Summary
이 프로토콜은 필드의 천연 기판에서 살아있는 선충을 효율적으로 추출하는 방법을 간략하게 설명합니다.
Abstract
견고한 실험 모델 유기체인 것 외에도 , Caenorhabditis elegans 와 그 친척은 또한 자연에 사는 실제 동물입니다. 그들의 자연 환경에서 야생 선충의 연구는 생물학의 많은 측면을 이해 에 대 한 귀중 한, 독특한 게놈과 현상 전 형 문자 진화 하는 선택적 정권을 포함 하 여, 복잡 한 특성 변화에 대 한 유전 기초, 그리고 모든 동물 인구에 기본 자연 유전 다양성. 이 원고는 썩어가는 과일, 꽃, 곰팡이, 잎 쓰레기 및 토양을 포함하여 자연 기판에서 선충을 추출하는 간단하고 효율적인 방법을 설명합니다. Baermann 깔때기 방법, 고전적인 신생아 기술, 선택적으로 그들의 기판에서 활성 선충을 분리. 그것은 견본에서 거의 모든 활성 벌레를 복구하기 때문에, Baermann 깔때기 기술은 풍부하고 빠르게 성장하는 유전자형과 함께 생기는 희소하고 느린 성장 유전형의 복구를 허용합니다, 이는 재생의 다세대를 포함하는 추출 방법에서 놓칠 수 있습니다. 이 기술은 또한 대사 유전학, 인구 유전학 및 생태학적 질문을 해결하는 데 적합합니다. 그것은 동시에 샘플에서 전체 인구를 캡처, 나이의 자연 분포의 편견보기를 허용, 남녀, 그리고 유전자형. 이 프로토콜은 현장에서 대규모로 배포할 수 있게 해주며, 기판을 웜 플레이트로 빠르게 변환할 수 있으며 저자는 여러 대륙의 현장 작업을 통해 이를 검증했습니다.
Introduction
실험실에서 C. elegans를 연구하는 연구원이 야생에서 C. elegans 및 관련 rhabditid 선충에 초점을 확장함에 따라 귀중한 생물학적 통찰력이 부상하고 있습니다. 야생 선충의 연구는 그들의 자연적인 맥락에서 유전자와 게놈을 배치, 잠재적으로 실험실 조건에 의해 가려진 기능을 공개1,2,3,4,5. 이 연구 결과는 진화 그 자체를 위한 전제 조건으로 통찰력을 생성합니다, 유전 변이6,7,8,9,10. 야생 샘플에 의해 포착된 자연적인 유전 변이는 또한 많은 복잡한 특성의 유전 기초로 진입을 제공합니다11,12,13.
선충의 자연 인구의 격리를 필요로 하는 연구를 설계할 때, 특히 원격 현장 작업을 수행할 때, 실용적인 고려 사항은 앞에 옵니다. 이 프로토콜은 미끼 또는 야생 기판에서 OP50에서 배양 될 수있는 활성 선충의 전체 인구를 깨끗하게 격리하는 것을 목표로합니다. 이 방법은 카노르하비티스, 오샤이우스 및 프리스티션슈를 포함한 자유 생활 rhabditid 및 디플로아스테로이드 선충을 추출하는 데 적합합니다.
그들의 기판에서 선충을 격리하기위한 많은 기술이있다14,15. 가장 기본적인 방법은 선충-중간 접시에 직접 기판을 배치하여 8,15마리를 기어나갈 때 동물을 따는 것입니다. 이 방법은 모든 선충을 샘플에서 분리하는 것이 목표인 경우 많은 시간과 노동이 필요합니다. 보다 정교한 기술은 동물의 무게, 크기, 이동성 또는 이들의 일부 조합을 활용14. 각 방법은 설정 및 처리량 측면에서 장점과 단점을 가지고 있습니다. 그(것)들은 또한 그들의 샘플링 바이어스에서 다르고 견본에 있는 동물이 방법의 분리 원리의 축에 따라 변화하는 경우에 특정 선충을 위해 선택할 수 있습니다.
