Summary
I denne artikkelen ble primære lungeendotelceller isolert og dyrket fra nyfødte mus.
Abstract
Endotelceller spiller kritiske roller i reguleringen av vaskulær tone, immunitet, koagulasjon og permeabilitet. Endoteldysfunksjon oppstår ved medisinske tilstander, inkludert diabetes, aterosklerose, sepsis og akutt lungeskade. En pålitelig og reproduserbar metode for å isolere rene endotelceller fra mus er nødvendig for å undersøke endotelcellenes rolle i patogenesen av disse og andre forhold. I denne protokollen ble lungemikrovaskulære endotelceller fremstilt fra 5-7 dager gamle nyfødte musevalper. Lungene høstes, hakkes og fordøyes enzymatisk med kollagenase I, og frigjorte celler dyrkes over natten. Endotelceller velges deretter ved hjelp av anti-PECAM1 (CD-31) IgG konjugert til magnetiske perler, og celler blir igjen dyrket til samløp. En sekundær celleseleksjon skjer da med anti-ICAM2 (CD-102) IgG konjugert til magnetiske perler for å øke renheten til endotelcellene, og cellene blir igjen dyrket til samløp. Hele prosessen tar omtrent 7-10 dager før cellene kan brukes til eksperimentering. Denne enkle protokollen gir svært rene (renhet >92%) endotelceller som umiddelbart kan brukes til in vitro-studier , inkludert studier fokusert på endotelial cytokin- og kjemokinproduksjon, leukocytt-endotelinteraksjoner, endotelkoagulasjonsveier og endotelpermeabilitet. Med mange knockouts og transgene muselinjer tilgjengelig, gir denne prosedyren seg også til å forstå funksjonen til spesifikke gener uttrykt av endotelceller i sunne og patologiske responser på skade, infeksjon og betennelse.
Introduction
Interessen for å studere det vaskulære endotelet har vokst nylig, da dysfunksjon av mikrovaskulære endotelceller forekommer i flere menneskelige sykdommer, som hjerneslag, kardiovaskulær sykdom, diabetes, akutt lungeskade, sepsis og ikke-smittsomme skader 1,2,3,4,5. For å definere patogenesen av disse tilstandene og forstå rollene til spesifikke gener i beskyttende og dysregulerte endotelcelleresponser, er det behov for pålitelige metoder for å isolere og dyrke mikrovaskulære endotelceller med høy renhet fra mus. Mens mange studier bruker humane endotelceller som humane endotelceller i navlestrengen (HUVEC) eller humane lungemikrovaskulære endotelceller (HMVEC), er det flere grunner til å bruke musendotelceller til å studere endotelfunksjon og dysfunksjon. For det første er det betydelig heterogenitet i respons av endotelceller fra forskjellige menneskelige givere, noe som fører til variabilitet i resultatene mellom individuelle eksperimenter 6,7,8. For det andre kan aktivering av genmål i primære humane cellelinjer også føre til variable proteinuttrykksnivåer 9,10. I kontrast er det minimal heterogenitet i responsene til musendotelceller11, forutsatt at den genetiske bakgrunnen er den samme mellom studiegrupper. Videre kan et stort antall museendotelceller fremstilles ved å samle lunger fra flere nyfødte mus. Disse faktorene tillater mer konsistente og reproduserbare resultater mellom eksperimenter. Endelig sørger tilgjengeligheten av knockout eller transgene mus også for isolering av celletyper som mangler proteiner av interesse.
De betydelige utfordringene med å isolere friske og rene populasjoner av muselungeendotelceller ved hjelp av publiserte metoder 12,13,14,15,16 førte til utvikling av en mer pålitelig og grei metode for å isolere høykvalitets mikrovaskulære endotelceller fra muselunge. Fordeler med dagens protokoll inkluderer bruk av nyfødte mus, som er lett tilgjengelige, noe som begrenser husdyrhold og boligkostnader. I tillegg er vår erfaring at levedyktigheten til endotelceller fra nyfødte mus er vesentlig høyere enn endotelceller fremstilt fra voksne mus. Fordi nyfødte mus har lite lungevev, kan endotelceller høstes ved å fordøye utskårne lunger i kollagenase i stedet for å bruke trakeal instillasjon av kollagenase, som anbefales for innsamling fra voksne mus16. Dette reduserer også tiden mellom euthanisering av mus og å få endotelceller inn i cellekulturmedier og inkubatoren uten å påvirke renheten eller utbyttet eller reproduserbarheten av endotelresponser. Til slutt ble rene cellepopulasjoner isolert uten flowcytometri, noe som kan skade eller føre til lavere utbytte av endotelcellene14,15,17.
