Summary
Den nåværende protokollen beskriver en unik, klinisk relevant modell av perifer arteriell sykdom som kombinerer lårarterie og veneelektrokoagulasjon med administrering av en nitrogenoksidsyntasehemmer for å indusere hindlimb gangren hos FVB-mus. Intracardiac DiI perfusjon brukes deretter til høyoppløselig, tredimensjonal bildebehandling av fotputens vaskulatur.
Abstract
Perifer arteriell sykdom (PAD) er en betydelig årsak til sykelighet som følge av kronisk eksponering for aterosklerotiske risikofaktorer. Pasienter som lider av sin mest alvorlige form, kronisk lem-truende iskemi (CLTI), står overfor betydelige svekkelser i dagliglivet, inkludert kronisk smerte, begrenset gangavstand uten smerte og ikke-helbredende sår. Prekliniske modeller er utviklet i ulike dyr for å studere PAD, men musens bakbens iskemi er fortsatt den mest brukte. Det kan være betydelig variasjon som svar på iskemisk fornærmelse i disse modellene, avhengig av musestammen som brukes og nettstedet, antallet og midler til arteriell forstyrrelse. Denne protokollen beskriver en unik metode som kombinerer lårarterie og veneelektrokoagulasjon med administrering av en nitrogenoksidsyntase (NOS)-hemmer for pålitelig indusering av gangren i fotpute i Friend Virus B (FVB) mus som ligner vevstapet av CLTI. Mens tradisjonelle metoder for å vurdere reperfusjon som laser Doppler perfusjonsavbildning (LDPI) fortsatt anbefales, intrakariac perfusjon av lipofilt fargestoff 1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI) brukes til å merke vaskulaturen. Etterfølgende helmontert konfokal laserskanning mikroskopi gir mulighet for høyoppløselig, tredimensjonal (3D) rekonstruksjon av fotpute vaskulære nettverk som utfyller tradisjonelle måter å vurdere reperfusjon i bakbenet iskemi modeller.
Introduction
Perifer arteriell sykdom (PAD), preget av redusert blodstrøm til ekstremiteter på grunn av aterosklerose, påvirker 6,5 millioner mennesker i USA og 200 millioner mennesker over hele verden1. Pasienter med PAD opplever redusert lemfunksjon og livskvalitet, og de med CLTI, den mest alvorlige formen for PAD, har økt risiko for amputasjon og død med en 5-års dødelighet nær 50%2. I klinisk praksis anses pasienter med ankel-brachial indekser (ABI) <0,9 å ha PAD, og de med ABI <0,4 forbundet med enten hvilesmerter eller vevstap som å ha CLTI3. Symptomene varierer mellom pasienter med lignende ABIer avhengig av daglig aktivitet, muskeltoleranse for iskemi, anatomiske variasjoner og forskjeller i sikkerhetsutvikling4. Siffer og lem koldbrann er den mest alvorlige manifestasjonen av alle vaskulære okklusive sykdommer som resulterer i CLTI. Det er en form for tørr nekrose som mumifiserer bløtvevet. I tillegg til aterosklerotisk PAD, kan det også observeres hos pasienter med diabetes, vaskulitter som Buergers sykdom og Raynauds fenomen, eller kalsipylakse i innstillingen av end-stage nyresykdom5,6.
Flere prekliniske modeller er utviklet for å studere patogenesen av PAD / CLTI og teste effekten av potensielle behandlinger, hvorav den vanligste forblir mus hindlimb iskemi. Induserende hindlimb iskemi hos mus oppnås vanligvis ved hindring av blodstrøm fra iliac eller lårarterier, enten ved suturligasjon, elektrokoagulasjon eller andre midler for å begrense ønsket fartøy7. Disse teknikkene reduserer perfusjonen drastisk til bakbenet og stimulerer neovascularization i lår- og kalvemuskulaturen. Imidlertid er det essensielle murine belastningsavhengige forskjeller i følsomhet for iskemisk fornærmelse delvis på grunn av anatomiske forskjeller i sikkerhetsfordeling8,9. For eksempel er C57BL / 6 mus relativt motstandsdyktige mot bakbens iskemi, som demonstrerer redusert lemfunksjon, men generelt ingen tegn på koldbrann i fotputen. På den annen side har BALB / c mus en iboende dårlig kapasitet til å komme seg fra iskemi og utvikler vanligvis automatisk amputasjon av foten eller underbenet etter lårarterie ligation alene. Denne alvorlige responsen på iskemi begrenser det terapeutiske vinduet og kan utelukke langsgående vurdering av lemreperfusjon og funksjon. Interessant nok har genetiske forskjeller i et enkelt kvantitativt trekklocus plassert på murinkromosom 7 blitt involvert i disse differensialskepsibilitetene til C57BL / 6 og BALB / c mus til vevnekrose og lemreperfusjon10.
Sammenlignet med C57BL/6- og BALB/c-stammer, viser FVB-mus en mellomliggende, men inkonsekvent respons på femoral arterieligasjon alene. Noen dyr utvikler footpad gangrene i form av svarte iskemiske negler eller mumifiserte sifre, men andre uten noen overt tegn på iskemi11. Samtidig administrering av Nω-Nitro-L-arginin metylsterhydroklorid (L-NAME), en nitrogenoksidsyntase (NOS) inhibitor12, forhindrer kompenserende vasodilaterende mekanismer og øker ytterligere oksidativt stress i bakbensvev. I kombinasjon med femoral arterie ligation eller koagulasjon, produserer denne tilnærmingen konsekvent fotputevevstap hos FVB-mus som ligner de atrofiske endringene i CLTI, men utvikler seg sjelden til lem auto-amputasjon11. Oksidativt stress er et av kjennetegnene til PAD/CLTI og forplantes ved endotel dysfunksjon og redusert biotilgjengelighet av nitrogenoksid (NO)13,14. NO er et pluripotent molekyl som vanligvis utøver gunstige effekter på arteriell og kapillær blodstrøm, blodplateadhesjon og aggregering, og leukocyttrekruttering og aktivering13. Reduserte nivåer av NOS har også vist seg å aktivere angiotensin-konverterende enzymet, som induserer oksidativt stress og akselererer utviklingen av aterosklerose15.
