Summary
Este artigo descreve a modelagem isquemia-reperfusão (I/R) em um embrião de 3 dias usando um gancho personalizado de agulha espinhal para entender melhor o desenvolvimento e o tratamento da I/R. Este modelo é simples, rápido e barato.
Abstract
Distúrbios de isquemia e reperfusão (I/R), como infarto do miocárdio, acidente vascular cerebral e doença vascular periférica, são algumas das principais causas de doença e morte. Muitos modelos in vitro e in vivo estão atualmente disponíveis para estudar o mecanismo de I/R em doenças ou tecidos danificados. No entanto, até o momento, nenhum modelo de I/R de ovo foi relatado, o que permitiria uma melhor compreensão dos mecanismos de I/R e uma triagem mais rápida de medicamentos. Este artigo descreve a modelagem de I/R usando um gancho personalizado de agulha espinhal em um embrião de 3 dias para entender os mecanismos de desenvolvimento e tratamento de I/R. Nosso modelo pode ser usado para investigar anomalias nos níveis de DNA, RNA e proteína. Este método é simples, rápido e barato. O modelo atual pode ser usado de forma independente ou em conjunto com os modelos in vitro e in vivo I/R existentes.
Introduction
A lesão tecidual isquemia-reperfusão tem sido associada a uma série de patologias, incluindo ataques cardíacos, acidente vascular cerebral isquêmico, trauma e doença vascular periférica1,2,3,4,5. Isso se deve principalmente à falta de uma compreensão abrangente da progressão da doença e à falta de um modelo de pesquisa eficaz. A lesão isquêmica ocorre quando o suprimento de sangue para uma área específica do tecido é cortado. Como resultado, o tecido isquêmico eventualmente necrosa, embora a taxa varie dependendo do tecido. Assim, restaurar o suprimento de sangue pode ajudar a mitigar os danos. No entanto, tem sido observado, em alguns casos, que a reperfusão causa mais danos teciduais do que a isquemia sozinha faz 6,7,8. Portanto, a compreensão dos mecanismos moleculares e celulares da isquemia-reperfusão é necessária para desenvolver uma intervenção terapêutica eficaz. Atualmente, não se sabe nenhum tratamento eficaz para lesões de I/R. Essa disparidade levou à criação de novos modelos experimentais, que vão desde modelos in vitro até in vivo, para resolver o problema existente9,10,11,12,13.
Os embriões de filhotes (Gallus gallus domesticus) são amplamente utilizados em pesquisas devido à sua facilidade de acesso, aceitabilidade ética, tamanho relativamente grande (em comparação com outros embriões), baixo custo e rápido crescimento14. Utilizamos um embrião de pintinho a 72 h de desenvolvimento para criar um em ovo I/R octurando e liberando a artéria vitelline direita com a ajuda de uma agulha espinhal. Nós o chamamos de modelo de isperfusão de isquemia de Gancho-I/R (Figura 1). O modelo utilizado neste estudo é capaz de simular com precisão todos os processos a jusante, incluindo vias oxidativas e inflamatórias, frequentemente associadas a danos de I/R15,16,17.
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Protocol
O Comitê de Ética Animal Institucional da Era's Lucknow Medical College and Hospital emitiu uma renúncia por escrito afirmando que nenhuma aprovação formal foi necessária para realizar esses experimentos de acordo com o Comitê para fins de controle e supervisão de experimentos em animais (CPCSEA). No entanto, foram seguidos procedimentos operacionais padrão para minimizar qualquer potencial de sofrimento embrionário.
1. Preparação do buffer (Tabela 1)
- Preparar a solução de Ringer
- Para preparar a solução de Ringer, dissolva 0,72 g de NaCl (123 mM), 0,017 g de CaCl2 (1,53 mM), 0,037 g de KCl (4,96 mM) em 70 mL de H2O destilado estéril, com um volume final de 100 mL. Ajuste o pH para 7,4. Deixe-o dissolver completamente e autoclave. Em seguida, filtrar através de um filtro de 0,22 μm, aliquotar em quantidades de uso único (cerca de 10 mL) e armazenar à temperatura ambiente.
- Prepare solução salina normal (0,9% cloreto de sódio, NaCl).
- Em 70 mL de H2O destilado estéril, dissolva 0,9 g de NaCl (154 mM). Coma o volume até 100 mL. Autoclave por 15 min a 121 °C. Ajuste o pH para 7,4 com 0,1 N HCl ou 0,1 N NaOH, se necessário. Faça alíquotas de 10 mL em um tubo de centrífuga estéril de 15 mL e armazene à temperatura ambiente.
- Prepare 70% de etanol (v/v).