Den nåværende modifiserte protokollen fører konsekvent til høy renhet og levedyktige endotelceller på 7-10 dager som kan brukes umiddelbart til in vitro-eksperimenter . Isolering av celler direkte fra knockout-dyr minimerer også manipulering av celler før eksperimentering. Disse metodene kan brukes til å undersøke rollen til forskjellige proteiner i endotelfunksjon for å oppdage endotelbaserte terapeutiske mål for flere sykdommer.
Protocol
Alle dyreprosedyrer ble godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee ved University of California San Francisco. Mannlige C57BL/6 neonatale musevalper (alder 5-7 dager) ble brukt til studien. Hele protokollen tar 7-10 dager (figur 1).
1. Fremstilling av endotelcellemedium
- Forbered basalmediet: Dulbeccos modifiserte ørnemedium med 4,500 mg / l glukose og 4 mM L-glutamin (DMEM) supplert med 20% (v / v) varmeinaktivert føtal bovint serum, 100 U / 100 μg / ml penicillin / streptomycin og 25 mM HEPES (se materialtabell). Sterilt filter med 22 μM filter. Oppbevar basalmedium ved 4 °C og bruk det innen en måned etter tilberedning.
- Forbered hele mediet: Basalmedium supplert med 100 μg / ml heparin, 100 μg / ml endotelcelleveksttilskudd, 1x ikke-essensielle aminosyrer og 1 mM natriumpyruvat (se materialtabell). Sterilt filter med 22 μM filter. Oppbevares ved 4 °C og brukes innen en måned etter tilberedning.
2. Forbelegg av magnetiske perler mot rotter13
- Lag 50 ml perlevaskebuffer: Fosfatbufret oppløsning (PBS) tilsatt 0,1 % (w/v) bovint serumalbumin (BSA). Sterilt filter med 22 μM filter og oppbevares ved 4 °C og brukes innen en måned etter tilberedning.
- Virvel de magnetiske kulene i noen sekunder for å resuspendere perlene og pipetten 50 μL av perlene (2 x 107 perler) i to 1,5 ml mikrosentrifugerør, ett for CD-31 og ett for CD-102 (se materialfortegnelse). Tilsett 1 ml perlevaskbuffer og bland godt.
MERK: Alle de nevnte volumene ble brukt til å isolere endotelceller fra 3-4 neonatale musevalper (5-7 dager gamle). CD-31 og CD-102 er endotelcelleoverflatemarkørene som brukes til magnetisk immunperlevalg. - Plasser rørene på en magnetisk separator og fjern supernatanten med en Pasteur-pipet i glass. Gjenta vasken 3 ganger med 1 ml perlevaskebuffer hver gang.
- Heng opp perlene i originalt dråpevolum, 50 μL, med perlevaskebuffer. Deretter tilsettes 5 μL (2,5 μg) antistoff (CD-31/CD-102) til hver 50 μL perler.
- Inkuber dråpesuspensjonen ved forsiktig rotasjon på en ende-over-ende-rotator over natten ved 4 °C eller i 3 timer ved romtemperatur. Gjenta vasken 4 ganger.
- Resuspender immunkulene i originalvolumet, 50 μL, med perlevaskebuffer og oppbevar ved 4 °C og bruk innen 1-2 uker.
3. Isolering og plating av lungecellene
- Forbered type 1 kollagenaseoppløsning på isolasjonsdagen: Tilsett 25 mg type 1 kollagenase til 25 ml HBSS (se materialfortegnelse). Inkuber ved 37 °C i 1 time med forsiktig rotasjon og sterilt filter med 22 μM filter. Oppbevares varmt ved 37 °C.
- Injiser 5-7 dager gamle musevalper intramuskulært med heparin (25 μL / mus, 1000 U / ml) 10 minutter før eutanasi for å minimere endotelcelleaktivering og koagulasjonsdannelse14,15.
- Avlive musevalpen med halshugging ved hjelp av skarp saks i samsvar med AVMA-retningslinjene for eutanasi fra 2020. Fest deretter musen til et disseksjonsbrett med ventral side opp.
