Summary
Bu makalede, primer akciğer endotel hücreleri yenidoğan farelerden izole edilmiş ve kültürlenmiştir.
Abstract
Endotel hücreleri vasküler tonus, bağışıklık, pıhtılaşma ve geçirgenliğin düzenlenmesinde kritik rol oynar. Endotel disfonksiyonu diyabet, ateroskleroz, sepsis ve akut akciğer hasarı gibi tıbbi durumlarda ortaya çıkar. Endotel hücrelerinin bu ve diğer durumların patogenezindeki rolünü araştırmak için saf endotel hücrelerini farelerden izole etmek için güvenilir ve tekrarlanabilir bir yönteme ihtiyaç vardır. Bu protokolde 5-7 günlük yenidoğan fare yavrularından akciğer mikrovasküler endotel hücreleri hazırlandı. Akciğerler toplanır, kıyılır ve kollajenaz I ile enzimatik olarak sindirilir ve serbest bırakılan hücreler bir gecede kültürlenir. Endotel hücreleri daha sonra manyetik boncuklara konjuge edilmiş anti-PECAM1 (CD-31) IgG kullanılarak seçilir ve hücreler tekrar birleşecek şekilde kültürlenir. Daha sonra endotel hücrelerinin saflığını arttırmak için manyetik boncuklara konjuge edilmiş anti-ICAM2 (CD-102) IgG ile ikincil bir hücre seçimi meydana gelir ve hücreler tekrar birleşecek şekilde kültürlenir. Tüm süreç, hücrelerin deney için kullanılabilmesi için yaklaşık 7-10 gün sürer. Bu basit protokol, endotel sitokini ve kemokin üretimi, lökosit-endotel etkileşimleri, endotel pıhtılaşma yolları ve endotel geçirgenliğine odaklanan çalışmalar da dahil olmak üzere in vitro çalışmalar için hemen kullanılabilecek oldukça saf (saflıkta >% 92) endotel hücreleri verir. Birçok nakavt ve transgenik fare çizgisi mevcut olduğundan, bu prosedür aynı zamanda endotel hücreleri tarafından eksprese edilen spesifik genlerin yaralanma, enfeksiyon ve inflamasyona karşı sağlıklı ve patolojik yanıtlardaki işlevini anlamaya da katkıda bulunur.
Introduction
Vasküler endotel çalışmalarına olan ilgi son zamanlarda artmıştır, çünkü mikrovasküler endotel hücrelerinin işlev bozukluğu inme, kardiyovasküler hastalık, diyabet, akut akciğer hasarı, sepsis ve enfeksiyöz olmayan yaralanmalar gibi birçok insan hastalığında ortaya çıkmaktadır 1,2,3,4,5. Bu durumların patogenezini tanımlamak ve koruyucu ve düzensiz endotel hücre yanıtlarında spesifik genlerin rolünü anlamak için, farelerden yüksek saflıkta mikrovasküler endotel hücrelerini izole etmek ve kültürlemek için güvenilir yöntemlere ihtiyaç vardır. Birçok çalışma, insan göbek damarı endotel hücreleri (HUVEC) veya insan akciğer mikrovasküler endotel hücreleri (HMVEC) gibi insan endotel hücrelerini kullanırken, endotel fonksiyonunu ve disfonksiyonunu incelemek için fare endotel hücrelerini kullanmanın birçok nedeni vardır. İlk olarak, farklı insan donörlerinden gelen endotel hücrelerinin yanıtlarında önemli bir heterojenlik vardır, bu da bireysel deneyler arasında sonuçlarda değişkenliğe yol açar 6,7,8. İkincisi, birincil insan hücre hatlarındaki gen hedeflerinin susturulması, değişken protein ekspresyon seviyeleri 9,10'a da yol açabilir. Buna karşılık, fare endotel hücrelerinin yanıtlarında minimal heterojenite vardır11, genetik arka planın çalışma grupları arasında aynı olduğu varsayılarak. Ayrıca, çok sayıda fare endotel hücresi, birkaç yenidoğan fareden akciğerleri bir araya getirerek hazırlanabilir. Bu faktörler, deneyler arasında daha tutarlı ve tekrarlanabilir sonuçlar sağlar. Son olarak, nakavt veya transgenik farelerin mevcudiyeti, ilgilenilen proteinlerden yoksun hücre tiplerinin izolasyonunu da sağlar.