- Misture 70 mL de etanol puro (Mol. wt. 46,07 g/L) a 30 mL de H2O estéril. Prepare conforme necessário ou armazene em temperatura ambiente. Não há necessidade de esterilização.
- Prepare 1x Salina tampão fosfato (1x PBS).
- Prepare 100 mL de 1x PBS adicionando 0,144 g de Na2HPO4·7H2O (5,37 mM), 0,8 g de NaCl (136,8 mM), 0,2 g de KCl (26,8 mM), 0,2 g de KH2PO4 (14). 6 mM) a 70 mL de água destilada. Dissolva e coma o volume até 100 mL e autoclave por 15 min a 121 °C. Leve o pH para 7.4, adicionando um par de gotas de 0,1 N HCl ou 0,1 N NaOH, se necessário. Faça alíquotas de 10 mL em um tubo de centrífuga estéril de 15 mL e armazene à temperatura ambiente.
2. Dia 1
- Disponha todas as ferramentas necessárias para a esterilização de ovos (70% de etanol, lenços de limpeza, um rack de ovos e um marcador OHP).
- Limpe os ovos de 0 dia com 70% de etanol usando lenços de papel de tecido. Use apenas um ovo de 0 dias, pois ovos mais velhos podem não dar origem a um embrião.
- Escreva a data atual em ovos com um marcador OHP.
- Coloque os ovos em uma incubadora de ovos a uma temperatura de 36-37 °C e um nível de umidade de 60%-65%. Incubar os ovos para as próximas 24 horas.
3. Dia 2
- Providencie os equipamentos necessários para a retirada de 5-6 mL de albumina (tesoura de borda afiada, seringa de 5 mL, agulha de 18 G, descartador de seringa e fita adesiva).
- Limpe a tesoura cirúrgica com 70% de etanol ou esterilize usando uma autoclave depois de limpá-las com 70% de etanol.
- Agora leve o ovo da incubadora de ovos de 37 °C para camadas.
- Coloque o ovo em uma prateleira de ovos limpa.
- Conecte um pequeno pedaço de fita adesiva (tamanho: cerca de 1 polegada de comprimento x largura) à borda do ovo.
- Faça um pequeno furo na borda da casca de ovo usando uma tesoura de borda afiada. Insira uma seringa de 5 mL em um ângulo aproximado de 75°.
NOTA: A seringa de 5 mL vem com uma agulha de 24 G x 1 (estéril), mas é bom substituir a agulha de 24 G x 1 por uma agulha de 18 G x 1,5 (estéril). A agulha de 18 G x 1,5 tem 1,25 x 38 mm de largura. Portanto, facilitará a remoção do albumina. - Depois de inserir a agulha no saco de gema, retire lentamente 5-6 mL de albumina.
NOTA: Isso fornece ao embrião uma cama na qual ele pode crescer. Retirar o albumina evita o excesso de albumina enquanto estabelece uma janela. Finalmente, o risco do embrião ser danificado durante a janela é mitigado eliminando 5-6 mL de albumina. - Depois de remover a albumina, resseque a abertura com fita adesiva e deixe os ovos incubados a 37 °C por 48 h.
4. Dia 4
- Prepare a solução do Ringer, salina 0,9% normal e 1x PBS conforme descrito na seção 1 do protocolo. Então, autoclave as três soluções. Após o autoclavamento, coloque a respectiva solução em temperatura ambiente.
- Retire o ovo da incubadora de ovos de 37 °C e corte a casca em uma forma circular. Antes de cortar a casca de ovo, cubra a área a ser cortada com fita adesiva.
NOTA: Cobrir a área da janela com fita adesiva impede a quebra da casca de ovo em lugares indesejados. No entanto, se você invadir um lugar indesejado, sele a área com a fita adesiva. Cobrir os lugares a serem cortados com fita adesiva evita que pedaços de concha caiam sobre o saco de gema. - Crie um pequeno buraco na casca de ovo com uma tesoura de borda afiada no local onde a janela é desejada e comece a cortar uma abertura circular. Esse processo é conhecido como janela.
NOTA: Certifique-se de que o corte circular é grande o suficiente para permitir fácil acesso ao embrião de qualquer direção. Se necessário, altere a posição do ovo para acomodar a posição do embrião. - Em seguida, usando um microscópio cirúrgico de zoom estéreo, localize a artéria vitelline direita (RVA).
NOTA: Os embriões de frango normalmente sofrem torção torácica (juntamente com flexure cervical, etc.) à medida que se desenvolvem, de tal forma que o lado esquerdo da cabeça esteja contra a gema na fase de 72h. Mais caudally, onde as artérias vitelline saem do corpo, o embrião não é muito torcido, e esta parte do corpo fica ventral lado para baixo em direção à gema. Então, vendo diretamente, o direito do embrião é à direita do pesquisador. - Uma vez que o RVA esteja localizado, crie dois pequenos orifícios nos lados esquerdo e direito do RVA usando uma agulha de 26 G (Figura 2).
