Summary
本文从新生小鼠中分离培养原代肺内皮细胞。
Abstract
内皮细胞在调节血管张力、免疫力、凝血和通透性方面起着关键作用。内皮功能障碍发生在糖尿病、动脉粥样硬化、败血症和急性肺损伤等疾病中。需要一种可靠且可重复的方法来从小鼠中分离纯内皮细胞，以研究内皮细胞在这些和其他疾病的发病机制中的作用。在该方案中，从5-7日龄的新生小鼠幼崽制备肺微血管内皮细胞。收获肺，切碎并用胶原酶I酶消化，释放的细胞培养过夜。然后使用与磁珠偶联的抗PECAM1（CD-31）IgG选择内皮细胞，并再次培养细胞以汇合。然后进行二次细胞选择，将抗ICAM2（CD-102）IgG与磁珠偶联以提高内皮细胞的纯度，并再次培养细胞以汇合。整个过程大约需要7-10天才能将细胞用于实验。这种简单的方案产生高纯度（纯度>92%）的内皮细胞，可立即用于 体外 研究，包括专注于内皮细胞因子和趋化因子产生、白细胞-内皮相互作用、内皮凝血途径和内皮通透性的研究。由于有许多敲除和转基因小鼠系可用，该程序还有助于了解内皮细胞在对损伤，感染和炎症的健康和病理反应中表达的特定基因的功能。
Introduction
最近对研究血管内皮的兴趣日益浓厚，因为微血管内皮细胞的功能障碍发生在多种人类疾病中，例如中风，心血管疾病，糖尿病，急性肺损伤，败血症和非感染性损伤1，2，3，4，5。为了确定这些疾病的发病机制并了解特定基因在保护和失调的内皮细胞反应中的作用，需要可靠的方法来分离和培养小鼠的高纯度微血管内皮细胞。虽然许多研究利用人内皮细胞，如人脐静脉内皮细胞（HUVEC）或人肺微血管内皮细胞（HMVEC），但使用小鼠内皮细胞研究内皮功能和功能障碍的原因有多种。首先，来自不同人类供体的内皮细胞的反应存在相当大的异质性，这导致单个实验之间的结果存在差异6，7，8。其次，沉默原代人类细胞系中的基因靶标也会导致蛋白质表达水平变化9，10。相比之下，假设研究组之间的遗传背景相同，小鼠内皮细胞11的反应异质性最小。此外，可以通过汇集来自几只新生小鼠的肺来制备大量的小鼠内皮细胞。这些因素允许实验之间获得更一致和可重复的结果。最后，敲除或转基因小鼠的可用性也提供了缺乏目标蛋白质的细胞类型的分离。
使用已发表的方法12，13，14，15，16分离健康和纯的小鼠肺内皮细胞群的巨大挑战导致开发一种更可靠和直接的方法来分离高质量的小鼠肺微血管内皮细胞。当前方案的优点包括使用现成的新生小鼠，限制了畜牧业和住房成本。此外，根据我们的经验，新生小鼠内皮细胞的活力大大高于成年小鼠制备的内皮细胞。由于新生小鼠的肺组织较小，因此可以通过将切除的肺消化到胶原酶中来收获内皮细胞，而不是使用气管滴注胶原酶，建议从成年小鼠中收集胶原酶16。这也减少了对小鼠实施安乐死和将其内皮细胞放入细胞培养基和培养箱之间的时间，而不会影响纯度或产量或内皮反应的可重复性。最后，在没有流式细胞术的情况下分离纯细胞群，这可能会损害或导致内皮细胞的产量降低14，15，17。
目前修改的方案在7-10天内始终如一地产生高纯度和活的内皮细胞，可立即用于 体外 实验。直接从敲除动物中分离细胞还可以最大限度地减少实验前对细胞的操作。这些方法可用于研究各种蛋白质在内皮功能中的作用，以发现多种疾病的基于内皮的治疗靶点。
Protocol
所有动物程序均由加州大学旧金山分校机构动物护理和使用委员会批准。雄性C57BL / 6新生小鼠幼崽（年龄5-7天）用于研究。整个协议需要7-10天（图1）。
1. 内皮细胞培养基的制备
- 准备基础培养基：Dulbecco 的改良鹰培养基含有 4，500 mg/L 葡萄糖和 4 mM L-谷氨酰胺 （DMEM），补充有 20% （v/v） 热灭活胎牛血清、100 U/100 μg/mL 青霉素/链霉素和 25 mM HEPES（见 材料表）。带22μM过滤器的无菌过滤器。将基础培养基储存在4°C，并在制备后一个月内使用。
- 准备完整的培养基：基础培养基补充有100μg/ mL肝素，100μg/ mL内皮细胞生长补充剂，1x非必需氨基酸和1mM丙酮酸钠（见 材料表）。带22μM过滤器的无菌过滤器。储存在4°C并在制备后一个月内使用。
2. 抗鼠磁珠的预涂13
