Summary
В этой статье описывается моделирование ишемии-реперфузии (I / R) в 3-дневном эмбрионе цыпленка с использованием крючка, настроенного на спинальную иглу, чтобы лучше понять развитие и лечение I / R. Эта модель проста, быстра и недорога.
Abstract
Расстройства ишемии и реперфузии (I / R), такие как инфаркт миокарда, инсульт и заболевания периферических сосудов, являются одними из ведущих причин болезни и смерти. Многие модели in vitro и in vivo в настоящее время доступны для изучения механизма I/R в заболевании или поврежденных тканях. Однако до настоящего времени не сообщалось о модели ovo I/R, что позволило бы лучше понять механизмы I/R и ускорить скрининг лекарств. В этой статье описывается моделирование I /R с использованием крючка спинальной иглы в 3-дневном эмбрионе цыпленка, чтобы понять механизмы развития и лечения I/R. Наша модель может быть использована для исследования аномалий на уровнях ДНК, РНК и белка. Этот метод прост, быстр и недорог. Текущая модель может использоваться независимо или в сочетании с существующими моделями I/R in vitro и in vivo .
Introduction
Ишемия-реперфузионное повреждение тканей было связано с рядом патологий, включая сердечные приступы, ишемический инсульт, травмы и заболевания периферических сосудов1,2,3,4,5. В первую очередь это связано с отсутствием всестороннего понимания прогрессирования заболевания и отсутствием эффективной исследовательской модели. Ишемическое повреждение возникает, когда кровоснабжение определенного участка ткани прекращается. В результате ишемическая ткань в конечном итоге некротизируется, хотя скорость варьируется в зависимости от ткани. Следовательно, восстановление кровоснабжения может помочь смягчить ущерб. Однако в некоторых случаях было замечено, что реперфузия вызывает больше повреждений тканей, чем одна только ишемия6,7,8. Поэтому понимание молекулярных и клеточных механизмов ишемии-реперфузии требуется для разработки эффективного терапевтического вмешательства. В настоящее время не известно эффективного лечения I/R травм. Это несоответствие побудило к созданию новых экспериментальных моделей, начиная от моделей in vitro до in vivo, для решения существующей проблемы9,10,11,12,13.
Эмбрионы цыплят (Gallus gallus domesticus) широко используются в исследованиях из-за их простоты доступа, этической приемлемости, относительно большого размера (по сравнению с другими эмбрионами), низкой стоимости и быстрого роста14. Мы использовали эмбрион цыпленка в 72 ч развития для создания in ovo I/R путем окклюдирования и высвобождения правой вителлиновой артерии с помощью спинномозговой иглы. Мы назвали его моделью ишемии-реперфузии Hook-I/R (рисунок 1). Модель, используемая в этом исследовании, способна точно моделировать все последующие процессы, включая окислительные и воспалительные пути, которые часто связаны с повреждением I/R15,16,17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Институциональный этический комитет по защите животных в Медицинском колледже и больнице Лакхнау Эры выпустил письменный отказ, в котором говорилось, что для проведения этих экспериментов не требуется официального разрешения в соответствии с Комитетом по контролю и надзору за экспериментами на животных (CPCSEA). Тем не менее, были соблюдены стандартные операционные процедуры, чтобы свести к минимуму любую возможность эмбрионального дистресса.
1. Подготовка буфера (таблица 1)
- Приготовьте раствор Рингера
- Для приготовления раствора Рингера растворяют 0,72 г NaCl (123 мМ), 0,017 г CaCl2 (1,53 мМ), 0,037 г KCl (4,96 мМ) в 70 мл стерильного дистиллированного H2O, с конечным объемом 100 мл. Отрегулируйте pH до 7,4. Дайте ему полностью раствориться и автоклав. Затем фильтруют через фильтр 0,22 мкм, аликвотируют на одноразовые количества (около 10 мл) и хранят при комнатной температуре.
- Готовят обычный физиологический раствор (0,9% хлорида натрия, NaCl).
- В 70 мл стерильного дистиллированного H2O растворить 0,9 г NaCl (154 мМ). Восполнить объем до 100 мл. Автоклав в течение 15 мин при 121 °C. При необходимости отрегулируйте рН до 7,4 с 0,1 Н HCl или 0,1 Н NaOH. Сделайте аликвоты по 10 мл в стерильной центрифужной трубке объемом 15 мл и храните при комнатной температуре.
- Готовят 70% этанол (v/v).
- Смешайте 70 мл чистого этанола (мол. масс. 46,07 г/л) до 30 мл стерильного H2O. Приготовьте по мере необходимости или храните при комнатной температуре. Нет необходимости в стерилизации.
- Приготовьте 1x фосфатного буферного физиологического раствора (1x PBS).
- Приготовьте 100 мл 1x PBS, добавив 0,144 г Na2HPO4·7H2O (5,37 мМ), 0,8 г NaCl (136,8 мМ), 0,2 г KCl (26,8 мМ), 0,2 г KH2PO4 (14,6 мМ) до 70 мл дистиллированной воды. Растворить и восполнить объем до 100 мл и автоклав в течение 15 мин при 121 °С. Доведите рН до 7,4, добавив пару капель 0,1 N HCl или 0,1 N NaOH, если это необходимо. Сделайте аликвоты по 10 мл в стерильной центрифужной трубке объемом 15 мл и храните при комнатной температуре.
2. День 1
- Разложите все инструменты, необходимые для стерилизации яиц (70% этанол, чистящие салфетки, стойка для яиц и маркер OHP).
- Очистите яйца на 0 дней с 70% этанолом, используя салфетки из папиросной бумаги. Используйте только 0-дневное яйцо, так как старые яйца могут не дать начало эмбриону.