Baermann 깔때기 방법은 기생 후크웜16을 포함하여 토양 주거 선충을 연구하는 동안 자바에 장치를 발명 네덜란드 의사 G. K. T. F. Baermann에 의해 1917 년에 처음 설명되었다. Baermann 깔때기는 이동성의 원리에 따라 작동합니다. 기판은 천 또는 종이 필터가 늘어선 깔때기에 배치됩니다 ("Kimwipe"는 현재 프로토콜에서 "보풀이없는 닦아"라고 불리는이 연구에 사용됩니다) 바닥에 닫혀 있습니다. 그런 다음 깔때기가 물로 채워져 필터가 밀봉 된 콘센트에서 분리하는 동안 샘플을 잠급합니다. 시료의 활성 선충은 물 속으로 자신을 방출하고 필터를 통해 수영, 결국 깔때기의 바닥에 정착. 깔때기 콘센트가 열리고 선충 한 방울을 접시에 내포합니다(그림 1).
그림 1: Baermann 깔때기 기술의 요약. (A) 관심있는 사이트에서 박테리아가 풍부한 샘플을 수집합니다. (B) Baermann 깔때기에 샘플을 잠급니다 웜이 몸부림치고 가라앉을 때까지 기다린다. (C) 깔때기에서 한 방울을 해제합니다. (D) 단일 헤르마프로디트 또는 짝짓기 암컷을 이동하여 판을 분리합니다. 삽화: 라민 라니 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Baermann 깔때기는 모든 종류의 선충 (특정 대안에 대한 토론 섹션 참조)에 대해 작동하지 않으며 Caenorhabditis 또는 작은 14의 크기 범위에서 활성 형태인 사람들에게 가장 적합합니다. 그러나, 연구가 Baermann 깔때기를 사용할 수 있는 경우, 많은 장점이 있다. 이 방법은 제한된 설정, 실습 시간 및 비용이 필요한 현장에서 실용적입니다. 연구원은 접시에 기판의 방해없이 깨끗한 샘플로 남아, 이는 쉽게 따기 수 있습니다. 필터를 사용하면 곤충 유충이나 미테에 의한 플레이트의 오염을 방지하며, 이는 샘플을 선충에 대고 접시를 피우거나 먹이를 먹는다. 가장 중요한 것은 Baermann 깔때기는 기판14에서 거의 모든 인구를 효율적으로 추출하며, 이는 연구의 설계에 따라 필요할 수 있습니다. 예를 들면, 야생 인구의 단계 또는 성 분포를 계산하거나, 느리게 성장하거나 희귀 한 유전자형을 찾거나, OP50에 끌리지 않는 선충을 샘플링하는 데 관심이있는 연구원은이 방법의 혜택을 누릴 수 있습니다. 이것은 샘플링 계획이 샘플링 시간에 인구의 스냅샷을 취하기 때문에 생태학17, 인구 유전학18, 또는 metagenetic19 질문을 공부하는 연구원을 위해 적습니다.
본 원고는 Baermann 깔때기를 사용하여 선충의 인구를 격리하고 현장에서 동소 여성과 동위 원소 라인을 확립하기 위한 완벽한 프로토콜을 설명하며, 간편한 운송을 위해 선택한 장비를 사용합니다. 연구실 근처에서 현장 작업을 수행하는 연구원의 경우 이러한 단계중 상당수가 생략되거나 단순화될 수 있습니다.
Protocol
1. 현장에서 시드 NGM 플레이트 준비
- 여행 하기 전에, 몸무게 23.005 g의 선충 성장 매체 (NGM) ( 재료의 표 참조) 분말 및 밀봉 가능한 비닐 봉지에 사전 팩. 원하는 미디어의 각 리터에 대해 하나의 가방을 만듭니다.
참고: 여행 전에 사전 포장은 현장에서 기능적 균형의 필요성을 우회합니다. - 여행 전에는 1m MgSO4, 1M CaCl2 1mL, 원하는 각 매체리터당 1M 칼륨 인산염 버퍼 25mL를 준비하십시오. 1L의 인산염 버퍼를 만들려면 웜북20에 설명된 대로 KH2PO4 108.3g과 K2HPO4 35.6 g를 물에 용해하십시오.