- 制作 50 mL 珠洗缓冲液：补充有 0.1% （w/v） 牛血清白蛋白 （BSA） 的磷酸盐缓冲溶液 （PBS）。无菌过滤器与22μM过滤器并储存在4°C并在制备后一个月内使用。
- 将磁珠涡旋几秒钟以重悬磁珠，并将 50 μL 磁珠（2 x 107 个磁珠）移液到两个 1.5 mL 微量离心管中，一个用于 CD-31，一个用于 CD-102（参见 材料表）。加入 1 mL 珠洗缓冲液并充分混合。
注意：所有提到的体积都用于从3-4只新生小鼠幼崽（5-7天大）中分离内皮细胞。CD-31和CD-102是用于磁性免疫珠选择的内皮细胞表面标志物。 - 将试管放在磁选机上，并用玻璃巴斯德移液管除去上清液。每次用 1 mL 珠洗缓冲液重复洗涤 3 次。
- 用磁珠洗涤缓冲液将磁珠重悬于原始微球体积 50 μL。然后向每 50 μL 磁珠中添加 5 μL （2.5 μg） 抗体 （CD-31/CD-102）。
- 将珠悬浮液在4°C下在端对端旋转器上轻轻旋转过夜或在室温下孵育3小时。重复洗涤4次。
- 用磁珠洗涤缓冲液将免疫珠重悬于原始体积50μL中，并储存在4°C并在1-2周内使用。
3. 肺细胞的分离和电镀
- 在分离当天准备1型胶原酶溶液：将25mg的1型胶原酶加入25mL的HBSS中（见 材料表）。在37°C下温育1小时，轻轻旋转并使用22μM过滤器无菌过滤器。将溶液保温至37°C。
- 在安乐死前 10 分钟肌内注射 5-7 天大的小鼠幼崽肝素（25 μL/小鼠，1，000 U/mL），以尽量减少内皮细胞活化和凝块形成14，15。
- 根据 2020 年 AVMA 安乐死指南，使用锋利的剪刀对小鼠幼崽实施斩首安乐死。然后，将鼠标固定在腹侧朝上的解剖板上。
- 用70%乙醇喷洒胴体，然后首先切割横膈膜，然后沿着胸部的整个侧壁向上切割，从而暴露胸腔。反射肋骨，然后暴露心脏和肺部。
注意：鉴于新生小鼠的体型较小，在此步骤中使用较小的镊子和剪刀，并确保不要刺穿心脏或肺部，因为这会导致肺部血液排出不足。 - 将 25 G 针头连接到 10 mL 注射器上，并将 5 mL 冷 DMEM 注入心脏右心室以去除肺部血液。肺部会变白。
- 通过切开相应支气管远端的肺叶，一次一个肺叶从胸腔中取出肺。
- 将所有肺叶汇集到预装有 20 mL 冰冷基础培养基的 50 mL 锥形管中（来自步骤 1.1）。
- 与其他小鼠幼崽重复步骤3.2-3.7，将所有肺叶汇集到相同的50 mL锥形管中。
- 用手轻轻搅拌管子10-15秒，以清洗肺部表面任何多余的红细胞。
注意：没有必要从肺部内部或周围清除所有血液;但是，这提高了纯度。任何进一步的组织处理都需要在无菌罩中进行。 - 使用细胞过滤器从培养基中取出肺，并将组织转移到无菌的一次性100 mm直径组织培养皿中，并用无菌剪刀切碎。
- 将切碎的组织转移到装有25 mL预热胶原酶溶液的50 mL锥形管中（步骤3.1）。在37°C下在旋转混合器上轻轻搅拌45分钟。
注意：即使过度消化 60 分钟也会导致产量降低。 - 将20mL注射器连接到15G钝性插管（参见 材料表）并将悬浮液研磨10-15次，以将组织分解为细胞悬浮液。要有活力，但要避免过度起泡。
注意：将不再有可见的肺部分，取而代之的是，完成此步骤后，悬浮液将变得混浊。 - 通过 70 μm 细胞过滤器将悬浮液过滤到新鲜的 50 mL 锥形管中。此外，用额外的 15 mL 基础培养基冲洗用于消化的锥形管和细胞过滤器。
- 在4°C下以400× g 离心细胞悬液8分钟。
- 用玻璃巴斯德移液管除去上清液，并将沉淀重悬于2mL完全培养基中。转移到T-75烧瓶中，并在37°C的加湿，5%CO2 培养箱中加入8mL完全培养基。
- 第二天，用10 mL不含钙和镁的Hank平衡盐溶液（HBSS/CMF）（参见 材料表）洗涤烧瓶两次，并加入10 mL完全培养基。
注意：2-3天后，培养物将融合90-95%，并准备进行原代免疫珠分离。
4. 原代免疫珠分离和内皮细胞培养
- 用 10 mL HBS/CMF 洗涤贴壁内皮细胞两次。加入2mL无胰蛋白酶细胞分离溶液（参见 材料表），并在37°C下孵育~5分钟。确保所有细胞都已从烧瓶中取出。
