Summary
유산균(LAB) 배양액의 품질관리 평가는 발효 절차를 위한 LAB 균주의 생존력과 기능성을 향상시키는 효과적인 방법으로 확인되었습니다. 이 주장을 뒷받침하기 위해 우리는 발효 및 바이오 프로세싱 절차를 위해 LAB 배양이 어떻게 활성화되고 배양되는지 설명하는 프로토콜을 개발했습니다.
Abstract
유산균(LAB)은 요구르트 및 치즈와 같은 발효 유제품 제조에 크게 사용되는 필수 유제품 스타터 배양입니다. LAB는 주로 발효의 주요 최종 생성물인 젖산을 생산하며, 발효식품의 관능적 특성을 부여하는 중요한 대사산물을 합성합니다. LAB는 적절한 영양 요구 사항이 충족되면 많은 환경에서 번성하는 까다로운 박테리아입니다. 식품 및 유제품 산업의 발효 응용 분야를 위한 우수한 LAB 유제품 스타터 배양에 대한 수요로 인해 모든 바이오프로세싱 작업에 실행 가능하고 활동적인 배양을 제공해야 할 필요성이 대두되었습니다. 따라서 실험실 및 유제품 가공 환경에서 LAB 배양의 실행 가능성과 향상된 기능을 보장하기 위한 표준 프로토콜의 개발은 매우 중요합니다. 약하고 스트레스를 받고 손상된 LAB 배양 세포의 소생과 관련된 문제를 해결하기 위해 LAB 균주의 회복, 세포 재생 향상 및 대사 기능 개선을 위한 두드러진 단계를 생생하게 설명하는 프로토콜이 가장 중요합니다. LAB 스타터 배양의 배양 순도, 기능 및 생존력 유지도 마찬가지로 중요합니다. 따라서 고유한 프로토콜 지침을 준수하면 발효 및 생명공학 공정에 전념하는 많은 LAB 균주의 발효 성능이 향상될 것입니다. 그 결과, 노스캐롤라이나 농업 기술 주립 대학의 식품 미생물학 및 생명공학 연구소는 선택된 LAB 균주의 활성화 및 품질 관리를 위한 표준 프로토콜을 개발하여 발효 연구에 사용되는 고기능 및 실행 가능한 LAB 배양 균주를 탄생시켰습니다. 유제품 및 식품 산업에서 사용하기 위해 이와 같은 프로토콜을 조정하고 권장하면 많은 응용 분야에서 LAB 실행 가능성과 기능을 보장하는 데 도움이 될 것입니다.
Introduction
유산균(LAB)은 산업적 잠재력을 가진 독특하고 다양한 박테리아의 그룹입니다. 락토바실러스 델브루키에 속하는 균주 불가리쿠스와 스트렙토코커스 써모필러스는 주로 요구르트1과 같은 발효 유제품의 유제품 스타터 배양으로 사용됩니다. 선택된 LAB 균주는 복용량이적절하게 투여될 때 인간에게 건강상의 이점을 제공하기 때문에 프로바이오틱스로 분류됩니다2. 유산균은 또한 그람 양성, 포자 형성이 아닌, 호흡이 없지만 일반적으로 주요 발효 생성물로서 젖산의 생산을 특징으로 하는 공기내성 미생물입니다. LAB는 또한 광범위한 식품 매개 병원체4를 억제할 수 있는 유기산, 박테리오신 및 기타 항균 화합물3과 같은 필수 대사산물을 합성합니다. 탄수화물 이화 작용의 주요 최종 생성물이자 LAB 발효의 부산물인 젖산은 항균 특성을 가지고 있으며 식품 생물 보존 응용 분야에 잠재적으로 유용한 유기 대사 산물입니다 3,5,6. 또한 LAB에서 생산 된 유기산은 식품의 풍미, 질감 및 향을 부여하여 결과적으로 전반적인 관능적 특성을 향상시킵니다 5,6. LAB의 뚜렷한 영양 요구 사항과 유비쿼터스 특성이 결합되어 궁극적으로 박테리아가 유제품 기반 식품, 발효 식품, 야채 및 인간의 장7과 같은 다양한 환경에서 쉽게 번성할 수 있도록합니다.