Når en modell av hindlimb iskemi er etablert, overvåke etterfølgende lem reperfusjon og den terapeutiske effekten av eventuelle behandlinger er også nødvendig. I den foreslåtte murine gangrene-modellen kan graden av vevstap først kvantifiseres ved hjelp av Faber-poengsummen for å vurdere fotens brutto utseende (0: normal, 1-5: tap av negler der score representerer antall negler som er berørt, 6-10: atrofi av sifre der score representerer antall sifre berørt, 11-12: delvis og fullstendig fotatrofi, henholdsvis)9. Kvantitative målinger av hindlimb perfusjon gjøres da vanligvis ved hjelp av LDPI, som er avhengig av Doppler interaksjoner mellom laserlys og røde blodlegemer for å indikere perfusjon på pikselnivå i en interesseregion (ROI)16. Selv om denne teknikken er kvantitativ, ikke-invasiv og ideell for gjentatte målinger, gir den ikke granulær anatomiske detaljer av bakbenet vaskulatur16. Andre avbildningsmodaliteter, som mikro-beregnet tomografi (mikro-CT), magnetisk resonansangiografi (MRA) og røntgenmikroangiografi, viser seg enten kostbart, krever sofistikert instrumentering eller på annen måte teknisk utfordrende16. I 2008 beskrev Li et al. en teknikk for merking av blodkar i netthinnen med lipofil karbocyaninfarge DiI17. DiI inkorporerer i endotelceller og, ved direkte diffusjon, flekker vaskulære membranstrukturer som angiogene spirer og pseudopodale prosesser17,18. På grunn av sin direkte levering til endotelceller og fargestoffets svært fluorescerende natur, gir denne prosedyren intens og langvarig merking av blodkar. I 2012 tilpasset Boden et al. teknikken for DiI-perfusjon til murin hindlimb iskemimodellen via helmontert avbildning av høstede lår adductor muskler etter lårarterie ligation19.
Den nåværende metoden gir en relativt billig og teknisk mulig måte å vurdere neovascularization som svar på hindlimb iskemi og gen- eller cellebaserte terapeutiske midler. I en ytterligere tilpasning beskriver denne protokollen anvendelsen av DiI-perfusjon for å avbilde fotputevaskulaturen i høy oppløsning og 3D i en murinmodell av bakbenet koldbrann.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøk beskrevet i protokollen ble godkjent av University of Miami Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). FVB-mus, både menn og kvinner i alderen 8-12 uker, ble brukt til studien.
1. Utarbeidelse av L-NAME-løsning
- Under sterile forhold i en laminær strømningshette, lag en L-NAME lagerløsning ved å oppløse 1 g L-NAME pulver (se Materialbord) med 20 ml sterilt vann for å lage en oppløsning på 50 mg/ml. Oppbevar lagerløsningen i 300-500 μL aliquots ved -20 °C i opptil 3 måneder.
- For å lage en fungerende L-NAME-løsning, tine en aliquot av L-NAME lagerløsning og fortynn med PBS (1:4) under sterile forhold for å oppnå en endelig konsentrasjon på 10 mg / ml.
- For å forberede PBS (pH 7,4), oppløs 8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g Na2HPO4 og 0,23 g NaH2PO4 i 800 ml destillert vann. Juster pH til 7,4 med HCl. Tilsett vann til et totalt volum på 1000 ml og filtrer gjennom et 0,22 μm flaske toppfilter.
MERK: Intraperitoneal (IP) injeksjon av 4 μL/g L-NAME arbeidsløsning tilsvarer ønsket 40 mg/kg dose L-NAME. L-NAME arbeidsløsning bør holdes på is under bruk, og nye fortynninger bør gjøres daglig ved hjelp av nyoppussede aliquots av lagerløsning.
2. Kjemisk og kirurgisk induksjon av hindlimb koldbrann
- Få FVB-mus i alderen 8-12 uker, enten fra en oppdretter eller oppdrettet in-facility (se Tabell over materialer). 2 timer før operasjonen, administrer en 40 mg/kg IP-dose L-NAME.
- Bedøv mus med IP-injeksjon på 100 mg/kg ketamin og 10 mg/kg xylazin (se Materialtabell) fortynnet i PBS. Bekreft tilstrekkelig sedasjon ved fravær av tå-klype refleks og fortsett å overvåke luftveiene under prosedyren.
- Fjern hår fra bilaterale bakben og lyske ved hjelp av saks og/eller en depilatorisk krem. Plasser dyret under et kirurgisk mikroskop supine; og teip ekstremitetene på plass. Steriliser det kirurgiske feltet ved å omkrets påføre povidon-jodoppløsningen på operasjonsstedet.
- Under 10-20x forstørrelse, bruk saks eller en skalpell for å lage et 1 cm snitt langs lyskekroppen bare dårligere enn inngangsbåndet. Bruk fine tang og en steril bomullsspissapplikator for å direkte dissekere den inguinale fettputen lateralt fra inguinal ligamentet og eksponere den underliggende lårhylsen slik at lårarterien, venen og nerven er tydelig identifisert (figur 1).
- Bruk fine tang, pierce lårhylsen. Pensle forsiktig lårnerven bort fra lårarterien. Identifiser starten på den laterale circumflex grenen av lårarterien (LCFA) dypt til lårnerven (figur 1).
- Fortsett med elektrokoagulasjon av lårarterien og vene bare proksimal til LCFA ved å aktivere cautery enheten (se Tabell over materialer) og forsiktig kontakte karene med en side-til-side bevegelse, sikre at lårnerven er godt isolert og forblir beskyttet mot termisk skade. Del det koagulerte karsegmentet med saks.
- Fortsett med eksponeringen av den distale lårarterien og venen ved å mobilisere den inguinale fettputen medialt. Identifiser den overfladiske epigastriske arterien og saphenopoplitealkrysset mer distalt.