- 여행 하기 전에 웜북20에 설명 된 대로 37 °C에서 LB에서 재배 된 OP50 (재료의 표 참조)의 하룻밤 문화를 만듭니다. 알리코컬은 50mL 원콘 튜브로 문화를 인용하고 누설을 방지하기 위해 파라핀 필름으로 상단을 감싸는다.
- 현장에서 NGM 패킷의 내용을 이중 증류수(ddH20) 또는 1L 플라스크 또는 병에서 사용할 수 있는 가장 순수하고 가장 멸균된 물의 973mL로 용해한다.
- 뜨거운 접시 나 난로에 끓는 뜨거운 물 목욕에 느슨한 모자 또는 알루미늄 호일 커버와 미디어 플라스크 또는 병을 놓습니다. 모든 분말이 용해되고 맑을 때까지 가끔 저어줍니다 (이것은 ~ 30 분 정도 걸립니다).
참고: 마그네틱 핫 플레이트를 사용할 수 있는 경우 교반 바는 수동 교반의 양을 제한하는 훌륭한 옵션입니다. - 수조에서 미디어를 제거하고 가끔 흔들거나 교반 바와 함께 ~ 58 °C로 식힙니다. 미디어가 58° C로 냉각되면 세로지학적 또는 표준 파이펫을 사용하여 1M 칼륨 인산염 버퍼 25mL, 1M MgSO4 1mL, 1M CaCl2 1mL을 추가하여 각 단계 사이에 잘 혼합합니다.
- 사용 가능한 가장 멸균 환경에서 파이펫 또는 미디어를 원하는 크기의 플레이트에 붓고 밤새 냉각하고 고화할 수 있습니다. 각 기판 샘플에 대해 60mm 플레이트(~10mL)를 붓습니다. 각 등쪽 라인에 대해 35mm 플레이트(~3.5mL)를 붓는다. 필요한 작은 플레이트의 수는 사전에 예측하기 어렵다.
- 각 플레이트에 OP50 배양의 파이펫 50 μL을 사용하여 사용하기 전에 밤새 건조하고 성장할 수 있습니다.
2. 선충 기판의 컬렉션
- 현장에서 박테리아가 풍부한 기판을 식별합니다. 일부 예로는 썩어가는 과일, 꽃, 곰팡이 및 초본 식물줄기가 있습니다. 토양과 잎 쓰레기는 카노르하비티스를 거의 포함하지 않지만 적합합니다.
- 장갑을 낀 손으로 이 기판(1-15cm3)의 샘플을 고유한 샘플 ID(그림 1A)로 표시된 밀봉 가능한 비닐 봉지에 넣습니다.
- 샘플 ID, 위도, 경도, 날짜, 기판의 설명 및 주변 및 기판 온도, 수집 시간, 기판 조건, 기판 관련 거시 척추 동물의 존재 등을 포함하여 실험과 관련된 기타 지역 환경 측정을 기록합니다. 이 프로세스를 간소화하기 위해 스마트 폰 앱을 사용할 수 있습니다21.
3. 베어만 깔때기의 배열의 준비
- 각 깔때기에 대해 가위를 사용하여 고무 튜브 세그먼트를 잘라냅니다 ( 재료 표 참조) ~ 3cm 길이.
- 플라스틱 깔때기의 끝에 튜브 세그먼트를 맞춥니다( 재료 표 참조). 이것은 착용감이 매우 단단하기 때문에 약간의 노력이 필요할 수 있습니다.
- 튜브 클램프를 고무 튜브 위에 밀어 놓고 닫습니다.
- 깔때기 홀더를 만들려면 메스를 사용하여 평평한 배송 방향에서 함께 접히지 않은 골판지 플라이 바이알 트레이 ( 재료 표 참조)의 바닥에 직경 35mm의 원형 구멍을 잘라냅니다. 표준 트레이는 3 x 4 배열에 이러한 구멍 12개를 수용할 수 있습니다.
