Summary
In diesem Artikel wurden primäre Lungenendothelzellen aus neonatalen Mäusen isoliert und kultiviert.
Abstract
Endothelzellen spielen eine entscheidende Rolle bei der Regulierung des Gefäßtonus, der Immunität, der Gerinnung und der Permeabilität. Endotheliale Dysfunktion tritt bei Erkrankungen wie Diabetes, Arteriosklerose, Sepsis und akuter Lungenschädigung auf. Eine zuverlässige und reproduzierbare Methode zur Isolierung reiner Endothelzellen aus Mäusen wird benötigt, um die Rolle von Endothelzellen in der Pathogenese dieser und anderer Erkrankungen zu untersuchen. In diesem Protokoll wurden mikrovaskuläre Endothelzellen der Lunge von 5-7 Tage alten neugeborenen Mauswelpen präpariert. Die Lunge wird geerntet, zerkleinert und enzymatisch mit Kollagenase I verdaut, und die freigesetzten Zellen werden über Nacht kultiviert. Endothelzellen werden dann mit anti-PECAM1 (CD-31) IgG selektiert, das an magnetische Beads konjugiert ist, und die Zellen werden erneut bis zur Konfluenz kultiviert. Es erfolgt dann eine sekundäre Zellselektion mit anti-ICAM2 (CD-102) IgG, das an magnetische Beads konjugiert wird, um die Reinheit der Endothelzellen zu erhöhen, und die Zellen werden erneut bis zur Konfluenz kultiviert. Der gesamte Prozess dauert etwa 7-10 Tage, bevor die Zellen für Experimente verwendet werden können. Dieses einfache Protokoll liefert hochreine (Reinheit >92%) Endothelzellen, die sofort für In-vitro-Studien verwendet werden können, einschließlich der Studien, die sich auf die Produktion von endothelialen Zytokinen und Chemokinen, Leukozyten-Endothel-Interaktionen, endotheliale Gerinnungswege und Endothelpermeabilität konzentrieren. Da viele Knockouts und transgene Mauslinien zur Verfügung stehen, eignet sich dieses Verfahren auch zum Verständnis der Funktion spezifischer Gene, die von Endothelzellen bei gesunden und pathologischen Reaktionen auf Verletzungen, Infektionen und Entzündungen exprimiert werden.
Introduction
Das Interesse an der Untersuchung des vaskulären Endothels hat in letzter Zeit zugenommen, da eine Dysfunktion der mikrovaskulären Endothelzellen bei mehreren menschlichen Krankheiten auftritt, wie z. B. Schlaganfall, Herz-Kreislauf-Erkrankungen, Diabetes, akute Lungenschädigung, Sepsis und nicht-infektiöse Verletzungen 1,2,3,4,5. Um die Pathogenese dieser Erkrankungen zu definieren und die Rolle spezifischer Gene bei protektiven und fehlregulierten Endothelzellantworten zu verstehen, besteht ein Bedarf an zuverlässigen Methoden zur Isolierung und Kultivierung hochreiner mikrovaskulärer Endothelzellen aus Mäusen. Während in vielen Studien menschliche Endothelzellen wie menschliche Nabelvenen-Endothelzellen (HUVEC) oder humane mikrovaskuläre Endothelzellen der Lunge (HMVEC) verwendet werden, gibt es mehrere Gründe, Endothelzellen der Maus zur Untersuchung der Endothelfunktion und -dysfunktion zu verwenden. Erstens gibt es eine beträchtliche Heterogenität in den Antworten von Endothelzellen verschiedener menschlicher Spender, was zu einer Variabilität der Ergebnisse zwischen den einzelnen Experimenten führt 6,7,8. Zweitens kann das Silencing von Genzielen in primären humanen Zelllinien auch zu unterschiedlichen Proteinexpressionsniveaus führen 9,10. Im Gegensatz dazu gibt es nur eine minimale Heterogenität in den Antworten der Endothelzellen der Maus11, wenn man davon ausgeht, dass der genetische Hintergrund zwischen den Studiengruppen derselbe ist. Darüber hinaus kann eine große Anzahl von Endothelzellen der Maus präpariert werden, indem Lungen von mehreren neugeborenen Mäusen gepoolt werden. Diese Faktoren ermöglichen konsistentere und reproduzierbarere Ergebnisse zwischen den Experimenten. Schließlich ermöglicht die Verfügbarkeit von Knockout- oder transgenen Mäusen auch die Isolierung von Zelltypen, denen die Proteine von Interesse fehlen.
