste wasbeurt, resuspendeerde de kraalcelkorrel in 3 ml volledig groeimedium en breng het over in een T-75 kolf. Voeg 7 ml compleet groeimedium toe en incubeer bij 37 °C in een bevochtigde 5% CO 2-incubator.
- Was de volgende dag cellen met HBSS/CMF en voeg vervolgens 10 ml vers medium toe. Vervang media door 10 ml vers compleet medium om de 2-3 dagen tot 90-95% confluent. Zodra de endotheelcellen volledig samenvloeien, zijn ze klaar voor experimenten. De cellen mogen niet worden gebruikt na passage zes, omdat senescentie kan optreden en andere celtypen het kunnen overnemen.
6. Bevestiging van de endotheelceloppervlakmarkers door flowcytometrie
- Na het gebruik van trypsinevrije celloslatingsoplossing om de cellen los te maken, resuspendeert u de celpellet tot 1 x 10 5 cellen / ml en aliquot 100 μL van de celsuspensie in drie microcentrifugebuizen van1,5 ml, gelabeld 1, 2 en 3.
- Was cellen met 1 ml 1x PBS. Centrifugeer bij 500 x g gedurende 2 minuten bij 4 °C. Verwijder de wasbuffer en herhaal dit twee keer.
- Resuspendie van de celkorrel in 100 μL van 1x PBS. Voeg aan buis 1 μL geconjugeerd antimuis CD-31 (PECAM-1) antilichaam (bijv. fycoerythrin (PE) antimuis CD-31 antilichaam) en 1 μL geconjugeerd antimuis CD-102 (ICAM-2) (bijv. fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC) antimuis CD102-antilichaam toe) (zie materiaaltabel). Voeg aan buis 2 de juiste isotypecontroles toe. Buis nr. 3 blijft onbevlekt.
- Incubeer de buizen op ijs en in het donker gedurende 30-45 minuten.
- Voeg 1 ml PBS toe aan elke buis, vortex voorzichtig, en centrifugeer op 500 x g gedurende 2 minuten bij 4 °C. Verwijder de was en herhaal dit drie keer. Resuspensie van de laatste pellet in 500 μL PBS.
- Houd de buizen afgedekt met aluminiumfolie op 4 °C tot de analyse. De analyse moet binnen 3-4 uur worden voltooid.
- Verkrijg stroomgegevens met behulp van een cytometer. Gebruik een niet-gekleurd monster als een negatieve controle om de laserspanning correct in te stellen op basis van celautofluorescentie. Poort totale celpopulatie met een naar voren verspreid perceel en zijverstrooiingsplot.
OPMERKING: Na het uitsluiten van doubletten worden CD31+ CD102+ dubbelpositieve cellen gedefinieerd als endotheelcellen.
Representative Results
Met dit eenvoudige protocol kan men microvasculaire endotheelcellen van muizen gedurende 7-10 dagen isoleren, kweken en karakteriseren (figuur 1). Kortom, longen worden weggesneden en enzymatisch verteerd voordat ze worden platgelegd. Onmiddellijk na het plateren zullen endotheelcellen en andere cellen in celkweekmedia drijven. Tegen de volgende dag zullen endotheelcellen en de verontreinigende cellen aan de plaat worden gehecht en is een krachtige wastechniek nodig om puin en de drijvende cellen te verwijderen. Zodra de cellen samenvloeiing bereiken, wordt de eerste immunobeadselectie uitgevoerd. De CD-31-positieve cellen beginnen dan te groeien in een kasseiformatie (figuur 2). Cellen die geen kasseimorfologie hebben of overwoekeren zijn verontreinigingen en geen endotheelcellen13,14,15,16.
Een tweede immunobeadselectie wordt vervolgens uitgevoerd met behulp van anti-CD-102 gecoate kralen om de zuiverheid van endotheelcellen te verhogen, vergelijkbaar met andere protocollen13,16. Cellen die na tweede immunobeadselectie tot samenvloeiing zijn gegroeid, kunnen vervolgens worden gebruikt voor experimenten. Fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) wordt gebruikt om te bevestigen dat de celpopulatie CD-31- en CD-102-positief is (figuur 3).