- 골판지를 뒤집어 면에 한 번 접고(두 번은 아니고, 플라이 바이알 트레이를 만드는 것처럼) 측면을 테이프로 묶어 거꾸로 된 판지 트레이(그림 2)를 높이게 합니다.
- 구멍에 깔때기를 놓고 먼저 튜브 클램프가 닫힌 위치에 있는지 확인합니다.
그림 2: 용도가 변경된 골판지 플라이 바이알 트레이, 접힌 후 잘라내어 각각 12개의 Baermann 깔때기를 지원합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
4. 시료를 깔때기로 옮기다
- 각 깔때기에 물을 붓고 림 아래 약 3cm를 채웁니다. 기포가 튜브에 갇혀 있는 경우 깔때기를 눌러 풀어 놓습니다.
- 장갑을 낀 손으로, 보풀이 없는 물티슈나 특히 김스 와이프(반으로 접어서 사각형을 만들었다)를 깔때기 위에 놓고 중앙을 눌러 물에 잠겼다.
- 자연 기판 (과일, 꽃, 토양, 잎 쓰레기 등)의 큰 고체 조각을 작은 조각으로 수동으로 분해하여 웜이 기판에서 떨어지기 위해 여행해야합니다.
참고: 잎 쓰레기와 어색하게 모양의 샘플은 푸드 프로세서 나 블렌더에서 사전 처리 할 수 있습니다. - 천연 기판(1-15cm3)의 샘플을 조직을 천공하지 않고 림 위로 돌출하지 않고 깔때기에 티슈/보풀이 없는 닦아에 부드럽게 놓습니다.
- 깔때기 또는 깔때기 옆에 있는 골판지에 레이블을 지정하고 필드 수집 노트에 해당하는 샘플 ID를 표시합니다.
- 티슈/보풀이 없는 닦아샘플을 접습니다(그림 1B). 토양이나 파편이 깔때기의 바닥으로 전달될 수 없도록 티슈/보풀이 없는 물티슈 내에 포함된 샘플을 보관하십시오.
참고: 이 단계는 코너가 깔때기 의 가장자리에 드리워지는 것을 방지하여 측면의 깔때기에서 물을 심는 것입니다. - 손, 주걱 또는 파이펫 팁을 사용하면 깔때기에서 깔때기, 교차 오염 샘플로 이동할 수있는 활성 곤충, 밀리페드 또는 기타 동물을 선택합니다. 티슈/보풀이 없는 닦아 샘플을 완전히 감싸거나 시료 의 상단에 두 번째 조직을 놓아 교차 오염을 방지합니다.
- 전체 샘플이 잠수되도록 깔때기에 물을 더 추가합니다(그림 3).
그림 3: 조립된 바어만 깔때기. 각 샘플은 티슈/보풀이 없는 물티슈로 감싸고 깔때기의 물 속에 잠겨 있어 닫습니다. ~12h의 기간 동안, 선충은 조직을 통해 깔때기의 바닥으로 이동합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
5. 깔때기에서 선충 추출
- ~12시간 또는 하룻밤을 기다립니다. 이 시간 동안 활성 웜은 조직 /보풀이없는 닦기를 통해 고정 된 깔때기의 바닥까지 기판에서 몸부림합니다.
참고: 12h보다 훨씬 오래 기다리는 것은 저산소증 또는 병원성 감염으로 인해 웜 사망률을 위험에 빠뜨릴 수 있으며, 이는 특히 벌레와 박테리아로 붐비는 샘플의 짧은 기간에 위험이 있을 수 있습니다. - OP50 대장균 박테리아의 반점으로 시드된 60mm NGM 웜 플레이트의 바닥에 깔때기의 샘플 ID를 작성합니다. 접시에서 뚜껑을 제거합니다.
- 깔때기 스탠드에서 해당 샘플을 포함하는 깔때기를 제거합니다. 한 손으로 는 깔때기를 열어 놓은 웜 플레이트 위에 수직으로 고정하여 다른 손으로 튜브 클램프에 압력을 방출하여 튜브에서 벌레 플레이트에 한 방울의 물이 떨어질 수 있도록 합니다(그림 1C). 유입경로에서 물이 떨어지자마자 NGM 플레이트가 침수되는 것을 방지하기 위해 재빨리 닫습니다.