Die erheblichen Herausforderungen bei der Isolierung gesunder und reiner Populationen von Lungenendothelzellen der Maus mit veröffentlichten Methoden 12,13,14,15,16 führten zur Entwicklung einer zuverlässigeren und einfacheren Methode zur Isolierung hochwertiger mikrovaskulärer Endothelzellen der Mauslunge. Zu den Vorteilen des aktuellen Protokolls gehört die Verwendung von neugeborenen Mäusen, die leicht verfügbar sind, was die Tierhaltungs- und Haltungskosten begrenzt. Darüber hinaus ist unserer Erfahrung nach die Lebensfähigkeit von Endothelzellen von neonatalen Mäusen wesentlich höher als von Endothelzellen, die von erwachsenen Mäusen präpariert wurden. Da neugeborene Mäuse über kleines Lungengewebe verfügen, können Endothelzellen durch Verdauung der herausgeschnittenen Lunge in Kollagenase gewonnen werden, anstatt eine tracheale Instillation von Kollagenase zu verwenden, die für die Entnahme von erwachsenen Mäusen empfohlen wird16. Dies verkürzt auch die Zeit zwischen dem Einschläfern von Mäusen und dem Einbringen ihrer Endothelzellen in Zellkulturmedien und den Inkubator, ohne die Reinheit oder Ausbeute oder die Reproduzierbarkeit der Endothelantworten zu beeinträchtigen. Schließlich wurden reine Zellpopulationen ohne Durchflusszytometrie isoliert, was die Endothelzellen schädigen oder zu geringeren Ausbeuten führen kann14,15,17.
Das derzeit modifizierte Protokoll führt innerhalb von 7-10 Tagen zu hochreinen und lebensfähigen Endothelzellen, die sofort für In-vitro-Experimente verwendet werden können. Die Isolierung von Zellen direkt aus Knockout-Tieren minimiert auch die Manipulation von Zellen vor dem Experiment. Diese Methoden könnten verwendet werden, um die Rolle verschiedener Proteine in der Endothelfunktion zu untersuchen, um endothelbasierte therapeutische Ziele für mehrere Krankheiten zu entdecken.
Protocol
Alle Tierverfahren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der University of California San Francisco genehmigt. Für die Studie wurden männliche C57BL/6 neonatale Mauswelpen (Alter 5-7 Tage) verwendet. Das gesamte Protokoll dauert 7-10 Tage (Abbildung 1).
1. Herstellung des Endothelzellmediums
- Bereiten Sie das Basalmedium vor: Dulbeccos modifiziertes Adlermedium mit 4.500 mg/l Glukose und 4 mM L-Glutamin (DMEM), ergänzt mit 20 % (v/v) hitzeinaktiviertem fötalem Kälberserum, 100 U/100 μg/ml Penicillin/Streptomycin und 25 mM HEPES (siehe Materialtabelle). Sterilfilter mit 22 μM Filter. Lagern Sie Basalmedium bei 4 °C und verbrauchen Sie es innerhalb eines Monats nach der Zubereitung.
- Bereiten Sie das komplette Medium vor: Basalmedium, ergänzt mit 100 μg/ml Heparin, 100 μg/ml Endothelzellwachstumsergänzung, 1x nicht-essentiellen Aminosäuren und 1 mM Natriumpyruvat (siehe Materialtabelle). Sterilfilter mit 22 μM Filter. Bei 4 °C lagern und innerhalb eines Monats nach der Zubereitung verbrauchen.
2. Vorbeschichtung von Anti-Ratten-Magnetperlen13
- Stellen Sie 50 ml Perlenwaschpuffer her: Phosphatgepufferte Lösung (PBS), ergänzt mit 0,1 % (w/v) Rinderserumalbumin (BSA). Sterilfilter mit 22 μM Filter und bei 4 °C lagern und innerhalb eines Monats nach der Zubereitung verbrauchen.
- Wirbeln Sie die magnetischen Kügelchen einige Sekunden lang auf, um die Kügelchen zu resuspendieren, und pipettieren Sie 50 μl der Kügelchen (2 x 107 Perlen ) in zwei 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen, eines für CD-31 und eines für CD-102 (siehe Materialtabelle). Fügen Sie 1 ml Perlenwaschpuffer hinzu und mischen Sie gut.
HINWEIS: Alle genannten Volumina wurden verwendet, um Endothelzellen von 3-4 neugeborenen Mauswelpen (5-7 Tage alt) zu isolieren. CD-31 und CD-102 sind die Oberflächenmarker von Endothelzellen, die für die magnetische Immunobead-Selektion verwendet werden. - Legen Sie die Röhrchen auf einen Magnetabscheider und entfernen Sie den Überstand mit einer Pasteurpipette aus Glas. Wiederholen Sie das Waschen 3 Mal mit jeweils 1 ml Perlenwaschpuffer.
