Summary
该协议演示了一种在微信道中产生10-1000 Hz谐波振荡流的便捷方法。这是通过将计算机控制的扬声器振膜以模块化方式连接到微通道来实现的。
Abstract
微流体技术已成为化学和生物实验室分析和合成的标准工具。液体样品（如化学试剂和细胞培养物）的注射主要通过稳定的流动来完成，这些流动通常由注射泵，重力或毛细管力驱动。互补振荡流的使用很少在应用中考虑，尽管它具有最近在文献中证明的众多优点。在微通道中实现振荡流的重大技术障碍可能是其缺乏广泛采用的原因。可以产生振荡流量的先进商用注射泵通常更昂贵，并且仅适用于低于1 Hz的频率。在这里，演示了一种低成本、即插即用型扬声器设备的组装和操作，该设备在微通道中产生振荡流。可实现频率范围为 10-1000 Hz 的高保真谐波振荡流以及独立的幅度控制。在整个工作范围内可实现 10-600 μm 的幅度，包括在典型微通道中谐振频率下> 1 mm 的幅度。虽然振荡频率由扬声器决定，但我们说明了振荡幅度对流体特性和通道几何形状敏感。具体而言，振荡幅度随着通道电路长度和液体粘度的增加而减小，而相反，振幅随着扬声器管厚度和长度的增加而增加。此外，该装置不需要在微通道上设计先前的特征，并且易于拆卸。它可以与注射泵产生的稳定流量同时使用，以产生脉动流量。
Introduction
微通道中液体流速的精确控制对于芯片实验室应用至关重要，例如液滴生产和封装1，混合2，3以及悬浮颗粒的分拣和操作4，5，6，7。流量控制的主要方法是注射泵，它产生高度受控的稳定流量，分配固定体积的液体或固定的体积流量，通常仅限于完全单向流量。产生单向流动的替代策略包括使用重力头8、毛细管力9或电渗流10。可编程注射泵允许对流速和分配体积进行瞬态双向控制，但由于注射泵的机械惯性，响应时间限制在大于1 s。
由于流动物理学的质变，在较短的时间尺度上进行流量控制解锁了6，11，12，13，14，15个其他不可访问的可能性。利用这种可变流物理的最实用方法是通过声波或振荡流，其时间段从10-1-10-9 s或101 -109 Hz不等。该频率范围的较高端使用体声波（BAW;100 kHz-10 MHz）和表面声波（SAW;10 MHz-1 GHz）设备访问。在典型的BAW器件中，通过在键合压电体上施加电压信号来振动整个基板和流体柱。这可以实现相对较高的吞吐量，但也会导致在较高振幅下加热。然而，在SAW器件中，固液界面通过向压电基板上图案化的一对叉指电极施加电压来振荡。由于波长非常短（1 μm-100 μm），小至300 nm的颗粒可以通过SAW设备中产生的压力波精确地操纵。尽管能够操纵小颗粒，但SAW方法仅限于局部粒子操纵，因为波会随着与源的距离而迅速衰减。
在1-100 kHz频率范围内，振荡流通常使用压电元件产生，压电元件键合到设计腔体16，17上方的聚二甲基硅氧烷（PDMS）微通道上。图案化腔上方的PDMS膜的行为类似于振动膜或鼓，对通道内的流体加压。在此频率范围内，波长大于通道尺寸，但振荡速度幅度较小。在这种频率状态下，最有用的现象是产生声波/粘性流，这些流是由于惯性为18的液体流动中固有的非线性而引起的整流稳定流。稳定的流动通常表现为障碍物，尖角或微气泡附近的高速反向旋转涡流。这些涡旋可用于混合19，20 并从流流21中分离10μm大小的颗粒。
对于10-1000 Hz范围内的频率，振荡分量的速度及其相关的稳定粘性流在幅度和有用性方面都是相当大的。该频率范围内的强振荡流可用于惯性聚焦22，促进液滴23的产生，并且可以产生模拟血流的流动条件（Womersley数）用于 体外 研究。另一方面，流流对于混合、粒子捕获和操作非常有用。该频率范围内的振荡流也可以使用如上所述与器件23键合的压电元件来实现。通过键合压电元件实现振荡流的一个重要障碍是，它需要事先设计功能。此外，粘合的扬声器元件是不可拆卸的，并且必须将新元件粘合到每个设备24上。但是，此类设备具有紧凑的优点。另一种方法是使用机电继电器阀20。这些阀门需要气动压力源和定制控制软件来操作，因此增加了测试和实施的技术障碍。然而，这种装置能够应用设定的压力幅度和频率。