요구르트 생산 및 다양한 유제품 응용 분야 8,9를 위한 LAB의 스타터 배양에 대한 수요가 증가하고 있으므로 LAB 균주 배양뿐만 아니라 동결건조 및 분리 균주의 활성화에서 중요한 관심과 확립된 과학 기술을 준수해야 합니다. 따라서 식품 미생물학 및 생명 공학 실험실은 발효 유제품 및 요구르트 생산에 사용되는 산업 스타터 배양에서 분리 된 LAB 균주의 활성화, 우수한 성장 및 발효 특성을 목표로하는 적절한 기술 개발에 적극적으로 참여하고 있습니다. 또한, 산업적으로 생산된 LAB 배양균주는 동결건조 및 냉동보관 등의 보존활성을 거쳐 이들이 겪게 되는 냉 충격 과정의 결과로 세포 스트레스 및 손상을 일으킨다는 점도 주목할 만하다(10). 단리된 식품 또는 동결건조 제품으로부터 수득된 LAB 균주의 제한, 생존성 도전 및 기능성 향상에 있어서, 이들의 발효 특성을 향상시키기 위한 품질 관리의 한 형태로서 이들 배양물을 적절하게 활성화시키는 것이 중요하다8. 이 연구의 목표는 궁극적으로 생존 가능한 LAB 성장을 촉진하고 LAB 균주의 발효 성능과 대사 기능을 향상시키는 L. delbrueckii subsp. bulgaricus 배양 균주의 활성화 및 성장을 위한 사내 품질 관리 프로토콜을 개발하는 것이었습니다. 이 프로토콜은 궁극적으로 발효 연구뿐만 아니라 산업 목적 또는 바이오 프로세싱 작업을위한 다른 LAB 균주의 배양을 위해 (최적의 성장 배지 및 적절한 배양 조건 사용) 적용될 수 있습니다. 따라서 이 LAB 활성화 및 품질 관리 프로토콜은 우수한 실행 가능한 유제품 스타터 배양을 얻고 글로벌 유제품 및 식품 산업의 다양한 응용 분야에서 잠재적으로 기능할 수 있도록 보장합니다.
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Protocol
1. 일반 재료 및 방법
- 락토바실러스 델브루에키 아종의 출처 불가리쿠스
- 신뢰할 수있는 출처에서 L. 불가리쿠스 균주를 얻으십시오.
참고: 이 연구에서는 총 5개의 L. 불가리쿠스 균주가 품질 관리 연구에 사용되었습니다(표 1). 발효유 제품의 산업 생산을위한 동결 건조 L. bulgaricus 의 두 가지 균주는 불가리아 플 로브 디프에있는 식품 기술 대학의 생명 공학과 인 Albert Krastanov 박사에 의해 제공되었습니다. 미국 시장에서 이용 가능한 상업용 요구르트 제품에서 분리 된 2 개의 균주는 노스 캐롤라이나 A & T 주립 대학의 식품 미생물학 및 생명 공학 실험실의 -80 ° C 재고에서 얻었으며 동결 건조 된 균주는 공급 업체 C에 의해 공급되었습니다. 모든 LAB 균주는 추가 사용이 될 때까지 -80°C에서 유지하였다. 또 다른 박테리아 균주 (Limosilactobacillus reuteri)는 노스 캐롤라이나 A & T 주립 대학의 식품 미생물학 및 생명 공학 실험실의 -80 ° C 재고로부터 얻어졌으며 또한 평가되었다.
- 신뢰할 수있는 출처에서 L. 불가리쿠스 균주를 얻으십시오.
- 표준 L. MRS 발효액 배지
- 1 L의 탈이온수(DW)에 55 g의 MRS 및 0.5 g의 L-시스테인을 완전히 용해시켜 드만, 로고사 샤프(MRS) 배지를 제조한다.
- 준비된 MRS 용액 7mL와 2mL를 각각 시험관에 분주하고 121°C에서 15분 동안 오토클레이브한 후 실온(RT)에서 냉각합니다.
- MRS 한천 배지
- 1L의 DW에 55g의 MRS 및 0.5g의 L- 시스테인을 완전히 용해시켜 MRS 한천 배지를 제조합니다. 한천 분말(15g)을 넣고 한천 배지를 121°C에서 15분 동안 멸균한 다음 수조에서 식힌다.
- 새로 준비된 모든 배지를 멸균 페트리 접시에 붓고 더 필요할 때까지 4 ° C에서 보관하십시오.
- 변형 강화 클로스트리듐 중간-피루브산(mRCM-PYR)
- Oyeniran et al.13 및 Nwamaioha 및 Ibrahim 18에 따라 강화 클로스트리듐 배지를 최적화하여 L. 불가리쿠스의 선택성 및 정확한 열거를 위해 펩톤 #3 10g, 쇠고기 추출물 10g, 효모 추출물 5g, 염화나트륨 5g, 아세트산나트륨 3g, 이염기성 인산칼륨 2g, DW 1L에 우라실 0.1g, 염화칼슘 0.25g, 덱스트로스 5g, 과당 5g, 맥아당 10g, 피루브산나트륨 2g, 트윈 80 0.2%, L-시스테인 0.5g.