- Resuspendieren Sie die Perlen im ursprünglichen Perlenvolumen, 50 μL, mit Perlenwaschpuffer. Fügen Sie dann 5 μl (2,5 μg) Antikörper (CD-31/CD-102) zu jeweils 50 μl Beads hinzu.
- Die Perlensuspension wird bei sanfter Rotation auf einem End-over-End-Rotator über Nacht bei 4 °C oder für 3 h bei Raumtemperatur inkubiert. Wiederholen Sie die Wäsche 4 Mal.
- Resuspendieren Sie die Immunobeads im ursprünglichen Volumen, 50 μL, mit Bead-Waschpuffer und lagern Sie sie bei 4 °C und verbrauchen Sie sie innerhalb von 1-2 Wochen.
3. Isolierung und Beschichtung der Lungenzellen
- Bereiten Sie Typ-1-Kollagenase-Lösung am Tag der Isolierung zu: Fügen Sie 25 mg Typ-1-Kollagenase zu 25 ml HBSS hinzu (siehe Materialtabelle). Inkubation bei 37 °C für 1 h mit sanfter Rotation und Sterilfilter mit 22 μM-Filter. Die Lösung bei 37 °C warm halten.
- 5-7 Tage alte Mäusewelpen werden 10 Minuten vor der Euthanasie intramuskulär mit Heparin (25 μl/Maus, 1.000 U/ml) injiziert, um die Aktivierung der Endothelzellen und die Bildung von Gerinnseln zu minimieren14,15.
- Euthanasieren Sie den Mäusewelpen mit Enthauptung mit einer scharfen Schere gemäß den AVMA-Richtlinien für Euthanasie 2020. Heften Sie dann die Maus mit der Bauchseite nach oben an ein Sezierbrett.
- Besprühen Sie den Kadaver mit 70%igem Ethanol und legen Sie dann die Brusthöhle frei, indem Sie zuerst das Zwerchfell durchschneiden und dann entlang der gesamten Seitenwände des Brustkorbs nach oben schneiden. Durch die Reflexion des Brustkorbs werden dann Herz und Lunge freigelegt.
Anmerkungen: Verwenden Sie für diesen Schritt angesichts der geringen Größe von Neugeborenenmäusen kleinere Pinzetten und Scheren und stellen Sie sicher, dass Sie das Herz oder die Lunge nicht durchbohren, da dies zu einer unzureichenden Blutentnahme aus der Lunge führt. - Befestigen Sie eine 25-G-Nadel an einer 10-ml-Spritze und injizieren Sie 5 ml kaltes DMEM in die rechte Herzkammer, um Blut aus der Lunge zu entfernen. Die Lunge wird weiß.
- Entfernen Sie die Lunge aus der Brusthöhle, einen Lappen nach dem anderen, indem Sie die Lappen distal zu den entsprechenden Bronchien durchtrennen.
- Alle Lungenlappen werden in ein konisches 50-ml-Röhrchen gefüllt, das mit 20 ml eiskaltem Basalmedium (ab Schritt 1.1) gefüllt ist.
- Wiederholen Sie die Schritte 3.2-3.7 mit den anderen Mäusewelpen und bündeln Sie alle Lungenlappen in demselben konischen 50-ml-Röhrchen.
- Bewegen Sie den Schlauch 10-15 s lang vorsichtig von Hand, um überschüssige rote Blutkörperchen zu waschen, die visuell auf der Oberfläche der Lunge wahrgenommen werden.
Anmerkungen: Es ist nicht notwendig, das gesamte Blut aus der Lunge oder um die Lunge herum zu entfernen. Dies verbessert jedoch die Reinheit. Alle weiteren Gewebehandlungen müssen in einer sterilen Haube erfolgen. - Verwenden Sie ein Zellsieb, um die Lunge aus dem Medium zu entfernen, und übertragen Sie das Gewebe in eine sterile Einweg-Gewebekulturschale mit einem Durchmesser von 100 mm und zerkleinern Sie es mit einer sterilisierten Schere.
- Übertragen Sie das zerkleinerte Gewebe mit 25 ml vorgewärmter Kollagenaselösung in das konische 50-ml-Röhrchen (Schritt 3.1). Auf einem rotierenden Mischer 45 min bei 37 °C vorsichtig umrühren.
HINWEIS: Eine Überverdauung von nur 60 Minuten kann zu geringeren Erträgen führen. - Befestigen Sie eine 20-ml-Spritze an einer stumpfen 15-G-Kanüle (siehe Materialtabelle) und verreiben Sie die Suspension 10-15 Mal, um das Gewebe zu einer zellulären Suspension aufzubrechen. Seien Sie kräftig, aber vermeiden Sie übermäßiges Aufschäumen.