- Spray med 70% etanol, og utsett deretter thoraxhulen ved først å kutte membranen og deretter kutte overlegen oppover langs hele brystets sidevegger. Reflekterer brystkassen tilbake da eksponerer hjertet og lungene.
MERK: Bruk mindre tang og saks for dette trinnet gitt den lille størrelsen på nyfødte mus, og sørg for ikke å stikke hull i hjertet eller lungene, da dette vil føre til utilstrekkelig blodfjerning fra lungene. - Fest en 25 G kanyle til en 10 ml sprøyte, og injiser 5 ml kald DMEM inn i hjertets høyre ventrikkel for å fjerne blod fra lungene. Lungene blir hvite.
- Fjern lungene fra brysthulen, en lobe om gangen, ved å kutte lobene distalt for de tilsvarende bronkiene.
- Samle alle lungelappene i et 50 ml konisk rør forhåndsfylt med 20 ml iskaldt basalmedium (fra trinn 1.1).
- Gjenta trinn 3,2-3,7 med de andre musevalpene, og samle alle lungelappene i det samme 50 ml koniske røret.
- Rør forsiktig røret for hånd i 10-15 s for å vaske eventuelle overskytende røde blodlegemer som er visuelt verdsatt på overflaten av lungene.
MERK: Det er ikke nødvendig å fjerne alt blod fra innsiden eller rundt lungene; Dette forbedrer imidlertid renheten. All videre vevshåndtering må gjøres i en steril hette. - Bruk en cellesil for å fjerne lungene fra mediet, og overfør vevet til en steril, engangs 100 mm diameter vevskulturskål og hakk med sterilisert saks.
- Overfør hakket vev til 50 ml konisk rør med 25 ml forvarmet kollagenaseoppløsning (trinn 3.1). Beveg forsiktig på en roterende mikser i 45 minutter ved 37 °C.
MERK: Overfordøyelse i selv 60 minutter kan føre til lavere utbytter. - Fest en 20 ml sprøyte til en 15 G butt kanyle (se materialfortegnelsen) og triturer suspensjonen 10-15 ganger for å bryte opp vevet til en cellulær suspensjon. Vær kraftig, men unngå overskumming.
MERK: Det vil ikke lenger være synlige deler av lungen, og i stedet vil suspensjonen være uklar når dette trinnet er fullført. - Filtrer suspensjonen gjennom en 70 μm cellesil til et nytt 50 ml konisk rør. Skyll videre det koniske røret som brukes til fordøyelsen og cellesilen med ytterligere 15 ml basalmedium.
- Sentrifuger cellesuspensjonen ved 400 x g i 8 minutter ved 4 °C.
- Fjern supernatanten med en glasspasteurpipett og resuspender pelleten i 2 ml komplett medium. Overfør til en T-75-kolbe og tilsett 8 ml komplett mellomkultur ved 37 °C i en fuktet 5 % CO2 -inkubator.
- Neste dag, vask flasker to ganger med 10 ml Hank's Balanced Salt Solution uten kalsium og magnesium (HBSS / CMF) (se materialfortegnelse) og tilsett 10 ml komplett medium.
MERK: Etter 2-3 dager vil kulturen være 90-95% konfluent og klar for primær immunperleisolasjon.
4. Primær immunperleisolering og dyrking av endotelceller
- Vask adherente endotelceller to ganger med 10 ml hbss/cmf. Tilsett 2 ml trypsinfri celledetachmentløsning (se materialfortegnelse) og inkuber ved 37 °C i ~5 minutter. Forsikre deg om at alle cellene er løftet fra kolben.
MERK: En trypsinfri løsrivelsesløsning må brukes i stedet for trypsin, da trypsin kan forstyrre celleoverflatens adhesjonsmarkør CD-31. - Tilsett 8 ml basalmedium for å nøytralisere celleløsningen og overføre innholdet til et 15 ml konisk rør. Spinn ned ved 400 x g i 4 minutter ved romtemperatur.
- Fjern supernatanten med en Pasteur-pipett av glass og resuspender cellene i 2 ml basalmedium. Overfør cellesuspensjonen på 2 ml til et 5 ml polystyrenrør med rund bunn (se materialfortegnelsen).