참고: Caenorhabditis 종을 포함하여 OP50에 끌린 벌레를 선택하려면 박테리아 잔디밭에서 떨어진 방울을 방출하십시오. 물이 접시에 스며들거나 증발하면 , 케노르하비티스 선충이 세균 잔디밭으로 기어 들어갑니다. - 정리: 깔때기의 내용을 던지세요. 후일의 재사용을 위해 유입깔을 뜨거운 물로 씻으시다.
6. 문화 정착
- 5x-50x배율에서 스테레오현미경 하에서 분리된 선충을 관찰한다. 플레이트에는 선충과 훨씬 낮은 주파수, 작은 올리고채테 안넬리드, 타디그레이드, 회전자 및 작은 갑각류(그림 4)가 포함되어야 합니다.
참고: 깔때기가 올바르게 설정된 경우, 어떤 mites, 곤충, 또는 눈에 보이는 비 생활 재료는 깔때기를 통해 그것을 만들 것입니다.
그림 4: BAermann 깔때기에서 NGM 플레이트에 릴리스된 첫 번째 물방울의 내용.
- 동포마프로디테 또는 동종 항선을 설정하려면 웜 픽을 사용하여 각 L4 hermaphrodite 또는 짝짓기 성인 여성(더 큰 체형 및 뚜렷한 남성 tail22의 부족으로 인식가능)을 OP50(도 1D)으로 시드된 별도의 35mm NGM 플레이트로 전송합니다. 라이터를 사용하여 웜을 전송하기 전과 후에 웜 픽을 소독합니다.
- 파라핀 필름을 사용하여 여행을 위해 플레이트를 철저히 감쌉니다.
Representative Results
이 프로토콜은 2018년 8월 스미소니언 열대 연구소 현장 역에서 과일, 꽃, 곰팡이, 토양 및 줄기에서 선충을 분리하는 데 사용되었습니다. 4일 동안 단일 조사자가 처리한 131개의 기판 중 130기판(99.2%)이 선충을 산출했습니다. 기판의 44개(33.6%)는 카노르하비티스 선충(그림 5)을 산출했다. PCR 및 짝짓기 테스트23에 의해 이 44기판에서 확립된 문화의 후속 분석은 C. 베세이, C. tropicalis, C. briggsae, C. sp. 24, C. sp. 57 및 C. panamensis의 6개의 다른 Caenorhabditis 종의 존재를 밝혔습니다.
이 프로토콜은 2019년 8월 4일 동안 우크라이나 체르노빌 배제 구역의 다양한 기판에서 선충을 분리하는 데 다시 사용되었습니다. 살아있는 벌레는 63개의 토양 견본 중 62개, 무척추 동물 샘플 17개 중 1개, 과일 샘플 75개 중 31개, 미끼 샘플 12개 중 1개(토론 섹션 참조), 버섯, 강대선 또는 늑대 대변 샘플(각각 1개의 샘플)에서 회수되지 않았다. 18S 리보소말 DNA15의 후속 시퀀싱은 이러한 선충을 Oscheius, 파나그라이무스, 아크로벨로이드, 메소르하비티스, 파나그릴루스, 프리스티션슈트 및 펠로데라로 확인했지만, 카노르하비티스는 확인되지 않았다(그림 5).
그림 5: 두 번의 컬렉션 여행의 성공률. 2018년 파나마(왼쪽)와 2019년 우크라이나(오른쪽). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
이 방법의 핵심 원리는 선충이 물에 잠긴 조직을 통과하고 기판과 더 큰 무척추 동물 오염 물질은 통과하지 못한다는 것입니다. 프로토콜의 중요한 단계는 (1) 적절한 기판을 수집하고, (2) 기판을 기체, 여과 물질로 감싸고, 물에서, (3) 필터를 통과하여 물 바닥으로 침몰한 벌레를 수집하고, (4) 개별 웜을 분리하여 동종 여성 또는 이소헤르마페로드라인을 생성한다. 이 방법의 다른 모든 부분은 사용 가능한 리소스, 기판의 특성 또는 현장 작업 목표에 따라 필요에 따라 수정할 수 있습니다. 고려 가치가 있는 일부 수정 사항은 다음과 같습니다.