- Coloque a sonda de imagem de fluxo sanguíneo Doppler acima da RVA. Certifique-se de que a sonda de imagem de fluxo sanguíneo Doppler seja colocada a 5 ± 1 mm do local da isquemia e em direção à extremidade distal da RVA. Faça uma leitura de fluxo por 2 minutos e 30 s (ou mais se desejar). Esta será a leitura de fase normoxic.
- Enquanto isso, usando um plier de nariz e fórceps dentados, molde manualmente a borda da agulha espinhal na forma de um gancho (Figura 3). Faça isso dobrando a borda da agulha espinhal por aproximadamente 1 mm. Um tamanho maior tornará mais difícil inserir e remover a agulha espinhal durante o procedimento de I/R.
- Insira a agulha espinhal diretamente abaixo da artéria vitelline direita usando um micromanipulador.
NOTA: Insira a agulha espinhal com extrema cautela para evitar danificar o RVA ou quaisquer artérias adjacentes. A técnica ideal é ajustar o gancho personalizado da agulha espinhal exatamente acima do lado direito do orifício RVA, seguido de inserir gradualmente a borda personalizada da agulha espinhal no saco de gema com a ajuda de um micromanipulador sob a orientação de um microscópio cirúrgico de zoom estéreo através do orifício direito. Uma vez que o gancho da agulha espinhal esteja no saco da gema, ajuste gradualmente o gancho sob o RVA de modo que sua borda seja exatamente colocada sob o orifício esquerdo. Agora é a hora de levantar a agulha espinhal. - Agora, com a ajuda do micromanipulador, eleva gradualmente a artéria até que o fluxo sanguíneo Doppler indique uma diminuição mínima de 80% no fluxo arterial.
- Uma vez que uma queda de 80% ou mais no fluxo Doppler seja alcançada, deixe a agulha espinhal levantada (puxando a artéria para cima) por 5 minutos. Este será o período de isquemia na RVA.
NOTA: É fundamental monitorar o fluxo Doppler durante a duração da isquemia. Se for encontrada uma quantidade significativa de flutuação, encerre os testes. - Após o período de isquemia de 5 minutos, libera gradualmente a artéria para restaurar os níveis normais de fluxo sanguíneo. Certifique-se de que uma leitura do medidor de fluxo sanguíneo Doppler exiba valores comparáveis aos obtidos durante a normoxia. Este será o período de reperfusão na RVA (Figura 4).
- Após o procedimento de I/R, aplique algumas gotas (2-3) de 1x PBS no embrião e observe-o por 2-3 min.
NOTA: O uso de 1x PBS ajuda a evitar que o embrião seque. - Por fim, reseealar a janela com fita adesiva e coloque o ovo de volta na incubadora de ovos por 5h e 55 min.
- Depois de 5h e 55 min, retire o ovo da incubadora de ovos, coloque-o no rack de ovos, reabra a janela e siga o protocolo de tratamento a jusante.
5. Tratamentos
- Para o tratamento das artérias com drogas, ativadores ou inibidores, extir essa pena a RVA após 1h do processo de I/R.
- Para os estudos a jusante, primeiro remova o embrião da casca de ovo colocando-o em uma placa de Petri estéril de 90 mm.
- Uma vez que o embrião é liberado na placa de Petri, extireta o RVA usando a íris ocular sob a orientação de um microscópio cirúrgico de zoom estéreo.
- Certifique-se de que a dimensão de excisão de RVA é de até 15 ± 1 mm (distal do tronco), 5 ± 1 mm cada no lado esquerdo e direito da artéria e 2 ± 1 mm em direção ao tronco.
NOTA: Uma régua pode ser utilizada para medir a área a ser extirpada (opcional). - Depois de excisar o RVA, lave-o com 1x PBS em uma placa de Petri estéril contendo 1x PBS.
- Para os tratamentos desejados, coloque a artéria em um tubo de centrífuga de 1,5 mL (esterilizado) preenchido com 500 μL da solução de Ringer. Coloque o RVA no tubo de centrífuga e coloque-o em uma incubadora de 37 °C por 5h e 55 min.
NOTA: Dependendo dos tratamentos, use a solução do Ringer sem qualquer tratamento, ou tratamento com o volume e concentração desejados de droga, ativador ou inibidor. - Após 5h e 55 min de incubação, retire a RVA da incubadora laboratorial de 37 °C e prossiga com os tratamentos desejados.