Yayınlanmış yöntemler 12,13,14,15,16 kullanılarak fare akciğer endotel hücrelerinin sağlıklı ve saf popülasyonlarının izole edilmesindeki önemli zorluklar, yüksek kaliteli fare akciğer mikrovasküler endotel hücrelerini izole etmek için daha güvenilir ve basit bir yöntem geliştirilmesine yol açmıştır. Mevcut protokolün avantajları, hazır bulunan yenidoğan farelerinin kullanılmasını, hayvancılığın ve konut maliyetlerinin sınırlandırılmasını içerir. Ek olarak, deneyimlerimize göre, yenidoğan farelerden endotel hücrelerinin canlılığı, yetişkin farelerden hazırlanan endotel hücrelerinden önemli ölçüde daha yüksektir. Yenidoğan fareler küçük akciğer dokusuna sahip olduklarından, endotel hücreleri, yetişkin farelerden toplanması için önerilen kollajenazın trakeal instilasyonunu kullanmak yerine, eksize edilmiş akciğerleri kollajenaza sindirerek toplanabilir16. Bu aynı zamanda fareleri ötenazi yapmak ve endotel hücrelerini hücre kültürü ortamına ve inkübatöre sokmak arasındaki süreyi, endotel yanıtlarının saflığını veya verimini veya tekrarlanabilirliğini etkilemeden azaltır. Son olarak, saf hücre popülasyonları, endotel hücrelerinin 14,15,17 verimlerine zarar verebilecek veya daha düşük verimlere yol açabilecek akış sitometrisi olmadan izole edilmiştir.
Mevcut modifiye protokol sürekli olarak 7-10 gün içinde in vitro deneyler için hemen kullanılabilecek yüksek saflıkta ve canlı endotel hücrelerine yol açmaktadır. Hücreleri doğrudan nakavt hayvanlarından izole etmek, deneyden önce hücrelerin manipülasyonunu da en aza indirir. Bu yöntemler, çoklu hastalıklar için endotel bazlı terapötik hedefleri keşfetmek için çeşitli proteinlerin endotel fonksiyonundaki rolünü araştırmak için kullanılabilir.
Protocol
Tüm hayvan prosedürleri, California San Francisco Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanmıştır. Çalışma için erkek C57BL/6 yenidoğan fare yavruları (5-7 gündüz) kullanıldı. Tüm protokol 7-10 gün sürer (Şekil 1).
1. Endotel hücre ortamının hazırlanması
- Bazal ortamı hazırlayın: Dulbecco'nun 4.500 mg / L glikoz ve 4 mM L-Glutamin (DMEM) içeren Modifiye Kartal Ortamı,% 20 (v / v) ısı ile inaktive edilmiş fetal sığır serumu, 100 U / 100 μg / mL penisilin / streptomisin ve 25 mM HEPES ile desteklenmiştir (bkz. 22 μM filtreli steril filtre. Bazal ortamı 4 ° C'de saklayın ve hazırlandıktan sonra bir ay içinde kullanın.
- Tam ortamı hazırlayın: 100 μg / mL heparin, 100 μg / mL endotel hücre büyüme takviyesi, 1x esansiyel olmayan amino asitler ve 1 mM sodyum piruvat ile desteklenmiş bazal ortam (bkz. 22 μM filtreli steril filtre. 4 ° C'de saklayın ve hazırlıktan sonraki bir ay içinde kullanın.
2. Anti-sıçan manyetik boncukların ön kaplaması13
- 50 mL boncuk yıkama tamponu yapın: %0,1 (w/v) sığır serum albümini (BSA) ile desteklenmiş fosfat tamponlu çözelti (PBS). 22 μM filtreli steril filtre ve 4 °C'de saklayın ve hazırlandıktan sonra bir ay içinde kullanın.
- Boncukları ve pipetleri boncukların 50 μL'sini (2 x 107 boncuk) biri CD-31 ve diğeri CD-102 için olmak üzere iki adet 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne yeniden askıya almak için manyetik boncukları birkaç saniye boyunca vorteks edin (bkz. 1 mL boncuk yıkama tamponu ekleyin ve iyice karıştırın.
NOT: Bahsedilen tüm hacimler 3-4 yenidoğan fare yavrusundan (5-7 günlük) endotel hücrelerini izole etmek için kullanılmıştır. CD-31 ve CD-102 manyetik immün boncuk seçiminde kullanılan endotel hücre yüzey belirteçleridir. - Tüpleri manyetik bir ayırıcıya yerleştirin ve süpernatantı bir cam Pasteur pipet ile çıkarın. Her seferinde 1 mL boncuk yıkama tamponu ile 3 kez yıkayın.
- Boncukları orijinal boncuk hacminde, 50 μL'de, boncuk yıkama tamponu ile tekrar askıya alın. Daha sonra her 50 μL boncuk için 5 μL (2.5 μg) antikor (CD-31 / CD-102) ekleyin.
- Boncuk süspansiyonunu, bir uçtan uca rotatör üzerinde gece boyunca 4 °C'de veya oda sıcaklığında 3 saat boyunca hafifçe dönerek inkübe edin. Yıkamayı 4 kez tekrarlayın.
- İmmün boncukları orijinal hacimde, 50 μL'de, boncuk yıkama tamponu ile tekrar askıya alın ve 4 ° C'de saklayın ve 1-2 hafta içinde kullanın.
3. Akciğer hücrelerinin izolasyonu ve kaplanması
- İzolasyon gününde Tip 1 kollajenaz çözeltisi hazırlayın: 25 mL HBSS'ye 25 mg Tip 1 kollajenaz ekleyin ( bkz. 22 μM filtre kullanarak nazik dönüş ve steril filtre ile 1 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin. Çözeltiyi 37 °C'de sıcak tutun.
