Summary
Este artículo describe el modelado de isquemia-reperfusión (I / R) en un embrión de pollito de 3 días utilizando un gancho personalizado de aguja espinal para comprender mejor el desarrollo y el tratamiento de I / R. Este modelo es simple, rápido y económico.
Abstract
La isquemia y los trastornos de reperfusión (I / R), como el infarto de miocardio, el accidente cerebrovascular y la enfermedad vascular periférica, son algunas de las principales causas de enfermedad y muerte. Muchos modelos in vitro e in vivo están actualmente disponibles para estudiar el mecanismo I/R en enfermedades o tejidos dañados. Sin embargo, hasta la fecha, no se ha informado de ningún modelo in ovo I/R, lo que permitiría una mejor comprensión de los mecanismos I/R y un cribado farmacológico más rápido. Este artículo describe el modelado de I / R utilizando un gancho personalizado de aguja espinal en un embrión de pollito de 3 días para comprender el desarrollo de I / R y los mecanismos de tratamiento. Nuestro modelo se puede utilizar para investigar anomalías a nivel de ADN, ARN y proteínas. Este método es simple, rápido y económico. El modelo actual se puede utilizar de forma independiente o en conjunto con los modelos I/R in vitro e in vivo existentes.
Introduction
La lesión tisular por isquemia-reperfusión se ha relacionado con una serie de patologías, incluidos ataques cardíacos, accidente cerebrovascular isquémico, traumatismos y enfermedad vascular periférica1,2,3,4,5. Esto se debe principalmente a la falta de una comprensión integral de la progresión de la enfermedad y la falta de un modelo de investigación efectivo. La lesión isquémica ocurre cuando se corta el suministro de sangre a un área específica del tejido. Como resultado, el tejido isquémico eventualmente se necrotiza, aunque la tasa varía según el tejido. Por lo tanto, restaurar el suministro de sangre puede ayudar a mitigar el daño. Sin embargo, se ha observado, en algunos casos, que la reperfusión causa más daño tisular que la isquemia sola6,7,8. Por lo tanto, se requiere comprender los mecanismos moleculares y celulares de la isquemia-reperfusión para desarrollar una intervención terapéutica efectiva. Actualmente, no se conoce un tratamiento efectivo para las lesiones I/R. Esta disparidad ha impulsado la creación de nuevos modelos experimentales, que van desde modelos in vitro hasta modelos in vivo, para abordar el problema existente9,10,11,12,13.
Los embriones de pollito (Gallus gallus domesticus) son ampliamente utilizados en la investigación debido a su facilidad de acceso, aceptabilidad ética, tamaño relativamente grande (en comparación con otros embriones), bajo costo y rápido crecimiento14. Utilizamos un embrión de pollito a las 72 h de desarrollo para crear un in ovo I/R ocluyendo y liberando la arteria vitelina derecha con la ayuda de una aguja espinal. Lo llamamos el modelo hook-I/R isquemia-reperfusión (Figura 1). El modelo utilizado en este estudio es capaz de simular con precisión todos los procesos posteriores, incluidas las vías oxidativas e inflamatorias, que se asocian frecuentemente con el daño I/R15,16,17.
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Protocol
El Comité Institucional de Ética Animal en el Colegio Médico y Hospital Lucknow de Era emitió una exención por escrito que indica que no se requería una aprobación formal para realizar estos experimentos de acuerdo con el Comité para el Propósito de Control y Supervisión de Experimentos en Animales (CPCSEA). Sin embargo, se siguieron los procedimientos operativos estándar para minimizar cualquier potencial de angustia embrionaria.
1. Preparación del tampón (Tabla 1)
- Preparar la solución de Ringer
- Para preparar la solución de Ringer, disuelva 0,72 g de NaCl (123 mM), 0,017 g de CaCl2 (1,53 mM), 0,037 g de KCl (4,96 mM) en 70 mL de H2O destilado estéril, con un volumen final de 100 mL. Ajuste el pH a 7.4. Deja que se disuelva por completo y autoclave. Luego, filtre a través de un filtro de 0.22 μm, alícuota en cantidades de un solo uso (aproximadamente 10 ml) y guárdela a temperatura ambiente.
- Preparar solución salina normal (cloruro de sodio al 0,9%, NaCl).
- En 70 ml de H2O destilado estéril, disolver 0,9 g de NaCl (154 mM). Componga el volumen a 100 ml. Autoclave durante 15 min a 121 °C. Ajuste el pH a 7.4 con 0.1 N HCl o 0.1 N NaOH si es necesario. Haga alícuotas de 10 ml en un tubo de centrífuga estéril de 15 ml y guárdelas a temperatura ambiente.
- Preparar etanol al 70% (v/v).
- Mezclar 70 ml de etanol puro (Mol. wt. 46,07 g/L) a 30 ml de H2O estéril. Preparar según sea necesario o almacenar a temperatura ambiente. No hay necesidad de esterilizar.