- Pierce lårhylsen mellom disse to stedene og forsiktig disseker lårnerven bort fra lårkarene. Fortsett med koagulasjon og transeksjon av lårarterien og venen som beskrevet i trinn 2.4.1.
- Skyll det kirurgiske feltet ved hjelp av en sprøyte fylt med steril PBS. Oppnå hemostase ved å påføre forsiktig trykk med en bomullsspissapplikator i 3-5 min til alle blødningsområder.
- Fortsett med lukkingen av snittet ved hjelp av absorberbar 5-0 sutur på en enkel kontinuerlig måte. Administrer en subkutan dose på 1 mg/kg med vedvarende buprenorfin (se materialfortegnelse) for postoperativ smertelindring.
- Bekreft tap av perfusjon i fotputen i det ligaterte bakbenet med LDPI (se Materialliste). Mens du fortsatt er bedøvet, plasser dyret på en mørk skumpute i en utsatt posisjon under LDPI-maskinen og bruk løkker med elektrisk tape for å sikre føttene på plass.
- Fortsett med LDPI av bilaterale føtter. Når skanningen er fullført, tegner du en avkastning rundt hver fotplate og oppnår gjennomsnittlige fluxverdier.
- Beregn perfusjonsindeksen som forholdet mellom gjennomsnittlige fluksverdier fra den ligaterte til ikke-ligaterte fotputen. Kontroller at perfusjonsindeksen er mindre enn 0,1.
- Overfør dyret tilbake til et rent bur med en varmepute eller overheadlampe for å opprettholde kroppstemperaturen. Sørg for fullstendig gjenoppretting fra anestesi før du overfører mus tilbake til dyreanlegget.
3. Postoperativ administrering av L-NAME og overvåking av hindlimb koldbrann
- På postoperative dager 1-3, administrer ytterligere 40 mg/kg IP-dose L-NAME til hvert dyr. Samtidig må du nøye vurdere foten fra den iskemiske lemmen.
- Kvantifisere graden av hindlimb iskemi og koldbrann ved hjelp av Faber hindlimb iskemi score9. Scorer 1-5: antall iskemiske negler; scorer 6-10: 1-5 iskemiske sifre; scorer 11 og 12: delvis og fullstendig fotatrofi. Record Faber scorer på postoperative dager 1-3 og deretter ukentlig.
4. Tilberedning av DiI og arbeidsløsninger for dyreperfusjon
- For å klargjøre DiI-lagerløsningen oppløses 100 mg DiI-krystaller (se materialtabellen) i 16,7 ml 100 % etanol. Dekk i aluminiumsfolie og la på en gyngeplattform over natten i mørket ved romtemperatur.
- For å forberede fortynningsmiddelet, oppløs 50 g glukose i 1000 ml destillert vann for å gi en 5% glukoseoppløsning. Filtrer gjennom et 0,22 μm flaske toppfilter. Bland PBS og 5% glukoseløsninger i et 1:4-forhold for å forberede en fungerende fortynningsløsning.
5. Utstyrsoppsett og DiI-perfusjon
- Gjør DiI arbeidsløsning ved å tilsette 200 μL DiI-lagerløsning til 10 ml arbeidsløsning (fremstilt i trinn 4.2) umiddelbart før bruk. Rist for hånd for å blande godt.
- Koble to eller tre 3-veis stoppekraner og en 25 G sommerfuglnål i serie. Forbered 10 ml sprøyter med 4 ml PBS, 10 ml DiI-oppløsning og 10 ml 10 % nøytralt bufret formalin (se materialtabellen).
- Koble sprøyten med formalin til den proksimale innstrømningsporten og injiser løsningen for å skylle luft fra linjen; dreie stoppekranen for å lukke porten. Gjenta den samme prosedyren sekvensielt, koble sprøytene med DiI og deretter PBS til henholdsvis midtre og distale innstrømningsporter, og pass på å skylle alle luftbobler gjennom stoppekranenheten.
MERK: Pass på at det ikke er noen luftbobler i noen del av stoppekranenheten eller slangen. Luftbobler kan okkludere små arterier under perfusjon, noe som resulterer i dårlig intravaskulær DiI-distribusjon og kompromitterte bilderesultater. - Når oppsettet er fullført, avliver du dyret ved CO2-overdose i et induksjonskammer.
- Plasser dyret som skal perfunderes i en liggende stilling på en absorberende pute og sikre axillae og nedre ekstremiteter med nåler.
- Bruk saks, lag et tverrsnitt for å åpne bukhulen. Eksponer og del deretter venstre og høyre membran for å få tilgang til thoraxhulen.
- Klipp brystveggen på hver side av brystbenet fra de nedre ribbeina til første eller andre ribber, unngå de indre thoraxarteriene (pattedyr) medialt. Bruk en hemostat (se Materialfortegnelse) for å gripe den nedre enden av brystbenet og reflektere det mot dyrets hode for å eksponere thoraxhulen.
- Identifiser venstre ventrikel, som vises lettere i fargen enn høyre ventrikel. Ta forsiktig tak i hjertet med stumpe tang og sett sommerfuglnålen inn i venstre ventrikel.
- Bruk saks eller en 18 G nål for å punktere riktig atrium, slik at blod- og perfusjonsløsninger kan gå tilbake til hjertet for å drenere. Stabiliser nålen med en eller to hender, pass på at du ikke utilsiktet punkterer høyre ventrikel og parfymerer lunge i stedet for systemisk sirkulasjon.
- Åpne porten til sprøyten med PBS og injiser manuelt 2-4 ml med en hastighet på 1-2 ml/min i 1-2 minutter for å skylle blod fra det vaskulære systemet. Sikre vellykket perfusjon ved å observere blødning fra høyre atrium. Lukk porten på PBS-sprøyten etter injeksjon.
- Åpne porten til sprøyten med DiI og injiser 5-10 ml med en hastighet på 1-2 ml/ min i 5 minutter. Overvåk ørene, nesen og håndflatene som skal bli litt rosa med injeksjon av DiI-oppløsning. Etter injeksjon, lukk porten på DiI-sprøyten og vent i 2 min for å tillate inkorporering av fargestoffet før injeksjon av fikseringsmiddel.