注意：需要使用无胰蛋白酶分离溶液代替胰蛋白酶，因为胰蛋白酶会破坏细胞表面粘附标志物CD-31。 - 加入 8 mL 基础培养基以中和细胞分离溶液并将内容物转移到 15 mL 锥形管中。在室温下以400× g 旋转4分钟。
- 使用玻璃巴斯德移液管除去上清液，并将细胞重悬于2 mL基础培养基中。将 2 mL 细胞悬液转移到 5 mL 圆底聚苯乙烯管中（参见 材料表）。
- 涡旋抗 CD-31 包被的磁珠几秒钟以重悬磁珠，每 2 mL 细胞悬液添加 30 μL 磁珠。盖上盖子。
- 在室温下在端对端旋转器上孵育管10分钟。然后将试管放在磁选机上并放置2分钟。
- 轻轻地使用玻璃巴斯德移液管，吸出上清液。从磁体上取下试管，通过向试管中加入 3 mL 基础培养基来重悬磁珠细胞沉淀，并上下移液数次。
- 更换磁选机上的管2分钟，然后使用玻璃巴斯德移液管小心地吸出上清液。
- 重复洗涤（步骤4.6-4.7）至少4次，直到上清液看起来澄清。
- 最后一次洗涤后，将磁珠细胞沉淀重悬于3 mL完全生长培养基中，并将其转移到T-75烧瓶中。加入7mL完全生长培养基，并在37°C下在加湿的5%CO2 培养箱中孵育。
- 第二天用HBSS/CMF洗涤细胞，然后加入10mL新鲜完全培养基。每 2-3 天用 10 mL 新鲜完全培养基替换培养基，直至 90-95% 汇合。
注意：一旦细胞~90-95%汇合，这需要~3-4天，培养物就可以进行二次免疫珠分离。
5. 免疫珠二次分离和内皮细胞培养
- 用 10 mL HBSS/CMF 洗涤贴壁内皮细胞两次。加入2mL无胰蛋白酶细胞分离溶液，并在37°C下孵育~5分钟。确保所有细胞都已从烧瓶中取出。
- 加入 8 mL 基础培养基以中和细胞分离溶液，并转移到 15 mL 锥形管中。在室温下以400× g 旋转4分钟。
- 使用玻璃巴斯德移液管除去上清液，并将细胞重悬于2mL基础培养基中。将 2 mL 细胞悬液转移到 5 mL 圆底聚苯乙烯管中。
- 涡旋抗 CD-102 包被磁珠几秒钟以重悬磁珠，每 2 mL 细胞悬液添加 30 μL 磁珠。盖上盖子。
- 将管在室温下在端对端旋转器上孵育10分钟。将试管放在磁选机上，静置2分钟。然后使用玻璃巴斯德移液管轻轻吸出上清液。
- 从磁体上取下试管，通过向试管中加入 3 mL 基础培养基来重悬磁珠细胞沉淀，并上下移液数次。
- 更换磁选机上的管2分钟，然后使用玻璃巴斯德移液管小心地吸出上清液。
- 重复洗涤（步骤5.6-5.7）4次或更多次，直到上清液出现澄清。
- 最后一次洗涤后，将磁珠细胞沉淀重悬于3 mL完全生长培养基中，并将其转移到T-75烧瓶中。加入7mL完全生长培养基，并在37°C下在加湿的5%CO2 培养箱中孵育。
- 第二天用HBSS/CMF洗涤细胞，然后加入10mL新鲜完全培养基。每 2-3 天用 10 mL 新鲜完全培养基替换培养基，直至 90-95% 汇合。一旦内皮细胞完全融合，它们就可以进行实验了。细胞不应在第六代后使用，因为可能发生衰老，并且其他细胞类型可能会接管。
6.流式细胞术确认内皮细胞表面标志物
- 使用无胰蛋白酶细胞分离溶液分离细胞后，将细胞沉淀重悬至 1 x 10 5 个细胞/mL，并将 100 μL 细胞悬液等分到三个1.5 mL 微量离心管中，标记为 1、2 和 3。
- 用 1 mL 的 1x PBS 洗涤细胞。在4°C下以500× g 离心2分钟。 取出洗涤缓冲液并重复两次。
- 将细胞沉淀重悬于 100 μL 1x PBS 中。向试管 1 中加入 1 μL 偶联抗小鼠 CD-31 （PECAM-1） 抗体（例如：藻红蛋白 （PE） 抗小鼠 CD-31 抗体）和 1 μL 偶联抗小鼠 CD-102 （ICAM-2）（例如：异硫氰酸荧光素 （FITC） 抗小鼠 CD102 抗体）（参见 材料表）。对于管2，添加适当的同种型对照。3号管将保持未染色。
- 将试管在冰上和黑暗中孵育30-45分钟。
- 向每个管中加入1mL PBS，轻轻涡旋，并在4°C下以500× g 离心2分钟。 取出洗净液，重复三次。将最终沉淀重悬于 500 μL PBS 中。