- Vortex anti-CD-31 belagte perler i noen sekunder for å resuspendere perlene og tilsett 30 μL perler for hver 2 ml cellesuspensjon. Fest lokket.
- Inkuber røret i 10 minutter ved romtemperatur på en ende-over-ende rotator. Legg deretter rørene på en magnetisk separator og la stå i 2 minutter.
- Bruk forsiktig en Pasteur-pipette i glass til å aspirere supernatanten. Fjern røret fra magneten, resuspender perlecellepelleten ved å tilsette 3 ml basalmedium til røret, og pipett opp og ned flere ganger.
- Sett røret på magnetseparatoren på magnetseparatoren i 2 minutter, og aspirer deretter supernatanten forsiktig med en Pasteur-pipette i glass.
- Gjenta vask (trinn 4.6-4.7) minst 4 ganger til supernatanten er klar.
- Etter den siste vasken, resuspender perlecellepelleten i 3 ml komplett vekstmedium og overfør den til en T-75-kolbe. Tilsett 7 ml av det komplette vekstmediet, og inkuber ved 37 °C i en fuktet 5 % CO2 -inkubator.
- Neste dag vaske celler med HBSS / CMF, deretter legge til 10 ml av frisk komplett medium. Bytt ut media med 10 ml ferskt komplett medium hver 2-3 dag til 90-95% sammenflytende.
MERK: Når cellene er ~ 90-95% konfluerende, som tar ~ 3-4 dager, er kulturen klar for sekundær immunobead isolasjon.
5. Sekundær immunperleisolering og dyrking av endotelceller
- Vask adherente endotelceller to ganger med 10 ml HBSS / CMF. Tilsett 2 ml trypsinfri celledetachmentløsning og inkuber ved 37 °C i ~5 minutter. Forsikre deg om at alle cellene er løftet fra kolben.
- Tilsett 8 ml basalmedium for å nøytralisere celleavløsningsløsning og overfør til et 15 ml konisk rør. Spinn ned ved 400 x g i 4 minutter ved romtemperatur.
- Fjern supernatanten med en Pasteur-pipett av glass og resuspender cellene i 2 ml basalmedium. Overfør cellesuspensjonen på 2 ml til et 5 ml polystyrenrør med rund bunn.
- Vortex anti-CD-102 belagte perler i noen sekunder for å resuspendere perlene og tilsett 30 μL perler for hver 2 ml cellesuspensjon. Fest lokket.
- Inkuber røret i 10 minutter ved romtemperatur på en ende-over-ende rotator. Plasser rørene på en magnetisk separator og la stå i 2 minutter. Aspirer deretter supernatanten forsiktig med en Pasteur-pipette i glass.
- Fjern røret fra magneten, resuspender perlecellepelleten ved å tilsette 3 ml basalmedium til røret, og pipett opp og ned flere ganger.
- Sett røret på magnetseparatoren på magnetseparatoren i 2 minutter før du forsiktig aspirerer supernatanten med en Pasteur-pipette i glass.
- Gjenta vask (trinn 5.6-5.7) 4 ganger eller mer til supernatanten er klar.
- Etter den siste vasken, resuspender perlecellepelleten i 3 ml komplett vekstmedium og overfør den til en T-75-kolbe. Tilsett 7 ml komplett vekstmedium, og inkuber ved 37 °C i en fuktet 5 % CO2 -inkubator.
- Neste dag vaske celler med HBSS / CMF, deretter legge til 10 ml av frisk komplett medium. Bytt ut media med 10 ml ferskt komplett medium hver 2-3 dag til 90-95% sammenflytende. Når endotelcellene er helt sammenflytende, er de klare for eksperimentering. Cellene bør ikke brukes utover passasje seks da senescens kan forekomme, og andre celletyper kan ta over.
6. Bekreftelse av endotelcelleoverflatemarkørene ved flowcytometri
- Etter bruk av trypsinfri celledetachmentløsning for å løsne cellene, resuspenderes cellepellet til 1 x 10 5 celler / ml og aliquot 100 μL av cellesuspensjonen i tre1,5 ml mikrosentrifugerør, merket 1, 2 og 3.
- Vask celler med 1 ml 1x PBS. Sentrifuge ved 500 x g i 2 minutter ved 4 °C. Fjern vaskebufferen og gjenta to ganger.