- Åpne porten til sprøyten med formalin og injiser 5-10 ml med en hastighet på 1-2 ml / min i 5 minutter. Etter injeksjon, fjern nålen fra venstre ventrikel og fortsett å høste vev av interesse.
- Bruk tung saks, dislocate tibia ved ankelen, helt skille venstre og høyre føtter fra underbenene. Plasser høstede føtter i en 6- eller 12-brønnsplate med 1-2 ml 10% formalinoppløsning. Pakk platen med folie og oppbevar den ved 4 °C over natten.
6. Tilberedning av fotputevev for konfokal laserskanning av mikroskopi
- Neste dag erstatter du den fikseringsløsningen i 6- eller 12-brønnsplate med 1-2 ml PBS per brønn.
- For å flå foten, lag først et langsgående snitt med en skalpell på plantaren og dorsale aspekter av foten. Deretter, ved hjelp av tannede tang og en liten hemostat, fjern forsiktig all hud fra foten og sifrene, og ikke skade det underliggende bløtvevet.
- Fortsett til montering og avbildning av vev, helst innen 1-2 dager etter perfusjon og høsting. Alternativt kan du returnere fotputer til 6- eller 12-brønnsplater med 1-2 ml PBS; deksel med folie og oppbevares ved 4 °C for å opprettholde fluorescens i opptil 1 måned.
- For å montere vev plasserer du føttene mellom to glassmikroskopsklier individuelt med en skumbiopsipute brettet over seg selv (en eller to ganger avhengig av vevstykkelsen) i hver ende (se Materialbord). Bruk to små bindemiddelklemmer til å komprimere glasssklier sammen i hver ende (endelig tykkelse ca. 1 mm).
MERK: Tykkere vev vil kreve lengre skannetider. Den flådde fotputen kan komprimeres mellom glasssklier en dag før bildebehandling for å redusere vevstykkelsen.
7. Confocal laser skanning mikroskopi
- Klargjør bildeøkten: Slå på bildesystemet og start anskaffelsesprogramvaren (se Tabell over materialer). Bruk et mål for lav forstørrelse/lav numerisk blenderåpning (f.eks. x5/0,15) til å ta bilder, ettersom objektiver med lavere forstørrelse vanligvis har lengre arbeidsavstander som kreves for dette eksperimentet.
- Klikk Ja for å aktivere fasedialogboksen. Aktiver 561 nm-laseren i kategorien Konfigurasjon. På hovedskjermen aktiverer du en synlig strålebane ved å klikke på Synlig-knappen . Sett en detektor til 570-600 nm-området ved å klikke på den tilsvarende Aktive avkrysningsruten.
- Velg Flisskanning-ikonet i kategorien Hent > anskaffelse , og angi ønsket oppløsning (512 x 512 eller 1024 x 1024).
- Plasser tørrmontert (ingen vann eller PBS tilsatt) vevsprøve komprimert mellom glasssklier på mikroskopstadiet og sett vev i fokus.
- Hvis du vil angi skannegrensene, navigerer du til øvre venstre eller høyre hjørne av eksemplet. Klikk Merk posisjon-knappen under Menyen Side ved side på Anskaffelse-fanen. Naviger til det motsatte hjørnet (henholdsvis nederst til høyre eller venstre) og klikk på Mark Position-knappen igjen.
- For å angi dybden på Z-stabelen, klikk på Live-knappen nederst til venstre på skjermen og naviger til midten av prøven. Bruk z-akseknappen til å bla gjennom til bunnen av prøven.
- Klikk På Start-knappen under Z-Stack-menyen på Oppkjøp-fanen. Bla gjennom til toppen av eksemplet og klikk på Avslutt-knappen . Klikk på Z-trinns størrelse og sett til ønsket verdi (f.eks. 50 μm).
- I nedre høyre hjørne av skjermen klikker du på Start for å starte bildeanskaffelse.
8. Kvantitativ analyse og 3D-rekonstruksjon av fotputevaskularitet
- Last ned og installer den nyeste versjonen av Fiji (ImageJ) samt Vessel Analysis plugin20. Åpne mikroskopi bildefiler i Fiji, som vil kombinere individuelle Z-serien i Z-stabler som kan vises i z-aksen ved hjelp av glidebryteren nederst i bildet.
- Velg det sammensatte Z-stakkbildet, og velg deretter Stabler > Z-prosjekt under menyen for å opprette en todimensjonal projeksjon. Deretter konverterer du Z-projeksjonen til binær under Prosess > binær > Lag binær.
- Kjør Vascular Density plugin under Plugins > Vaskulær tetthet. Når du blir bedt om det, bruker du markøren til å spore en avkastning rundt omkretsen av fotputen og sifrene. Legg merke til kartettheten som rapporteres, som uttrykkes som en prosentandel av avkastningen (vaskulær arealfraksjon).
- Hvis du vil opprette 3D-rekonstruksjoner i Fiji, velger du Stabler > 3D-prosjekt og angir ønsket rotasjonsakse, vinkel og hastighet under menyen Bilde. Alternativt kan du velge Volumvisning under Plugins-menyen for å visualisere bilder som stykker eller manipulere rekonstruksjonen i de ønskede aksene.
- Hvis du vil ha mer involvert 3D-gjengivelse, kan du bruke alternativ bildeanalyse- og prosesseringsprogramvare (se Materialfortegnelse). Konverter filer til ønsket programvare format og sy individuelle fliser skanninger ved hjelp av flis stitching funksjonalitet.