- Prepare 1x solución salina tampón de fosfato (1x PBS).
- Preparar 100 mL de 1x PBS añadiendo 0.144 g de Na2HPO4·7H2O (5.37 mM), 0.8 g de NaCl (136.8 mM), 0.2 g de KCl (26.8 mM), 0.2 g de KH2PO4 (14. 6 mM) a 70 mL de agua destilada. Disolver y enrasar el volumen a 100 mL y autoclave durante 15 min a 121 °C. Lleve el pH a 7.4, agregando un par de gotas de 0.1 N HCl o 0.1 N NaOH, si es necesario. Hacer alícuotas de 10 ml en un tubo de centrífuga estéril de 15 ml y almacenar a temperatura ambiente.
2. Día 1
- Organice todas las herramientas necesarias para la esterilización de huevos (etanol al 70%, toallitas de limpieza, un estante para huevos y un marcador OHP).
- Limpie los huevos de 0 días con etanol al 70% usando toallitas de papel de seda. Use solo un óvulo de 0 días, ya que los óvulos más viejos pueden no dar lugar a un embrión.
- Escriba la fecha actual en los huevos con un marcador OHP.
- Coloque los huevos en una incubadora de huevos a una temperatura de 36-37 ° C y un nivel de humedad del 60% -65%. Incubar los huevos durante las próximas 24 h.
3. Día 2
- Organice el equipo necesario para la extracción de 5-6 ml de albúmina (tijeras de borde afilado, jeringa de 5 ml, aguja de 18 G, desechador de jeringas y cinta adhesiva).
- Limpie las tijeras quirúrgicas con etanol al 70% o esterilícelas con un autoclave después de limpiarlas con etanol al 70%.
- Ahora tome el huevo de la incubadora de huevos de 37 ° C para la puesta en capas.
- Coloque el huevo en una rejilla de huevos limpia.
- Coloque un pequeño trozo de cinta adhesiva (tamaño: aproximadamente 1 pulgada de largo x ancho) al borde del huevo.
- Haga un pequeño agujero en el borde de la cáscara del huevo con tijeras de borde puntiagudo. Inserte una jeringa de 5 ml en un ángulo aproximado de 75°.
NOTA: La jeringa de 5 ml viene con una aguja de 24 G x 1 (estéril), pero es bueno reemplazar la aguja de 24 G x 1 con una aguja de 18 G x 1.5 (estéril). La aguja de 18 G x 1,5 mide 1,25 x 38 mm de ancho. Por lo tanto, facilitará la eliminación de la albúmina. - Después de insertar la aguja en el saco vitelino, retire lentamente 5-6 ml de albúmina.
NOTA: Esto proporciona al embrión una cama en la que puede crecer. La extracción de albúmina evita el derrame excesivo de albúmina mientras se establece una ventana. Finalmente, el riesgo de que el embrión se dañe durante las ventanas se mitiga eliminando 5-6 ml de albúmina. - Después de retirar la albúmina, vuelva a sellar la abertura con cinta adhesiva y deje que los huevos se incuben a 37 °C durante 48 h.
4. Día 4
- Prepare la solución de Ringer, solución salina normal al 0,9% y 1 pbS como se describe en la sección 1 del protocolo. Luego, autoclave las tres soluciones. Después del autoclave, coloque la solución respectiva a temperatura ambiente.
- Saque el huevo de la incubadora de huevos a 37 °C y corte la cáscara en forma circular. Antes de cortar la cáscara del huevo, cubra el área a cortar con cinta adhesiva.
NOTA: Cubrir el área de la ventana con cinta adhesiva evita la ruptura de la cáscara del huevo en lugares no deseados. Sin embargo, si irrumpe en un lugar no deseado, selle el área con la cinta adhesiva. Cubrir los lugares a cortar con cinta adhesiva evita que las piezas de concha caigan sobre el saco vitelino. - Cree un pequeño agujero en la cáscara del huevo con una tijera de borde puntiagudo en el lugar donde se desea la ventana y comience a cortar una abertura circular. Este proceso se conoce como ventana.
NOTA: Asegúrese de que el corte circular sea lo suficientemente grande como para permitir un fácil acceso al embrión desde cualquier dirección. Si es necesario, altere la posición del óvulo para acomodar la posición del embrión. - A continuación, utilizando un microscopio quirúrgico con zoom estéreo, localice la arteria vitelina derecha (RVA).
NOTA: Los embriones de pollo normalmente se someten a torsión torácica (junto con flexión cervical, etc.) a medida que se desarrollan, de modo que el lado izquierdo de la cabeza está contra la yema en la etapa de 72 h. Más caudalmente, donde las arterias vitellineales salen del cuerpo, el embrión no está muy retorcido, y esta parte del cuerpo se encuentra del lado ventral hacia abajo hacia la yema. Entonces, viendo directamente, el derecho del embrión está a la derecha del investigador. - Una vez localizado el RVA, cree dos pequeños orificios en los lados izquierdo y derecho del RVA con una aguja de 26 G (Figura 2).