- Resuspender cellepelleten i 100 μL 1x PBS. Til rør 1, legg til 1 μL av konjugert anti-mus CD-31 (PECAM-1) antistoff (ex: phycoerythrin (PE) anti-mus CD-31 antistoff) og 1 mikrol av konjugert anti-mus CD-102 (ICAM-2) (ex: fluorescein isotiocyanat (FITC) anti-mus CD102 antistoff) (se tabell over materialer). Til rør 2, legg til passende isotypekontroller. Rør nr. 3 vil forbli ufarget.
- Inkuber rørene på is og i mørket i 30-45 min.
- Tilsett 1 ml PBS i hvert rør, virvel forsiktig og sentrifuge ved 500 x g i 2 minutter ved 4 °C. Fjern vask og gjenta tre ganger. Oppløs den endelige pelleten i 500 mikrol PBS.
- Hold rørene dekket med aluminiumsfolie ved 4 °C inntil analyse. Analysen må fullføres innen 3-4 timer.
- Innhent strømningsdata ved hjelp av et cytometer. Bruk en ufarget prøve som en negativ kontroll for å stille laserspenningen riktig i henhold til celleautofluorescens. Gate total cellepopulasjon med et fremoverspredt plott og sidespredningsplott.
MERK: Etter ekskludering av dubletter defineres CD31+ CD102+ dobbeltpositive celler som endotelceller.
Representative Results
Denne enkle protokollen gjør det mulig å isolere, dyrke og karakterisere mikrovaskulære endotelceller fra mus over 7-10 dager (figur 1). Kort fortalt blir lungene skåret ut og enzymatisk fordøyd før plating. Umiddelbart etter plating vil endotelceller og andre celler flyte i cellekulturmedier. Neste dag vil endotelceller og forurensende celler festes til platen, og en kraftig vasketeknikk er nødvendig for å fjerne rusk og de flytende cellene. Når cellene når sammenløp, utføres det første immunperlevalget. De CD-31-positive cellene begynner deretter å vokse i en brosteinsformasjon (figur 2). Celler som ikke har brosteinsmorfologi eller gjengroing er forurensninger og ikke endotelceller13,14,15,16.
Et annet immunperlevalg utføres deretter ved bruk av anti-CD-102-belagte perler for å øke renheten til endotelceller, lik andre protokoller13,16. Celler som har vokst til samløp etter andre immunperlevalg, kan deretter brukes til eksperimentering. Fluorescensaktivert cellesortering (FACS) brukes for å bekrefte at cellepopulasjonen er CD-31- og CD-102-positiv (figur 3).
Disse endotelcellene kan deretter brukes til mange applikasjoner, for eksempel å studere endoteliale inflammatoriske veier og endotelbarrierefunksjon. For eksempel ble det observert at behandling med murine cytomix (IFNg, TNFa og IL1b, hver ved 10 ng/ml) induserte IL-6-produksjon av endotelceller (figur 4A). Deretter ble Electric Cell-substrate Impedance Sensing (ECIS)18 brukt til å måle transendotelial motstand (TER) mot strømmen av elektrisk strøm over murine lungeendotelcellemonolag. Det ble observert at cellene behandlet med cytomix førte til en reduksjon i TER (figur 4B), noe som er forenlig med økt endotelpermeabilitet. Disse eksemplene illustrerer hvordan endotelceller fremstilt ved hjelp av denne protokollen kan studere ulike endotelprosesser. Dette gjør at etterforskere lettere kan studere gener av interesse for endotelceller, gitt det stadig økende antallet tilgjengelige knockout og transgene mus.