Deze endotheelcellen kunnen vervolgens voor vele toepassingen worden gebruikt, zoals het bestuderen van endotheelontstekingsroutes en de endotheelbarrièrefunctie. Er werd bijvoorbeeld waargenomen dat behandeling met murine cytomix (IFNg, TNFa en IL1b, elk bij 10 ng / ml) IL-6-productie door endotheelcellen veroorzaakte (figuur 4A). Vervolgens werd Electric Cell-substrate Impedance Sensing (ECIS)18 gebruikt om transendotheliale weerstand (TER) te meten tegen de stroom van elektrische stroom over murine long endotheliale cel monolagen. Er werd waargenomen dat de cellen behandeld met cytomix leidden tot een afname van TER (figuur 4B), wat consistent is met een verhoogde endotheelpermeabiliteit. Deze voorbeelden illustreren hoe de endotheelcellen die met behulp van dit protocol zijn bereid, verschillende endotheelprocessen kunnen bestuderen. Dit stelt onderzoekers in staat om genen die van belang zijn in endotheelcellen gemakkelijker te bestuderen, gezien het steeds groeiende aantal beschikbare knock-out- en transgene muizen.
Figuur 1: Schema voor isolatie van muriene long endotheelcellen. Longen van 5-7 dagen oude neonatale pups worden geoogst en gehakt. Gehakt weefsel werd enzymatisch verteerd met collagenase I. Cellulaire suspensie wordt gedurende 2-3 dagen verguld en gekweekt. Cellen ondergaan vervolgens primaire immunobead-isolatie met CD-31-gecoate kralen en worden nog eens 3-4 dagen gekweekt. Tweede immunobead isolatie met CD-102-gecoate kralen voordat het nog eens 2-3 dagen wordt gekweekt. Cellen zijn nu klaar voor functionele experimenten. De afbeelding is gemaakt door een webgebaseerde illustratietool, Biorender. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Morfologie van de muriene long endotheelcellen. Gekweekte muriene long endotheelcellen vertonen een kasseimorfologie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Analyse van endotheelcellen door flowcytometrie. (A) Alle gebeurtenissen worden gevisualiseerd op een dot plot van de Forward Scatter (FSC) en Side Scatter (SSC). (B) Scatter plot bevestiging van muriene long endotheelcellen die positief zijn voor zowel endotheel-specifieke celoppervlakantigenen CD-31 als CD-102. (C) Histogram van het isotypemonster en het monster gekleurd met CD-31/CD-102-specifiek antilichaam. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Cytomix induceert muriene long endotheliale cel IL-6 productie en endotheelcel permeabiliteit. Murine long microvasculaire endotheelcellen van C57BL/6 muizen werden behandeld met cytomix (IFNg, TNFa en IL1b, elk bij 10 ng/ml). (A) IL-6-niveaus werden vervolgens gekwantificeerd in kweeksupernatanten na 15 h (**p<0,01, n = 4 putten/toestand). (B) Electric Cell-Substrate Impedance Sensing werd gebruikt om de transendotheliale weerstand (TER) herhaaldelijk gedurende 15 uur te meten. De gegevens werden genormaliseerd naar de resistentie onmiddellijk vóór de toevoeging van de cytomix zoals aangegeven en werden geanalyseerd door tweerichtingsanalyse van variantie (ANOVA) gevolgd door de Tukey post-test19 (**p<0,01, n = 4 putten/conditie). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Discussion
Dit eenvoudige protocol leent zich voor zeer zuivere endotheelcellen uit muizenlongen. Hoewel de totale tijd van begin tot eind 7-10 dagen is, is de hands-on tijd ongeveer 3-4 uur. In vergelijking met andere methoden13,14,15,16 is het huidige protocol gestroomlijnd, waarbij essentiële stappen worden behouden zonder afbreuk te doen aan opbrengst en zuiverheid.