- Напишите текущую дату на яйцах маркером OHP.
- Поместите яйца в инкубатор для яиц с температурой 36-37 °C и уровнем влажности 60%-65%. Высиживать яйца в течение следующих 24 ч.
3. День 2
- Расположите необходимое оборудование для вывода 5-6 мл альбумина (острые краевые ножницы, шприц 5 мл, игла 18 г, шприц-выбрасыватель, скотч, скотч).
- Протрите хирургические ножницы 70% этанолом или стерилизуйте с помощью автоклава после протирания их 70% этанолом.
- Теперь возьмите яйцо из инкубатора яиц при температуре 37 °C для прослойки.
- Поместите яйцо на чистую стойку для яиц.
- Прикрепите небольшой кусочек клейкой ленты (размер: около 1 дюйма длины х ширины) к краю яйца.
- Сделайте небольшое отверстие в краю яичной скорлупы с помощью остроконечных краевых ножниц. Вставьте шприц объемом 5 мл под приблизительным углом 75°.
ПРИМЕЧАНИЕ: Шприц 5 мл поставляется с иглой 24 G x 1 (стерильная), но хорошо заменить иглу 24 G x 1 иглой 18 G x 1,5 (стерильной). Игла 18 G x 1.5 имеет ширину 1,25 x 38 мм. Поэтому он облегчит удаление альбумина. - После введения иглы в желточный мешок медленно выводят 5-6 мл альбумина.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это обеспечивает эмбриону кровать, на которой он может расти. Выведение альбумина предотвращает переливание альбумина при установлении окна. Наконец, риск повреждения эмбриона во время окна смягчается путем устранения 5-6 мл альбумина. - После удаления альбумина повторно запечатайте отверстие клейкой лентой и оставьте яйца для инкубации при 37 °C в течение 48 ч.
4. День 4
- Приготовьте раствор Рингера, 0,9% нормального физиологического раствора и 1x PBS, как описано в разделе 1 протокола. Затем автоклавируйте три решения. После автоклавирования поместите соответствующий раствор при комнатной температуре.
- Выньте яйцо из инкубатора для яиц при температуре 37 °C и разрежьте скорлупу в круглую форму. Перед тем, как разрезать яичную скорлупу, накройте область, подлежащую разрезанию, скотчем.
ПРИМЕЧАНИЕ: Покрытие оконной зоны клейкой лентой предотвращает разрушение яичной скорлупы на нежелательные места. Однако, если вы вломитесь в нежелательное место, запечатайте область скотчем. Покрытие мест, подлежащих разрезанию, клейкой лентой предотвращает падение кусочков оболочки на желточный мешок. - Создайте небольшое отверстие в яичной скорлупе резко заостренным краем ножницами в том месте, где требуется окно, и начните прорезать круглое отверстие. Этот процесс называется окном.
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что круговой разрез достаточно большой, чтобы обеспечить легкий доступ к эмбриону с любого направления. При необходимости измените положение яйцеклетки, чтобы приспособиться к положению эмбриона. - Затем, используя хирургический микроскоп со стереозумом, найдите правую вителлиновую артерию (RVA).
ПРИМЕЧАНИЕ: Куриные эмбрионы обычно подвергаются грудному перекруту (наряду с цервикальным изгибом и т. Д.) По мере их развития, так что левая сторона головы находится против желтка на стадии 72 ч. Более каудально, там, где вителлиновые артерии выходят из организма, эмбрион не сильно скручивается, и эта часть тела лежит вентральной стороной вниз по направлению к желтку. Так, при непосредственном взгляде справа от эмбриона находится справа от исследователя. - Как только RVA будет найден, создайте два небольших отверстия на левой и правой сторонах RVA с помощью иглы 26 G (рисунок 2).
- Поместите зонд допплеровской визуализации кровотока над RVA. Убедитесь, что допплеровский зонд для визуализации кровотока размещен на расстоянии 5 ± 1 мм от места ишемии и к дистальному концу RVA. Возьмите показания флюса в течение 2 мин и 30 с (или дольше, если это необходимо). Это будет показание нормоксической фазы.
- Тем временем, используя плоскогубцы для носа и зубчатые щипцы, вручную формируйте край спинномозговой иглы в форму крючка (рисунок 3). Сделайте это, согнув край спинномозговой иглы примерно на 1 мм. Больший размер затруднит введение и удаление спинномозговой иглы во время процедуры I / R.
- Вставьте спинномозговую иглу непосредственно под правую вителлиновую артерию с помощью микроманипулятора.
ПРИМЕЧАНИЕ: Вставьте спинномозговую иглу с особой осторожностью, чтобы избежать повреждения RVA или любых соседних артерий. Оптимальным методом является регулировка специально разработанного крючка спинальной иглы точно над правой стороной отверстия RVA с последующим постепенным введением специально разработанного края спинальной иглы в желточный мешок с помощью микроманипулятора под руководством хирургического микроскопа стереозума через правое отверстие. Как только крючок спинальной иглы окажется в желточном мешочке, постепенно отрегулируйте крючок под RVA так, чтобы его край был точно помещен под левое отверстие. Сейчас самое время поднять спинномозговую иглу. - Теперь с помощью микроманипулятора постепенно поднимайте артерию до тех пор, пока допплеровский поток кровотока не укажет на минимальное снижение артериального потока на 80%.
- Как только будет достигнуто падение на 80% или более в допплеровском потоке, оставьте спинномозговую иглу поднятой (потянув артерию вверх) в течение 5 минут. Это будет период ишемии в RVA.