本文介绍了一种用户友好型方法的构造、操作和表征，以在微通道中产生频率范围为10-1000 Hz的振荡流。该方法具有许多优点，例如经济高效的组装，易于操作，并随时可以与标准微流体通道和附件（如注射泵和管道）连接。此外，与以前的类似方法25相比，该方法为用户提供了对振荡频率和幅度的选择性和独立控制，包括正弦和非正弦波形之间的调制。这些功能使用户能够轻松部署振荡流，从而促进在生物学和化学领域广泛采用当前存在的各种微流体技术和应用。
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Protocol
1. 快速原型模具设计与制造
- 在 PC 上打开 AutoCAD。在任务栏上选择“文件”，然后选择“ 打开 ”并浏览并单击具有.dxf或.dwg扩展名的通道模具的三维 （3D） 模型文件。
- 通过单击并拖动整个模型周围的框来选择整个模型。通过将设计导出为 .stl 文件，方法是选择“ 文件| 导出，然后选择 其他格式 ，然后从下拉框中选择 .stl。
- 将文件上传到高精度树脂立体光刻（SLA）打印机，如Formlabs FORM3。将树脂倒入树脂室并开始印刷，并以最小的z轴步骤生产模具（Formlabs CLEAR树脂为25微米）。
- 等待自动零件打印完成。
注：功能小至0.1 mm的模具可以通过这种方式制造。 - 从树脂中除去部件后，将其在异丙醇中搅拌5分钟以除去任何剩余的树脂。
- 用空气或氮气干燥模具2分钟。
注：使用硅晶圆的传统微流体模具制造和任何SU8或KMPR光刻胶的光刻也可用于生产具有较小特征的模具。 - 将干燥的模具在60°C下在紫外线下固化，最长1小时。
2. PDMS微通道制造
- 将模具放在一张铝箔上。为了缓解PDMS的分层，请在模具上喷涂硅胶脱模剂，进行1或2次。
- 将PDMS树脂和交联剂以10：1的重量比倒入一次性杯中，并用一次性勺子混合。
- 将得到的混合物倒入模具上，以产生所需厚度的薄膜。为防止大通道壁变形，PDMS厚度保持在最大特征厚度的5毫米以上或3-4倍以上。
- 将装有PDMS的模具放入脱气室并合上盖子。确保O形圈密封腔室。
- 关闭排气阀并打开真空粗泵以启动脱气。
- 将倒入的混合物在真空泵中脱气超过4-6个循环，每个循环持续约5分钟。使用细线手动去除任何剩余的气泡（在角落和沟槽中）。
- 将烤箱温度设置为80°C，并使其预热。将混合物置于80°C的烤箱中2小时以固化。
- 从烤箱中取出固化的模具，将其置于室温下10分钟以冷却。
- 使用手术刀，小心地切出模具的边缘。为了获得最佳分层效果，请使用注射器在模具和固化的PDMS之间注入异丙醇。
- 将固化的PDMS从模具中剥离，并用剃须刀片将其切割成单独的设备。每个设备的尺寸必须在10 mm x 10 mm到30 mm x 70 mm之间，才能与载玻片粘合。
- 使用活检冲头在入口和出口处打一个直径为1.0-3.0毫米的孔。
- 打开手持式射频 （RF） 等离子发生器。要激活载玻片，将电极丝稳定地穿过干净的干载玻片多次，持续2分钟。保持约 5 mm 的线与玻璃间隙。将固化的PDMS的设备侧与激活的载玻片接触，然后置于80°C烘箱中2小时。
- 将聚乙烯入口和出口管切割成所需长度，然后将其插入入口和出口孔中。
- 为防止管子在操作过程中脱落，请在接触面上涂上硅酮密封胶，并使其固化2小时以固定管子。
3. 振荡驱动器组装
- 将一对鳄鱼到引脚导线的鳄鱼夹末端夹紧到扬声器的端子上。这里使用了带有8厘米锥体的15 W扬声器，尽管也可以使用其他扬声器。
- 将辅助控制器芯片放在绝缘容器上。将针脚端插入辅助控制器芯片的螺钉插座，并用螺丝刀牢固拧紧以确保连接。
- 将辅助电缆的一端连接到控制器芯片，另一端连接到计算机或智能手机上的辅助端口。
- 将 12 V 直流 （DC） 适配器连接到电源。通过将直流适配器的同轴端连接到电源插座来打开控制器芯片。
- 使用互联网浏览器，导航到在线音调发生器网站（例如，https://www.szynalski.com/tone-generator/）。
- 在在线申请中输入所需的频率（5-1200 Hz）。将音量条滚动到所需的量（例如，100%）。
- 单击 波形发生器 符号，然后选择所需的波形（正弦波、正波、三角形、锯齿形）。请注意，默认值为正弦波形。按 播放 以启动扬声器。
4. 适配器组件