HINWEIS: Es werden keine sichtbaren Teile der Lunge mehr vorhanden sein, und stattdessen wird die Suspension nach Abschluss dieses Schritts trüb sein. - Filtern Sie die Suspension durch ein 70-μm-Zellsieb in ein frisches konisches 50-ml-Röhrchen. Spülen Sie anschließend das konische Röhrchen, das für den Aufschluss verwendet wird, und das Zellsieb mit zusätzlichen 15 ml Basalmedium.
- Die Zellsuspension wird bei 400 x g für 8 min bei 4 °C zentrifugiert.
- Entfernen Sie den Überstand mit einer Pasteurpipette aus Glas und resuspendieren Sie das Pellet in 2 ml vollständigem Medium. In einen T-75-Kolben überführen und 8 ml komplette Mediumkultur bei 37 °C in einen befeuchteten 5%igen CO2 -Inkubator geben.
- Waschen Sie die Kolben am nächsten Tag zweimal mit 10 ml Hank's Balanced Salt Solution ohne Calcium und Magnesium (HBSS/CMF) (siehe Materialtabelle) und fügen Sie 10 ml komplettes Medium hinzu.
HINWEIS: Nach 2-3 Tagen ist die Kultur zu 90-95% konfluent und bereit für die Isolierung der primären Immunbead.
4. Primäre Immunbead-Isolierung und Kultivierung von Endothelzellen
- Adhärente Endothelzellen werden zweimal mit 10 mL HBSS/CMF gewaschen. Fügen Sie 2 ml trypsinfreie Zellablösungslösung hinzu (siehe Materialtabelle) und inkubieren Sie sie bei 37 °C für ~5 min. Stellen Sie sicher, dass alle Zellen aus dem Kolben gehoben wurden.
HINWEIS: Anstelle von Trypsin muss eine trypsinfreie Ablösungslösung verwendet werden, da Trypsin den Adhäsionsmarker CD-31 auf der Zelloberfläche stören kann. - Fügen Sie 8 ml Basalmedium hinzu, um die Zellablösungslösung zu neutralisieren, und übertragen Sie den Inhalt in ein konisches 15-ml-Röhrchen. Bei 400 x g 4 min bei Raumtemperatur schleudern.
- Entfernen Sie den Überstand mit einer Pasteurpipette aus Glas und resuspendieren Sie die Zellen in 2 ml Basalmedium. Übertragen Sie die 2-ml-Zellsuspension in ein 5-ml-Polystyrolröhrchen mit rundem Boden (siehe Materialtabelle).
- Vortex-Anti-CD-31-beschichtete Beads für einige Sekunden, um die Beads zu resuspendieren, und fügen Sie 30 μl Beads pro 2 ml Zellsuspension hinzu. Schließe den Deckel.
- Inkubieren Sie das Röhrchen 10 Minuten lang bei Raumtemperatur auf einem End-über-End-Rotator. Legen Sie dann die Röhrchen auf einen Magnetabscheider und lassen Sie sie 2 Minuten einwirken.
- Saugen Sie den Überstand vorsichtig mit einer Pasteurpipette aus Glas ab. Entfernen Sie das Röhrchen vom Magneten, resuspendieren Sie das Bead-Cell-Pellet, indem Sie 3 ml Basalmedium in das Röhrchen geben, und pipettieren Sie es mehrmals auf und ab.
- Setzen Sie den Schlauch für 2 Minuten wieder auf den Magnetabscheider und saugen Sie dann den Überstand vorsichtig mit einer Pasteurpipette aus Glas ab.
- Wiederholen Sie die Wäschen (Schritt 4.6-4.7) mindestens 4 Mal, bis der Überstand klar erscheint.
- Nach der letzten Wäsche wird das Bead-Cell-Pellet in 3 ml vollständigem Wachstumsmedium resuspendiert und in einen T-75-Kolben überführt. Fügen Sie 7 ml des vollständigen Nährmediums hinzu und inkubieren Sie bei 37 °C in einem befeuchteten 5% CO2 -Inkubator.
- Waschen Sie die Zellen am nächsten Tag mit HBSS/CMF und geben Sie dann 10 ml frisches Komplettmedium hinzu. Ersetzen Sie das Medium alle 2-3 Tage durch 10 ml frisches Komplettmedium, bis 90-95% konfluiert sind.
HINWEIS: Sobald die Zellen ~90-95% konfluent sind, was ~3-4 Tage dauert, ist die Kultur bereit für die sekundäre Immunbead-Isolierung.
5. Sekundäre Immunbead-Isolierung und Kultivierung von Endothelzellen
- Adhärente Endothelzellen zweimal mit 10 ml HBSS/CMF waschen. Fügen Sie 2 ml trypsinfreie Zellablöselösung hinzu und inkubieren Sie sie bei 37 °C für ~5 min. Stellen Sie sicher, dass alle Zellen aus dem Kolben gehoben wurden.