- Endotel hücre aktivasyonunu ve pıhtı oluşumunu en aza indirmek için ötenaziden 10 dakika önce 5-7 günlük fare yavrularına kas içinden heparin (25 μL / fare, 1.000 U / mL) enjekte edin14,15.
- 2020 AVMA Ötenazi Kılavuzlarına uygun olarak keskin makas kullanarak fare yavrusunu kafası kesilerek ötenazi yapın. Ardından, fareyi ventral tarafı yukarı bakacak şekilde bir diseksiyon panosuna sabitleyin.
- Karkası% 70 etanol ile püskürtün, ardından önce diyaframı keserek ve ardından göğsün tüm yan duvarları boyunca üstün bir şekilde yukarı doğru keserek göğüs boşluğunu açığa çıkarın. Göğüs kafesini o zamana yansıtmak kalbi ve akciğerleri açığa çıkarır.
NOT: Yenidoğan farelerin küçük boyutu göz önüne alındığında bu adım için daha küçük forseps ve makas kullanın ve akciğerlerden yetersiz kan alınmasına yol açacağından kalbi veya akciğerleri delmediğinizden emin olun. - 10 mL'lik bir şırıngaya 25 G'lik bir iğne takın ve akciğerlerden kan almak için kalbin sağ ventrikülüne 5 mL soğuk DMEM enjekte edin. Akciğerler beyaza dönecek.
- Akciğerleri göğüs boşluğundan, her seferinde bir lobdan, lobları karşılık gelen bronşlara distal keserek çıkarın.
- Tüm akciğer loblarını, 20 mL buz gibi soğuk bazal ortam ile önceden doldurulmuş 50 mL'lik bir konik tüpe toplayın (adım 1.1'den itibaren).
- 3.2-3.7 arasındaki adımları diğer fare yavrularıyla tekrarlayın ve tüm akciğer loblarını aynı 50 mL konik tüpte toplayın.
- Akciğerlerin yüzeyinde görsel olarak takdir edilen fazla kırmızı kan hücrelerini yıkamak için tüpü 10-15 saniye boyunca elle hafifçe çalkalayın.
NOT: Akciğerlerin içinden veya çevresinden tüm kanın alınması gerekli değildir; Bununla birlikte, bu saflığı arttırır. Daha fazla doku işlemenin steril bir başlıkta yapılması gerekir. - Akciğerleri ortamdan çıkarmak için bir hücre süzgeci kullanın ve dokuyu steril, tek kullanımlık 100 mm çapında bir doku kültürü kabına aktarın ve sterilize edilmiş makasla kıyın.
- Kıyılmış dokuyu, 25 mL önceden ısıtılmış kollajenaz çözeltisi ile 50 mL konik tüpe aktarın (adım 3.1). Dönen bir karıştırıcıda 37 °C'de 45 dakika boyunca hafifçe çalkalayın.
NOT: 60 dakika boyunca bile aşırı sindirim, daha düşük verime neden olabilir. - 15 G künt kanüle 20 mL'lik bir şırınga takın ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve dokuyu hücresel bir süspansiyona ayırmak için süspansiyonu 10-15 kez tritüre edin. Güçlü olun, ancak aşırı köpürmekten kaçının.
NOT: Artık akciğerin görünür parçaları olmayacak ve bunun yerine, bu adımın tamamlanmasının ardından süspansiyon bulutlu olacaktır. - Süspansiyonu 70 μm'lik bir hücre süzgecinden yeni bir 50 mL konik tüpe filtreleyin. Ayrıca, sindirim için kullanılan konik tüpü ve hücre süzgecini ilave 15 mL bazal ortam ile durulayın.
- Hücresel süspansiyonu 400 x g'de 4 °C'de 8 dakika boyunca santrifüj edin.
- Süpernatantı bir cam Pasteur pipet ile çıkarın ve peleti 2 mL tam ortamda tekrar askıya alın. Bir T-75 şişesine aktarın ve nemlendirilmiş,% 5 CO2 inkübatörde 37 ° C'de 8 mL tam orta kültür ekleyin.
- Ertesi gün, şişeleri kalsiyum ve magnezyum (HBSS / CMF) içermeyen 10 mL Hank'in Dengeli Tuz Çözeltisi ile iki kez yıkayın ( Malzeme Tablosuna bakın) ve 10 mL tam ortam ekleyin.
NOT: 2-3 gün sonra, kültür% 90-95 oranında akıcı ve primer immünoboncuk izolasyonu için hazır olacaktır.
4. Primer immünoboncuk izolasyonu ve endotel hücrelerinin kültürlenmesi
- Yapışık endotel hücrelerini 10 mL HBSS/CMF ile iki kez yıkayın. 2 mL tripsin içermeyen hücre ayrılma çözeltisi ekleyin ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve ~ 5 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin. Tüm hücrelerin şişeden kaldırıldığından emin olun.
NOT: Tripsin hücre yüzeyi yapışma markörü CD-31'i bozabileceğinden, tripsin yerine tripsin içermeyen bir ayrılma çözeltisi kullanılmalıdır. - Hücre ayrılma çözeltisini nötralize etmek ve içeriği 15 mL'lik bir konik tüpe aktarmak için 8 mL bazal ortam ekleyin. Oda sıcaklığında 4 dakika boyunca 400 x g'de döndürün.