- Etter å ha sydd individuelle flisskanninger sammen, åpner du den sammensatte filen og fortsetter med volumoverflategjengivelse. Klikk på Legg til ny overflate for å åpne veiviseren for overflateoppretting og bruke pilene til å veksle mellom menyer, spesielt ved å angi avkastningen og terskelintensiteten. Når du er fornøyd med overflategjengivelsen, kan du bruke animasjonsfunksjonaliteten til å lage videoer av det behandlede bildet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne protokollen beskriver et pålitelig middel for å indusere iskemi og vevstap i murinfotpaden ved hjelp av en kombinasjon av lårarterie og venekoagulasjon med L-NAME-administrasjon, en nitrogenoksidsyntasehemmer, i mottakelige FVB-mus. Figur 1 beskriver anatomien til den murinske bakbensvaskulaturen og indikerer stedene til lårarterien og venekoagulasjonen (gul X), bare proksimal til lateral circumflex lårarterie (LCFA) og proksimal til saphenopopliteal krysset. LCFA må identifiseres, og koagulasjonsstedene som er respektive for denne strukturen, holdes konsistente gjennom alle kirurgiske prosedyrer. Som beskrevet, 2 timer før kirurgiske inngrep og på postoperative dager 1-3, ble mus også administrert 40 mg / kg IP av L-NAME for å opprettholde forhøyede vevsnivåer av oksidativt stress. Figur 2 viser variasjonen i vevstap som kan forventes fra denne modellen en uke etter operasjonen, med Faber score9 registrert i nedre høyre hjørne av hvert bilde.
DiI-perfusjon ble utført hos FVB-mus ved 5 og 20 dager etter lårarterie og venekoagulasjon for å vurdere bakre reperfusjon etter induksjon av iskemi. Figur 3A illustrerer murinanatomien etter disseksjon for å eksponere thoraxhulen. En sommerfuglnål settes inn i venstre ventrikel for å begynne hjerteperfusjon. Legg merke til at venstre ventrikel ser litt blekere ut i fargen enn høyre ventrikel. Figur 3B viser utstyret som er satt opp med stoppekraner koblet i serie og tre sprøyter fylt med PBS, DiI-løsning og fikseringsmiddel. Etter DiI-perfusjon ble føttene høstet, flådd og komprimert mellom mikroskopskred som vist i figur 3C,D før avbildning med et konfokalt laserskanningsmikroskop under 5x forstørrelse. Rekonstruksjonsmikroskopibilder viste normal vaskulær anatomi i ikke-ligatert kontrollfotpute (figur 4A) sammenlignet med alvorlig redusert perfusjon med fotputen i ligatert bakben 5 dager etter operasjonen (figur 4B). Tjue dager etter operasjonen ble perfusjonen til fotputen betydelig forbedret (figur 4C, D og figur 5B), men ikke i den grad det ikke er ligatert kontroll (figur 4A og figur 5A). Vaskularitet ble kvantifisert som beskrevet ovenfor ved hjelp av Vessel Density plugin i Fiji. Den vaskulære fraksjonen for kontrollfotputen var 28%. Fem dager etter operasjonen ble footpad vaskulær brøkdel sterkt redusert til 2%, men gradvis gjenopprettet til 15% og 18% i to separate mus med 20 dager postoperativt. For å visualisere fotputens vaskulære anatomi i 3D importerte vi et sydd mikroskopibilde til alternativ bildeanalyse- og prosesseringsprogramvare for å lage en overflategjengivelse som beskrevet tidligere (tilleggsfigur 1). En video av overflategjengivelsen ble deretter opprettet ved hjelp av animasjonsfunksjonaliteten (video 1).
Figur 1: Anatomien til den murinske bakbensvaskulaturen og stedene i lårarterien og venekoagulasjonen. Den eksterne iliac arterien fortsetter som lårarterien (FA) distal til inguinal ligament. De første grenene av lårarterien inkluderer lateral circumflex (LCFA) og dype lårarterier (ikke avbildet). Mer distalt, den proksimale kaudale femoral (PCFA) og overfladiske kaudale epigastriske arterier (SCEA) gren fra FA proksimal til bifurcation av saphenous (SA) og popliteal arterier (PA). Lårnerven (FN) går sammen med lårkarene og bør isoleres forsiktig før koagulasjon av lårkarene. FA og femoral vene (FV) koagulasjonssteder er også indikert (X). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Representative bilder av hindlimb gangren i FVB mus med tilsvarende Faber score. Graden av iskemiske endringer indusert av denne modellen varierer fra en eller flere iskemiske negler (Faber scorer 1-5) til gangrenøse sifre (Faber scorer 6-10) og delvis eller fullstendig fotatrofi. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Dyrespredning og utstyrsoppsett for DiI-perfusjon og montering av musefot for avbildning. (A) Anatomisk fotografi av murinanatomien under DiI-perfusjon. Buken og thoraxhulene åpnes, brystbenet reflekteres, og ribbenene kuttes på hver side av brystbenet. En 25 G sommerfuglnål koblet til stoppekranenheten settes inn i venstre ventrikel. (B) Tre 3-veis stoppekraner er koblet sammen i serie. Tre 10 ml sprøyter er fylt med fixative, DiI og PBS og koblet til stoppekranenheten. En 25 G sommerfuglnål er koblet til utstrømningsporten til den proksimale stoppekranen. (C) Montering av flådd fot mellom to mikroskopsklier med en brettet skumbiopsipute og bindemiddelklemme i hver ende for å komprimere lysbildene sammen. (D) En alternativ visning av den flådde foten komprimert mellom mikroskopskred. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Representative 5x-bilder innhentet ved konfokal laserskanning av mikroskopi av musefotputen etter DiI-perfusjon med kvantifisert kartetthet uttrykt som en prosentandel av roi. (A) Normal fotputevaskulatur. (B) Fotputevaskulatur 5 dager etter lårarterien og venekoagulasjonen viser alvorlig redusert perfusjon med minimal kar opacification. (C) Fotputevaskulatur 20 dager etter lårarterien og venekoagulasjonen viser en viss rekonstituering av distal strømning til metatarsale og digitale arterier. (D) Bilde av en ekstra musefotpute oppnådd 20 dager etter lårarterien og venekoagulasjonen som viser minimalt stort kar sammenlignet med mikrovaskulær opacification. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Forstørrede bilder av fotputens vaskulatur. (A) 5x og 20x bilder av kontroll footpad vaskulatur som demonstrerer intakt perfusjon via metatarsale og digitale arterier. (B) 5x og 20x bilder av footpad fra ligated hindlimb 20 dager postoperativt viser redusert perfusjon via større metatarsale arterielle grener, men utviklingen av et omfattende, plysj kapillær nettverk. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Video 1: Animasjon av 3D-overflategjengivelsen av fotputens vaskulatur. Video som viser en overflategjengivelse av fotputens vaskulatur illustrerer 3D-oppløsningen som kan oppnås med den beskrevne protokollen. Klikk her for å laste ned denne videoen.