- Fügen Sie 8 ml Basalmedium hinzu, um die Zellablösungslösung zu neutralisieren, und geben Sie es in ein konisches 15-ml-Röhrchen um. Bei 400 x g 4 min bei Raumtemperatur schleudern.
- Entfernen Sie den Überstand mit einer Pasteurpipette aus Glas und resuspendieren Sie die Zellen in 2 ml Basalmedium. Übertragen Sie die 2-ml-Zellsuspension in ein 5-ml-Polystyrolröhrchen mit rundem Boden.
- Vortex-Anti-CD-102-beschichtete Beads für einige Sekunden, um die Beads zu resuspendieren, und fügen Sie 30 μl Beads pro 2 ml Zellsuspension hinzu. Schließe den Deckel.
- Inkubieren Sie das Röhrchen 10 Minuten lang bei Raumtemperatur auf einem End-über-End-Rotator. Legen Sie die Röhrchen auf einen Magnetabscheider und lassen Sie sie 2 Minuten einwirken. Saugen Sie dann den Überstand vorsichtig mit einer Pasteurpipette aus Glas ab.
- Entfernen Sie das Röhrchen vom Magneten, resuspendieren Sie das Bead-Cell-Pellet, indem Sie 3 ml Basalmedium in das Röhrchen geben, und pipettieren Sie es mehrmals auf und ab.
- Setzen Sie den Schlauch für 2 Minuten wieder auf den Magnetabscheider, bevor Sie den Überstand vorsichtig mit einer Pasteurpipette aus Glas absaugen.
- Wiederholen Sie die Wäschen (Schritt 5.6-5.7) 4 Mal oder öfter, bis der Überstand klar erscheint.
- Nach der letzten Wäsche wird das Bead-Cell-Pellet in 3 ml vollständigem Wachstumsmedium resuspendiert und in einen T-75-Kolben überführt. Fügen Sie 7 ml komplettes Nährmedium hinzu und inkubieren Sie es bei 37 °C in einem befeuchteten 5% CO2 -Inkubator.
- Waschen Sie die Zellen am nächsten Tag mit HBSS/CMF und geben Sie dann 10 ml frisches Komplettmedium hinzu. Ersetzen Sie das Medium alle 2-3 Tage durch 10 ml frisches Komplettmedium, bis 90-95% konfluiert sind. Sobald die Endothelzellen vollständig zusammenfließen, sind sie bereit für Experimente. Die Zellen sollten nicht über die sechste Passage hinaus verwendet werden, da es zu Seneszenz kommen kann und andere Zelltypen die Oberhand gewinnen können.
6. Bestätigung der Endothelzelloberflächenmarker durch Durchflusszytometrie
- Nachdem Sie trypsinfreie Zellablöselösung zum Lösen der Zellen verwendet haben, resuspendieren Sie das Zellpellet auf 1 x 105 Zellen/ ml und aliquoten Sie 100 μl der Zellsuspension in drei 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen, die mit 1, 2 und 3 gekennzeichnet sind.
- Waschen Sie die Zellen mit 1 ml 1x PBS. Bei 500 x g für 2 min bei 4 °C zentrifugieren. Entfernen Sie den Waschpuffer und wiederholen Sie den Vorgang zweimal.
- Resuspendieren Sie das Zellpellet in 100 μL 1x PBS. In Röhrchen 1 werden 1 μl konjugierter Anti-Maus-CD-31 (PECAM-1)-Antikörper (z. B. Phycoerythrin (PE) Anti-Maus-CD-31-Antikörper) und 1 μl konjugierter Anti-Maus-CD-102 (ICAM-2) (z. B. Fluorescein-Isothiocyanat (FITC) Anti-Maus-CD102-Antikörper) gegeben (siehe Materialtabelle). Fügen Sie Tube 2 die entsprechenden Isotyp-Steuerelemente hinzu. Tube Nr. 3 bleibt ungefärbt.
- Inkubieren Sie die Röhrchen auf Eis und im Dunkeln für 30-45 min.
- Geben Sie 1 ml PBS in jedes Röhrchen, wirbeln Sie vorsichtig und zentrifugieren Sie 2 Minuten lang bei 4 °C bei 500 x g . Entfernen Sie die Wäsche und wiederholen Sie den Vorgang dreimal. Resuspendieren Sie das letzte Pellet in 500 μl PBS.
- Bewahren Sie die Röhrchen bis zur Analyse mit Aluminiumfolie bedeckt bei 4 °C auf. Die Analyse muss innerhalb von 3-4 Stunden abgeschlossen sein.