- Bir cam Pasteur pipet kullanarak süpernatantı çıkarın ve hücreleri 2 mL bazal ortamda yeniden askıya alın. 2 mL hücre süspansiyonunu 5 mL yuvarlak tabanlı polistiren tüpe aktarın (bkz.
- Boncukları yeniden askıya almak ve her 2 mL hücre süspansiyonu için 30 μL boncuk eklemek için birkaç saniye boyunca Vortex anti-CD-31 kaplı boncuklar. Kapağı sabitleyin.
- Tüpü oda sıcaklığında 10 dakika boyunca uçtan uca bir döndürücü üzerinde inkübe edin. Daha sonra tüpleri manyetik bir ayırıcıya yerleştirin ve 2 dakika bekletin.
- Bir cam Pasteur pipet kullanarak yavaşça süpernatanı aspire edin. Tüpü mıknatıstan çıkarın, tüpe 3 mL bazal ortam ekleyerek boncuk hücresi peletini yeniden askıya alın ve birkaç kez yukarı ve aşağı pipet yapın.
- Manyetik ayırıcı üzerindeki tüpü 2 dakika boyunca değiştirin ve ardından bir cam Pasteur pipet kullanarak süpernatantı dikkatlice aspire edin.
- Süpernatant net görünene kadar yıkamaları (adım 4.6-4.7) en az 4 kez tekrarlayın.
- Son yıkamadan sonra, boncuk hücreli peleti 3 mL tam büyüme ortamında tekrar askıya alın ve bir T-75 şişesine aktarın. Tam büyüme ortamının 7 mL'sini ekleyin ve nemlendirilmiş% 5 CO2 inkübatörde 37 ° C'de inkübe edin.
- Ertesi gün hücreleri HBSS / CMF ile yıkayın, ardından 10 mL taze komple ortam ekleyin. Ortamı, %90-95 birleşene kadar her 2-3 günde bir 10 mL taze komple ortam ile değiştirin.
NOT: Hücreler ~% 90-95 oranında birleştiğinde, ~ 3-4 gün sürer, kültür ikincil immünoboncuk izolasyonu için hazırdır.
5. Sekonder immünoboncuk izolasyonu ve endotel hücrelerinin kültürlenmesi
- Yapışık endotel hücrelerini 10 mL HBSS / CMF ile iki kez yıkayın. 2 mL tripsin içermeyen hücre ayrılma çözeltisi ekleyin ve ~ 5 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin. Tüm hücrelerin şişeden kaldırıldığından emin olun.
- Hücre ayrılma çözeltisini nötralize etmek ve 15 mL'lik bir konik tüpe aktarmak için 8 mL bazal ortam ekleyin. Oda sıcaklığında 4 dakika boyunca 400 x g'de döndürün.
- Bir cam Pasteur pipet kullanarak süpernatantı çıkarın ve hücreleri 2 mL bazal ortamda yeniden askıya alın. 2 mL hücre süspansiyonunu 5 mL yuvarlak tabanlı polistiren tüpe aktarın.
- Vortex anti-CD-102 kaplı boncuklar, boncukları yeniden askıya almak ve her 2 mL hücre süspansiyonu için 30 μL boncuk eklemek için birkaç saniye boyunca kaplanmış boncuklar. Kapağı sabitleyin.
- Tüpü oda sıcaklığında 10 dakika boyunca uçtan uca bir döndürücü üzerinde inkübe edin. Tüpleri manyetik bir ayırıcıya yerleştirin ve 2 dakika bekletin. Daha sonra bir cam Pasteur pipet kullanarak süpernatantı nazikçe aspire edin.
- Tüpü mıknatıstan çıkarın, tüpe 3 mL bazal ortam ekleyerek boncuk hücresi peletini yeniden askıya alın ve birkaç kez yukarı ve aşağı pipet yapın.
- Bir cam Pasteur pipet kullanarak süpernatantı dikkatlice aspire etmeden önce manyetik ayırıcı üzerindeki tüpü 2 dakika boyunca değiştirin.
- Süpernatant net görünene kadar yıkamaları (adım 5.6-5.7) 4 kez veya daha fazla tekrarlayın.
- Son yıkamadan sonra, boncuk hücreli peleti 3 mL tam büyüme ortamında tekrar askıya alın ve bir T-75 şişesine aktarın. 7 mL tam büyüme ortamı ekleyin ve nemlendirilmiş% 5 CO2 inkübatörde 37 ° C'de inkübe edin.
- Ertesi gün hücreleri HBSS / CMF ile yıkayın, ardından 10 mL taze komple ortam ekleyin. Ortamı, %90-95 birleşene kadar her 2-3 günde bir 10 mL taze komple ortam ile değiştirin. Endotel hücreleri tamamen birleştikten sonra, deney için hazırdırlar. Hücreler, yaşlanma meydana gelebileceğinden ve diğer hücre tipleri devralabileceğinden, altıncı pasajın ötesinde kullanılmamalıdır.