Supplerende figur 1: Trinn i overflategjengivelsen av DiI-parfymebilder. (A) Original DiI perfusjonsbilde importert til bildeanalyse og prosesseringsprogramvare. (B) Overflategjengivelse lagt på DiI-perfusjonsbilde under innstilling av terskelintensiteten. (C) Endelig 3D-overflategjengivelse av DiI perfusjonsmikroskopibilde. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mens mus hindlimb iskemi er den mest brukte prekliniske modellen for å studere neovascularization i PAD og CLTI, er det betydelig variasjon i iskemi alvorlighetsgrad og utvinning avhengig av den spesifikke musestammen som brukes og nettstedet, antall og metode for arteriell forstyrrelse. Kombinasjonen av femoral arterie ligation og IP-administrasjon av L-NAME kan pålitelig indusere hindlimb gangren i FVB mus11. Den samme behandlingen resulterer i hindlimb iskemi uten vevstap hos C57BL/6 mus, mens i BALB/c mus kan automatisk amputasjon av foten eller benet induseres av lårarterie ligation alene. Som sådan gir den ovenfor beskrevne teknikken for femoral arteriekoagulasjon med samtidig L-NAME-administrasjon hos FVB-mus, som har en mellomliggende respons på iskemi fornærmelse, en unik og reproduserbar modell av footpad gangrene som er sett i den mest alvorlige manifestasjonen av sykdommer som fører til CLTI. Graden av vevstap observert med denne modellen kan variere fra noen få iskemiske negler til flere gangrenøse sifre, men utvikler seg sjelden til auto-amputasjon av foten eller benet, noe som muliggjør langsgående vurdering av lemreperfusjon og funksjon. I motsetning til BALB / c mus, der utbruddet av koldbrann er raskt med lem auto-amputasjon vanligvis forekommer på mindre enn en uke, er det forsinket utbrudd av vevstap i denne FVB mus gangren modellen. Femoral arteriekoagulasjon begrenser akutt blodstrømmen til bakbenet. Likevel er akkumulering av oksidativt stress på grunn av L-NAME-administrasjon på postoperative dager 0-3 mer gradvis, med topp atrofiske endringer observert mellom 7-14 dager. Derfor tilbyr denne modellen et forbedret terapeutisk vindu for å evaluere effekten av en bestemt intervensjon på bruttovevsutseende og redning av vevstap i tillegg til kvantifisering av reperfusjon og vurdering av lemfunksjon.
Når det gjelder kirurgisk teknikk, er koagulasjon eller ligasjon av både lårarterien og venen favorisert på grunn av den relative enkelheten i denne operasjonen sammenlignet med isolasjonen av lårarterien. Selv om denne teknikken kan føre til venøs trombose og insuffisiens, forener den den iskemiske fornærmelsen og bidrar til å indusere gangrenøse endringer mer pålitelig. I tillegg er kronisk venøs insuffisiens (CVI) svært utbredt i befolkningen generelt, med 10% -30% av voksne berørt. Konsekvent har omtrent 20% av pasientene med PAD, spesielt de med alvorlig arteriell insuffisiens, også komorbid CVI21,22. Uansett om man bestemmer seg for å ligate eller koagulere lårbenet, er det kritisk viktig å opprettholde de spesifikke stedet (e) av lårarterieforstyrrelse konstant på tvers av eksperimentelle grupper. Mer proksimale ligasjoner, som iliac arterien, fører til okklusjon av ytterligere nedstrøms sikkerheter og begrense muligheten for arteriogenese8,16. Imidlertid bør angiogenese i den distale delen av lemmen, spesielt gastrocnemius-muskelen, fortsatt utløses. I FVB mus, dobbel ligasjon eller koagulasjon av lårarterien bare proksimal til lateral circumflex femoral arterie og proksimal til saphenopopliteal bifurcation mer konsekvent induserer koldbrann enn en enkelt ligation eller koagulasjon sted.
Det skal bemerkes at hos PAD- og CLTI-pasienter er lem iskemi forårsaket av aterosklerotisk obstruksjon (en kronisk prosess). I motsetning, i musemodeller, blir lem iskemi indusert kirurgisk (en akutt prosess). Selv om denne FVB-musen hindlimb gangren modell har en relativt langsommere utbrudd av koldbrann med forsinket topp alvorlighetsgrad av vevstap, er det ikke direkte sammenlignbart med kronisk, progressiv arteriell stenose karakteristisk for PAD og CLTI. Andre grupper har utviklet subakutte lårarterie okklusjonsteknikker ved hjelp av ameroid constrictors bestående av en ytre metallhylse og et indre lag av fuktighetsabsorberende materiale som gradvis ekspanderer selv. Denne teknikken har vist seg å resultere i redusert uttrykk for inflammatoriske markører, lavere blodstrømsgjenoppretting ved 4-5 uker, og redusert muskelnekrose23,24. Annet enn forskjeller i iskemiskarphet, prekliniske modeller som bruker unge, sunne dyr, klarer heller ikke å gjenskape risikofaktorer som diabetes, hypertensjon, fedme, hyperlipidemi, røyking og infeksjon som bidrar til store negative lemhendelser og byrden av vaskulær sykdom.