ПРИМЕЧАНИЕ: Критически важно контролировать доплеровский поток во время продолжительности ишемии. Если обнаружено значительное количество колебаний, прекратите тесты. - После 5-минутного периода ишемии постепенно освобождайте артерию для восстановления нормального уровня кровотока. Убедитесь, что показания допплеровского кровотока отображают значения, сопоставимые с теми, которые получены во время нормоксии. Это будет период реперфузии в RVA (рисунок 4).
- После процедуры I/R нанесите несколько капель (2-3) 1x PBS на эмбрион и наблюдайте за ним в течение 2-3 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Использование 1x PBS помогает предотвратить высыхание эмбриона. - Наконец, повторно запечатайте окно скотчем и поместите яйцо обратно в инкубатор для яиц на 5 ч и 55 мин.
- Через 5 ч и 55 мин возьмите яйцо из инкубатора для яиц, поместите его на стойку для яиц, снова откройте окно и следуйте протоколу последующей обработки.
5. Лечение
- Для лечения артерий лекарственными препаратами, активаторами или ингибиторами иссекают RVA через 1 ч В/Р процесса.
- Для последующих исследований сначала удалите эмбрион из яичной скорлупы, поместив его на стерильную чашку Петри толщиной 90 мм.
- Как только эмбрион будет выпущен в чашку Петри, иссекните RVA с помощью глазной радужной оболочки под руководством хирургического микроскопа со стереозумом.
- Убедитесь, что размер Иссечения RVA составляет до 15 ± 1 мм (дистально от ствола), 5 ± 1 мм каждый на левой и правой стороне артерии и 2 ± 1 мм к стволу.
ПРИМЕЧАНИЕ: Линейка может использоваться для измерения площади, подлежащей иссекению (необязательно). - После иссекания RVA промыть его 1x PBS в стерильной чашке Петри, содержащей 1x PBS.
- Для желаемого лечения поместите артерию в центрифужную трубку объемом 1,5 мл (стерилизованную), заполненную 500 мкл раствора Рингера. Поместите RVA в трубку центрифуги и поместите его в инкубатор при температуре 37 °C на 5 ч и 55 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от методов лечения, либо используйте раствор Рингера без какого-либо лечения, либо лечение желаемым объемом и концентрацией препарата, активатора или ингибитора. - Через 5 ч и 55 мин инкубации выньте RVA из лабораторного инкубатора с температурой 37 °C и приступайте к желаемой обработке.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Метод допплеровской визуализации кровотока был использован для оценки эффективности нашей модели. Короче говоря, мы сравнили данные контрольной группы с данными из группы RVA, чтобы определить успех нашего творения. На рисунке 4A изображен типичный поток, связанный с контрольным животным, в то время как на рисунке 4B показаны результаты, полученные от RVA. Число 1-8 представляет различные события, связанные с фазами ввода-вывода. Вкратце числовые 1-3 соответствуют фазе нормоксии, в то время как резкое снижение потока в точках 3 и 4 представляет собой события, связанные с уменьшением кровотока в РВА. Как только было достигнуто падение на 80% или выше, RVA оставалось поднятым в течение следующих 5 минут. Это была фаза ишемии (число 4-5). После 5-минутного подъема RVA была выпущена RVA, которая представлена цифрами 6 и 7. Поток от точки 7 и далее представляет собой фазу реперфузии, которая происходит после того, как RVA достигла нормального уровня кровотока, который был фазой реперфузии. Этот конкретный эксперимент продемонстрировал эффективность I/R моделирования в 3-дневном развитом эмбрионе цыпленка.
Чтобы проверить полезность нашей модели, мы изучили паттерны экспрессии белков, РНК и ДНК с помощью ИФА, вестерн-блоттинга, qRT-PCR и анализа гелевого электрофореза. Вкратце, мы разделили 3-дневные развитые яйцеклетки на три экспериментальные группы: контрольная, I/R и Treatment + I/R. Существенная разница в экспрессии белков, генов и целостности ДНК наблюдалась между их соответствующими I/R и контрольными группами. Как обсуждается ниже, медикаментозное лечение в группе I/R эффективно улучшило исход, наблюдаемый в этой группе, по сравнению с группой, получавшей I/R, в одной только группе; это согласуется с нашей предыдущей публикацией, на которой основан этот протокол1. Стандартные лабораторные процедуры применялись для ИФА18, вестерн-блоттинг19, qRT-PCR20 и гель-электрофореза21, которые не рассматриваются в данной работе (Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7, Рисунок 8).
Ишемия-реперфузия стимулирует несколько процессов, в том числе образование активных форм кислорода (АФК), которые наносят ущерб тканям. Пагубные эффекты, вызванные реакцией внутренних антиоксидантных защитных систем организма на АФК, являются важной особенностью повреждения I /R. Мы изучили активность регуляторных белков кислорода 150 (ORP150), цитоплазматической супероксиддисмутазы 1 (SOD1) и каталазы в ишемизированных сосудах. По сравнению с контрольной группой, I/R повысил активность ORP150, цитоплазматического SOD1 и каталазы (рисунок 5A-C). Тем не менее, добавление N-ацетил-L-цистеина (NAC), аквенчера АФК, смягчило окислительный стресс группы I / R.
Чтобы оценить воспалительный потенциал нашей модели, мы использовали ИФА для изучения экспрессии IL-1β и TNF-α (рисунок 6). Оба интерлейкина были чрезмерно экспрессированы в группе I/R по сравнению с контрольной группой, что указывает на то, что наша модель имеет потенциал для использования в воспалительных исследованиях. Затем мы проверили экспрессию NOD-подобного рецептора пирина, содержащего домен белка 3 (NLRP3), воспалительного пути 22,23 и провоспалительной молекулы NF-kβ24,25, которые участвуют в усилении воспаления, чтобы подтвердить полезность этой модели для воспалительных исследований. В ответ на I/R, сгенерированный в RVA, это исследование обнаружило доказательства активации инфламмасомы NLRP3 (рисунок 7A), а также NF-kβ (рисунок 7B). Тем не менее, лечение нарингенином, хорошо известным противовоспалительным препаратом, улучшило воспалительные эффекты, как это наблюдалось в группах, получавших лекарство.