Figur 1 Skjematisk for isolering av murine lungeendotelceller. Lunger fra 5-7 dager gamle nyfødte valper høstes og hakkes. Hakket vev ble enzymatisk fordøyd med kollagenase I. Cellulær suspensjon er belagt og dyrket i 2-3 dager. Cellene gjennomgår deretter primær immunbeadisolering med CD-31-belagte perler og dyrkes i ytterligere 3-4 dager. Andre immunperleisolering med CD-102-belagte perler før dyrking ytterligere 2-3 dager. Cellene er nå klare for funksjonell eksperimentering. Bildet ble opprettet av et nettbasert illustrasjonsverktøy, Biorender. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2 Morfologi av murine lungeendotelceller. Kultiverte murine lungeendotelceller viser en brosteinsmorfologi. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3 Analyse av endotelceller ved flowcytometri. (A) Alle hendelser visualiseres på et punktplott av Forward Scatter (FSC) og Side Scatter (SSC). (B) Spredningsplottbekreftelse av at murine lungeendotelceller er positive for både endotelspesifikke celleoverflateantigener CD-31 og CD-102. (C) Histogram av isotypeprøven og prøven farget med CD-31/CD-102-spesifikt antistoff. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4 Cytomix induserer murine lungeendotelcelle IL-6 produksjon og endotelcellepermeabilitet. Murine lunge mikrovaskulære endotelceller fra C57BL/6 mus ble behandlet med cytomix (IFNg, TNFa og IL1b, hver på 10 ng / ml). (A) IL-6-nivåene ble deretter kvantifisert i kultursupernatanter ved 15 timer (**p<0,01, n = 4 brønner/tilstand). (B) Registrering av elektrisk celle-substratimpedans ble brukt til å måle transendotelmotstanden (TER) gjentatte ganger over 15 timer. Data ble normalisert til resistens umiddelbart før tilsetning av cytomix som angitt og ble analysert ved toveis variansanalyse (ANOVA) etterfulgt av Tukey post-test19 (**p<0.01, n = 4 brønner/tilstand). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Discussion
Denne enkle protokollen egner seg til endotelceller med høy renhet fra murine lunger. Selv om den totale tiden fra start til slutt er 7-10 dager, er hands-on tiden rundt 3-4 timer. Sammenlignet med andre metoder13,14,15,16, er den nåværende protokollen strømlinjeformet, og holder viktige trinn uten å gå på kompromiss med utbytte og renhet.
Det er verdt å merke seg noen kritiske aspekter ved denne protokollen. For det første er det viktig å bruke nyfødte valper i stedet for voksne mus. Vår erfaring er at endotelceller fra voksne mus ikke formerer seg like lett som celler fra nyfødte unger, og de blir lett overkjørt av celler med spindellignende morfologi forenlig med fibroblaster eller mesenkymale stamceller15,16. En mulig forklaring på forskjellen er at lungeutviklingen er i alveolarstadiet hos nyfødtmus, karakterisert ved raskere spredning av endotelceller20. Det kan også være en viss grad av senescens med aldring21. Enzymatisk fordøyelsestid må også være presis, da underfordøyelse kan føre til en enkeltcellesuspensjon med lavt utbytte. I motsetning til dette kan over fordøyelsen føre til en betydelig mengde celledød. Vi har bestemt at den optimale tiden for kollagenase fordøyelse er bestemt til å være 45 minutter. Dette følges deretter av mekanisk dissosiasjon med en stump kanyle. Instilling av intratrakeal kollagenase under enzymatisk fordøyelse er også rapportert14,15; Dette kan imidlertid være tidkrevende og fører til ufullstendig fordøyelse under det nåværende arbeidet. Til slutt går noen protokoller direkte til immunperleisolering umiddelbart etter enzymatisk fordøyelse13,16. Vi har funnet ut at dyrking av cellene fra den dissosierte lungen i mediet for en dag eller to før immunperlevalget foretas, øker utbyttet av levedyktige og svært rene endotelceller betydelig. Dette kan være relatert til hastigheten på å få isolerte celler inn i vevskulturmediet, noe som fører til mindre celledød i de tidlige stadiene etter fjerning fra musene, høyere innledende såingstetthet og tid for endotelcellene å feste seg og proliferere før den første immunperleisolasjonen.
Begrensninger i fremstilling og analyse av musendotelceller er som følger. Hver mus gir bare et begrenset antall celler som må brukes i løpet av noen få passasjer. Dette problemet kan løses ved å samle lungefordøyelse fra flere mus. Dessverre lykkes vi ikke i våre anstrengelser for å kryobevare og tine cellene for fremtidig bruk. Til tross for disse begrensningene har musendotelceller noen fordeler. De kan være nyttige, spesielt i situasjoner der humane endotelceller enten ikke kan brukes (f.eks. genknockout), når komplementære studier kreves for å bekrefte resultater med humane celler, eller når heterogeniteten av responser fra endotelceller fra forskjellige humane donorer gjør reproduserbarhet mellom eksperimenter problematisk6. Den homogene endotelcellepopulasjonen fra genetisk identiske mus muliggjør reproduserbarhet mellom eksperimenter og studiet av spesifikke gener og veier under stabile bakgrunnsforhold.