- Coloque la sonda de imágenes de flujo sanguíneo Doppler sobre el RVA. Asegúrese de que la sonda de imágenes de flujo sanguíneo Doppler se coloque a 5 ± 1 mm del sitio de la isquemia y hacia el extremo distal de la RVA. Tome una lectura de flujo durante 2 minutos y 30 s (o más si lo desea). Esta será la lectura de la fase normóxica.
- Mientras tanto, usando un alicate nasal y pinzas dentadas, moldee manualmente el borde de la aguja espinal en forma de gancho (Figura 3). Haga esto doblando el borde de la aguja espinal durante aproximadamente 1 mm. Un tamaño más grande hará que sea más difícil insertar y quitar la aguja espinal durante el procedimiento de I / R.
- Inserte la aguja espinal directamente debajo de la arteria vitellinena derecha con un micromanipulador.
NOTA: Inserte la aguja espinal con extrema precaución para evitar dañar el RVA o cualquier arteria adyacente. La técnica óptima es ajustar el gancho diseñado a medida de la aguja espinal exactamente por encima del lado derecho del orificio RVA, seguido de insertar gradualmente el borde diseñado a medida de la aguja espinal en el saco vitelino con la ayuda de un micromanipulador bajo la guía de un microscopio quirúrgico de zoom estéreo a través del orificio derecho. Una vez que el gancho de la aguja espinal esté en el saco vitelino, ajuste gradualmente el gancho debajo del RVA para que su borde se coloque exactamente debajo del orificio izquierdo. Ahora es el momento de levantar la aguja espinal. - Ahora, con la ayuda del micromanipulador, levante gradualmente la arteria hasta que el flujo sanguíneo Doppler indique una disminución mínima del 80% en el flujo arterial.
- Una vez que se logre una caída del 80% o más en el flujo Doppler, deje la aguja espinal levantada (tirando de la arteria hacia arriba) durante 5 minutos. Este será el período de isquemia en la RVA.
NOTA: Es fundamental controlar el flujo Doppler durante la duración de la isquemia. Si se encuentra una cantidad significativa de fluctuación, finalice las pruebas. - Después del período de isquemia de 5 minutos, libere gradualmente la arteria para restaurar los niveles normales de flujo sanguíneo. Asegúrese de que una lectura del medidor de flujo sanguíneo Doppler muestre valores comparables a los obtenidos durante la normoxia. Este será el período de reperfusión en la RVA (Figura 4).
- Después del procedimiento de I / R, aplique unas gotas (2-3) de 1x PBS al embrión y mírelo durante 2-3 min.
NOTA: El uso de 1x PBS ayuda a evitar que el embrión se seque. - Finalmente, vuelva a sellar la ventana con cinta adhesiva y coloque el huevo de nuevo en la incubadora de huevos durante 5 h y 55 min.
- Después de 5 h y 55 min, saque el huevo de la incubadora de huevos, colóquelo en la rejilla de huevos, vuelva a abrir la ventana y siga el protocolo de tratamiento aguas abajo.
5. Tratamientos
- Para el tratamiento de las arterias con medicamentos, activadores o inhibidores, extirpe la RVA después de 1 h del proceso I / R.
- Para los estudios posteriores, primero retire el embrión de la cáscara del huevo colocándolo en una placa de Petri estéril de 90 mm.
- Una vez que el embrión se libera en la placa de Petri, extirpe el RVA utilizando el iris ocular bajo la guía de un microscopio quirúrgico de zoom estéreo.
- Asegúrese de que la dimensión de escisión de RVA sea de hasta 15 ± 1 mm (distal del tronco), 5 ± 1 mm cada uno en el lado izquierdo y derecho de la arteria, y 2 ± 1 mm hacia el tronco.
NOTA: Se puede utilizar una regla para medir el área a extirpar (opcional). - Después de extirpar el RVA, lávelo con 1x PBS en una placa de Petri estéril que contenga 1x PBS.
- Para los tratamientos deseados, coloque la arteria en un tubo centrífugo de 1,5 ml (esterilizado) lleno de 500 μL de solución de Ringer. Coloque el RVA en el tubo de la centrífuga y colóquelo en una incubadora de 37 °C durante 5 h y 55 min.
NOTA: Dependiendo de los tratamientos, use la solución de Ringer sin ningún tratamiento, o el tratamiento con el volumen y la concentración deseados de medicamento, activador o inhibidor. - Después de 5 h y 55 min de incubación, saque el RVA de la incubadora de laboratorio de 37 ° C y continúe con los tratamientos deseados.