6. Endotel hücre yüzey belirteçlerinin akım sitometrisi ile doğrulanması
- Hücreleri ayırmak için tripsin içermeyen hücre ayrılma çözeltisini kullandıktan sonra, hücre peletini 1 x 10 5 hücre / mL'ye ve hücre süspansiyonunun 100 μL'sini 1, 2 ve 3 etiketli üç adet1.5 mL mikrosantrifüj tüpüne aliquot olarak yeniden askıya alın.
- Hücreleri 1 mL 1x PBS ile yıkayın. 4 °C'de 2 dakika boyunca 500 x g'de santrifüj. Yıkama tamponunu çıkarın ve iki kez tekrarlayın.
- Hücre peletini 100 μL 1x PBS'de yeniden askıya alın. Tüp 1'e, 1 μL konjuge fare karşıtı CD-31 (PECAM-1) antikoru (ör. fikoeritrin (PE) fare karşıtı CD-31 antikoru) ve 1 μL konjuge fare karşıtı CD-102 (ICAM-2) (ör. floresein izotiyosiyanat (FITC) anti-fare CD102 antikoru) ekleyin (bkz. Tüp 2'ye, uygun izotip kontrollerini ekleyin. 3 numaralı tüp lekesiz kalacaktır.
- Tüpleri buz üzerinde ve karanlıkta 30-45 dakika boyunca inkübe edin.
- Her tüpe 1 mL PBS ekleyin, yavaşça vorteks yapın ve 4 ° C'de 2 dakika boyunca 500 x g'de santrifüj yapın. Çıkarın, yıkayın ve üç kez tekrarlayın. Son peleti 500 μL PBS'de tekrar askıya alın.
- Tüpleri analize kadar alüminyum folyo ile kaplı 4 ° C'de tutun. Analizin 3-4 saat içinde tamamlanması gerekir.
- Bir sitometre kullanarak akış verilerini alın. Lazer voltajını hücre otofloresansına göre düzgün bir şekilde ayarlamak için lekesiz bir numuneyi negatif kontrol olarak kullanın. İleriye doğru dağılmış bir grafik ve yan saçılma grafiği ile toplam hücre popülasyonunu açın.
NOT: Çiftleri hariç tuttuktan sonra, CD31+ CD102+ çift pozitif hücreler endotel hücreleri olarak tanımlanır.
Representative Results
Bu basit protokol, fare mikrovasküler endotel hücrelerini 7-10 gün boyunca izole etmeyi, kültürlemeyi ve karakterize etmeyi sağlar (Şekil 1). Kısaca, akciğerler kaplamadan önce eksize edilir ve enzimatik olarak sindirilir. Kaplamadan hemen sonra, endotel hücreleri ve diğer hücreler hücre kültürü ortamında yüzecektir. Ertesi gün, endotel hücreleri ve kirletici hücreler plakaya yapışacak ve kalıntıları ve yüzen hücreleri çıkarmak için güçlü bir yıkama tekniğine ihtiyaç duyulacaktır. Hücreler birleşime ulaştığında, ilk immünoboncuk seçimi yapılır. CD-31-pozitif hücreler daha sonra bir parke taşı oluşumunda büyümeye başlar (Şekil 2). Arnavut kaldırımı morfolojisine sahip olmayan veya aşırı büyüyen hücreler kirleticidir ve endotel hücreleri değildir13,14,15,16.
Daha sonra, diğer protokollere benzer şekilde, endotel hücrelerinin saflığını arttırmak için anti-CD-102 kaplı boncuklar kullanılarak ikinci bir immünoboncuk seçimi yapılır13,16. İkinci immünoboncuk seçiminden sonra birleşen hücreler daha sonra deney için kullanılabilir. Floresan ile aktive edilmiş hücre sıralama (FACS), hücre popülasyonunun CD-31- ve CD-102-pozitif olduğunu doğrulamak için kullanılır (Şekil 3).
Bu endotel hücreleri daha sonra endotel enflamatuar yollarını ve endotel bariyer fonksiyonunu incelemek gibi birçok uygulama için kullanılabilir. Örneğin, murin sitomiksi (IFNg, TNFa ve IL1b, her biri 10 ng / mL'de) ile tedavinin endotel hücreleri tarafından IL-6 üretimini indüklediği gözlenmiştir (Şekil 4A). Daha sonra Elektrik Hücresi-substrat Empedans Algılaması (ECIS)18 , murin akciğer endotel hücresi monokatmanları boyunca elektrik akımının akışına karşı transendotelyal direnci (TER) ölçmek için kullanıldı. Sitomiks ile tedavi edilen hücrelerin TER'de azalmaya yol açtığı gözlenmiştir (Şekil 4B), bu da artmış endotel geçirgenliği ile uyumludur. Bu örnekler, bu protokol kullanılarak hazırlanan endotel hücrelerinin çeşitli endotel süreçlerini nasıl inceleyebileceğini göstermektedir. Bu, araştırmacıların endotel hücrelerine ilgi duyan genleri daha kolay incelemelerini sağlar, çünkü giderek artan sayıda mevcut nakavt ve transgenik fare göz önüne alındığında.