注：完整的扬声器到电子管适配器组件如图 1中的原理图所示。
- 通过将胶带粘贴在支架的弯曲表面和任一侧，将扬声器（图1（I））固定在3D打印扬声器支架上（请参阅补充文件1中的扬声器安装座.stl）。
- 垂直定位扬声器，扬声器锥面朝上。将3D打印适配器（图1（III））（参见补充文件2中的扬声器管适配器.stl）同心放在扬声器锥体上。
- 沿适配器边缘大量涂抹硅酮密封胶，并固化2小时。
- 将扬声器和扬声器支架放在显微镜载物台上，并向下胶带，以防止在操作过程中移动。
- 将200μL微量移液器吸头从其窄端切开约2厘米，并处理较宽的一半吸头。狭窄的锥形端将用作可逆连接的楔形密封。
- 首先通过微移液器吸头（图1（IV））将聚乙烯管（图1（V））连接到微通道（图1（VI）））出口，然后通过适配器的同轴端，最后通过侧面出来。
- 将移液器吸头的窄端牢固地楔入适配器的同轴端，以形成可拆卸的紧密密封。
5. 微通道振荡流的实验设置操作
- 将示踪剂颗粒加入到22%重量/重量（w / w）甘油溶液的小瓶中，以在20°C的液体中产生体积分数为0.01%-0.1%聚苯乙烯的中性浮力悬浮液。 通过摇晃剧烈混合以产生均匀的悬浮液。
- 将 1 mL 进样注射器与 1 mL 样品上样。将装载的注射器安装并固定到自动注射器泵上。将注射器针头插入设备的入口管中，以形成防水密封。
- 确保出口管穿过适配器组件并进入储液罐（请参阅上一节关于适配器组件）。
- 打开注射泵。使用触摸屏，选择注射器类型为 Becton-Dickinson 1 mL。然后，选择“ 注入”。然后选择所需的流速（0-1 mL/min）或流量（< 1 mL）。
- 使用注射泵启动稳定流量。等到足够体积的液体流动，出口管充满液体，直到扬声器。
注：如果出口管已启动，则给定设置的振荡幅度不会随稳定的传输流而变化。 - 按照步骤 3.5 所述，在音调发生器应用程序中选择所需的频率、幅度和波形，然后按 Play 在微通道内生成振荡流。
6. 观察和振幅测量
- 将设备安装在显微镜上。通过选择放大倍率在10倍至40倍之间的物镜来调整焦平面并定位载物台，从而设置光学配置。
- 要在明确定义的焦平面上获得测量值，请确保物镜的景深比通道深度小5倍或更多。
- 要观察振荡流，请使用帧速率至少是使用奈奎斯特采样定理计算的振荡频率的两倍的高速相机。为了获得实际有用的波形分辨率，使用>振荡频率10倍的帧速率测量每个时间段至少10个点。
- 或者，要仅观察脉动流的整流或长时间效应，通过将观察频率设置为振荡频率的任何完美除数来执行频闪成像。
- 对于直接成像和频闪成像，请使用配备全局快门的相机，以避免果冻效应。在任何一种情况下，保持曝光时间远小于振荡时间段（10倍或更多），以防止条纹。
- 要在没有高速摄像机的情况下测量振荡幅度，请以接近但不等于频闪帧速率的帧速率进行记录（例如，对于50 Hz信号，帧速率为49帧/秒）。这导致高度减速的振荡，从中可以精确测量幅度。
- 观察并记录振幅测量值。
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Representative Results
为了说明上述设置的功能和性能，给出了具有方形横截面的简单线性微通道中振荡流的代表性结果。通道的宽度和高度为110μm，长度为5厘米。首先，我们描述了球形聚苯乙烯示踪剂颗粒的运动，以及如何使用这些颗粒来检查振荡信号的保真度以及可实现的振荡幅度范围。然后，我们讨论特定流体性质或微流体材料对振荡幅度的影响。最后，我们说明了非正弦波形的能力。
为了进行比较，我们通过以体属性，通道几何形状和微流体材料来定义参考情况。工作液体是去离子水（μ = 1.00 mPa.s），其直径为0.01%的示踪剂颗粒的体积分数，d = 1μm和密度，ρ = 1.20 kg / m3。相应的粒子响应时间（由ρd2/18μ给出）为70 ns，远小于相应的振荡时间尺度（1-100 ms）。在通道中等高度观察颗粒，物镜为10倍，焦深为10μm。微流体管的直径为1.27 mm x 0.76 mm（外 x 内），出口管长度为12 cm，保持在通道水平以上5 cm处。