Het is vermeldenswaard enkele kritische aspecten van dit protocol. Ten eerste is het belangrijk om neonatale pups te gebruiken in plaats van volwassen muizen. In onze ervaring vermenigvuldigen endotheelcellen van volwassen muizen zich niet zo gemakkelijk als cellen van neonatale pups, en ze worden gemakkelijk overspoeld door cellen met spindelachtige morfologie die consistent is met fibroblasten of mesenchymale stamcellen15,16. Een mogelijke verklaring voor het verschil is dat de longontwikkeling zich in het alveolaire stadium bevindt bij neonatale muizen, gekenmerkt door de snellere proliferatie van endotheelcellen20. Er kan ook een zekere mate van veroudering zijn met het ouder worden21. Enzymatische verteringstijd moet ook nauwkeurig zijn, omdat onderdigestie kan leiden tot een eencellige suspensie met een lage opbrengst. Daarentegen kan oververtering leiden tot een aanzienlijke hoeveelheid celdood. We hebben vastgesteld dat de optimale tijd voor collagenasevertering is bepaald op 45 minuten. Dit wordt dan gevolgd door mechanische dissociatie met een stompe canule. Het inbrengen van intratracheal collagenase tijdens enzymatische spijsvertering is ook gemeld14,15; Dit kan echter tijdrovend zijn en leidt tot onvolledige spijsvertering tijdens het huidige werk. Ten slotte gaan sommige protocollen direct over tot immunobead-isolatie onmiddellijk na enzymatische vertering13,16. We hebben ontdekt dat het kweken van de cellen uit de gedissocieerde long in het medium gedurende een dag of twee voordat de immunobead-selectie wordt gemaakt, de opbrengst van levensvatbare en zeer zuivere endotheelcellen aanzienlijk verhoogt. Dit kan verband houden met de snelheid waarmee geïsoleerde cellen in het weefselkweekmedium worden gebracht, wat leidt tot minder celdood in de vroege stadia na verwijdering van de muizen, een hogere initiële zaaidichtheid en tijd voor de endotheelcellen om zich te hechten en te prolifereren vóór de eerste immunobead-isolatie.
Beperkingen van de bereiding en analyse van endotheelcellen van muizen zijn als volgt. Elke muis levert slechts een beperkt aantal cellen die binnen enkele passages moeten worden gebruikt. Dit probleem kan worden opgelost door de longvertering van verschillende muizen te bundelen. Helaas zijn we niet succesvol in onze pogingen om de cellen te cryopreserveren en te ontdooien voor toekomstig gebruik. Ondanks deze beperkingen hebben endotheelcellen van muizen enkele voordelen. Ze kunnen nuttig zijn, met name in situaties waarin menselijke endotheelcellen niet kunnen worden gebruikt (bijv. gen knock-out), wanneer aanvullende studies nodig zijn om resultaten met menselijke cellen te bevestigen, of wanneer de heterogeniteit van reacties van endotheelcellen van verschillende menselijke donoren reproduceerbaarheid tussen experimenten problematisch maakt6. De homogene endotheelcelpopulatie van genetisch identieke muizen zorgt voor reproduceerbaarheid tussen experimenten en de studie van specifieke genen en routes onder stabiele achtergrondomstandigheden.