Şekil 1: Murin akciğer endotel hücrelerinin izolasyonu için şematik. 5-7 günlük yenidoğan yavrularının akciğerleri toplanır ve kıyılır. Kıyılmış doku kollajenaz I. ile enzimatik olarak sindirildi. hücresel süspansiyon kaplanır ve 2-3 gün boyunca kültürlenir. Hücreler daha sonra CD-31 kaplı boncuklarla primer immünoboncuk izolasyonuna tabi tutulur ve 3-4 gün daha kültürlenir. 2-3 gün daha kültürlenmeden önce CD-102 kaplı boncuklarla ikinci immün boncuk izolasyonu. Hücreler artık işlevsel deneyler için hazırdır. Görüntü, web tabanlı bir illüstrasyon aracı olan Biorender tarafından oluşturulmuştur. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Murin akciğer endotel hücrelerinin morfolojisi. Kültürlenmiş murin akciğer endotel hücreleri parke taşı morfolojisi gösterir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Endotel hücrelerinin akım sitometrisi ile analizi . (A) Tüm olaylar, İleri Saçılma (FSC) ve Yan Saçılma (SSC) nokta grafiği üzerinde görselleştirilir. (B) Hem endotelyal spesifik hücre yüzey antijenleri CD-31 hem de CD-102 için pozitif olan murin akciğer endotel hücrelerinin saçılma grafiği doğrulaması. (C) İzotip numunenin histogramı ve CD-31/CD-102 spesifik antikoru ile boyanmış numune. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Sitomiks, murin akciğer endotel hücresi IL-6 üretimini ve endotel hücre geçirgenliğini indükler. C57BL / 6 farelerinden alınan murin akciğer mikrovasküler endotel hücreleri sitomiks (IFNg, TNFa ve IL1b, her biri 10 ng / mL'de) ile tedavi edildi. (A) IL-6 düzeyleri daha sonra kültür süpernatantlarında 15 saatte ölçüldü (**p<0.01, n = 4 kuyucuk/durum). (B) Transendotelyal direnci (TER) 15 saat boyunca tekrar tekrar ölçmek için Elektrik Hücre-Substrat Empedans Algılaması kullanıldı. Veriler, sitomiksin eklenmesinden hemen önce belirlenen şekilde dirence normalleştirildi ve iki yönlü varyans analizi (ANOVA) ve ardından Tukey son testi19 (**p<0.01, n = 4 kuyucuk / durum) ile analiz edildi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Discussion
Bu basit protokol, murin akciğerlerinden yüksek saflıkta endotel hücrelerine kendini ödünç verir. Baştan sona toplam süre 7-10 gün olmasına rağmen, uygulamalı süre 3-4 saat civarındadır. Diğer yöntemlerle karşılaştırıldığında13,14,15,16, mevcut protokol kolaylaştırılmıştır, verim ve saflıktan ödün vermeden gerekli adımları atmaktadır.
Bu protokolün bazı kritik yönlerine dikkat etmek önemlidir. İlk olarak, yetişkin fareler yerine yenidoğan yavruları kullanmak önemlidir. Deneyimlerimize göre, yetişkin farelerden elde edilen endotel hücreleri, yenidoğan yavrularından gelen hücreler kadar kolay çoğalmazlar ve fibroblastlar veya mezenkimal kök hücrelerle tutarlı iğ benzeri morfolojiye sahip hücreler tarafından kolayca istila edilirler15,16. Aradaki farkın olası bir açıklaması, akciğer gelişiminin yenidoğan farelerde alveolar aşamada olması ve endotel hücrelerinin daha hızlı çoğalması ile karakterize olmasıdır20. 21 yaşla birlikte bir dereceye kadar yaşlanma da olabilir. Enzimatik sindirim süresinin de hassas olması gerekir, çünkü hazımsızlık düşük verimli tek hücreli süspansiyona yol açabilir. Buna karşılık, aşırı sindirim önemli miktarda hücre ölümüne yol açabilir. Kollajenaz sindirimi için en uygun sürenin 45 dakika olarak belirlendiğini belirledik. Bunu daha sonra künt bir kanül ile mekanik ayrışma izler. Enzimatik sindirim sırasında intratrakeal kollajenaz damlatılması da bildirilmiştir14,15; Bununla birlikte, bu zaman alıcı olabilir ve mevcut çalışma sırasında eksik sindirime yol açabilir. Son olarak, bazı protokoller enzimatik sindirimden hemen sonra doğrudan immünoboncuk izolasyonuna ilerler13,16. İmmünoboncuk seçimini yapmadan önce bir veya iki gün boyunca ortamdaki ayrışmış akciğerden hücrelerin kültürlenmesinin, canlı ve oldukça saf endotel hücrelerinin verimini önemli ölçüde artırdığını bulduk. Bu, izole edilmiş hücrelerin doku kültürü ortamına girme hızı ile ilişkili olabilir, bu da farelerden çıkarıldıktan sonraki erken aşamalarda daha az hücre ölümüne, daha yüksek başlangıç tohumlama yoğunluğuna ve endotel hücrelerinin ilk immünoboncuk izolasyonundan önce yapışması ve çoğalması için zamana yol açar.