I de fleste studier av murin hindlimb iskemi, restaurering av blodstrøm til iskemisk bakben er vanligvis vurdert via LDPI24,25. Denne metoden er ikke-invasiv og repeterbar, men kan påvirkes av kjerne kroppstemperatur, bedøvelse, hår tilstedeværelse, og posisjonering av bakbenene26. Standardisering av disse prosedyrene og bruk av det ikke-ligaterte bakbenet som internkontroll kan bidra til å redusere eventuelle variasjoner. I motsetning til LDPI gir mikro-CT og MRA anatomisk informasjon med høy oppløsning, men krever tradisjonelt injeksjon av kontrastmiddel16. Røntgenmikroangiografi er også invasiv og teknisk utfordrende16,27. I likhet med DiI muliggjør perfusjon med røntgentette silikonstøpemidler post-mortem 3D-rekonstruksjon av den perifere vaskulaturen28. Intrakarakum- eller hale veneinjeksjon av fluorescerende lectin er også beskrevet for merking av vevsvaskulatur29. Etter høsting av vev av interesse, brukes immunhiistokjemisk farging med endotelspesifikke markører (f.eks. CD31, von Willebrand-faktor) ofte til å kvantifisere kapillærtetthet30.
Sammenlignet med teknikkene nevnt ovenfor, gir DiI perfusjon flere fordeler. For det første er reagensene og materialene som kreves relativt billige, forutsatt at tilgang til et konfokalt laserskanningsmikroskop er tilgjengelig. Denne metoden tillater 3D-rekonstruksjon av vaskulaturen, som kan kvantifiseres ved hjelp av bildeanalyseprogramvare. Mens denne protokollen fokuserer på fotputevaskulaturen, er helmontert bildebehandling av andre murin hindlimbvev, spesielt gastrocnemius og adductor muskler, også mulig og relevant for angiogenese og arteriogenese19 studier. Denne teknikken kan endres for større dyremodeller, inkludert rotter og kaniner, ved å øke volumet av perfusjonsløsninger. Imidlertid er bildebegrensninger angående vevsstørrelse beskrevet nedenfor.
Kritiske deler av DiI-perfusjon er som følger. Luftbobler i apparatet kan okkludere små kar og hindre fordelingen av DiI gjennom hele vaskulaturen, og dermed påvirke bilderesultatene. Som sådan må det tas hensyn til å fjerne eventuelle luftbobler i stoppekranapparatet og slangen før perfusjon. Filtrering av alle løsninger unntatt DiI gjennom et 0,22 μm flaske toppfilter anbefales også å fjerne eventuelle mikropartikler. Under intrakariac perfusjon, nøye overvåke lungene. Hvis de blir forstørret og blir rosa i farge, er dette et tegn på at sommerfuglnålen har penetrert gjennom til høyre ventrikel og må trekkes litt tilbake.
En viktig begrensning av DiI-perfusjon er prosedyrens terminale natur, som ikke tillater gjentatte målinger. Fordi dårlige perfusjonsresultater kan reflektere underliggende arteriell insuffisiens eller teknisk feil, anbefales det å høste og avbilde det ikke-ligaterte bakbenet som internkontroll. Når det gjelder avbildning, er optimal vevstykkelse for laserpenetrasjon ~ 1 mm etter kompresjon. Følgelig krever større vev seksjonering i mindre stykker som skal monteres på lysbilder og innkvarteres på mikroskopstadiet og proporsjonalt lengre bildeoppkjøpstider.
Oppsummert skisserer denne protokollen en unik preklinisk modell for å studere PAD og CLTI. Spesielt, lårarterie og venekoagulasjon med samtidig administrering av L-NAME, en NOS-hemmer, induserer pålitelig vevstap i fotputene til FVB-mus. Post-mortem, intrakariac DiI perfusjon brukes deretter til å merke vaskulaturen fluorescerende. Etterfølgende helmontert bildebehandling av de høstede føttene med konfokal laserskanningsmikroskopi gir mulighet for høyoppløselig, 3D-rekonstruksjon av fotputens vaskulatur og visualisering av arterielle og kapillære nettverk som utfyller tradisjonelle måter å vurdere reperfusjon i bakbens iskemimodeller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av tilskudd til Z-J L og OC V fra National Institutes of Health [R01HL149452 og VITA (NHLBl-CSB-HV-2017-01-JS)]. Vi takker også Microscopy and Imaging Facility of the Miami Project for å kurere lammelse ved University of Miami School of Medicine for å gi tilgang til deres bildeanalyse- og prosesseringsprogramvare.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Binder clips (small) | Office supply store | ||
| Buprenorphine (sustained-release) | |||
| Butterfly needle (25 G with Luer-Lok) | VWR | 10148-584 | |
| Confocal laser scanning microscope | Leica | TCS SP5 | |
| DiI (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate) | Invitrogen | D282 | |
| Electrocautery device | Gemini Cautery System | 5917 | |
| Ethanol (100%) | VWR | 89370-084 | |
| Fiji (ImageJ) software | NIH | Used version 2.1.0. Free download, no license required. | |
| Foam biopsy pads | Fisher Scientific | 22-038-221 | |
| Formalin (neutral buffered, 10%) | VWR | 89370-094 | |
| FVB mice | Jackson Laboratory | 001800 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| HCl (1 M) | Sigma-Aldrich | 13-1700 | |
| Imaris software | Oxford Instruments | Used version 9.6.0. | |
| Isoflurane | Pivetal | NDC 46066-755-04 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Ketamine | |||
| L-NAME (Nω-Nitro-L-arginine methyl ester hydrochloride) | Sigma-Aldrich | N5751 | |
| Laser Doppler perfusion imager | MoorLDI | moorLDI2-HIR | Used moorLDI V5 software. |
| Microscope slides (25 x 75 x 1 mm) | VWR | 48311-703 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S7907 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S8282 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S8263 | |
| Needles (27 G) | BD | 305109 | |
| Povidone-iodine swabstick (10%) | Medline | MDS093901ZZ | |
| Surgical instruments | Roboz Surgical | Fine forceps, needle driver, spring scissors, and hemostat are recommended. | |
| Suture (5-0 absorbable) | DemeTECH | G275017B0P | |
| Syringes (10 mL) | BD | 305482 | |
| Three-way stopcocks | Cole-Parmer | 19406-49 | |
| Vascular Analysis Plugin | Free download, no license required. See reference: Elfarnawany (2015). | ||
| Xylazine |
References
- Virani, S. S., et al. Heart disease and stroke statistics-2020 update: A report from the American Heart Association. Circulation. 141 (9), 139 (2020).