- Erfassen Sie Durchflussdaten mit einem Zytometer. Verwenden Sie eine ungefärbte Probe als Negativkontrolle, um die Laserspannung entsprechend der Autofluoreszenz der Zelle richtig einzustellen. Gate-Gesamtzellpopulation mit einem Vorwärtsstreudiagramm und einem Seitenstreudiagramm.
HINWEIS: Nach Ausschluss der Dubletten werden CD31+ CD102+ doppelt positive Zellen als Endothelzellen definiert.
Representative Results
Dieses einfache Protokoll ermöglicht es, mikrovaskuläre Endothelzellen der Maus über einen Zeitraum von 7-10 Tagen zu isolieren, zu kultivieren und zu charakterisieren (Abbildung 1). Kurz gesagt, die Lunge wird herausgeschnitten und enzymatisch verdaut, bevor sie plattiert wird. Unmittelbar nach der Beschichtung schwimmen Endothelzellen und andere Zellen in Zellkulturmedien. Am nächsten Tag sind die Endothelzellen und die kontaminierenden Zellen auf der Platte haftet, und es ist eine gründliche Waschtechnik erforderlich, um Ablagerungen und die schwimmenden Zellen zu entfernen. Sobald die Zellen die Konfluenz erreicht haben, wird die erste Immunobead-Selektion durchgeführt. Die CD-31-positiven Zellen beginnen dann in einer Kopfsteinpflasterformation zu wachsen (Abbildung 2). Zellen, die keine Kopfsteinpflastermorphologie aufweisen oder überwuchert sind, sind Kontaminanten und keine Endothelzellen13,14,15,16.
Eine zweite Immunobead-Selektion wird dann unter Verwendung von Anti-CD-102-beschichteten Beads durchgeführt, um die Reinheit der Endothelzellen zu erhöhen, ähnlich wie bei anderen Protokollen13,16. Zellen, die nach der zweiten Immunobead-Selektion zur Konfluenz gewachsen sind, können dann für Experimente verwendet werden. Die fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) wird verwendet, um zu bestätigen, dass die Zellpopulation CD-31- und CD-102-positiv ist (Abbildung 3).
Diese Endothelzellen können dann für viele Anwendungen verwendet werden, z. B. für die Untersuchung endothelialer Entzündungswege und der endothelialen Barrierefunktion. So wurde beispielsweise beobachtet, dass die Behandlung mit murinem Cytomix (IFNg, TNFa und IL1b, jeweils bei 10 ng/ml) die IL-6-Produktion durch Endothelzellen induzierte (Abbildung 4A). Anschließend wurde Electric Cell-substrate Impedance Sensing (ECIS)18 verwendet, um den transendothelialen Widerstand (TER) gegen den Fluss von elektrischem Strom durch murine Endothelzell-Monolagen der Lunge zu messen. Es wurde beobachtet, dass die mit cytomix behandelten Zellen zu einer Abnahme der TER führten (Abbildung 4B), was mit einer erhöhten endothelialen Permeabilität übereinstimmt. Diese Beispiele veranschaulichen, wie die mit diesem Protokoll präparierten Endothelzellen verschiedene Endothelprozesse untersuchen können. Dies ermöglicht es den Forschern, angesichts der ständig wachsenden Zahl verfügbarer Knockout- und transgener Mäuse leichter Gene in Endothelzellen zu untersuchen.
Abbildung 1: Schematische Darstellung der Isolierung von murinen Lungenendothelzellen. Die Lungen von 5-7 Tage alten neugeborenen Welpen werden entnommen und zerkleinert. Das gehackte Gewebe wurde enzymatisch mit Kollagenase I verdaut. Zellsuspension wird plattiert und für 2-3 Tage kultiviert. Die Zellen werden dann einer primären Immunbead-Isolierung mit CD-31-beschichteten Beads unterzogen und für weitere 3-4 Tage kultiviert. Zweite Immunbead-Isolierung mit CD-102-beschichteten Beads vor der Kultivierung weitere 2-3 Tage. Die Zellen sind nun bereit für funktionelle Experimente. Das Bild wurde mit einem webbasierten Illustrationstool, Biorender, erstellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Morphologie der murinen Lungenendothelzellen. Kultivierte murine Lungenendothelzellen weisen eine Kopfsteinpflastermorphologie auf. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Analyse von Endothelzellen mittels Durchflusszytometrie . (A) Alle Ereignisse werden in einem Punktdiagramm der Vorwärtsstreuung (FSC) und der Seitenstreuung (SSC) visualisiert. (B) Scatterplot-Bestätigung, dass murine Lungenendothelzellen positiv für die beiden endothelspezifischen Zelloberflächenantigene CD-31 und CD-102 sind. (C) Histogramm der Isotypprobe und der mit CD-31/CD-102-spezifischen Antikörpern gefärbten Probe. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Cytomix induziert die Produktion von IL-6-Endothelzellen der murinen Lunge und die Permeabilität von Endothelzellen. Mikrovaskuläre Endothelzellen der murinen Lunge von C57BL/6-Mäusen wurden mit Cytomix (IFNg, TNFa und IL1b, jeweils mit 10 ng/ml) behandelt. (A) Die IL-6-Konzentrationen wurden dann in Kulturüberständen nach 15 h quantifiziert (**p<0,01, n = 4 Wells/Bedingung). (B) Elektrische Zell-Substrat-Impedanzmessung wurde verwendet, um den transendothelialen Widerstand (TER) wiederholt über 15 h zu messen. Die Daten wurden auf die Resistenz unmittelbar vor der Zugabe des Zytomixes normiert und mittels Zwei-Wege-Varianzanalyse (ANOVA) analysiert, gefolgt von der Tukey-Post-Test19 (**p<0,01, n = 4 Wells/Bedingung). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Discussion
Dieses einfache Protokoll eignet sich für hochreine Endothelzellen aus der murinen Lunge. Obwohl die Gesamtzeit von Anfang bis Ende 7-10 Tage beträgt, beträgt die Hands-on-Zeit etwa 3-4 Stunden. Im Vergleich zu anderen Methoden13,14,15,16 ist das aktuelle Protokoll optimiert, so dass wesentliche Schritte beibehalten werden, ohne die Ausbeute und Reinheit zu beeinträchtigen.
Es lohnt sich, einige kritische Aspekte dieses Protokolls zu beachten. Erstens ist es wichtig, neonatale Welpen anstelle von erwachsenen Mäusen zu verwenden. Unserer Erfahrung nach vermehren sich Endothelzellen von erwachsenen Mäusen nicht so leicht wie Zellen von neugeborenen Jungtieren und werden leicht von Zellen mit spindelartiger Morphologie überrannt, die mit Fibroblasten oder mesenchymalen Stammzellen übereinstimmt15,16. Eine mögliche Erklärung für den Unterschied ist, dass sich die Lungenentwicklung bei neonatalen Mäusen im Alveolarstadium befindet, das durch eine schnellere Proliferation von Endothelzellen gekennzeichnetist 20. Mit zunehmendem Altervon 21 Jahren kann es auch zu einem gewissen Grad an Seneszenz kommen. Die enzymatische Verdauungszeit muss ebenfalls präzise sein, da eine Unterverdauung zu einer Einzelzellsuspension mit geringer Ausbeute führen kann. Im Gegensatz dazu kann eine Überverdauung zu einem erheblichen Zelltod führen. Wir haben festgestellt, dass die optimale Zeit für den Kollagenase-Aufschluss 45 Minuten beträgt. Es folgt die mechanische Dissoziation mit einer stumpfen Kanüle. Die Instillation von intratrachealer Kollagenase während der enzymatischen Verdauung wurde ebenfalls berichtet14,15; Dies kann jedoch zeitaufwändig sein und zu einer unvollständigen Verdauung während der laufenden Arbeit führen. Schließlich gehen einige Protokolle unmittelbar nach dem enzymatischen Verdauen direkt zur Isolierung von Immunbeads über13,16. Wir haben herausgefunden, dass die Kultivierung der Zellen aus der dissoziierten Lunge im Medium für ein oder zwei Tage vor der Auswahl der Immunbeads die Ausbeute an lebensfähigen und hochreinen Endothelzellen erheblich erhöht. Dies könnte mit der Geschwindigkeit zusammenhängen, mit der isolierte Zellen in das Gewebekulturmedium gelangen, was zu einem geringeren Zelltod in den frühen Stadien nach der Entfernung aus den Mäusen, einer höheren anfänglichen Aussaatdichte und einer Zeit für die Endothelzellen führt, um sich vor der ersten Immunbead-Isolierung zu adhäsieren und zu vermehren.
Die Einschränkungen der Präparation und Analyse von Endothelzellen der Maus sind wie folgt. Jede Maus stellt nur eine begrenzte Anzahl von Zellen zur Verfügung, die innerhalb weniger Passagen verwendet werden müssen. Dieses Problem kann überwunden werden, indem die Lungenverdauung von mehreren Mäusen gepoolt wird. Leider sind wir in unseren Bemühungen, die Zellen für die zukünftige Verwendung zu kryokonservieren und aufzutauen, erfolglos. Trotz dieser Einschränkungen haben Endothelzellen der Maus einige Vorteile. Sie können insbesondere in Situationen hilfreich sein, in denen menschliche Endothelzellen entweder nicht verwendet werden können (z. B. Gen-Knockout), wenn ergänzende Studien erforderlich sind, um die Ergebnisse mit menschlichen Zellen zu bestätigen, oder wenn die Heterogenität der Antworten von Endothelzellen verschiedener menschlicher Spender die Reproduzierbarkeit zwischen den Experimenten problematisch macht6. Die homogene Endothelzellpopulation von genetisch identischen Mäusen ermöglicht die Reproduzierbarkeit zwischen Experimenten und die Untersuchung spezifischer Gene und Signalwege unter stabilen Hintergrundbedingungen.