열매를 심어 벌레를 미끼
현장 현장에서 발견되는 박테리아가 풍부한 썩는 재료의 충분한 공급이 없는 경우, 사과나 토마토 조각과 같은 샘플을 가져와 부패하게 할 수 있습니다. 미끼를 몇 가지 말뚝으로 잘 고정하여 큰 동물이 제거하지 않으므로 나중에 쉽게 수집 할 수 있습니다. 미끼가 부패하기 전에 건조 할 수있는 직사광선을 피하십시오.
사용 가능한 재료중 유입경로 장치 구축
튜브 클램프를 수용할 수 있을 만큼 크고 최고 무거운 깔때기를 지탱할 수 있을 만큼 안정적으로 구멍이 있는 모든 구조가 작동합니다. 단일 깔때기의 경우, 마시는 유리는 적합한 홀더입니다. 안면 조직, 화장지 또는 종이 타월과 같은 모든 종류의 조직을 사용할 수 있습니다.
저산소증 또는 감염을 방지하기 위해 깔때기에 물질을 적게 넣거나 대기 시간을 조정합니다.
시료가 벌레 또는 박테리아의 매우 높은 농도를 가지고 있는 경우에, 선충은 12 h 잠복기가 완료되기 전에 저산소증 또는 감염에서 정지하기 시작할 수 있습니다. 이것이 우려되는 경우, 연구원은 유입경로를 더 일찍 확인하거나 인구밀도가 높은 기판의 아주 작은 하위 샘플로 추가 깔때기를 준비할 수 있습니다.
NGM 플레이트 준비 조정을 실험적 요구 및 제약 조건에 맞게 조정
NGM 플레이트는 실험에 적합한 미디어 및 식품 공급원으로 제조할 수 있습니다. 위에서 설명한 필드 프로토콜은 수하물 중량을 최소화하도록 설계되었습니다. 수하물 제한 및 현장 작업 타이밍에 따라 실험실에서 준비되거나 상업적으로 구매한 이미 쏟아진 NGM 플레이트를 가져오는 것이 현장에 접시를 붓는 것보다 바람직할 수 있습니다.
실험실에서 깔때기 격리 수행
프로토콜은 자연에서 발생하는 선충 인구를 캡처하기 위해 필드 조건하에서 완전한 절차를 수행하는 것을 설명합니다. 일부 연구 목표에 대 한, 그것은 나중에 선충을 격리 하는 충분 한 수 있습니다., 밀봉 된 가방에 샘플실험실로 다시 여행 후. 그럼에도 불구하고 Baermann 깔때기 방법은 다른 격리 방법보다 살아남은 선충의 더 깨끗하고 완전한 샘플을 제공합니다. 그러나 밀봉 된 가방에 있는 샘플은 온도와 저산소증의 잠재적 인 극단에 노출되기 때문에 여행 중에 선택을 경험할 수 있습니다. 이는 샘플 수집 후 가능한 한 빨리 격리를 수행하여 최소화할 수 있습니다.
Baermann 깔때기에 대한 일반적인 대체 방법은 기판을 NGM 플레이트에 직접 배치하고 벌레가 기어 나올 때까지 기다리는 것을 포함하며, 이는 노동 집약적이거나 인구의 불완전한 수집을 초래합니다. 또한 미테와 곤충 애벌레로 오염된 접시를 산출합니다. Baermann 깔때기 방법은 활성 웜의 전체 인구를 기판에서 신속하게 분리하기위한 저비용 저기술 저노동 전략입니다.