- Duff, S., Mafilios, M. S., Bhounsule, P., Hasegawa, J. T. The burden of critical limb ischemia: A review of recent literature. Vascular Health and Risk Management. 15, 187-208 (2019).
- Mills, J. L., et al. The society for vascular surgery lower extremity threatened limb classification system: Risk stratification based on Wound, Ischemia, and foot Infection (WIfI). Journal of Vascular Surgery. 59 (1), 220-234 (2014).
- Conte, M. S., et al. Global vascular guidelines on the management of chronic limb-threatening ischemia. Journal of Vascular Surgery. 69 (6), (2019).
- Yeager, R. A. Relationship of hemodialysis access to finger gangrene in patients with end-stage renal disease. Journal of Vascular Surgery. 36 (2), 245-249 (2002).
- Al Wahbi, A. Autoamputation of diabetic toe with dry gangrene: A myth or a fact. Diabetes, Metabolic Syndrome and Obesity: Targets and Therapy. 11, 255-264 (2018).
- Niiyama, H., Huang, N. F., Rollins, M. D., Cooke, J. P.
- Hellingman, A. A., et al. Variations in surgical procedures for hind limb ischaemia mouse models result in differences in collateral formation. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 40 (6), 796-803 (2010).
- Chalothorn, D., Clayton, J. A., Zhang, H., Pomp, D., Faber, J. E. Collateral density, remodeling, and VEGF-A expression differ widely between mouse strains. Physiological Genomics. 30 (2), 179-191 (2007).
- Dokun, A. O., et al. A quantitative trait locus (LSq-1) on mouse chromosome 7 is linked to the absence of tissue loss after surgical hindlimb ischemia. Circulation. 117 (9), 1207-1215 (2008).
- Parikh, P. P., et al. A Reliable Mouse Model of Hind limb Gangrene. Annals of Vascular Surgery. 48, 222-232 (2018).
- Kopincová, J., Púzserová, A., Bernátová, I. L-NAME in the cardiovascular system - nitric oxide synthase activator. Pharmacological Reports. 64 (3), 511-520 (2012).
- Soiza, R. L., Donaldson, A. I. C., Myint, P. K. Pathophysiology of chronic peripheral ischemia: new perspectives. Therapeutic Advances in Chronic Disease. 11, 1-15 (2020).
- McDermott, M. M., et al. Skeletal muscle pathology in peripheral artery disease a brief review. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 40 (11), 2577-2585 (2020).
- Usui, M., et al. Pathogenic role of oxidative stress in vascular angiotensin-converting enzyme activation in long-term blockade of nitric oxide synthesis in rats. Hypertension. 34 (4), 546-551 (1999).
- Aref, Z., de Vries, M. R., Quax, P. H. A. Variations in surgical procedures for inducing hind limb ischemia in mice and the impact of these variations on neovascularization assessment. International Journal of Molecular Sciences. 20 (15), 1-14 (2019).
- Li, Y., Song, Y., Zhao, L., Gaidosh, G., Laties, A. M., Wen, R. Direct labeling and visualization of blood vessels with lipophilic carbocyanine dye DiI. Nature Protocols. 3 (11), 1703-1708 (2008).
- Honig, M. G., Hume, R. I. Dil and DiO: Versatile fluorescent dyes for neuronal labelling and pathway tracing. Trends in Neurosciences. 12 (9), 333-341 (1989).
- Boden, J., et al. Whole-mount imaging of the mouse hindlimb vasculature using the lipophilic carbocyanine dye DiI. BioTechniques. 53 (1), 3-6 (2012).
- Elfarnawany, M. H. Signal processing methods for quantitative power doppler microvascular angiography. Electronic Thesis and Dissertation Repository. , 3106 (2015).
- Matic, M., Matic, A., Djuran, V., Gajinov, Z., Prcic, S., Golusin, Z. Frequency of peripheral arterial disease in patients with chronic venous insufficiency. Iranian Red Crescent Medical Journal. 18 (1), 1-6 (2016).
- Ammermann, F., et al. Concomitant chronic venous insufficiency in patients with peripheral artery disease: Insights from MR angiography. European Radiology. 30 (7), 3908-3914 (2020).
- Yang, Y., et al. Cellular and molecular mechanism regulating blood flow recovery in acute versus gradual femoral artery occlusion are distinct in the mouse. Journal of Vascular Surgery. 48 (6), 1546-1558 (2008).
- Padgett, M. E., McCord, T. J., McClung, J. M., Kontos, C. D. Methods for acute and subacute murine hindlimb ischemia. Journal of Visualized Experiments. (112), e54166 (2016).
- Nowak-Sliwinska, P., et al. Consensus guidelines for the use and interpretation of angiogenesis assays. Angiogenesis. 21 (3), 425-432 (2018).
- Greco, A., et al. Repeatability, reproducibility and standardisation of a laser doppler imaging technique for the evaluation of normal mouse hindlimb perfusion. Sensors. 13 (1), 500-515 (2013).
- Kochi, T., et al. Characterization of the arterial anatomy of the murine hindlimb: Functional role in the design and understanding of ischemia models. PLoS ONE. 8 (12), 84047 (2013).
- Hlushchuk, R., Haberthür, D., Djonov, V. Ex vivo microangioCT: Advances in microvascular imaging. Vascular Pharmacology. 112, 2-7 (2019).
- Robertson, R. T., et al. Use of labeled tomato lectin for imaging vasculature structures. Histochemistry and Cell Biology. 143 (2), 225-234 (2015).
- Lee, J. J., et al. Systematic interrogation of angiogenesis in the ischemic mouse hind limb: Vulnerabilities and quality assurance. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 40, 2454-2467 (2020).