Ишемия-реперфузия активирует запрограммированные пути гибели клеток26,27,28. Мы изучили влияние I/R на пути апоптоза и аутофагии у эмбриона цыпленка. На рисунке 8А показано влияние I/R на каспазу-3 и zVAD-fmk. Рисунок 8B-D демонстрирует, что группа I/R имела более высокую экспрессию LC3II, а также соотношение LC3II/I (маркер аутофагосом), Beclin1 (значимый регулятор аутофагии в клетках млекопитающих) и Atg7 (необходим для базальной аутофагии), чем контрольная группа, соответственно, на уровнях белка. Напротив, на рисунке 8E показано влияние I/R на уровни мРНК. Однако добавление 3-МА, ингибитора аутофагии, изменило результаты. Эти результаты свидетельствуют о том, что модель может быть использована для исследования различных процессов гибели клеток (например, некроптоза). Рисунок 9 показывает, насколько эффективно изменения на уровне ДНК могут быть изучены с использованием нашей модели Hook-I/R.
Наконец, мы сравниваем результаты модели Hook-I / R и модели окклюзии средней мозговой артерии (MCAO), чтобы увидеть, насколько эффективна наша модель по сравнению с другими моделями. Подводя итог, можно сказать, что обработанные I/R RVAs имели более высокие уровни расщепленной каспазы-3 апоптотического белка, белков аутофагии Beclin1 и Atg7 и воспалительных интерлейкинов TNF-α и IFN-Ƴ, чем контрольные RVAs. Интересно, что независимо от того, анализируя воспалительный стресс или клеточные пути смерти, модель Hook-I / R дала результаты, которые были чрезвычайно похожи на те, которые были получены моделью MCAO (рисунок 10).
Рисунок 1: Принципиальная схема типичной установки модели ишемии-реперфузии эмбриона цыпленка Hook-I/R. На снимке показаны требования к экспериментам hook-I/R chick embryo ischemia-reperfusion, такие как хирургический микроскоп со стереозумом, лазерный допплеровский расходомер крови, микроманипулятор, спинномозговая игла, 72-часовые эмбрионы цыплят и источник освещения». Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Репрезентативное изображение 3-дневного участка окклюзии эмбриона цыпленка и области иссечения тканей. (А) Треугольник показывает местоположение иссечения ткани для западного блоттинга, РНК и выделения ДНК. Звезда и точки представляют место окклюзии и отверстия, созданные на левой и правой стороне RVA, чтобы вставить иглу под артерию, чтобы поднять ее, соответственно. Вместе с ним также предоставляется увеличенное изображение области извлечения ткани. Обозначение A представляет глаз, B представляет сердце, C представляет левую часть вителлиновой артерии, а C' представляет правую часть вителлиновой артерии. (B) Схематическое изображение правой стороны эмбриона цыпленка демонстрирует площадь иссечения ткани в непосредственной близости от RVA. Прямая линия представляет собой RVA, выходящий из ствола эмбриона. Звезда на вертикальной линии символизирует положение лазерного допплеровского зонда кровотока. Пересечение обозначает место окклюзии. Иссечение артерий делали до 15 ± 1 мм (дистально от туловища), по 5 ± 1 мм с левой и правой стороны артерии и 2 ± 1 мм по направлению к стволу. Все измерения показывают расстояния от места окклюзии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Репрезентативное изображение спинальной иглы с изготовленным на заказ крючком. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Представление типичного сигнала лазерного допплеровского кровотокомера. Типичный сигнал лазерного допплеровского кровотокомера измеряли на 3-дневной артерии эмбриона цыпленка из яйцеклетки контрольной группы (А). События на исходном уровне (1), во время нормоксии (2), немедленного предварительного подъема RVA (3), немедленного постлифтинга RVA (4), во время ишемии (5), немедленного предварительного высвобождения RVA (6), немедленного постреперфузии (7), во время реперфузии (8) в группе, получавшей лечение ишемии, как зарегистрировано лазерным допплеровским кровотокомером (B). Эта цифра была заимствована из Fauzia et al., 2018 (Frontiers in Pharmacology; под лицензией CC-BY)1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Влияние ишемии-реперфузии на экспрессию белков-маркеров окислительного стресса. Вестерн-блоттинг использовался для определения уровней экспрессии ORP150, SOD1 и каталазы. (A) Экспрессия ORP150 была увеличена после повреждения I/R. NAC, ингибитор пан-АФК, снизил ORP150 до уровня, сопоставимого с уровнем контроля. (B) После I/R выражение SOD1 было повышено. Экспрессия SOD1 также снижалась после лечения NAC. (C) Событие I/R индуцировало экспрессию каталазы. RVA, получавший I/R и подвергшийся воздействию NAC, показал снижение уровня каталазы. В качестве механизмов внутреннего контроля использовались ГАПДХ (А,С) и β-Актин (В). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6: Оценка IL-1β и TNF-α с использованием ИФА. ИФА использовался для количественной оценки IL-1β и TNF-α, и результаты показали, что наблюдалось увеличение экспрессии IL-1β и TNF-α, что было смягчено добавлением нарингенина. Для этого исследования была применена ANOVA, за которой последовал тест Ньюмана-Кеулса. Полосы погрешностей представляют среднее ± SD, n = 3. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 7: Влияние ишемии-реперфузии на экспрессию белков-маркеров воспаления. (A) I/R лечение приводило к увеличению экспрессии NLRP3. Инкубация I/R, обработанного RVA с нарингенином, снижала экспрессию NLRP3. (B) Подобно NLRP3, экспрессия NF-kβ также была увеличена после I/R лечения. Лечение нарингенином снижало экспрессию NF-kβ. В качестве внутреннего контроля использовался GAPDH. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 8: Влияние ишемии-реперфузии на апоптотический и аутофагический статус клеток RVA. (A) Для изучения индукции апоптоза процессом I/R оценивали экспрессию расщепленной каспазы 3 с использованием западного блоттинга. После повреждения I/R уровень расщепленной каспазы 3 был повышен. Однако при лечении zVAD-fmk, ингибитором апоптоза, снижалась расщепленная экспрессия каспазы 3. (Б-Д) Для оценки индукции аутофагии после I/R определяли экспрессию LC3II/I, Beclin1 и Atg7. После I/R экспрессия всех аутофагических маркеров увеличивалась, в то время как воздействие I/R-обработанного RVA ингибитора аутофагии 3-MA снижало экспрессию всех белков до контрольных уровней. В качестве внутреннего контроля использовался GAPDH. (E) qRT-PCR использовалась для подтверждения индукции аутофагии и определения уровней экспрессии мРНК Ambra1 и Atg7. Оба гена показали значительное увеличение экспрессии в группе I/R по сравнению с контролем, который был восстановлен до почти нормальных уровней после терапии NAC. GAPDH использовался в качестве внутреннего контроля для экспериментов qRT-PCR. Для эксперимента (E) применялась ANOVA, за которой следовал тест Ньюмана-Кеулса. Полосы погрешностей представляют среднее ± SD, n = 3. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 9: Влияние ишемии-реперфузии на повреждение ДНК. Чтобы определить, индуцирует ли I/R ники ДНК, мы исследовали повреждение ДНК с помощью гелевого электрофореза. I/R приводил к геномной деградации ДНК, о чем свидетельствует смазывание в образце I/R. NAC-терапия I/R-поврежденной RVA уменьшала повреждение ДНК. Была использована лестница ДНК размером 1 кб. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 10: Сравнение модели Hook-I/R с моделью MCAO. Было проведено сравнение между данными, генерируемыми моделью Hook-I/R, и данными, генерируемыми моделью MCAO. (A) Экспрессия апоптотического белка каспазы-3 и белков аутофагии Beclin1 и Atg7 была выше в I/R обработанных RVAs по сравнению с экспрессией тех же белков в контрольных RVAs, что соответствовало результатам, полученным в экспериментах MCAO. (B) Было обнаружено, что уровни TNF-α и IFN-Ƴ повышены как в группах RVA, так и MCAO по сравнению с их соответствующими контрольными группами. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Наименование материала/оборудования | Концентрация | Автоклав | Хранение | ||
| Реагенты для раствора Рингера | |||||
| Хлорид натрия | 123 мМ | ||||
| Калия хлорид | 4.96 мМ | ||||
| Хлористый кальций | 1,53 мМ | ||||
| Стерильная дистиллированная вода | 100 мл | ||||
| рН | 7.4 | 15 мин при 121 °C | Р.Т. | ||
| Реагенты для 0,9% нормального физиологического раствора | |||||
| Хлорид натрия | 154мМ | ||||
| Стерильная дистиллированная вода | 100 мл | ||||
| рН | 7.4 | 15 мин при 121 °C | Р.Т. | ||
| Реагенты для 70% этанола | |||||
| 70% этанол | 70 мл | ||||
| Стерильная дистиллированная вода | 30 мл | Не требуется | Р.Т. | ||
| Реагенты для 1x фосфатного буферного физиологического раствора | |||||
| Хлорид натрия | 136.8 мМ | ||||
| Калия хлорид | 26,8 мМ | ||||
| Фосфат калия моноосновной безводный | 14.6 мМ | ||||
| ди-натрия гидрофосфат гептагидрат | 5.37 мМ | ||||
| Стерильная дистиллированная вода | 100 мл | 15 мин при 121 °C | Р.Т. | ||
Таблица 1: Рецептура растворов, используемых в данном исследовании.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Целью исследований ишемии-реперфузии является создание терапевтических стратегий, которые предотвращают гибель клеток и способствуют выздоровлению29,30. Чтобы преодолеть существующие ограничения в исследованиях I/R, мы разработали модель эмбриона цыпленка Hook I/R для получения надежной и воспроизводимой модели I/R. Насколько нам известно, наша модель является первой I/R моделью, когда-либо созданной в 3-дневном эмбрионе цыпленка для рутинных экспериментов I/R, помимо изучения сигналов стресса (например, окислительного и воспалительного стресса). Учитывая преимущества размера и доступности на 3-й день развития31, эмбрион цыпленка был использован на стадии развития 72 ч из-за высокой производительности модели, простоты использования и адаптивности для рутинного анализа32. Короче говоря, на 3-й день развития цыпленок in ovo представляет собой высоко контролируемую, но доступную и достаточно прозрачную модель внутри яйца, которая может быть использована для визуализации нормальной физиологии, патологии заболевания и эффектов экспериментального лечения. Его огромный размер делает его особенно полезным для изучения формирования и поведения эмбриона во время нормальной физиологии, а также стресса33. Хотя более старые эмбрионы цыплят (инкубированные в течение 4 дней или дольше) могут быть использованы, и мы попробовали более поздний момент времени, использование старых эмбрионов в качестве модельных систем сильно ограничено тем фактом, что желточный мешок растет настолько толстым после 3 дней развития, что хирургические процедуры затруднены. Следует отметить, что, хотя RVA не полностью формируется в раннем временном окне (скажем, на 1 или 2 день), окно может привести к тератогенности34. Помимо ограничений, связанных с ранней или поздней временной точкой развития, 72-часовой эмбрион цыпленка служит идеальной моделью для исследования процесса I / R, поскольку 3-дневные эмбрионы цыплят имеют четко определенную кровеносную систему30.