Baermann 깔때기 방법은 모든 유형의 야생 선충을 수집하는 데 보편적으로 적용되지 않습니다. 일부 식물 주선선충은 기판에서 출현하는 데 12 시간보다 훨씬 오래 걸리며 너무 일찍 방출 된 물방울에서 결석할 것이며 일부 곤충 기생충은 바닥이 아닌 깔때기의 상단으로 기어 다니면서 collection14를 회피합니다. Baermann 깔때기에 대한 대안은 벌레를 복구하기 위해 더 전문적인 장비 또는 더 많은 노동력이 필요합니다. 그러나 위의 주의 사항이 실험에 문제가 되는 경우 여전히 선호될 수 있다. 반 Bezooijen14에 의해 검토 된 대체 옵션은 깔때기에 일정한 물 미트를 제공하는 깔때기 스프레이 방법을 포함, 산소를 추가하고 현탁액에 박테리아의 오버 플로우를 허용. 이것은 식물에서 선충의 더 확장 된 추출 기간을 허용합니다. 블렌더 원심 부양 방법은 특정 중력에 의해 분리하여 느리게 이동, 비활성 또는 상향 크롤링 선충을 복구하며, Oostenbrink 용출기는 중단된 선충으로부터 침전 침전물을 분리하기 위해 저류를 적용하고, Cobb의 방법은 신마토를 분리하기 위해 일련의 체, 크기, siation을 사용한다. 하지만 rhabditids를 수집하기 위해 Baermann 깔때기는 최소한의 노력으로 깨끗한 샘플을 신속하고 효과적으로 생성합니다.
Disclosures
저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 작품은 NIH 보조금 R35GM141906 및 R21ES031364 및 데이먼 러니언 펠로우십 DRG-2371-19에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 L glass bottle | NA | NA | Step 1 - vessel for making plate media |
| 1 mL pipette tips | any | NA | Step 1 - dispense worm media additives and seed plates |
| 1 mL pipetter | any | NA | Step 1 - dispense worm media additives and seed plates |
| 35 mm worm plates | Tritech | T3500 | Step 1 - worm plates |
| 4mm ID rubber tubing | Fisher | 14178A | Step 3 - part of the funnel |
| 60 mm worm plates | Greiner | 628161 | Step 1 - worm plates |
| 65 mm Funnel | Fisher | 22170156 | Step 3 - part of the funnel |
| Calcium chloride | Fisher | C79-500 | Step 1 - worm plate medium |
| Cooking pot | NA | NA | Step 1 - a water bath for melting the agar to pour plates |
| E. coli strain OP50 | Caenorhabditis Genetics Center | OP50 | Step 1 - worm food |
| Field microscope | OMAX | G223CS | Step 6 - for viewing worms in the field |
| Fly vial storage tray | Azer Scientific | ES-260T | Step 3 - to build a platform to hold 12 funnels |
| Hot plate or stove | NA | NA | Step 1 - to heat the water bath |
| Kimwipes | KimberlyClark | 34120 | Step 4 - filter for the funnels |
| LB media | Gibco | 10855021 | Step 1 - for growing OP50 |
| Lighter | NA | NA | Step 6 - sterilize the worm pick |
| Magnesium sulfate | Fisher | M63-500 | Step 1 - worm plate medium |
| NGM-lite agar | USBiological | N1000 | Step 1 - worm plate medium |
| Parafilm M wrapping film | Fisher | 13-374-10 | Step 6 - pack worm plates for travel |
| Potassium phosphate dibasic | Fisher | BP363-500 | Step 1 - worm plate medium |
| Potassium phosphate monobasic | Fisher | P285-3 | Step 1 - worm plate medium |
| scalpel | NA | NA | Step 3 - cut holes for the funnels |
| scissors | NA | NA | Step 3 - cut the rubber tubing |
| Tape | NA | NA | Step 3 - tape the funnel holder together |
| Tubing clamps | Fisher | 5869 | Step 3 - part of the funnel |
| Worm pick | NA | NA | Step 6 - for isolating individual worms |
| Ziplock-style storage bags | NA | NA | Step 2 - to bag a substrate sample |
References
- Frezal, L., Felix, M. A. C. elegans outside the Petri dish. Elife. 4, 05849 (2015).
- Greene, J. S., et al. Balancing selection shapes density-dependent foraging behaviour. Nature. 539 (7628), 254-258 (2016).