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Representative Results
Se utilizó la técnica Doppler Blood Flow Imaging para evaluar la efectividad de nuestro modelo. En resumen, comparamos los datos del grupo control con los datos del grupo RVA para determinar el éxito de nuestra creación. La Figura 4A representa un flujo típico asociado con el animal de control, mientras que la Figura 4B representa los resultados obtenidos de un RVA. El número 1-8 representa los diversos eventos asociados con las fases I/R. En resumen, los números 1-3 corresponden a la fase de normoxia, mientras que una fuerte disminución en el flujo en los puntos 3 y 4 representa los eventos asociados con la disminución del flujo sanguíneo en la RVA. Una vez que se había logrado un 80% o más de caída, el RVA se dejó elevado durante los siguientes 5 minutos. Esta fue la fase de la isquemia (numérica 4-5). Después de un levantamiento de 5 minutos del RVA, se lanzó el RVA, que está representado por los números 6 y 7. El flujo desde el punto 7 en adelante representa la fase de reperfusión, que ocurre después de que el RVA ha alcanzado niveles normales de flujo sanguíneo, que fue la fase de reperfusión. Este experimento en particular demostró la efectividad del modelado I / R en el embrión de pollito desarrollado de 3 días.
Para verificar la utilidad de nuestro modelo, hemos estudiado los patrones de expresión de proteínas, ARN y ADN a través de ELISA, western blotting, qRT-PCR y análisis de electroforesis en gel. En resumen, dividimos los óvulos desarrollados de 3 días en tres grupos experimentales: control, I / R y Tratamientos + I / R. Se observó una diferencia significativa en la expresión de proteínas, genes e integridad del ADN entre sus respectivos grupos I/R y control. Como se discute a continuación, el tratamiento farmacológico para el grupo I/R mejoró efectivamente el resultado observado en este grupo en comparación con el grupo tratado con I/R solo; esto es consistente con nuestra publicación anterior en la que se basa este protocolo1. Se siguieron procedimientos de laboratorio estándar para ELISA18, western blotting19, qRT-PCR20 y electroforesis en gel21, que no están cubiertos en este documento (Figura 5, Figura 6, Figura 7, Figura 8).
La isquemia-reperfusión estimula varios procesos, incluida la formación de especies reactivas de oxígeno (ROS) que son perjudiciales para los tejidos. Los efectos perjudiciales causados por la respuesta intrínseca de los sistemas de defensa del cuerpo antioxidante a las ROS es una característica importante de la lesión I / R. Examinamos las actividades de las proteínas reguladoras de oxígeno 150 (ORP150), la superóxido dismutasa citoplasmática 1 (SOD1) y la catalasa en los vasos isquémicos. En comparación con el grupo control, I/R elevó la actividad de ORP150, SOD1 citoplasmático y catalasa (Figura 5A-C). Sin embargo, la suplementación con N-acetil-L-cisteína (NAC), un calmante ROS, mitigó el estrés oxidativo del grupo I/R.
Para evaluar el potencial inflamatorio de nuestro modelo, utilizamos ELISA para examinar la expresión de IL-1β y TNF-α (Figura 6). Ambas interleucinas se sobreexpresaron en el grupo I/R en comparación con el grupo control, lo que indica que nuestro modelo tiene el potencial de ser utilizado en investigaciones inflamatorias. A continuación, probamos la expresión de la vía inflamasómica que contiene la proteína 3 (NLRP3) que contiene el dominio de piraína similar al NOD22,23 y la molécula proinflamatoria, NF-kβ24,25, que están involucradas en la amplificación de la inflamación, para confirmar la utilidad de este modelo para estudios inflamatorios. En respuesta a la I/R generada en la RVA, esta investigación encontró evidencia de activación del inflamasoma NLRP3 (Figura 7A), así como NF-kβ (Figura 7B). Sin embargo, el tratamiento con Naringenina, un fármaco antiinflamatorio bien conocido, mejoró los efectos inflamatorios, como se observó en los grupos tratados con fármacos.
La isquemia-reperfusión activa las vías programadas de muerte celular26,27,28. Estudiamos los efectos de la I/R sobre las vías de apoptosis y autofagia en el embrión de pollito. La Figura 8A muestra el efecto de I/R en caspasa-3 y zVAD-fmk. La Figura 8B-D demuestra que el grupo I/R tuvo una mayor expresión de LC3II, así como de la relación LC3II/I (marcador de autofagosomas), Beclin1 (un regulador significativo de la autofagia en células de mamíferos) y Atg7 (necesario para la autofagia basal) que el grupo de control, respectivamente, a niveles de proteínas. Por el contrario, la Figura 8E muestra el efecto de la I/R sobre los niveles de ARNm. Sin embargo, la adición de 3-MA, un inhibidor de la autofagia, revirtió los resultados. Estos hallazgos sugieren que el modelo podría usarse para investigar diferentes procesos de muerte celular (por ejemplo, necroptosis). La Figura 9 muestra la eficiencia con la que se pueden estudiar los cambios a nivel de ADN utilizando nuestro modelo Hook-I/R.