Понимание патофизиологии I/R травмы является основной целью разработки I/R-модели. В настоящее время не существует клинически полезного терапевтического средства для уменьшения ишемическо-реперфузионного повреждения1,35. В результате был предложен широкий спектр моделей in vitro и in vivo. В этом контексте впервые было предложено I/R моделирование в 3-дневном развивающемся эмбрионе цыпленка в ово. Предыдущие исследования показали, что окклюзия-реперфузия артериального кровотока вызывает патологические изменения в экспериментальных моделях, которые аналогичны тем, которые наблюдаются у людей36,37,38, поэтому мы надеялись, что наша модель сделает то же самое (такой окислительный и воспалительный стресс, наблюдаемый в моделях in vivo или у пациентов). С результатами нашего исследования вышеприведенная гипотеза оказалась верной.
Циркуляция крови от эмбрионов к желточному мешочку контролируется вителлиновыми сосудами в эмбрионах цыплят39. Эмбрионы получают питательные вещества из желтка и диффундируют кислород из воздуха через циркуляцию вителлина; таким образом, ограничивая любой из вителлиновых сосудов, что может нарушить питание и перенос кислорода. Исходя из этих фактов, ишемию индуцировали путем закупорки кровоснабжения RVA в течение 5 мин с последующей реперфузией в течение дополнительных 5 ч и 55 мин. Предлагаемая модель может быть использована для изучения ряда различных болезненных процессов, связанных с I/R, и тестирования различных лекарств и их мишеней. Текущая модель может быть использована для изучения изменений в ДНК, РНК и белках. У него есть потенциал, чтобы дать высокую производительность. Помимо своей простоты и адаптивности для регулярного анализа, модель также может исследовать кратковременное самонаведение стволовых клеток, которое будет исследовано в будущих исследованиях.
По сравнению с моделями in vitro, наша модель проста в использовании, экономична и быстро растет, а также этически невинна32. Наличие микроциркуляторного русла, иммунной системы и физиологических оценок - все это преимущества по сравнению с моделями in vitro, в то время как низкая стоимость, временная эффективность и отсутствие этических проблем являются преимуществами по сравнению с моделями in vivo40. Вышеуказанные преимущества указывают на то, что наша модель имеет сопоставимый эффект с другими моделями ввода-вывода, используемыми в настоящее время (рисунок 10). Потенциальным недостатком является неспособность текущей модели количественно оценить область инфаркта. Прямая оценка инфаркта может быть ценным биомаркером I/R-опосредованного повреждения и методом картирования эффектов различных терапевтических препаратов. Таким образом, мы стремились количественно оценить область инфаркта, но не смогли этого сделать из-за деликатной структуры 72-часовых птенцов. Поэтому необходимы дополнительные исследования для всесторонней оценки стратегий и путей осуществления процессов ввода-вывода.
Подводя итог, можно сказать, что текущая модель может быть использована для исследования различных путей заболевания, связанных с I/R, и скрининга различных лекарств и их мишеней. Благодаря своей высокой воспроизводимости, экономической эффективности и простоте, мы ожидаем, что наша модель станет ценным ресурсом для фундаментальной науки и трансляционных исследований.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов.
Acknowledgments
Мы хотим выразить нашу признательность Шанкару за его критический вклад во время видеографии и монтажа, г-ну Бакеру Хуссейну за закадровый голос, г-ну Асгару Ризви за редактирование видео, г-ну Мохаммаду Хайдеру за видеосъемку, г-ну Мохаммаду Данишу Сиддики за помощь в ходе экспериментов.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (-80°C) freezer | Haier, China | - | |
| 1.5mL Centrifuge tube | TARSONS, India | 500010X | |
| 100mm Petri dish (sterile) | Tarsons, India | 460050 | |
| 18G Needle (18G×1.5 (1.25×38mm) | Ramsons, India | 13990 | |
| 1mL Syringe | DISPO VAN | - | |
| 26G Needle (26G×1/2 (10.45x13mm) | DISPO VAN, india | 30722D | |
| 37°C egg incubator with adjustable percentage humidity | Gentek, India | GL-100 | |
| 37°C laboratory incubator | SCIENCE TECH, India | CB 101-14 | |
| 3-Methyladenine (3-MA) | Sigma Aldrich, USA | M9281 | |
| 3mL Pasture Pipette | TARSONS, India | 940050 | |
| 50mL Beaker | TARSONS, India | - | |
| 5mL Syringe | DISPO VAN, India | IP53 | |
| 70% ethanol | Merck Millipore, United States | 64-17-5 | |
| Adhesive tape/Cello tape | Sunrise, India | - | |
| Ambra1 primers | Applied Biosystems, Foster city, USA | Hs00387943_m1 | |
| Anti-mouse IgG | Cell Signaling Technology, USA | 7076S | |
| Anti-Rabbit IgG | Jackson Immuno Research Laboratories, USA | 711-035-152 | |
| Atg7 | R&D Systems, USA | MAB6608 | |