- 将管子用铝箔覆盖在4°C直至分析。分析需要在3-4小时内完成。
- 使用流式细胞仪采集流数据。使用未染色的样品作为阴性对照，根据细胞自发荧光正确设置激光电压。使用前向散射图和侧散点图门禁总细胞群。
注意：排除双峰后，CD31 + CD102 +双阳性细胞定义为内皮细胞。
Representative Results
这种简单的方案允许人们在7-10天内分离，培养和表征小鼠微血管内皮细胞（图1）。简而言之，肺在电镀前被切除并酶消化。接种后，内皮细胞和其他细胞将立即漂浮在细胞培养基中。到第二天，内皮细胞和污染细胞将粘附在板上，并且需要大力洗涤技术以去除碎片和漂浮细胞。一旦细胞达到汇合，就进行第一次免疫珠选择。然后CD-31阳性细胞开始以鹅卵石形式生长（图2）。没有鹅卵石形态或过度生长的细胞是污染物，而不是内皮细胞13，14，15，16。
然后使用抗CD-102包被的微球进行第二次免疫珠选择，以提高内皮细胞的纯度，类似于其他方案13，16。在第二次免疫珠选择后生长到汇合的细胞可用于实验。荧光激活细胞分选（FACS）用于确认细胞群为CD-31和CD-102阳性（图3）。
然后，这些内皮细胞可用于许多应用，例如研究内皮炎症途径和内皮屏障功能。例如，观察到用小鼠细胞混合物（IFNg，TNFa和IL1b，每个为10ng / mL）处理诱导内皮细胞产生IL-6 （图4A）。然后使用电池-基板阻抗传感（ECIS）18 测量跨内皮电阻（TER）对通过鼠肺内皮细胞单层的电流流动。观察到用细胞混合物处理的细胞导致TER降低 （图4B）， 这与内皮通透性增加一致。这些示例说明了使用该协议制备的内皮细胞如何研究各种内皮过程。这使得研究人员能够更容易地研究内皮细胞中感兴趣的基因，因为可用的敲除和转基因小鼠数量不断增加。
图1：小鼠肺内皮细胞分离示意图。 收获5-7天大的新生儿幼崽的肺并切碎。切碎的组织用胶原酶I酶消化，细胞悬浮液铺板培养2-3天。然后用CD-31包被的磁珠对细胞进行原代免疫珠分离，并再培养3-4天。在再培养2-3天之前，用CD-102包被的磁珠进行第二次免疫珠分离。细胞现在已经准备好进行功能实验了。该图像由基于Web的插图工具Biorender创建。 请点击此处查看此图的大图。
图2：鼠肺内皮细胞的形态。 培养的鼠肺内皮细胞显示出鹅卵石形态。 请点击此处查看此图的大图。
图3：通过流式细胞术分析内皮细胞 。 （A）所有事件都可视化在前向散射（FSC）和侧向散射（SSC）的点图上。（B）鼠肺内皮细胞对内皮特异性细胞表面抗原CD-31和CD-102均呈阳性的散点图确认。（C）同种型样品和用CD-31/CD-102特异性抗体染色的样品的直方图。 请点击此处查看此图的大图。
图 4：细胞混合物诱导鼠肺内皮细胞 IL-6 产生和内皮细胞通透性。 用细胞混合物（IFNg，TNFa和IL1b，每个10ng / mL）处理来自C57BL / 6小鼠的鼠肺微血管内皮细胞。（A）然后在培养上清液中定量IL-6水平15小时（**p<0.01，n = 4孔/条件）。（B）使用电池-基板阻抗传感在15小时内反复测量跨内皮电阻（TER）。在按指定添加细胞混合物之前立即将数据归一化为抗性，并通过双向方差分析（ANOVA）进行分析，然后进行Tukey后测试19 （**p<0.01，n = 4孔/条件）。 请点击此处查看此图的大图。
Discussion
这种简单的方案适用于来自鼠肺的高纯度内皮细胞。虽然从开始到结束的总时间为7-10天，但动手时间约为3-4小时。与其他方法13、14、15、16相比，目前的方案是简化的，在不影响产量和纯度的情况下保留了基本步骤。