Finalmente, comparamos los resultados del modelo Hook-I/R y el modelo de oclusión de la arteria cerebral media (MCAO) para ver qué tan efectivo es nuestro modelo en comparación con otros modelos. Para resumir, los RVA tratados con I/R tenían niveles más altos de la proteína apoptótica caspasa-3 escindida, las proteínas de autofagia Beclin1 y Atg7, y las interleucinas inflamatorias TNF-α e IFN-Ƴ que los RVA de control. Curiosamente, ya sea analizando el estrés inflamatorio o las vías de muerte celular, el modelo Hook-I / R produjo resultados que fueron extremadamente similares a los obtenidos por el modelo MCAO (Figura 10).
Figura 1: Diagrama esquemático de una configuración típica del modelo de isquemia-reperfusión del embrión de pollito Hook-I/R. La imagen muestra los requisitos de experimentación de isquemia-reperfusión del embrión de pollito Hook-I / R, como el microscopio quirúrgico de zoom estéreo, el medidor de flujo sanguíneo Doppler láser, el micromanipulador, la aguja espinal, los embriones de pollitos desarrollados de 72 h y una fuente de iluminación ". Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Imagen representativa de un sitio de oclusión y área de escisión de embriones de pollitos de 3 días. (A) El triángulo muestra la ubicación de la escisión del tejido para el blotting occidental, el ARN y el aislamiento de ADN. La estrella y los puntos representan el sitio de la oclusión y los orificios creados en el lado izquierdo y derecho del RVA para insertar la aguja debajo de la arteria para levantarla, respectivamente. También se proporciona una imagen ampliada del área de extracción de tejido junto con ella. La notación A representa el ojo, B representa el corazón, C representa la izquierda de la arteria vitelina y C' representa la derecha de la arteria vitelina. (B) Una representación esquemática del lado derecho del embrión de pollito demuestra el área de escisión tisular en las cercanías de RVA. La línea recta representa el RVA que emerge del tronco embrionario. La estrella en la línea vertical simboliza la posición de la sonda de flujo sanguíneo Laser Doppler. La intersección denota el sitio de oclusión. La escisión de las arterias se realizó hasta 15 ± 1 mm (distal del tronco), 5 ± 1 mm cada una en el lado izquierdo y derecho de la arteria, y 2 ± 1 mm hacia el tronco. Todas las mediciones muestran distancias desde el sitio de oclusión. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Imagen representativa de una aguja espinal con un gancho hecho a medida. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Representación de una señal típica del medidor de flujo sanguíneo Doppler láser. Se midió una señal típica del medidor de flujo sanguíneo Doppler láser en una arteria embrionaria de pollito de 3 días de un óvulo del grupo de control (A). Eventos al inicio (1), durante la normoxia (2), pre-levantamiento inmediato de RVA (3), post-lifting inmediato de RVA (4), durante isquemia (5), pre-liberación inmediata de RVA (6), post-reperfusión inmediata (7), durante la reperfusión (8) en el grupo tratado con isquemia según lo registrado por el medidor de flujo sanguíneo Laser Doppler (B). Esta cifra fue adoptada de Fauzia et al., 2018 (Frontiers in Pharmacology; bajo una licencia CC-BY)1. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Efecto de la isquemia-reperfusión sobre la expresión de proteínas marcadoras de estrés oxidativo. Se utilizó Western blotting para determinar los niveles de expresión de ORP150, SOD1 y catalasa. (A) La expresión de ORP150 aumentó después del daño I/R. NAC, un inhibidor de pan-ROS, redujo ORP150 a un nivel comparable al de control. (B) Después de I/R, la expresión de SOD1 fue elevada. La expresión de SOD1 también disminuyó después del tratamiento con NAC. (C) El evento I/R indujo la expresión de catalasa. RVA tratada con I/R y expuesta a NAC mostró una disminución en los niveles de catalasa. GAPDH (A,C) y β-Actina (B) se utilizaron como controles internos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Estimación de IL-1β y TNF-α utilizando ELISA. ELISA se utilizó para cuantificar la il-1β y el TNF-α, y los resultados revelaron que hubo un aumento en la expresión de IL-1β y TNF-α, que fue mitigado por la adición de naringenina. Para este estudio, se aplicó el ANOVA seguido de la prueba de Newman-Keuls. Las barras de error representan la media ± SD, n = 3. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7: Efecto de la isquemia-reperfusión sobre la expresión de proteínas marcadoras de inflamación. (A) El tratamiento I/R dio lugar a un aumento de la expresión de NLRP3. La incubación de RVA tratada con I/R con Naringenina disminuyó la expresión de NLRP3. (B) Similar a NLRP3, la expresión de NF-kβ también aumentó después del tratamiento I/R. El tratamiento de Naringenina redujo la expresión de NF-kβ. GAPDH se utilizó como control interno. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 8: Efecto de la isquemia-reperfusión sobre el estado apoptótico y autofágico de las células RVA. (A) Para explorar la inducción de la apoptosis por el proceso I/R, se evaluó la expresión de caspasa 3 escindida mediante western blotting. Después del daño I/R, se aumentó el nivel de caspasa 3 escindida. Sin embargo, el tratamiento con zVAD-fmk, un inhibidor de la apoptosis, disminuyó la expresión de caspasa 3 escindida. (B-D) Para evaluar la inducción de la autofagia después de I/R, se determinó la expresión de LC3II/I, Beclin1 y Atg7. Después de I/R, la expresión de todos los marcadores autofágicos aumentó, mientras que la exposición de RVA tratada con I/R al inhibidor de la autofagia 3-MA disminuyó la expresión de todas las proteínas a niveles de control. Como control interno, se utilizó GAPDH. (E) se utilizó qRT-PCR para confirmar la inducción de la autofagia y determinar los niveles de expresión de ARNm Ambra1 y Atg7. Ambos genes mostraron un aumento considerable en la expresión en el grupo I /R en comparación con el control, que se restauró a niveles casi normales después de la terapia NAC. GAPDH se utilizó como control interno para experimentos de qRT-PCR. Para el experimento (E), se aplicó el ANOVA, seguido de la prueba de Newman-Keuls. Las barras de error representan la media ± SD, n = 3. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 9: Efecto de la isquemia-reperfusión sobre el daño al ADN. Para determinar si I/R induce cortes de ADN, examinamos el daño al ADN mediante electroforesis en gel. I/R resultó en la degradación genómica del ADN, como se muestra al untar en la muestra de I/R. La terapia NAC de RVA dañada por I / R redujo el daño al ADN. Se empleó una escalera de ADN de 1 kb. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 10: Comparación del modelo Hook-I/R vs. el modelo MCAO. Se realizó una comparación entre los datos generados por el modelo Hook-I/R y los datos generados por el modelo MCAO. (A) La expresión de la proteína apoptótica caspasa-3 y las proteínas de autofagia Beclin1 y Atg7 fue mayor en los RVA tratados con I/R en comparación con la expresión de las mismas proteínas en los RVAs de control, lo que estuvo de acuerdo con los hallazgos obtenidos en los experimentos mcAO. (B) Se encontró que los niveles de TNF-α e IFN-Ƴ estaban elevados en los grupos RVA y MCAO en comparación con sus respectivos controles. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Nombre del material/equipo | Concentración | Autoclave | Almacenamiento | ||
| Reactivos para la solución de Ringer | |||||
| Cloruro de sodio | 123 metros | ||||
| Cloruro de potasio | 4,96 mM | ||||
| Cloruro de calcio | 1,53 mM | ||||
| Agua destilada estéril | 100 ml | ||||
| pH | 7.4 | 15 min a 121 °C | R.T. | ||
| Reactivos para solución salina normal al 0,9% | |||||
| Cloruro de sodio | 154mM | ||||
| Agua destilada estéril | 100 ml | ||||
| pH | 7.4 | 15 min a 121 °C | R.T. | ||
| Reactivos para etanol al 70% | |||||
| 70% etanol | 70 ml | ||||
| Agua destilada estéril | 30 ml | No es necesario | R.T. | ||
| Reactivos para 1x Phosphate Buffer Saline | |||||
| Cloruro de sodio | 136,8 millones de metros | ||||
| Cloruro de potasio | 26,8 millones de metros | ||||
| Fosfato de potasio monobásico anhidro | 14,6 mM | ||||
| di-Fosfato de hidrógeno di-Sodio heptahidratado | 5,37 mM | ||||
| Agua destilada estéril | 100 ml | 15 min a 121 °C | R.T. | ||
Tabla 1: Receta de soluciones utilizadas en este estudio.