| Atg7 primers | Applied Biosystems, Foster city, USA | Hs00893766_m1 | |
| Autoclave Bag | Tarsons, India | 550022 | |
| Autoclave Machine | Local made, Lucknow, India | - | |
| Beclin-1 | Proteintech, USA | 66665-1-Ig | |
| Beta Actin | ImmunoTag, USA | ITT07018 | |
| Bovine Serum Albumin | Himedia, Mumbai, India | TC194 | |
| Calcium Chloride | Himedia, Mumbai, India | GRM534 | |
| Catalase | ImmunoTag, USA | ITT5155 | |
| Cleaning wipes | Kimberly-Clark, India | 370080 | |
| Cleaved Caspase3 | ImmunoTag, USA | ITT07022 | |
| di-Sodium hydrogen phosphate heptahydrate | Himedia, Mumbai, India | GRM39611 | |
| Doppler blood flowmeter | Moors instrument, United Kingdom | moorVMS-LDF1 | |
| Egg rack | - | - | |
| Egg rack | - | - | |
| GAPDH | ImmunoTag, USA | M1000110 | |
| GAPDH primers | Applied Biosystems, Foster city, USA | Hs02758991_g1 | |
| Glycine | Himedia, Mumbai, India | MB013 | |
| Kidney tray | HOSPITO | - | |
| LC3A/B | Cell Signaling Technology, USA | 4108S | |
| Methanol | Rankem laboratories, Mumbai, India | M0252 | |
| Micromanipulator | Narishige, Japan | M-152 | |
| N-acetyl-L-cysteine (NAC) | Sigma Aldrich, USA | A7250 | |
| Naringenin | Sigma Aldrich, USA | 67604-48-2 | |
| NF-kβ | Thermo Fisher Scientific, USA | 51-0500 | |
| NLRP3 | ImmunoTag, USA | ITT07438 | |
| Nose plier | Local made, Lucknow, India | - | |
| Ocular forceps | Stoelting, Germany | 52106-40 | |
| Ocular iris | Tufft Surgical Instruments, Jaipur, India | Hard Age Vannas Micro Scissors Angled 8CM / 3 1/8" | |
| OHP marker pen | Camlin, India | - | |
| ORP-150 | ImmunoTag, USA | ITT08329 | |
| Pointed sharp edge scissor | Stoelting, Germany | 52132-11 | |
| Potassium Chloride | Himedia, Mumbai, India | MB043 | |
| Potassium phosphate monobasic anhydrous | Himedia, Mumbai, India | MB050 | |
| Protease Inhibitor | Abcam, United States | Ab65621 | |
| SOD-1 | ImmunoTag, USA | ITT4364 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific, Mumbai, India | 27605 | |
| Sodium dodecyl sulphate | Himedia, Mumbai, India | GRM886 | |
| Spinal needle 25GA; 3.50 IN (90.51 X 90mm) | Ramson, India | GS-2029 | |
| Stereo Zoom surgical microscope | Olympus, Japan | SZ2-STU3 | |
| Syringe discarder | BIOHAZARD | 882210 | |
| Toothed forceps | Stoelting, Germany | 52102-30 | |
| Tris Base | G Biosciences, United States | RC1217 | |
| Tris Hydrochloric Acid | Himedia, Mumbai, India | MB030 | |
| Tween 20 | G Biosciences, United States | RC1227 | |
| White Leghorn Chicken 0-day eggs | - | - | |
| Z-Val-Ala-Asp(OMe)-FMK | MP Biomedicals, LLC, USA | FK009 |
References
- Fauzia, E., et al. Chick Embryo: A Preclinical Model for Understanding Ischemia-Reperfusion Mechanism. Frontiers in Pharmacology. 21 (9), 1034 (2018).
- Eltzschig, H. K., Eckle, T. Ischemia and reperfusion--from mechanism to translation. Nature Medicine. 17 (11), 1391-1401 (2011).
- Raza, S. S., et al. Neuroprotective effect of naringenin is mediated through suppression of NF-κB signaling pathway in experimental stroke. Neuroscience. 29 (230), 157-171 (2013).
- Raza, S. S., et al. Hesperidin ameliorates functional and histological outcome and reduces neuroinflammation in experimental stroke. Brain Research. 28 (1420), 93-105 (2011).
- Raza, S. S., et al. Silymarin protects neurons from oxidative stress associated damages in focal cerebral ischemia: a behavioral, biochemical and immunohistological study in Wistar rats. Journal of the Neurological Sciences. 15 (1-2), 45-54 (2011).
- Fan, L., Zhou, L. AG490 protects cerebral ischemia/reperfusion injury via inhibiting the JAK2/3 signaling pathway. Brain and Behavior. 11 (1), 01911 (2021).
- Wu, M. Y., et al. Current Mechanistic Concepts in Ischemia and Reperfusion Injury. Cellular Physiology and Biochemistry. 46 (4), 1650-1667 (2018).
- Collard, C. D., Gelman, S. Pathophysiology, clinical manifestations, and prevention of ischemia-reperfusion injury. Anesthesiology. 94 (6), 1133-1138 (2001).
- Allen, D. D., et al. Cell lines as in vitro models for drug screening and toxicity studies. Drug Development and Industrial Pharmacy. 31 (8), 757-768 (2005).
- Schmeer, C., Gamez, A., Tausch, S., Witte, O. W., Isenmann, S. Statins modulate heat shock protein expression and enhance retinal ganglion cell survival after transient retinal ischemia/reperfusion in vivo. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 49 (11), 4971-4981 (2008).
- Huang, K. Y., et al. A systematic review and meta-analysis of acupuncture for improving learning and memory ability in animals. BMC Complementary and Alternative Medicine. 16 (1), 297 (2016).
- Sommer, C. J. Ischemic stroke: Experimental models and reality. Acta Neuropathologica. 133 (2), 245-261 (2017).