Fare endotel hücrelerinin hazırlanması ve analizindeki sınırlamalar aşağıdaki gibidir. Her fare yalnızca birkaç pasajda kullanılması gereken sınırlı sayıda hücre sağlar. Bu sorun, birkaç fareden akciğer sindirimini bir araya getirerek aşılabilir. Ne yazık ki, hücreleri gelecekte kullanmak üzere kriyoproteksiyon ve çözme çabalarımızda başarısız olduk. Bu sınırlamalara rağmen, fare endotel hücrelerinin bazı avantajları vardır. Özellikle insan endotel hücrelerinin kullanılamadığı durumlarda (örneğin, gen nakavtı), sonuçları insan hücreleriyle doğrulamak için tamamlayıcı çalışmaların gerekli olduğu durumlarda veya farklı insan donörlerinden gelen endotel hücrelerinin yanıtlarının heterojenliği, deneyler arasında tekrarlanabilirliği sorunlu hale getirdiğindeyardımcı olabilirler 6. Genetik olarak özdeş farelerden elde edilen homojen endotel hücre popülasyonu, deneyler ile stabil arka plan koşulları altında spesifik genlerin ve yolların incelenmesi arasında tekrarlanabilirliğe izin verir.
Fare endotel hücreleri, farklı hastalık süreçlerinde endotel aktivasyonu ve disfonksiyonu hakkında bilgi sağlamak için birden fazla uygulama için kullanılabilir. Örneğin, endotel hücreleri sepsiste ayrılmaz bir rol oynar, lokalize ve sistemik inflamasyonu aktive etme, dokularda lökosit kaçakçılığını ve aktivasyonunu teşvik etme, pıhtılaşmayı düzenleme ve endotel geçirgenliğini modüle etme rolleri ile hem yararlı hem de patolojik yanıtlara katkıda bulunur 2,22,23 . Bu basit protokol, bu endotel süreçlerinin her biri için tahlillerde kullanılabilecek canlı, fonksiyonel endotel hücreleri sağlar.
Disclosures
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu çalışma NIH T32GM008440 (JH / EW) ve NIH R01AI058106 (JH) tarafından desteklenmiştir. UCSF Parnassus Akış Sitometri Çekirdeğini (RRID:SCR_018206) kısmen Grant NIH P30 DK063720 ve NIH S10 Instrumentation Grant S10 1S10OD021822-01 tarafından desteklendiğini kabul ediyoruz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 mL conicals | Corning Life Sciences | 430829 | |
| Accutase Cell Detachment Solution | Innovative Cell Technologies, Inc | AT-104 | |
| BD PrecisionGlide Needle 25 G x 5/8" | Becton Disckinson | 305122 | |
| BioRender.com | BioRender | ||
| Blunt Cannula 15 G x 1-1/2" | Covidien | 8881202314 | |
| CD-102 Rat anti-mouse (3C4 (MIC2/4)) | BD Biosciences | 553326 | |
| CD-31 Rat anti-mouse (MEC 13.3) | BD Biosciences | 557355 | |
| Collagenase, Type 1 | Worthington Biochemical Corp | LS004194 | |
| DMEM, high glucose | Gibco | 11965092 | |
| Dynabeads Sheep Anti-Rat IgG | Invitrogen | 11035 | |
| Endothelial Cell Growth Supplment | EMD Millipore Corp | 02-102 | |
| Falcon cell strainers (70 µm) | Corning Life Sciences | 352350 | |
| Fetal Bovine Serum, heat inactivated | Gibco | 10082-147 | |
| Fine Scissors | Fine Science Tools | 14060-09 | |
| Fine Scissors | Fine Science Tools | 14060-10 | |
| Fisherbrand Disposable Borosilicate Glass Pasteur Pipets | Fisher Scientific | 13-678-20B | |
| FITC Rat Anti-mouse CD102 (3C4) | BD Biosciences | 557444 | |
| FITC Rat IgG2a, κ Isotype Control (R35-95) | BD Biosciences | 553929 | |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11050-10 | |
| HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red | Gibco | 14175095 | |
| Heparin Sodium Injections (1,000 Units/mL) | Medline | 0409-2720-02 | |
| Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma | H3393 | |
| HEPES (1 M) | Gibco | 15630106 | |
| Nonessential amino acids (100x) | Gibco | 11140050 | |
| PE Rat Anti-mouse CD31 (MEC 13.3) | BD Biosciences | 553373 | |
| PE Rat IgG2a, κ Isotype Control R35-95) | BD Biosciences | 553930 | |
| Penicillin Streptomycin (10,000 U/mL, 10,000 µg/mL) | Gibco | 15140122 | |
| Recombinant Murine IFN-γ | Peprotech | 315-05 | |
| Recombinant Murine IL-1β | Peprotech | 211-11B | |
| Recombinant Murine TNF-α | Peprotech | 315-01A | |
| Round bottom polystyrene test tubes | Corning Life Sciences | 352058 | |
| Semken Forceps | Fine Science Tools | 11008-13 | |
| Sodium pyruvate (100 mM) | Gibco | 11360070 | |
| Stericup Quick Release-GP Sterile Vacuum Filtration System, 250 mL | Millipore | S2GPU02RE | |
| Steriflip-GP Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit | Milipore | SCGP00525 | |
| Sterile syringe (10 mL) | Fisher Scientific | 14-955-459 | |
| Sterile syringe (20 mL) | Fisher Scientific | 14-955-460 | |
| T-75 cell culture flask with vent cap, CellBIND treated | Corning Life Sciences | 3290 |
References
- Maniatis, N. A., Orfanos, S. E. The endothelium in acute lung injury/acute respiratory distress syndrome. Current Opinion Critical Care. 14 (1), 22-30 (2008).