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Representative Results
A técnica do Doppler Blood Flow Imaging foi utilizada para avaliar a eficácia do nosso modelo. Em suma, comparamos os dados do grupo controle com os dados do grupo RVA para determinar o sucesso de nossa criação. A Figura 4A retrata um fluxo típico associado ao animal de controle, enquanto a Figura 4B retrata os resultados obtidos de um RVA. O 1-8 numérico representa os diversos eventos associados às fases de I/R. Resumindo, o 1-3 numérico corresponde à fase da normoxia, enquanto um declínio acentuado no fluxo nos pontos 3 e 4 representa os eventos associados à diminuição do fluxo sanguíneo na RVA. Uma vez alcançada uma queda de 80% ou mais, o RVA foi criado para os próximos 5 minutos. Esta foi a fase da isquemia (numérica 4-5). Após um levantamento de 5 min da RVA, foi liberada a RVA, que é representada por numéricos 6 e 7. O fluxo do ponto 7 em diante representa a fase de reperfusão, que ocorre após o RVA ter atingido níveis normais de fluxo sanguíneo, que foi a fase de reperfusão. Este experimento em particular demonstrou a eficácia da modelagem de I/R no embrião de 3 dias desenvolvido.
Para verificar a utilidade do nosso modelo, estudamos os padrões de expressão de proteínas, RNA e DNA através da ELISA, mancha ocidental, qRT-PCR e análise de eletroforese gel. Resumindo, dividimos os ovos desenvolvidos por três dias em três grupos experimentais: controle, I/R e Tratamentos + I/R. Observou-se diferença significativa na expressão de proteínas, genes e integridade do DNA entre seus respectivos grupos de I/R e controle. Como discutido abaixo, o tratamento medicamentoso ao grupo de I/R melhorou efetivamente o desfecho observado neste grupo em comparação apenas com o grupo tratado de I/R; isso é consistente com a nossa publicação anterior na qual este protocolo é baseado1. Foram seguidos procedimentos laboratoriais padrão para ELISA18, mancha ocidental19, qRT-PCR20 e eletroforese gel21, que não estão cobertos neste papel (Figura 5, Figura 6, Figura 7, Figura 8).
A isquemia-reperfusão estimula vários processos, incluindo a formação de espécies reativas de oxigênio (ROS) prejudiciais ao tecido. Os efeitos prejudiciais causados pela resposta intrínseca dos sistemas de defesa corporal antioxidante ao ROS são uma característica importante da lesão de I/R. Examinamos as atividades das proteínas reguladoras de oxigênio 150 (ORP150), a superóxido citoplasmático dismutase 1 (SOD1) e a catalase em vasos isquêmicos. Quando comparado ao grupo controle, a I/R elevou a atividade de ORP150, CItoplasmático SOD1 e catalase (Figura 5A-C). No entanto, a suplementação com N-Acetil-L-Cysteine (NAC), uma síndua ROS, atenuou o estresse oxidativo do grupo I/R.
Para avaliar o potencial inflamatório do nosso modelo, utilizamos a ELISA para examinar a expressão IL-1β e TNF-α (Figura 6). Ambas as interleucinas foram superexpressas no grupo de I/R em comparação com o grupo controle, indicando que nosso modelo tem potencial para ser usado em investigações inflamatórias. Em seguida, testamos a expressão do receptor de pirina tipo NOD, proteína 3 (NLRP3) inflamatório 22,23, e molécula pró-inflamatória, NF-kβ24,25, que estão envolvidas na inflamação amplificadora, para confirmar a utilidade deste modelo para estudos inflamatórios. Em resposta à I/R gerada na RVA, esta investigação encontrou evidências de ativação do inflamacronto NLRP3 (Figura 7A), bem como NF-kβ (Figura 7B). No entanto, o tratamento com Naringenin, uma conhecida droga anti-inflamatória, amenizou os efeitos inflamatórios, como observado nos grupos tratados com drogas.
A isquemia-reperfusão ativa as vias de morte celular programadas26,27,28. Estudamos os efeitos da I/R nas vias de apoptose e autofagia no embrião de filhotes. A Figura 8A retrata o efeito de I/R no caspase-3 e zVAD-fmk. A Figura 8B-D demonstra que o grupo I/R apresentou maior expressão de LC3II, bem como razão LC3II/I (marcador autofagosso), Beclin1 (um importante regulador da autofagia em células mamíferas) e Atg7 (necessário para a autofagia basal) do que o grupo controle, respectivamente, em níveis de proteína. Em contraste, a Figura 8E mostra o efeito do I/R nos níveis de mRNA. A adição do 3-MA, um inibidor de autofagia, no entanto, reverteu os resultados. Esses achados sugerem que o modelo pode ser usado para investigar diferentes processos de morte celular (por exemplo, necroptose). A Figura 9 mostra como as mudanças eficientes no nível de DNA podem ser estudadas usando nosso modelo Hook-I/R.