Endotheelcellen van muizen kunnen voor meerdere toepassingen worden gebruikt om inzicht te geven in endotheelactivatie en disfunctie in verschillende ziekteprocessen. Endotheelcellen spelen bijvoorbeeld een integrale rol bij sepsis en dragen bij aan zowel gunstige als pathologische reacties door hun rol bij het activeren van gelokaliseerde en systemische ontsteking, het bevorderen van leukocytenhandel en activering in weefsels, het reguleren van stolling en het moduleren van endotheelpermeabiliteit 2,22,23. Dit eenvoudige protocol biedt levensvatbare, functionele endotheelcellen die kunnen worden gebruikt in assays voor elk van deze endotheelprocessen.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door NIH T32GM008440 (JH / EW) en NIH R01AI058106 (JH). We erkennen de UCSF Parnassus Flow Cytometry Core (RRID:SCR_018206) die gedeeltelijk wordt ondersteund door Grant NIH P30 DK063720 en door de NIH S10 Instrumentation Grant S10 1S10OD021822-01.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 mL conicals | Corning Life Sciences | 430829 | |
| Accutase Cell Detachment Solution | Innovative Cell Technologies, Inc | AT-104 | |
| BD PrecisionGlide Needle 25 G x 5/8" | Becton Disckinson | 305122 | |
| BioRender.com | BioRender | ||
| Blunt Cannula 15 G x 1-1/2" | Covidien | 8881202314 | |
| CD-102 Rat anti-mouse (3C4 (MIC2/4)) | BD Biosciences | 553326 | |
| CD-31 Rat anti-mouse (MEC 13.3) | BD Biosciences | 557355 | |
| Collagenase, Type 1 | Worthington Biochemical Corp | LS004194 | |
| DMEM, high glucose | Gibco | 11965092 | |
| Dynabeads Sheep Anti-Rat IgG | Invitrogen | 11035 | |
| Endothelial Cell Growth Supplment | EMD Millipore Corp | 02-102 | |
| Falcon cell strainers (70 µm) | Corning Life Sciences | 352350 | |
| Fetal Bovine Serum, heat inactivated | Gibco | 10082-147 | |
| Fine Scissors | Fine Science Tools | 14060-09 | |
| Fine Scissors | Fine Science Tools | 14060-10 | |
| Fisherbrand Disposable Borosilicate Glass Pasteur Pipets | Fisher Scientific | 13-678-20B | |
| FITC Rat Anti-mouse CD102 (3C4) | BD Biosciences | 557444 | |
| FITC Rat IgG2a, κ Isotype Control (R35-95) | BD Biosciences | 553929 | |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11050-10 | |
| HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red | Gibco | 14175095 | |
| Heparin Sodium Injections (1,000 Units/mL) | Medline | 0409-2720-02 | |
| Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma | H3393 | |
| HEPES (1 M) | Gibco | 15630106 | |
| Nonessential amino acids (100x) | Gibco | 11140050 | |
| PE Rat Anti-mouse CD31 (MEC 13.3) | BD Biosciences | 553373 | |
| PE Rat IgG2a, κ Isotype Control R35-95) | BD Biosciences | 553930 | |
| Penicillin Streptomycin (10,000 U/mL, 10,000 µg/mL) | Gibco | 15140122 | |
| Recombinant Murine IFN-γ | Peprotech | 315-05 | |
| Recombinant Murine IL-1β | Peprotech | 211-11B | |
| Recombinant Murine TNF-α | Peprotech | 315-01A | |
| Round bottom polystyrene test tubes | Corning Life Sciences | 352058 | |
| Semken Forceps | Fine Science Tools | 11008-13 | |
| Sodium pyruvate (100 mM) | Gibco | 11360070 | |
| Stericup Quick Release-GP Sterile Vacuum Filtration System, 250 mL | Millipore | S2GPU02RE | |
| Steriflip-GP Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit | Milipore | SCGP00525 | |
| Sterile syringe (10 mL) | Fisher Scientific | 14-955-459 | |
| Sterile syringe (20 mL) | Fisher Scientific | 14-955-460 | |
| T-75 cell culture flask with vent cap, CellBIND treated | Corning Life Sciences | 3290 |
References
- Maniatis, N. A., Orfanos, S. E. The endothelium in acute lung injury/acute respiratory distress syndrome. Current Opinion Critical Care. 14 (1), 22-30 (2008).
- Khakpour, S., Wilhelmsen, K., Hellman, J. Vascular endothelial cell Toll-like receptor pathways in sepsis. Innate Immunity. 21 (8), 827-846 (2015).
- Tuttolomondo, A., Daidone, M., Pinto, A. Endothelial dysfunction and inflammation in ischemic stroke pathogenesis. Current Pharmaceutical Design. 26 (34), 4209-4219 (2020).