值得注意的是该协议的一些关键方面。首先，重要的是使用新生儿幼崽而不是成年小鼠。根据我们的经验，来自成年小鼠的内皮细胞不像来自新生幼崽的细胞那样容易增殖，并且它们很容易被具有与成纤维细胞或间充质干细胞一致的纺锤状形态的细胞所淹没15，16。对这种差异的一种可能的解释是，新生小鼠的肺发育处于肺泡阶段，其特征在于内皮细胞的增殖更快20。随着年龄的增长，也可能有一定程度的衰老21.酶消化时间也需要精确，因为消化不足会导致低产量的单细胞悬液。相反，过度消化会导致大量的细胞死亡。我们已经确定胶原酶消化的最佳时间为45分钟。然后用钝套管进行机械解离。在酶消化过程中滴注气管内胶原酶也有报道14，15;然而，这可能很耗时，并导致在当前工作期间消化不完全。最后，一些方案在酶消化后立即直接进行免疫珠分离13，16。我们发现，在进行免疫珠选择之前，将来自解离肺的细胞在培养基中培养一两天可显着提高活且高纯度内皮细胞的产量。这可能与将分离的细胞放入组织培养基的速度有关，这导致从小鼠中取出后早期阶段的细胞死亡减少，初始接种密度更高，并且在第一次免疫珠分离之前内皮细胞粘附和增殖的时间。
小鼠内皮细胞的制备和分析的局限性如下。每只鼠标仅提供有限数量的细胞，必须在几次传代内使用。这个问题可以通过汇集几只小鼠的肺消化物来克服。不幸的是，我们在冷冻保存和解冻细胞以备将来使用的努力中没有成功。尽管有这些限制，小鼠内皮细胞仍具有一些优势。它们可能会有所帮助，特别是在不能使用人内皮细胞的情况下（例如基因敲除），当需要补充研究来证实人类细胞的结果时，或者当来自不同人类供体的内皮细胞反应的异质性使实验之间的可重复性成为问题时6.来自遗传相同小鼠的同质内皮细胞群允许在稳定的背景条件下实验和特定基因和途径研究之间的可重复性。
小鼠内皮细胞可用于多种应用，以深入了解不同疾病过程中的内皮活化和功能障碍。例如，内皮细胞在脓毒症中起着不可或缺的作用，通过激活局部和全身炎症、促进组织中白细胞运输和活化、调节凝血和调节内皮通透性的作用，促进有益和病理反应2，22，23.这个简单的方案提供了可行的功能性内皮细胞，可用于测定这些内皮过程中的每一个。
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了NIH T32GM008440（JH / EW）和NIH R01AI058106（JH）的支持。我们感谢加州大学旧金山分校Parnassus流式细胞术核心（RRID：SCR_018206）部分由Grant NIH P30 DK063720和NIH S10仪器资助S10 1S10OD021822-01支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 mL conicals | Corning Life Sciences | 430829 | |
| Accutase Cell Detachment Solution | Innovative Cell Technologies, Inc | AT-104 | |
| BD PrecisionGlide Needle 25 G x 5/8" | Becton Disckinson | 305122 | |
| BioRender.com | BioRender | ||
| Blunt Cannula 15 G x 1-1/2" | Covidien | 8881202314 | |
| CD-102 Rat anti-mouse (3C4 (MIC2/4)) | BD Biosciences | 553326 | |
| CD-31 Rat anti-mouse (MEC 13.3) | BD Biosciences | 557355 | |
| Collagenase, Type 1 | Worthington Biochemical Corp | LS004194 | |
| DMEM, high glucose | Gibco | 11965092 | |
| Dynabeads Sheep Anti-Rat IgG | Invitrogen | 11035 | |
| Endothelial Cell Growth Supplment | EMD Millipore Corp | 02-102 | |
| Falcon cell strainers (70 µm) | Corning Life Sciences | 352350 | |
| Fetal Bovine Serum, heat inactivated | Gibco | 10082-147 | |