Finalmente, comparamos os resultados do modelo Hook-I/R e do modelo de oclusão da artéria cerebral média (MCAO) para ver o quão eficaz nosso modelo é em comparação com outros modelos. Resumindo, os RVAs tratados com I/R apresentaram níveis mais elevados da proteína apoptótica caspase-3, as proteínas autofagia Beclin1 e Atg7, e as interleucinas inflamatórias TNF-α e IFN-0 do que controlam os RVAs. Curiosamente, seja analisando o estresse inflamatório ou as vias de morte celular, o modelo Hook-I/R produziu resultados extremamente semelhantes aos obtidos pelo modelo MCAO (Figura 10).
Figura 1: Um diagrama esquemático de uma configuração típica do modelo de isquemia-reperfusão de embriões de pintinhos Hook-I/R. A imagem mostra os requisitos de experimentação de isquemia de embrião de pintinhos de Gancho-I/R, como o microscópio cirúrgico de zoom estéreo, o medidor de sangue Doppler laser, o micromanipulador, a agulha espinhal, os embriões de 72 h desenvolvidos e uma fonte de iluminação." Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Imagem representativa de um local de exposição de embriões de 3 dias de oclusão e área de excisão tecidual. (A) O triângulo mostra a localização da excisão do tecido para mancha ocidental, RNA e isolamento de DNA. A estrela e os pontos representam o local da oclusão e os orifícios criados no lado esquerdo e direito da RVA para inserir a agulha sob a artéria para levantá-la, respectivamente. Uma imagem ampliada da área de extração de tecidos também é fornecida junto com ela. A notação A representa o olho, B representa o coração, C representa a esquerda da artéria vitelline, e C' representa o direito da artéria vitelline. (B) Uma representação esquemática do lado direito do embrião do filhote demonstra a área de excisão tecidual nas proximidades da RVA. A linha reta representa o RVA emergindo do tronco do embrião. A estrela na linha vertical simboliza a posição da sonda laser doppler de fluxo sanguíneo. O cruzamento denota o local da oclusão. A excisão das artérias foi feita até 15 ± 1 mm (distal do tronco), 5 ± 1 mm cada no lado esquerdo e direito da artéria, e 2 ± 1 mm em direção ao tronco. Todas as medidas mostram distâncias do local da oclusão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Imagem representativa de uma agulha espinhal com um gancho feito sob medida. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Representação de um típico sinal de fluxo sanguíneo Laser Doppler. Um sinal típico do medidor de fluxo sanguíneo Laser Doppler foi medido em uma artéria de embrião de 3 dias de um ovo do grupo controle (A). Eventos na linha de base (1), durante a normoxia (2), pré-elevação imediata da RVA (3), pós-elevação imediata da RVA (4), durante isquemia (5), pré-liberação imediata de RVA (6), pós-reperfusão imediata (7), durante a reperfusão (8) no grupo tratado de isquemia, conforme registrado pelo fluxo sanguíneo Laser Doppler (B). Esse número foi adotado a partir de Fauzia et al., 2018 (Fronteiras em Farmacologia; sob licença CC-BY)1. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Efeito da isquemia-reperfusão na expressão de proteínas marcadoras de estresse oxidativo. A mancha ocidental foi usada para determinar os níveis de expressão ORP150, SOD1 e catalase. (A) A expressão ORP150 foi aumentada após danos à I/R. Nac, um inibidor pan-ROS, baixou o ORP150 para um nível comparável ao do controle. (B) Seguindo a expressão I/R, a expressão SOD1 foi elevada. A expressão SOD1 também foi diminuída após o tratamento naC. (C) O evento I/R induziu a expressão da catalase. O RVA tratado com I/R e exposto ao NAC apresentou diminuição nos níveis de catalase. GAPDH (A,C) e β-Actin (B) foram utilizados como controles internos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Estimativa de IL-1β e TNF-α utilizando ELISA. ELISA foi usado para quantificar il-1β e TNF-α, e os resultados revelaram que houve um aumento na expressão IL-1β e TNF-α, que foi mitigada pela adição de Naringenin. Para este estudo, foi aplicado o teste ANOVA seguido do teste Newman-Keuls. As barras de erro representam ± média SD, n = 3. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7: Efeito da isquemia-reperfusão na expressão de proteínas marcadoras de inflamação. (A) Tratamento de I/R resultou em aumento da expressão de NLRP3. A incubação de RVA tratado de I/R com Naringenin diminuiu a expressão de NLRP3. (B) Semelhante ao NLRP3, a expressão de NF-kβ também foi aumentada após o tratamento de I/R. O tratamento de Naringenin reduziu a expressão de NF-kβ. GAPDH foi usado como controle interno. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 8: Efeito da isquemia-reperfusão no estado apoptótico e autofágico das células RVA. (A) Para explorar a indução da apoptose pelo processo de I/R, a expressão do caspase 3 foi avaliada utilizando-se a mancha ocidental. Após o dano de I/R, o nível de caspase 3 foi aumentado. No entanto, o tratamento com zVAD-fmk, um inibidor de apoptose, diminuiu a expressão caspase 3. (B-D) Para avaliar a indução da autofagia após a I/R, foi determinada a expressão de LC3II/I, Beclin1 e Atg7. Após a I/R, a expressão de todos os marcadores autofárgicos aumentou, enquanto a exposição de RVA tratada por I/R ao inibidor de autofagia 3-MA diminuiu a expressão de todas as proteínas para controlar os níveis. Como controle interno, gapDH foi usado. (E) qRT-PCR foi utilizado para confirmar a indução da autofagia e determinar os níveis de expressão Ambra1 e Atg7 mRNA. Ambos os genes mostraram um aumento considerável na expressão no grupo I/R em comparação com o controle, que foi restaurado a níveis quase normais após a terapia NAC. GAPDH foi usado como controle interno para experimentos qRT-PCR. Para o experimento (E), foi aplicado o ANOVA, seguido do teste Newman-Keuls. As barras de erro representam ± média SD, n = 3. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 9: Efeito da isquemia-reperfusão no dano de DNA. Para determinar se a I/R induz os cortes de DNA, examinamos os danos de DNA usando eletroforese gel. A I/R resultou em degradação genômica de DNA, como mostrado pela mancha na amostra de I/R. A terapia NAC de RVA danificada por I/R reduziu os danos no DNA. Uma escada de DNA de 1 kb foi empregada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 10: Comparação do modelo Hook-I/R vs. o modelo MCAO. Foi feita uma comparação entre os dados gerados pelo modelo Hook-I/R e os dados gerados pelo modelo MCAO. (A) A expressão da proteína apoptótica caspase-3 e das proteínas autofagia Beclin1 e Atg7 foi maior em RVAs tratadas com I/R quando comparadas com a expressão das mesmas proteínas em RVAs de controle, o que estava de acordo com os achados obtidos nos experimentos de MCAO. (B) Os níveis TNF-α e IFN-º foram elevados nos grupos RVA e MCAO quando comparados aos seus respectivos controles. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Nome do Material/Equipamento | Concentração | Autoclave | Armazenamento | ||
| Reagentes para a solução de Ringer | |||||
| Cloreto de sódio | 123 mM | ||||
| Cloreto de potássio | 4,96 mM | ||||
| Cloreto de cálcio | 1,53 mM | ||||
| Água destilada estéril | 100 mL | ||||
| ph | 7.4 | 15 min a 121 °C | R.T. | ||
| Reagentes para soro fisiológico normal de 0,9% | |||||
| Cloreto de sódio | 154mM | ||||
| Água destilada estéril | 100 mL | ||||
| ph | 7.4 | 15 min a 121 °C | R.T. | ||
| Reagentes para 70% de etanol | |||||
| 70% de etanol | 70 mL | ||||
| Água destilada estéril | 30 mL | Não é necessário | R.T. | ||
| Reagentes para 1x Salina tampão fosfato | |||||
| Cloreto de sódio | 136,8 mM | ||||
| Cloreto de potássio | 26,8 mM | ||||
| Lindro monobásico de fosfato de potássio | 14,6 mM | ||||
| di-Sódio heptahydrate de hidrogênio | 5,37 mM | ||||
| Água destilada estéril | 100 mL | 15 min a 121 °C | R.T. | ||
Tabela 1: Receita de soluções utilizadas neste estudo.
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Discussion
O objetivo da pesquisa isquemia-reperfusão é criar estratégias terapêuticas que previnem a morte celular e promovam a recuperação 29,30. Para superar as restrições atuais na pesquisa de I/R, projetamos um modelo de embrião de pintinhos Hook I/R para produzir um modelo de I/R confiável e reprodutível. Para nosso conhecimento, o nosso é o primeiro modelo de I/R já criado em um embrião de 3 dias para experimentos de I/R de rotina, além de estudar sinais de estresse (por exemplo, estresse oxidativo e inflamatório). Dado os benefícios de tamanho e acessibilidade no 3º dia de desenvolvimento31, o embrião de filhotes foi utilizado em uma fase de desenvolvimento de 72h, por causa da alta produção do modelo, simplicidade para empregar e adaptabilidade para análises de rotina32. Resumindo, no dia 3, o filhote de in ovo é um modelo altamente controlado, porém acessível e razoavelmente transparente dentro do ovo que pode ser usado para visualizar a fisiologia normal, a patologia da doença e os efeitos do tratamento experimental. Seu tamanho enorme o torna particularmente útil para estudar a formação e o comportamento do embrião durante a fisiologia normal, bem como o estresse33. Embora embriões de filhotes mais velhos (aqueles incubados por 4 dias ou mais) possam ser empregados, e nós tentamos um ponto de tempo posterior, o uso de embriões mais antigos como sistemas de modelo é severamente limitado pelo fato de que o saco de gema cresce tão grosso além de 3 dias de desenvolvimento que os procedimentos cirúrgicos são difíceis. Vale ressaltar que, embora o RVA não esteja totalmente formado em uma janela de tempo inicial (digamos, no dia 1 ou 2), a janela pode levar à teratogenicidade34. Além das limitações associadas a um ponto de desenvolvimento de tempo precoce ou tardio, um embrião de 72 h serve como modelo ideal para pesquisar o processo de I/R, uma vez que os embriões de 3 dias têm um sistema circulatório bem definido30.