- Roberts, A. C., Porter, K. E. Cellular and molecular mechanisms of endothelial dysfunction in diabetes. Diabetes and Vascular Disease Research. 10 (6), 472-482 (2013).
- Widmer, R. J., Lerman, A. Endothelial dysfunction and cardiovascular disease. Global Cardiology Science and Practice. 2014 (3), 291-308 (2014).
- Joffre, J., et al. Catecholaminergic vasopressors reduce toll-like receptor agonist-induced microvascular endothelial cell permeability but not cytokine production. Critical Care Medicine. 49 (3), 315-326 (2021).
- Yan, J., Nunn, A. D., Thomas, R. Selective induction of cell adhesion molecules by proinflammatory mediators in human cardiac microvascular endothelial cells in culture. International Journal of Clinical and Experimental Medicine. 3 (4), 315-331 (2010).
- Bouïs, D., Hospers, G. A., Meijer, C., Molema, G., Mulder, N. H. Endothelium in vitro: A review of human vascular endothelial cell lines for blood vessel-related research. Angiogenesis. 4 (2), 91-102 (2001).
- Nolte, A., et al. Optimized basic conditions are essential for successful siRNA transfection into primary endothelial cells. Oligonucleotides. 19 (2), 141-150 (2009).
- Auguste, D. T., et al. Triggered release of siRNA from poly(ethylene glycol)-protected, pH-dependent liposomes. Journal of Controlled Release. 130 (3), 266-274 (2008).
- Gumkowski, F., Kaminska, G., Kaminski, M., Morrissey, L. W., Auerbach, R. Heterogeneity of mouse vascular endothelium. In vitro studies of lymphatic, large blood vessel and microvascular endothelial cells. Blood Vessels. 24 (1-2), 11-23 (1987).
- Alphonse, R. S., et al. The isolation and culture of endothelial colony-forming cells from human and rat lungs. Nature Protocols. 10 (11), 1697-1708 (2015).
- Lim, Y. -C., Luscinskas, F. W. Isolation and culture of murine heart and lung endothelial cells for in vitro model systems. Methods in Molecular Biology. 341, 141-154 (2006).
- Cao, G., Abraham, V., DeLisser, H. M. Isolation of endothelial cells from mouse lung. Current Protocols in Toxicoly. 61, 1-9 (2014).
- Fehrenbach, M. L., Cao, G., Williams, J. T., Finklestein, J. M., Delisser, H. M. Isolation of murine lung endothelial cells. American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 296 (6), 1096-1103 (2009).
- Wang, J., Niu, N., Xu, S., Jin, Z. G. A simple protocol for isolating mouse lung endothelial cells. Scientific Reports. 9 (1), 1458 (2019).
- Sutermaster, B. A., Darling, E. M. Considerations for high-yield, high-throughput cell enrichment: fluorescence versus magnetic sorting. Scientific Reports. 9 (1), 227 (2019).
- Szulcek, R., Bogaard, H. J., van Nieuw Amerongen, G. P. Electric cell-substrate impedance sensing for the quantification of endothelial proliferation, barrier function, and motility. Journal of Visualized Experiments. (85), e51300 (2014).
- Wong, E., et al. ERK1/2 has divergent roles in lps-induced microvascular endothelial cell cytokine production and permeability. Shock. 55 (3), 349-356 (2020).
- Domm, W., Misra, R. S., O'Reilly, M. A. Affect of early life oxygen exposure on proper lung development and response to respiratory viral infections. Frontiers in Medicine (Lausanne). 2, 55 (2015).
- Jia, G., Aroor, A. R., Jia, C., Sowers, J. R. Endothelial cell senescence in aging-related vascular dysfunction. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Basis of Disease. 1865 (7), 1802-1809 (2019).
- Joffre, J., Hellman, J., Ince, C., Ait-Oufella, H.
- Aird, W. C. The role of the endothelium in severe sepsis and multiple organ dysfunction syndrome. Blood. 101 (10), 3765-3777 (2003).