| Fine Scissors | Fine Science Tools | 14060-09 | |
| Fine Scissors | Fine Science Tools | 14060-10 | |
| Fisherbrand Disposable Borosilicate Glass Pasteur Pipets | Fisher Scientific | 13-678-20B | |
| FITC Rat Anti-mouse CD102 (3C4) | BD Biosciences | 557444 | |
| FITC Rat IgG2a, κ Isotype Control (R35-95) | BD Biosciences | 553929 | |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11050-10 | |
| HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red | Gibco | 14175095 | |
| Heparin Sodium Injections (1,000 Units/mL) | Medline | 0409-2720-02 | |
| Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma | H3393 | |
| HEPES (1 M) | Gibco | 15630106 | |
| Nonessential amino acids (100x) | Gibco | 11140050 | |
| PE Rat Anti-mouse CD31 (MEC 13.3) | BD Biosciences | 553373 | |
| PE Rat IgG2a, κ Isotype Control R35-95) | BD Biosciences | 553930 | |
| Penicillin Streptomycin (10,000 U/mL, 10,000 µg/mL) | Gibco | 15140122 | |
| Recombinant Murine IFN-γ | Peprotech | 315-05 | |
| Recombinant Murine IL-1β | Peprotech | 211-11B | |
| Recombinant Murine TNF-α | Peprotech | 315-01A | |
| Round bottom polystyrene test tubes | Corning Life Sciences | 352058 | |
| Semken Forceps | Fine Science Tools | 11008-13 | |
| Sodium pyruvate (100 mM) | Gibco | 11360070 | |
| Stericup Quick Release-GP Sterile Vacuum Filtration System, 250 mL | Millipore | S2GPU02RE | |
| Steriflip-GP Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit | Milipore | SCGP00525 | |
| Sterile syringe (10 mL) | Fisher Scientific | 14-955-459 | |
| Sterile syringe (20 mL) | Fisher Scientific | 14-955-460 | |
| T-75 cell culture flask with vent cap, CellBIND treated | Corning Life Sciences | 3290 |
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