- Khakpour, S., Wilhelmsen, K., Hellman, J. Vascular endothelial cell Toll-like receptor pathways in sepsis. Innate Immunity. 21 (8), 827-846 (2015).
- Tuttolomondo, A., Daidone, M., Pinto, A. Endothelial dysfunction and inflammation in ischemic stroke pathogenesis. Current Pharmaceutical Design. 26 (34), 4209-4219 (2020).
- Roberts, A. C., Porter, K. E. Cellular and molecular mechanisms of endothelial dysfunction in diabetes. Diabetes and Vascular Disease Research. 10 (6), 472-482 (2013).
- Widmer, R. J., Lerman, A. Endothelial dysfunction and cardiovascular disease. Global Cardiology Science and Practice. 2014 (3), 291-308 (2014).
- Joffre, J., et al. Catecholaminergic vasopressors reduce toll-like receptor agonist-induced microvascular endothelial cell permeability but not cytokine production. Critical Care Medicine. 49 (3), 315-326 (2021).
- Yan, J., Nunn, A. D., Thomas, R. Selective induction of cell adhesion molecules by proinflammatory mediators in human cardiac microvascular endothelial cells in culture. International Journal of Clinical and Experimental Medicine. 3 (4), 315-331 (2010).
- Bouïs, D., Hospers, G. A., Meijer, C., Molema, G., Mulder, N. H. Endothelium in vitro: A review of human vascular endothelial cell lines for blood vessel-related research. Angiogenesis. 4 (2), 91-102 (2001).
- Nolte, A., et al. Optimized basic conditions are essential for successful siRNA transfection into primary endothelial cells. Oligonucleotides. 19 (2), 141-150 (2009).
- Auguste, D. T., et al. Triggered release of siRNA from poly(ethylene glycol)-protected, pH-dependent liposomes. Journal of Controlled Release. 130 (3), 266-274 (2008).
- Gumkowski, F., Kaminska, G., Kaminski, M., Morrissey, L. W., Auerbach, R. Heterogeneity of mouse vascular endothelium. In vitro studies of lymphatic, large blood vessel and microvascular endothelial cells. Blood Vessels. 24 (1-2), 11-23 (1987).
- Alphonse, R. S., et al. The isolation and culture of endothelial colony-forming cells from human and rat lungs. Nature Protocols. 10 (11), 1697-1708 (2015).
- Lim, Y. -C., Luscinskas, F. W. Isolation and culture of murine heart and lung endothelial cells for in vitro model systems. Methods in Molecular Biology. 341, 141-154 (2006).
- Cao, G., Abraham, V., DeLisser, H. M. Isolation of endothelial cells from mouse lung. Current Protocols in Toxicoly. 61, 1-9 (2014).
- Fehrenbach, M. L., Cao, G., Williams, J. T., Finklestein, J. M., Delisser, H. M. Isolation of murine lung endothelial cells. American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 296 (6), 1096-1103 (2009).
- Wang, J., Niu, N., Xu, S., Jin, Z. G. A simple protocol for isolating mouse lung endothelial cells. Scientific Reports. 9 (1), 1458 (2019).
- Sutermaster, B. A., Darling, E. M. Considerations for high-yield, high-throughput cell enrichment: fluorescence versus magnetic sorting. Scientific Reports. 9 (1), 227 (2019).
- Szulcek, R., Bogaard, H. J., van Nieuw Amerongen, G. P. Electric cell-substrate impedance sensing for the quantification of endothelial proliferation, barrier function, and motility. Journal of Visualized Experiments. (85), e51300 (2014).
- Wong, E., et al. ERK1/2 has divergent roles in lps-induced microvascular endothelial cell cytokine production and permeability. Shock. 55 (3), 349-356 (2020).
- Domm, W., Misra, R. S., O'Reilly, M. A. Affect of early life oxygen exposure on proper lung development and response to respiratory viral infections. Frontiers in Medicine (Lausanne). 2, 55 (2015).
- Jia, G., Aroor, A. R., Jia, C., Sowers, J. R. Endothelial cell senescence in aging-related vascular dysfunction. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Basis of Disease. 1865 (7), 1802-1809 (2019).
- Joffre, J., Hellman, J., Ince, C., Ait-Oufella, H.
- Aird, W. C. The role of the endothelium in severe sepsis and multiple organ dysfunction syndrome. Blood. 101 (10), 3765-3777 (2003).