示踪剂粒子在通道中板上不同振荡频率下的轨迹位移如图 2所示。对于所示的所有振荡频率，均观察到谐波信号，分别为 100 Hz、200 Hz、400 Hz 和 800 Hz。成像帧速率大于或等于振荡频率的20倍。振幅（扬声器音量）设置在不同的振荡频率下保持恒定。对于 100 Hz、200 Hz、400 Hz 和 800 Hz 的频率，相应的幅度分别约为 125 μm、100 μm、25 μm 和 10 μm。
跟踪的粒子位移也用于确定谐波运动的保真度和振荡幅度的范围，这是校准过程中的关键步骤。使用傅里叶谱说明了粒子在不同振荡频率和幅度下的谐波位移的保真度，如图 3A所示。对于分别为 50 Hz、200 Hz 和 400 Hz 的频率，考虑了以辅助电缆（或放大器输入电压）中的电位差为特征的三种不同幅度。这些设置被命名为低电平（30%，1.5 V，黄色）、中间（60%，3 V，橙色）和高电平（90%，4.5 V，红色）。此处，百分比表示音量设置相对于最大扬声器音量或相应电压 5 V 的大小。 图3A 显示了在50 Hz、200 Hz和800 Hz振荡频率下粒子位移的傅里叶光谱，分别对应于黄色、橙色和红色的三种不同放大器输入电压（1.5 V、3 V、4.5 V）。频谱的主峰完全对应于所有音量设置所施加的频率。即使在最高振幅下，主峰也是次峰的10倍>。
对于 5 V 的放大器输入电压，扬声器锥体位移的幅度最大值为 5 mm，对于高达 50 Hz 的频率保持恒定，然后对于高于 50 Hz 的频率（例如，100 Hz 时为 1.5 mm）近似二次下降。液体中的粒子振荡幅度与扬声器锥体幅度和振荡频率的乘积给出的功率转换成正比。因此，我们期望振荡幅度在扬声器谐振频率附近最大，对于固定放大器输入电压，振荡幅度在扬声器谐振频率的两侧频率降低。此外，我们还可以期望流体的振荡幅度随放大器输入电压线性变化，其值不能超过扬声器锥体幅度的值。
这些期望值在图3B所示的振荡幅度与频率的关系图中得到证实。对于所有扬声器音量设置，特征曲线都有一个共振峰值，该峰值出现在大约180 Hz处，超过该峰值，幅度随着频率的增加而减小。不同电压下的曲线看起来相同，除了对数尺度的垂直平移意味着振荡幅度随电压线性变化。最后，即使在5 V谐振频率下，最大幅度也小于1.5 mm。然而，可以选择音量设置，以便在整个工作频率范围内可实现>100 μm的振荡幅度。
接下来，根据上述参考情况，介绍液体粘度、管径和管长在工作频率范围内振荡幅度的影响。对于这些实验，驱动器振幅（扬声器音量）在中间电平保持恒定，一次只修改一个设置参数，而其余参数与参考控制情况相同（菱形符号）。振荡幅度 与频率的 相应结果如图 4所示。当通过改变为25%甘油溶液（μ = 1.81 mPa.s）来增加工作液体的粘度时，振幅在工作频率范围内（方形符号）降低近2倍。这表明，一般来说，与去离子水相比，增加液体粘度将导致相似的特征振幅 与 频率曲线，幅度的恒定因子降低。当相同材料（聚乙烯）的微流体管直径增加到2.41 mm x 1.67 mm时，振幅与参考情况相比增加了1.5-3倍，具体取决于频率（圆形符号）。高频时增加较大，低频时增加较小，表明谐振频率增加。当相同材料（聚乙烯）的电子管长度增加到24 cm（2倍）时，振幅在谐振频率附近显着增加，但在非常低和非常高的频率（三角形符号）下与参考控制箱相比保持不变。
除了上面讨论的正弦波形外，还演示了非正弦波形。方形、三角形和锯齿形波形的粒子位移轨迹如图 5A所示。此处，振幅设置为中间值（最大值的60%），驱动频率为100 Hz，以4000帧/秒的速度观察粒子。正如预期的那样，在响应时间有限的实际系统中，与方形和锯齿形波形相关的位置变化是不可能的。对于此扬声器系统，响应时间估计为 0.5 ms。尽管如此，观察到这些波形的傅里叶谱与理想谱非常一致，至少高达三次谐波，如图 5B所示。
图 1.示意图用于说明装置的设计和组装。 关键组件包括 （I） 扬声器、（II） 扬声器支架、（III） 扬声器到管适配器、（IV） 移液器尖端楔形密封、（V） 聚乙烯管和 （VI） PDMS 微通道。 请点击此处查看此图的大图。
图 2.振荡流期间粒子位移的示例。 使用高速成像获得不同频率的正弦波形输入期间的代表性粒子轨迹。 请点击此处查看此图的大图。