- Yang, W., Chen, J., Meng, Y., Chen, Z., Yang, J. Novel targets for treating ischemia-reperfusion injury in the liver. International Journal of Molecular Sciences. 19 (5), 1302 (2018).
- Seabra, R., Bhogal, N. In vivo research using early life stage models. In Vivo. 24 (4), 457-462 (2010).
- Liu, H., et al. Adiponectin peptide alleviates oxidative stress and NLRP3 inflammasome activation after cerebral ischemia-reperfusion injury by regulating AMPK/GSK-3beta. Experiments in Neurology. 329, 113302 (2020).
- Aboutaleb, N., Jamali, H., Abolhasani, M., Pazoki Toroudi, H. Lavender oil (Lavandula angustifolia) attenuates renal ischemia/reperfusion injury in rats through suppression of inflammation, oxidative stress and apoptosis. Biomedicine and Pharmacotherapy. 110, 9-19 (2019).
- Wallert, M., et al. alpha-Tocopherol preserves cardiac function by reducing oxidative stress and inflammation in ischemia/reperfusion injury. Redox Biology. 26, 101292 (2019).
- Ashafaq, M., et al. Catechin hydrate ameliorates redox imbalance and limits inflammatory response in focal cerebral ischemia. Neurochemical Research. 37 (8), 1747-1760 (2012).
- Gallagher, S., Chakavarti, D.
- Abt, M. A., Grek, C. L., Ghatnekar, G. S., Yeh, E. S. Evaluation of lung metastasis in mouse mammary tumor models by quantitative real-time PCR. Journal of Visualized Experiments. (107), e53329 (2016).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. Journal of Visualized Experiments. (62), e3923 (2012).
- Wu, Y., et al. Cathelicidin aggravates myocardial ischemia/reperfusion injury via activating TLR4 signaling and P2X(7)R/NLRP3 inflammasome. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 139, 75 (2020).
- Franke, M., et al. The NLRP3 inflammasome drives inflammation in ischemia/reperfusion injury after transient middle cerebral artery occlusion in mice. Brain Behaviour and Immunity. 92, 223 (2021).
- Lawrence, T. The nuclear factor NF-kappaB pathway in inflammation. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 1 (6), 001651 (2009).
- Liu, H., et al. Pterostilbene attenuates astrocytic inflammation and neuronal oxidative injury after ischemia-reperfusion by inhibiting NF-kappaB phosphorylation. Frontiers in Immunology. 10, 2408 (2009).
- Prakash, R., et al. Sivelestat-loaded nanostructured lipid carriers modulate oxidative and inflammatory stress in human dental pulp and mesenchymal stem cells subjected to oxygen-glucose deprivation. Materials Science and Engineering: C Materials for Biological Applications. 120, 111700 (2021).
- Prakash, R., et al. Oxidative stress enhances autophagy in stem cells through Erk1/2 signaling pathway - implications for neurotransplantations. Stem Cell Reviews and Reports. , (2021).
- Ahmad, A., et al. Gelatin-coated polycaprolactone nanoparticle-mediated naringenin delivery rescue human mesenchymal stem cells from oxygen glucose deprivation-induced inflammatory stress. ACS Biomaterials Science and Engineering. 5 (2), 683-695 (2019).
- Guan, X., et al. The neuroprotective effects of carvacrol on ischemia/reperfusion-induced hippocampal neuronal impairment by ferroptosis mitigation. Life Science. 235, 116795 (2019).
- Jin, Z., Guo, P., Li, X., Ke, J., Wang, Y., Wu, H. Neuroprotective effects of irisin against cerebral ischemia/ reperfusion injury via Notch signaling pathway. Biomedicine and Pharmacotherapy. 120, 109452 (2019).
- Wainrach, S., Sotelo, J. R. Electron microscope study of the developing chick embryo heart. Zeitschrift fur Zellforschung und mikroskopische Anatomie. 55, 622-634 (1961).
- Joshi, V. C., Wilson, A. C., Wakil, S. J. Assay for the terminal enzyme of the stearoyl coenzyme A desaturase system using microsomes. Journal of Lipid Research. 18 (1), 32-36 (1977).
- Kain, K. H., et al. The chick embryo as an expanding experimental model for cancer and cardiovascular research. Development Dynamics. 243 (2), 216-228 (2014).
- Mann, R. A., Moore, K. L., Persaud, T. V. N. Limitations in the u~e of the early chick embryo 88 a teratological model. Teratology. 7, 22-23 (1973).
- Chen, T., Vunjak-Novakovic, G. In vitro models of ischemia-reperfusion injury. Regenerative English and Translation Medicine. 4 (3), 142-153 (2018).
- Ma, R., et al. Animal models of cerebral ischemia: A review. Biomedicine and Pharmacotherapy. 131, 110686 (2020).
- Bromage, D. I., et al. Remote ischaemic conditioning reduces infarct size in animal in vivo models of ischaemia-reperfusion injury: a systematic review and meta-analysis. Cardiovascular Research. 113 (3), 288-297 (2017).
- Kalogeris, T., Baines, C. P., Krenz, M., Korthuis, R. J.
- Hogers, B., DeRuiter, M. C., Baasten, A. M., Gittenberger-de Groot , A. C., Poelmann, R. E. Intracardiac blood flow patterns related to the yolk sac circulation of the chick embryo. Circ Res. 76 (5), 871-877 (1995).
- Rezzola, S., et al. angiogenesis-inflammation cross talk in diabetic retinopathy: novel insights from the chick embryo chorioallantoic membrane/human vitreous platform. Frontiers in Immunology. 11, 581288 (2020).