- Reddy, K. C., et al. Antagonistic paralogs control a switch between growth and pathogen resistance in C. elegans. PLOS Pathogens. 15 (1), 1007528 (2019).
- Schulenburg, H., Felix, M. A. The natural biotic environment of Caenorhabditis elegans. Genetics. 206 (1), 55-86 (2017).
- Zhang, F., et al. Caenorhabditis elegans as a model for microbiome research. Frontiers in Microbiology. 8, 485 (2017).
- Andersen, E. C., et al. Chromosome-scale selective sweeps shape Caenorhabditis elegans genomic diversity. Nature Genetics. 44 (3), 285-290 (2012).
- Cook, D. E., Zdraljevic, S., Roberts, J. P., Andersen, E. C. CeNDR, the Caenorhabditis elegans natural diversity resource. Nucleic Acids Research. 45, 650-657 (2017).
- Crombie, T. A., et al. Deep sampling of Hawaiian Caenorhabditis elegans reveals high genetic diversity and admixture with global populations. Elife. 8, 50465 (2019).
- Lee, D., et al. Balancing selection maintains hyper-divergent haplotypes in Caenorhabditis elegans. Nature Ecology & Evolution. 5 (6), 794-807 (2021).
- Rockman, M. V., Kruglyak, L. Recombinational landscape and population genomics of Caenorhabditis elegans. PLOS Genetics. 5 (3), 1000419 (2009).
- Evans, K. S., van Wijk, M. H., McGrath, P. T., Andersen, E. C., Sterken, M. G. From QTL to gene: C. elegans facilitates discoveries of the genetic mechanisms underlying natural variation. Trends in Genetics. 37, 933-947 (2021).
- Gaertner, B. E., Phillips, P. C. Caenorhabditis elegans as a platform for molecular quantitative genetics and the systems biology of natural variation. Genetics Research (Cambridge Core). 92 (5-6), 331-348 (2010).
- Noble, L. M., Rockman, M. V., Teotonio, H. Gene-level quantitative trait mapping in Caenorhabditis elegans. G3 Genes|Genomes|Genetics. 11 (2), 061 (2021).
- Van Bezooijen, J. Methods and techniques for nematology. , Wageningen University. (2006).
- Barrièrre, A., Félix, M. -A. Isolation of C. elegans. and related nematodes. Wormbook. , wormbook.1.115.2 (2014).
- Baermann, G. Eine einfache Methode zur Auffindung von Anklostomum (Nematoden) Larven in Erdproben. Geneeskundig tijdschrift voor Nederlandsch-Indië. 57, 131-137 (1917).
- Gray, N. F. Ecology of nematophagous fungi Panagrellus redivivus as the target organism. Plant and Soil. 297, 293-297 (1983).
- Mallez, S., Castagnone, C., Espada, M., Viera, P., Eisenback, J., Mota, M., Guillemaud, T., Castagnone-Sereno, P. First insights into the genetic diversity of the pinewood nematode in its native area using new polymorphic microsatellite loci. PLOS ONE. 8 (3), 4-11 (2013).
- Kerfahi, D., Tripathi, M. B., Porazinska, L. D., Park, J., Go, R., Adams, M. J. Do tropical rain forest soils have greater nematode diversity than High Arctic tundra? A metagenetic comparison of Malaysia and Svalbard. Global Ecology and Biogeography. 25, 716-728 (2016).
- Stiernagle, T.
- Di Bernardo, M., Crombie, T. A., Cook, D. E., Andersen, E. C. easyFulcrum: An R package to process and analyze ecological sampling data generated using the Fulcrum mobile application. PLOS ONE. 16, 0254293 (2021).
- Lints, R., Hall, D. H. Handbook of C. elegans male anatomy. WormAtlas. , (2005).
- Kiontke, K., Félix, M. -A., Ailion, M., Rockman, M. V., Braendle, C., Pénigault, J. -B., Fitch, D. H. A phylogeny and molecular barcodes for Caenorhabditis, with numerous new species from rotting fruits. BMC Evolutionary Biology. 11, 339 (2011).