图 3.分析信号保真度和幅度范围的粒子位移。 （A）不同振荡频率和振幅或扬声器音量下正弦振荡的傅里叶频谱分析。（B） 三种不同扬声器音量设置下振荡幅度 与 频率的特性曲线。 请点击此处查看此图的大图。
图 4.管长、管径和液体粘度对振荡幅度的影响。 与参考情况相比，管长或管直径的增加将导致振荡幅度在工作频率范围内增加。然而，粘度的增加会降低振荡幅度。 请点击此处查看此图的大图。
图 5.非正弦波形示例。 （A） 振荡频率为 100 Hz 的方形、三角形和锯齿形波形的粒子位移。（B） 非正弦粒子位移的相应傅里叶光谱。 请点击此处查看此图的大图。
补充文件 1. 立体光刻文件，以产生 图1 （II）中提到的3D打印扬声器支架。 请点击此处下载此文件。
补充文件 2. 立体光刻文件以产生3D打印的扬声器管适配器， 参见图1 （III）。 请点击此处下载此文件。
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Discussion
我们已经演示了基于扬声器的外部设备的组装（参见协议关键步骤3和4）和操作（参见协议关键步骤5和6），用于在微流体设备中产生频率范围为10至1000 Hz的振荡流。需要对悬浮示踪剂颗粒进行粒子跟踪，以确定谐波运动的保真度，并校准在工作频率范围内可实现的振荡幅度范围。给定音量设置的幅度-频率曲线主要取决于扬声器的特性，这些特性无法更改（参见 图3A，B的代表性结果中对扬声器特性的讨论）。然而，对于特定的通道设计，可以通过适当修改卡套管特性、液体粘度或其组合来修改和调整振荡幅度。例如，我们在 图4 中显示，在相同的体积设置下，较大的管直径或更长的管长度可以增加振荡幅度的大小。然而，粘度增加会降低振荡幅度范围，为用户提供从10μm到1 mm的振幅范围。
此方法的显著优点是易于组装、实现和操作。振荡驱动器的整个成本不到60美元，一旦购买零件，其组装只需大约2小时（参见 材料表）。与在微流体器件25中产生振荡流的替代方法不同，该方法几乎没有设计约束，并且确保了实现的最短的交货时间。尽管简单，我们的方法允许用户令人惊讶地精确控制振荡幅度，同时保持正弦和非正弦振荡波形的保真度。该技术还在两个数量级的频率范围内产生谐波运动。最后，该技术可以与标准微流体流量控制器（例如注射泵或压力发生器）产生的稳流组件一起使用，以产生高频脉动流量。如前所述22，28，当稳流速度与振荡流速相比较小时，振荡幅度和频率不受稳定传输流存在的影响。因此，这种方法是研究实验室环境的理想选择。
该方法的相应限制是振幅不能设置为所需值。必须测量并校准到给定微流体通道的振幅。它目前不可扩展，因此不能立即适用于工业应用。该装置的进一步发展将涉及设计一个简单的振膜，该隔膜可以粘合并由扬声器驱动，以允许更大的振幅并最大限度地减少对管子和微流体通道的依赖。
总体而言，这项工作提供了一种低成本，稳健且可定制的方法，用于在相对未开发的频率范围内在微流体通道中产生振荡流。该技术已被证明可用于牛顿26 和非牛顿27 液体的微流变学，微尺度28的增强混合以及长度减小的通道22中的惯性聚焦。本工作中概述的方法提供了一种可访问且适应性强的方法，当与来自注射泵的稳定流量相结合时，可以产生纯振荡流或脉动流。因此，这种方便的技术可以在微观尺度上将振荡流实施到现有的研究和工业中。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们要感谢伊利诺伊大学机械科学与工程系快速成型实验室为这项工作提供的支持和提供的设施。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Oscillatory Driver Assembly | |||
| Alligator-to-pin wire | Adafruit | 3255 | Small alligator clip to male jumper wire (12) |
| Aux cable | Adafruit | 2698 | 3.5 mm Male/Male stereo cable 1 m |
| Controller chip | Damgoo | TPA3116 | 50w+50w 2 channel audio amplifier (bluetooth and AUX) |