Endothelzellen der Maus können für vielfältige Anwendungen verwendet werden, um Einblicke in die endotheliale Aktivierung und Dysfunktion bei verschiedenen Krankheitsprozessen zu erhalten. Zum Beispiel spielen Endothelzellen eine wesentliche Rolle bei der Sepsis und tragen sowohl zu positiven als auch zu pathologischen Reaktionen bei, indem sie lokale und systemische Entzündungen aktivieren, den Transport und die Aktivierung von Leukozyten im Gewebe fördern, die Gerinnung regulieren und die Endothelpermeabilität modulieren 2,22,23. Dieses einfache Protokoll liefert lebensfähige, funktionelle Endothelzellen, die in Assays für jeden dieser Endothelprozesse verwendet werden können.
Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von NIH T32GM008440 (JH/EW) und NIH R01AI058106 (JH) unterstützt. Wir erkennen den UCSF Parnassus Flow Cytometry Core (RRID:SCR_018206) an, der teilweise durch den Grant NIH P30 DK063720 und den NIH S10 Instrumentation Grant S10 1S10OD021822-01 unterstützt wird.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 mL conicals | Corning Life Sciences | 430829 | |
| Accutase Cell Detachment Solution | Innovative Cell Technologies, Inc | AT-104 | |
| BD PrecisionGlide Needle 25 G x 5/8" | Becton Disckinson | 305122 | |
| BioRender.com | BioRender | ||
| Blunt Cannula 15 G x 1-1/2" | Covidien | 8881202314 | |
| CD-102 Rat anti-mouse (3C4 (MIC2/4)) | BD Biosciences | 553326 | |
| CD-31 Rat anti-mouse (MEC 13.3) | BD Biosciences | 557355 | |
| Collagenase, Type 1 | Worthington Biochemical Corp | LS004194 | |
| DMEM, high glucose | Gibco | 11965092 | |
| Dynabeads Sheep Anti-Rat IgG | Invitrogen | 11035 | |
| Endothelial Cell Growth Supplment | EMD Millipore Corp | 02-102 | |
| Falcon cell strainers (70 µm) | Corning Life Sciences | 352350 | |
| Fetal Bovine Serum, heat inactivated | Gibco | 10082-147 | |
| Fine Scissors | Fine Science Tools | 14060-09 | |
| Fine Scissors | Fine Science Tools | 14060-10 | |
| Fisherbrand Disposable Borosilicate Glass Pasteur Pipets | Fisher Scientific | 13-678-20B | |
| FITC Rat Anti-mouse CD102 (3C4) | BD Biosciences | 557444 | |
| FITC Rat IgG2a, κ Isotype Control (R35-95) | BD Biosciences | 553929 | |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11050-10 | |
| HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red | Gibco | 14175095 | |
| Heparin Sodium Injections (1,000 Units/mL) | Medline | 0409-2720-02 | |
| Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma | H3393 | |
| HEPES (1 M) | Gibco | 15630106 | |
| Nonessential amino acids (100x) | Gibco | 11140050 | |
| PE Rat Anti-mouse CD31 (MEC 13.3) | BD Biosciences | 553373 | |
| PE Rat IgG2a, κ Isotype Control R35-95) | BD Biosciences | 553930 | |
| Penicillin Streptomycin (10,000 U/mL, 10,000 µg/mL) | Gibco | 15140122 | |
| Recombinant Murine IFN-γ | Peprotech | 315-05 | |
| Recombinant Murine IL-1β | Peprotech | 211-11B | |
| Recombinant Murine TNF-α | Peprotech | 315-01A | |
| Round bottom polystyrene test tubes | Corning Life Sciences | 352058 | |
| Semken Forceps | Fine Science Tools | 11008-13 | |
| Sodium pyruvate (100 mM) | Gibco | 11360070 | |
| Stericup Quick Release-GP Sterile Vacuum Filtration System, 250 mL | Millipore | S2GPU02RE | |
| Steriflip-GP Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit | Milipore | SCGP00525 | |
| Sterile syringe (10 mL) | Fisher Scientific | 14-955-459 | |
| Sterile syringe (20 mL) | Fisher Scientific | 14-955-460 | |
| T-75 cell culture flask with vent cap, CellBIND treated | Corning Life Sciences | 3290 |
References
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