Entender a fisiopatologia da lesão de I/R é um objetivo principal de projetar um modelo de I/R. Atualmente, não há nenhuma terapêutica clinicamente útil para reduzir danos à isquemia-reperfusão1,35. Como resultado, uma ampla gama de modelos in vitro e em vivo foram propostos. Nesse contexto, a modelagem de I/R em um embrião de 3 dias em ovo foi proposta pela primeira vez. Pesquisas anteriores mostraram que a reperfusão da reperfusão do fluxo sanguíneo arterial causa alterações patológicas em modelos experimentais semelhantes aos observados em humanos36,37,38, por isso esperamos que nosso modelo faça o mesmo (tal estresse oxidativo e inflamatório observado em modelos in vivo ou em pacientes). Com os achados do nosso estudo, a hipótese acima mostrou-se correta.
A circulação de sangue de embriões para o saco de gema é controlada por vasos vitelinos em embriões de filhote39. Os embriões obtêm nutrientes da gema e o oxigênio difuso do ar através da circulação vitelline; assim, restringindo qualquer um dos vasos vitelinos que podem interromper a nutrição e a transferência de oxigênio. Com base nesses fatos, a isquemia foi induzida por ocluir o suprimento de sangue para a RVA por 5 minutos, seguido de reperfusão por adicional de 5h e 55 min. O modelo proposto pode ser utilizado para examinar uma série de vários processos de doenças associados à I/R e testar uma variedade de medicamentos e seus alvos. O modelo atual pode ser usado para examinar alterações no DNA, RNA e proteínas. Ele tem o potencial de dar alta saída. Além de sua simplicidade e adaptabilidade para análise regular, o modelo também pode investigar o homing de células-tronco de curto prazo, que serão investigados em estudos futuros.
Em comparação com modelos in vitro , nosso modelo é fácil de usar, econômico e cresce rapidamente, além de ser eticamente inocente32. A presença de microvasculatura, sistema imunológico e avaliações fisiológicas são todos benefícios em modelos in vitro , enquanto baixo custo, eficácia do tempo e nenhum problema ético são vantagens sobre os modelos in vivo40. As vantagens acima indicam que nosso modelo tem um efeito comparável aos outros modelos de I/R atualmente em uso (Figura 10). Uma deficiência potencial é a incapacidade do modelo atual de quantificar a área de infarto. A avaliação direta do infarto pode ser um biomarcador valioso para danos mediados por I/R e um método para mapear os efeitos de vários medicamentos terapêuticos. Assim, buscamos quantificar a área de infarto, mas não conseguimos fazê-lo devido à delicada estrutura dos filhotes desenvolvidos em 72 h. Portanto, são necessárias pesquisas adicionais para avaliar as estratégias e caminhos para os processos de I/R de forma abrangente.
Para resumir, o modelo atual pode ser usado para investigar várias vias da doença ligadas à I/R e rastrear uma variedade de drogas e seus alvos. Devido à sua alta reprodutibilidade, custo-efetividade e simplicidade, antecipamos que nosso modelo será um recurso valioso para a ciência básica e a pesquisa translacional.
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Disclosures
Os autores não declaram interesses concorrentes.