Musendotelceller kan brukes til flere applikasjoner for å gi innsikt i endotelaktivering og dysfunksjon i forskjellige sykdomsprosesser. For eksempel spiller endotelceller en integrert rolle i sepsis, og bidrar til både gunstige og patologiske responser gjennom deres roller i å aktivere lokalisert og systemisk betennelse, fremme leukocytttrafikk og aktivering i vev, regulere koagulasjon og modulere endotelpermeabilitet 2,22,23. Denne enkle protokollen gir levedyktige, funksjonelle endotelceller som kan brukes i analyser for hver av disse endotelprosessene.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av NIH T32GM008440 (JH/EW) og NIH R01AI058106 (JH). Vi anerkjenner UCSF Parnassus Flow Cytometry Core (RRID:SCR_018206) delvis støttet av Grant NIH P30 DK063720 og av NIH S10 Instrumentation Grant S10 1S10OD021822-01.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 mL conicals | Corning Life Sciences | 430829 | |
| Accutase Cell Detachment Solution | Innovative Cell Technologies, Inc | AT-104 | |
| BD PrecisionGlide Needle 25 G x 5/8" | Becton Disckinson | 305122 | |
| BioRender.com | BioRender | ||
| Blunt Cannula 15 G x 1-1/2" | Covidien | 8881202314 | |
| CD-102 Rat anti-mouse (3C4 (MIC2/4)) | BD Biosciences | 553326 | |
| CD-31 Rat anti-mouse (MEC 13.3) | BD Biosciences | 557355 | |
| Collagenase, Type 1 | Worthington Biochemical Corp | LS004194 | |
| DMEM, high glucose | Gibco | 11965092 | |
| Dynabeads Sheep Anti-Rat IgG | Invitrogen | 11035 | |
| Endothelial Cell Growth Supplment | EMD Millipore Corp | 02-102 | |
| Falcon cell strainers (70 µm) | Corning Life Sciences | 352350 | |
| Fetal Bovine Serum, heat inactivated | Gibco | 10082-147 | |
| Fine Scissors | Fine Science Tools | 14060-09 | |
| Fine Scissors | Fine Science Tools | 14060-10 | |
| Fisherbrand Disposable Borosilicate Glass Pasteur Pipets | Fisher Scientific | 13-678-20B | |
| FITC Rat Anti-mouse CD102 (3C4) | BD Biosciences | 557444 | |
| FITC Rat IgG2a, κ Isotype Control (R35-95) | BD Biosciences | 553929 | |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11050-10 | |
| HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red | Gibco | 14175095 | |
| Heparin Sodium Injections (1,000 Units/mL) | Medline | 0409-2720-02 | |
| Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma | H3393 | |
| HEPES (1 M) | Gibco | 15630106 | |
| Nonessential amino acids (100x) | Gibco | 11140050 | |
| PE Rat Anti-mouse CD31 (MEC 13.3) | BD Biosciences | 553373 | |
| PE Rat IgG2a, κ Isotype Control R35-95) | BD Biosciences | 553930 | |
| Penicillin Streptomycin (10,000 U/mL, 10,000 µg/mL) | Gibco | 15140122 | |
| Recombinant Murine IFN-γ | Peprotech | 315-05 | |
| Recombinant Murine IL-1β | Peprotech | 211-11B | |
| Recombinant Murine TNF-α | Peprotech | 315-01A | |
| Round bottom polystyrene test tubes | Corning Life Sciences | 352058 | |
| Semken Forceps | Fine Science Tools | 11008-13 | |
| Sodium pyruvate (100 mM) | Gibco | 11360070 | |
| Stericup Quick Release-GP Sterile Vacuum Filtration System, 250 mL | Millipore | S2GPU02RE | |
| Steriflip-GP Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit | Milipore | SCGP00525 | |
| Sterile syringe (10 mL) | Fisher Scientific | 14-955-459 | |
| Sterile syringe (20 mL) | Fisher Scientific | 14-955-460 | |
| T-75 cell culture flask with vent cap, CellBIND treated | Corning Life Sciences | 3290 |
References
- Maniatis, N. A., Orfanos, S. E. The endothelium in acute lung injury/acute respiratory distress syndrome. Current Opinion Critical Care. 14 (1), 22-30 (2008).