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Discussion
El objetivo de la investigación de isquemia-reperfusión es crear estrategias terapéuticas que prevengan la muerte celular y promuevan la recuperación29,30. Para superar las limitaciones actuales en la investigación de I / R, diseñamos un modelo de embrión de pollito Hook I / R para producir un modelo I / R confiable y reproducible. Hasta donde sabemos, el nuestro es el primer modelo de I / R jamás creado en un embrión de pollito de 3 días para experimentos de rutina de I / R, además de estudiar las señales de estrés (por ejemplo, estrés oxidativo e inflamatorio). Dados los beneficios de tamaño y accesibilidad en el día 3 del desarrollo31, el embrión de pollito se utilizó en una etapa de desarrollo de 72 h, debido a la alta producción del modelo, la simplicidad de emplear y la adaptabilidad para el análisis de rutina32. En resumen, en el día de desarrollo 3, el pollito in ovo es un modelo altamente controlado, pero accesible y razonablemente transparente dentro del huevo que se puede usar para visualizar la fisiología normal, la patología de la enfermedad y los efectos del tratamiento experimental. Su enorme tamaño lo hace particularmente útil para estudiar la formación y el comportamiento del embrión durante la fisiología normal, así como el estrés33. Aunque se pueden emplear embriones de pollitos más viejos (aquellos incubados durante 4 días o más), y probamos un punto de tiempo posterior, el uso de embriones más viejos como sistemas modelo está severamente limitado por el hecho de que el saco vitelino crece tan grueso más allá de los 3 días de desarrollo que los procedimientos quirúrgicos son difíciles. Cabe mencionar que, si bien el RVA no está completamente formado en una ventana de tiempo temprana (por ejemplo, en el día 1 o 2), las ventanas podrían conducir a la teratogenicidad34. Además de las limitaciones asociadas a un punto temporal de desarrollo temprano o tardío, un embrión de pollito de 72 h sirve como modelo ideal para investigar el proceso I/R ya que los embriones de pollito de 3 días tienen un sistema circulatorio bien definido30.
Comprender la fisiopatología de la lesión I / R es un objetivo importante del diseño de un modelo I / R. Actualmente, no existe ninguna terapéutica clínicamente útil para reducir el daño por isquemia-reperfusión1,35. Como resultado, se ha propuesto una amplia gama de modelos in vitro e in vivo. En este contexto, se propuso por primera vez el modelado I/R en un embrión de pollito en desarrollo de 3 días en ovo. Investigaciones anteriores han demostrado que la oclusión-reperfusión del flujo sanguíneo arterial provoca alteraciones patológicas en modelos experimentales similares a las observadas en humanos36,37,38, por lo que teníamos la esperanza de que nuestro modelo hiciera lo mismo (como el estrés oxidativo e inflamatorio observado en modelos in vivo o en pacientes). Con los hallazgos de nuestro estudio, se demostró que la hipótesis anterior era correcta.
La circulación de la sangre de los embriones al saco vitelino está controlada por los vasos vitelinos en embriones de pollitos39. Los embriones obtienen nutrientes de la yema y difunden oxígeno del aire a través de la circulación vitelina; por lo tanto, restringiendo cualquiera de los vasos vitelinos que pueden interrumpir la nutrición y la transferencia de oxígeno. Sobre la base de estos hechos, la isquemia se indujo al ocluir el suministro de sangre a la RVA durante 5 min, seguido de la reperfusión durante 5 h y 55 min adicionales. El modelo propuesto se puede utilizar para examinar una variedad de diversos procesos de enfermedad asociados con I / R y probar una variedad de medicamentos y sus objetivos. El modelo actual se puede utilizar para examinar los cambios en el ADN, el ARN y las proteínas. Tiene el potencial de dar un alto rendimiento. Además de su simplicidad y adaptabilidad para el análisis regular, el modelo también puede investigar el alojamiento de células madre a corto plazo, que se investigará en estudios futuros.
En comparación con los modelos in vitro , nuestro modelo es fácil de usar, rentable y crece rápidamente, además de ser éticamente inocente32. La presencia de microvasculatura, el sistema inmunitario y las evaluaciones fisiológicas son beneficios sobre los modelos in vitro , mientras que el bajo costo, la eficacia en el tiempo y la ausencia de problemas éticos son ventajas sobre los modelos in vivo40. Las ventajas anteriores indican que nuestro modelo tiene un efecto comparable a los otros modelos de I/R actualmente en uso (Figura 10). Una posible deficiencia es la incapacidad del modelo actual para cuantificar el área de infarto. La evaluación directa del infarto puede ser un biomarcador valioso para el daño mediado por I / R y un método para mapear los efectos de varios medicamentos de terapia. Por lo tanto, buscamos cuantificar el área de infarto pero no pudimos hacerlo debido a la delicada estructura de los pollitos desarrollados en 72 h. Por lo tanto, se requiere investigación adicional para evaluar las estrategias y vías para los procesos de I / R de manera integral.
Para resumir, el modelo actual se puede utilizar para investigar varias vías de enfermedad relacionadas con I / R y detectar una variedad de medicamentos y sus objetivos. Debido a su alta reproducibilidad, rentabilidad y simplicidad, anticipamos que nuestro modelo será un recurso valioso para la ciencia básica y la investigación traslacional.
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Disclosures
Los autores no declaran intereses contrapuestos.