Acknowledgments
Queremos expressar nossa gratidão a Hari Shankar por suas contribuições críticas durante a videografia e edição, Sr. Baqer Hussain por dublagem, Sr. Asghar Rizvi para edição de vídeo, Sr. Mohammad Haider para filmagens, Sr. Mohammad Dinamarquês Siddiqui para assistência durante os experimentos.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (-80°C) freezer | Haier, China | - | |
| 1.5mL Centrifuge tube | TARSONS, India | 500010X | |
| 100mm Petri dish (sterile) | Tarsons, India | 460050 | |
| 18G Needle (18G×1.5 (1.25×38mm) | Ramsons, India | 13990 | |
| 1mL Syringe | DISPO VAN | - | |
| 26G Needle (26G×1/2 (10.45x13mm) | DISPO VAN, india | 30722D | |
| 37°C egg incubator with adjustable percentage humidity | Gentek, India | GL-100 | |
| 37°C laboratory incubator | SCIENCE TECH, India | CB 101-14 | |
| 3-Methyladenine (3-MA) | Sigma Aldrich, USA | M9281 | |
| 3mL Pasture Pipette | TARSONS, India | 940050 | |
| 50mL Beaker | TARSONS, India | - | |
| 5mL Syringe | DISPO VAN, India | IP53 | |
| 70% ethanol | Merck Millipore, United States | 64-17-5 | |
| Adhesive tape/Cello tape | Sunrise, India | - | |
| Ambra1 primers | Applied Biosystems, Foster city, USA | Hs00387943_m1 | |
| Anti-mouse IgG | Cell Signaling Technology, USA | 7076S | |
| Anti-Rabbit IgG | Jackson Immuno Research Laboratories, USA | 711-035-152 | |
| Atg7 | R&D Systems, USA | MAB6608 | |
| Atg7 primers | Applied Biosystems, Foster city, USA | Hs00893766_m1 | |
| Autoclave Bag | Tarsons, India | 550022 | |
| Autoclave Machine | Local made, Lucknow, India | - | |
| Beclin-1 | Proteintech, USA | 66665-1-Ig | |
| Beta Actin | ImmunoTag, USA | ITT07018 | |
| Bovine Serum Albumin | Himedia, Mumbai, India | TC194 | |
| Calcium Chloride | Himedia, Mumbai, India | GRM534 | |
| Catalase | ImmunoTag, USA | ITT5155 | |
| Cleaning wipes | Kimberly-Clark, India | 370080 | |
| Cleaved Caspase3 | ImmunoTag, USA | ITT07022 | |
| di-Sodium hydrogen phosphate heptahydrate | Himedia, Mumbai, India | GRM39611 | |
| Doppler blood flowmeter | Moors instrument, United Kingdom | moorVMS-LDF1 | |
| Egg rack | - | - | |
| Egg rack | - | - | |
| GAPDH | ImmunoTag, USA | M1000110 | |
| GAPDH primers | Applied Biosystems, Foster city, USA | Hs02758991_g1 | |
| Glycine | Himedia, Mumbai, India | MB013 | |
| Kidney tray | HOSPITO | - | |
| LC3A/B | Cell Signaling Technology, USA | 4108S | |
| Methanol | Rankem laboratories, Mumbai, India | M0252 | |
| Micromanipulator | Narishige, Japan | M-152 | |
| N-acetyl-L-cysteine (NAC) | Sigma Aldrich, USA | A7250 | |
| Naringenin | Sigma Aldrich, USA | 67604-48-2 | |
| NF-kβ | Thermo Fisher Scientific, USA | 51-0500 | |
| NLRP3 | ImmunoTag, USA | ITT07438 | |
| Nose plier | Local made, Lucknow, India | - | |
| Ocular forceps | Stoelting, Germany | 52106-40 | |
| Ocular iris | Tufft Surgical Instruments, Jaipur, India | Hard Age Vannas Micro Scissors Angled 8CM / 3 1/8" | |
| OHP marker pen | Camlin, India | - | |
| ORP-150 | ImmunoTag, USA | ITT08329 | |
| Pointed sharp edge scissor | Stoelting, Germany | 52132-11 | |
| Potassium Chloride | Himedia, Mumbai, India | MB043 | |
| Potassium phosphate monobasic anhydrous | Himedia, Mumbai, India | MB050 | |
| Protease Inhibitor | Abcam, United States | Ab65621 | |
| SOD-1 | ImmunoTag, USA | ITT4364 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific, Mumbai, India | 27605 | |
| Sodium dodecyl sulphate | Himedia, Mumbai, India | GRM886 | |
| Spinal needle 25GA; 3.50 IN (90.51 X 90mm) | Ramson, India | GS-2029 | |
| Stereo Zoom surgical microscope | Olympus, Japan | SZ2-STU3 | |
| Syringe discarder | BIOHAZARD | 882210 | |
| Toothed forceps | Stoelting, Germany | 52102-30 | |
| Tris Base | G Biosciences, United States | RC1217 | |
| Tris Hydrochloric Acid | Himedia, Mumbai, India | MB030 | |
| Tween 20 | G Biosciences, United States | RC1227 | |
| White Leghorn Chicken 0-day eggs | - | - | |
| Z-Val-Ala-Asp(OMe)-FMK | MP Biomedicals, LLC, USA | FK009 |
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