| DC adapter | Adafruit | 798 | 12 V DC 1A regulated switching power adapter |
| Micro-pipette tip | VWR Signature | 37001-532 | 200 ul micropipette tip |
| Silicone sealant | Loctite | 908570 | Clear silicone waterproof sealant (80 ml) |
| Speaker | Drok | 6843996 | 4.5 inch 4 Ohm 40 W speaker |
| Speaker mount | 3D printed from 'speakermount.stl' in supplementary files | ||
| Speaker-to-tube adapter | 3D printed from 'speaketubeadapter.stl' in supplementary files | ||
| Microchannel Manufacture | |||
| Biopsy punch | Miltex | 15110 | Biopsy punch with plunger (1 - 4 mm) |
| Degasser | |||
| Disposable cup | |||
| Disposable spoon | |||
| Glass Slides | VWR Signature | 16004-430 | 3" x 1" pre clean 1 mm thick |
| Mold | Si - SU-8 or 3D printed | ||
| Oven | Fischer Scientific | Isotemp | |
| PDMS resin and cross-linker | Dow Chemical | 4019862 | Sylgard 184 PDMS resin and crosslinker (500 g) |
| Polyethylene tubing | Becton Dickinson Intramedic | 427440 | Polyethylene tubing (PE 60 - PE 200) |
| Razor blades | VWR | 55411-050 | Single edge industrial razor blades |
| RF plasma generator | Electro-Technic Products | BD - 20 | High frequency generator |
| Silicone Mold Release | CRC | 03301 | Food Grade Silicon Mold release (16 oz) |
| Observation and Characterization | |||
| Camera | Edgertronic | SC2+ | |
| Lens | Nikon | Plan Fluor 10x | |
| Microscope | Nikon | Ti Eclipse manual stage | |
| Needles | Becton Dickinson | 305175 | PrecisionGlide 20G |
| Syringe | Becton Dickinson | 1180100555 | Monoject 1 ml |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | Dual syringe programmable syringe pump | |
| Tracer Particles | Spherotech | PP-10-10 | Polystyrene tracer particles 1 um |
References
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