Acknowledgments
Queremos expresar nuestro agradecimiento a Hari Shankar por sus aportes críticos durante la videografía y la edición, al Sr. Baqer Hussain por la voz en off, al Sr. Asghar Rizvi por la edición de video, al Sr. Mohammad Haider por las grabaciones de video, al Sr. Mohammad Danish Siddiqui por la asistencia durante los experimentos.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (-80°C) freezer | Haier, China | - | |
| 1.5mL Centrifuge tube | TARSONS, India | 500010X | |
| 100mm Petri dish (sterile) | Tarsons, India | 460050 | |
| 18G Needle (18G×1.5 (1.25×38mm) | Ramsons, India | 13990 | |
| 1mL Syringe | DISPO VAN | - | |
| 26G Needle (26G×1/2 (10.45x13mm) | DISPO VAN, india | 30722D | |
| 37°C egg incubator with adjustable percentage humidity | Gentek, India | GL-100 | |
| 37°C laboratory incubator | SCIENCE TECH, India | CB 101-14 | |
| 3-Methyladenine (3-MA) | Sigma Aldrich, USA | M9281 | |
| 3mL Pasture Pipette | TARSONS, India | 940050 | |
| 50mL Beaker | TARSONS, India | - | |
| 5mL Syringe | DISPO VAN, India | IP53 | |
| 70% ethanol | Merck Millipore, United States | 64-17-5 | |
| Adhesive tape/Cello tape | Sunrise, India | - | |
| Ambra1 primers | Applied Biosystems, Foster city, USA | Hs00387943_m1 | |
| Anti-mouse IgG | Cell Signaling Technology, USA | 7076S | |
| Anti-Rabbit IgG | Jackson Immuno Research Laboratories, USA | 711-035-152 | |
| Atg7 | R&D Systems, USA | MAB6608 | |
| Atg7 primers | Applied Biosystems, Foster city, USA | Hs00893766_m1 | |
| Autoclave Bag | Tarsons, India | 550022 | |
| Autoclave Machine | Local made, Lucknow, India | - | |
| Beclin-1 | Proteintech, USA | 66665-1-Ig | |
| Beta Actin | ImmunoTag, USA | ITT07018 | |
| Bovine Serum Albumin | Himedia, Mumbai, India | TC194 | |
| Calcium Chloride | Himedia, Mumbai, India | GRM534 | |
| Catalase | ImmunoTag, USA | ITT5155 | |
| Cleaning wipes | Kimberly-Clark, India | 370080 | |
| Cleaved Caspase3 | ImmunoTag, USA | ITT07022 | |
| di-Sodium hydrogen phosphate heptahydrate | Himedia, Mumbai, India | GRM39611 | |
| Doppler blood flowmeter | Moors instrument, United Kingdom | moorVMS-LDF1 | |
| Egg rack | - | - | |
| Egg rack | - | - | |
| GAPDH | ImmunoTag, USA | M1000110 | |
| GAPDH primers | Applied Biosystems, Foster city, USA | Hs02758991_g1 | |
| Glycine | Himedia, Mumbai, India | MB013 | |
| Kidney tray | HOSPITO | - | |
| LC3A/B | Cell Signaling Technology, USA | 4108S | |
| Methanol | Rankem laboratories, Mumbai, India | M0252 | |
| Micromanipulator | Narishige, Japan | M-152 | |
| N-acetyl-L-cysteine (NAC) | Sigma Aldrich, USA | A7250 | |
| Naringenin | Sigma Aldrich, USA | 67604-48-2 | |
| NF-kβ | Thermo Fisher Scientific, USA | 51-0500 | |
| NLRP3 | ImmunoTag, USA | ITT07438 | |
| Nose plier | Local made, Lucknow, India | - | |
| Ocular forceps | Stoelting, Germany | 52106-40 | |
| Ocular iris | Tufft Surgical Instruments, Jaipur, India | Hard Age Vannas Micro Scissors Angled 8CM / 3 1/8" | |
| OHP marker pen | Camlin, India | - | |
| ORP-150 | ImmunoTag, USA | ITT08329 | |
| Pointed sharp edge scissor | Stoelting, Germany | 52132-11 | |
| Potassium Chloride | Himedia, Mumbai, India | MB043 | |
| Potassium phosphate monobasic anhydrous | Himedia, Mumbai, India | MB050 | |
| Protease Inhibitor | Abcam, United States | Ab65621 | |
| SOD-1 | ImmunoTag, USA | ITT4364 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific, Mumbai, India | 27605 | |
| Sodium dodecyl sulphate | Himedia, Mumbai, India | GRM886 | |
| Spinal needle 25GA; 3.50 IN (90.51 X 90mm) | Ramson, India | GS-2029 | |
| Stereo Zoom surgical microscope | Olympus, Japan | SZ2-STU3 | |
| Syringe discarder | BIOHAZARD | 882210 | |
| Toothed forceps | Stoelting, Germany | 52102-30 | |
| Tris Base | G Biosciences, United States | RC1217 | |
| Tris Hydrochloric Acid | Himedia, Mumbai, India | MB030 | |
| Tween 20 | G Biosciences, United States | RC1227 | |
| White Leghorn Chicken 0-day eggs | - | - | |
| Z-Val-Ala-Asp(OMe)-FMK | MP Biomedicals, LLC, USA | FK009 |
References
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