- Khakpour, S., Wilhelmsen, K., Hellman, J. Vascular endothelial cell Toll-like receptor pathways in sepsis. Innate Immunity. 21 (8), 827-846 (2015).
- Tuttolomondo, A., Daidone, M., Pinto, A. Endothelial dysfunction and inflammation in ischemic stroke pathogenesis. Current Pharmaceutical Design. 26 (34), 4209-4219 (2020).
- Roberts, A. C., Porter, K. E. Cellular and molecular mechanisms of endothelial dysfunction in diabetes. Diabetes and Vascular Disease Research. 10 (6), 472-482 (2013).
- Widmer, R. J., Lerman, A. Endothelial dysfunction and cardiovascular disease. Global Cardiology Science and Practice. 2014 (3), 291-308 (2014).
- Joffre, J., et al. Catecholaminergic vasopressors reduce toll-like receptor agonist-induced microvascular endothelial cell permeability but not cytokine production. Critical Care Medicine. 49 (3), 315-326 (2021).
- Yan, J., Nunn, A. D., Thomas, R. Selective induction of cell adhesion molecules by proinflammatory mediators in human cardiac microvascular endothelial cells in culture. International Journal of Clinical and Experimental Medicine. 3 (4), 315-331 (2010).
- Bouïs, D., Hospers, G. A., Meijer, C., Molema, G., Mulder, N. H. Endothelium in vitro: A review of human vascular endothelial cell lines for blood vessel-related research. Angiogenesis. 4 (2), 91-102 (2001).
- Nolte, A., et al. Optimized basic conditions are essential for successful siRNA transfection into primary endothelial cells. Oligonucleotides. 19 (2), 141-150 (2009).
- Auguste, D. T., et al. Triggered release of siRNA from poly(ethylene glycol)-protected, pH-dependent liposomes. Journal of Controlled Release. 130 (3), 266-274 (2008).
- Gumkowski, F., Kaminska, G., Kaminski, M., Morrissey, L. W., Auerbach, R. Heterogeneity of mouse vascular endothelium. In vitro studies of lymphatic, large blood vessel and microvascular endothelial cells. Blood Vessels. 24 (1-2), 11-23 (1987).
- Alphonse, R. S., et al. The isolation and culture of endothelial colony-forming cells from human and rat lungs. Nature Protocols. 10 (11), 1697-1708 (2015).
- Lim, Y. -C., Luscinskas, F. W. Isolation and culture of murine heart and lung endothelial cells for in vitro model systems. Methods in Molecular Biology. 341, 141-154 (2006).
- Cao, G., Abraham, V., DeLisser, H. M. Isolation of endothelial cells from mouse lung. Current Protocols in Toxicoly. 61, 1-9 (2014).
- Fehrenbach, M. L., Cao, G., Williams, J. T., Finklestein, J. M., Delisser, H. M. Isolation of murine lung endothelial cells. American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 296 (6), 1096-1103 (2009).
- Wang, J., Niu, N., Xu, S., Jin, Z. G. A simple protocol for isolating mouse lung endothelial cells. Scientific Reports. 9 (1), 1458 (2019).
- Sutermaster, B. A., Darling, E. M. Considerations for high-yield, high-throughput cell enrichment: fluorescence versus magnetic sorting. Scientific Reports. 9 (1), 227 (2019).
- Szulcek, R., Bogaard, H. J., van Nieuw Amerongen, G. P. Electric cell-substrate impedance sensing for the quantification of endothelial proliferation, barrier function, and motility. Journal of Visualized Experiments. (85), e51300 (2014).
- Wong, E., et al. ERK1/2 has divergent roles in lps-induced microvascular endothelial cell cytokine production and permeability. Shock. 55 (3), 349-356 (2020).
- Domm, W., Misra, R. S., O'Reilly, M. A. Affect of early life oxygen exposure on proper lung development and response to respiratory viral infections. Frontiers in Medicine (Lausanne). 2, 55 (2015).
- Jia, G., Aroor, A. R., Jia, C., Sowers, J. R. Endothelial cell senescence in aging-related vascular dysfunction. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Basis of Disease. 1865 (7), 1802-1809 (2019).
- Joffre, J., Hellman, J., Ince, C., Ait-Oufella, H.
- Aird, W. C. The role of the endothelium in severe sepsis and multiple organ dysfunction syndrome. Blood. 101 (10), 3765-3777 (2003).