- 0.008% 아닐린 블루와 15 g의 한천을 첨가하기 전에 6 N HCl을 사용하여 용액의 최종 pH(6.0 ± 0.2)를 조정한다. 배지를 121°C에서 15분 동안 오토클레이브하고, 수조에서 냉각시키고, 멸균된 페트리 접시에 붓는다. 새로 준비된 모든 배지는 필요할 때까지 4 ° C의 멸균 페트리 접시에 보관하십시오.
- LAB 배양물의 글리세롤 스톡
- 동일한 부피의 DW에 100% 글리세롤을 희석하여 글리세롤 스톡(50% 글리세롤)을 제조하고 건식 멸균 사이클을 사용하여 100°C에서 30분 동안 멸균합니다. 글리세롤 스톡을 RT로 식히고 추가 사용을 위해 무균 상태로 보관하십시오.
- 하룻밤 배양에서 박테리아 성장(개발된 QC 프로토콜을 사용하여 얻은 L. 불가리쿠스의 단일 콜로니)을 사용하십시오.
- 밤새 배양된 500μL를 2mL 원심분리 튜브에 50% 글리세롤로 피펫팅하고 부드럽게 혼합합니다. LAB 배양물을 함유하는 글리세롤 스톡을 동결시키고 필요할 때까지 -80°C의 초저온에서 보관한다.
참고: LAB 배양의 품질 관리 및 활성화를 위한 프로토콜의 그래픽 체계가 그림 1에 나와 있습니다.
| 아니요 | 제품 코드 | 견본 | 근원 | 1로 표시된 박테리아 조성 |
| 1 | 시즌 9 | 순수 산업용 변형 | 불가리아 | Lb. 불가리쿠스 |
| 2 | LB6 | 순수 산업용 변형 | 불가리아 | 파운드 불가리쿠스, |
| 3 | ATCC 11842 | 순수 산업용 변형 | 증권 시세 표시기 | Lb. 불가리쿠스 |
| 4 | 갈까마귀 | 요구르트 | 미국 | Lb. 불가리쿠스, 다른 라이브 문화 |
| 5 | E22 | 요구르트 | 미국 | Lb. 불가리쿠스, 다른 라이브 문화 |
| 6 | 로이테리 | 요구르트 | 미국 | 리모실락토바실러스 루테리 |
| 1파운드 =락토바실러스 | ||||
표 1: 프로바이오틱스 균주. 이 표에는 이 연구에 사용된 프로바이오틱스 균주가 나열되어 있습니다.
2. LAB 배양의 활성화 및 품질 관리를 위한 프로토콜
- -80°C 초저온 냉동고에서 준비된 LAB 균주(2mL 원심분리 튜브에 담겨 있음)의 글리세롤 재고를 꺼내 사용하기 전에 해동하지 마십시오.
- 원심 분리기 튜브의 입구를 70 % 알코올로 청소 및 소독하고 사용하기 전에 부드럽게 와동하십시오.
- 원심분리 튜브에서 약 250 μL (0.25 mL)의 스톡 LAB 배양물을 새로운 2 mL MRS 테스트 튜브로 피펫팅합니다.
- 부드럽게 소용돌이치고, 시험관을 파라 필름하고, 42 ° C에서 12-16 시간 동안 밤새 혐기성 배양합니다.
- 2mL MRS 시험관에서 하룻밤 동안 성장한 배양물에서 약 500μL(0.5mL)를 새로운 7mL MRS 시험관, 와류로 가져와 42°C에서 12-16시간 동안 밤새 혐기성 배양합니다.
- UV-가시광선 분광광도계로 610nm에서 배양물의 광학 밀도 (OD) 또는 성장을 측정하여 미생물 성장을 평가하고 0.7과 0.9 사이의 허용가능한 결과를 기록합니다.
- 7mL MRS 튜브에서 밤새 배양한 것을 MRS 및 MRCM-PYR 한천 플레이트에 걸고 42°C에서 72시간 동안 혐기성 배양합니다.
- 한천 플레이트에서 분리된 콜로니를 선택하여 신선한 7mL MRS 시험관으로 옮기고 부드럽게 소용돌이치고 42°C에서 12-16시간 동안 밤새 혐기성 배양합니다.
- 분리된 균주가 포함된 한천 플레이트를 4°C에서 일주일 동안 냉장고에 보관한다.
- 610nm에서 줄무늬 플레이트에서 분리된 LAB 배양물의 7mL MRS 시험관에서 OD(0.7에서 0.9 사이)를 측정 및 확인하고 이를 모든 관련 실험을 위한 작업 배양으로 사용합니다.
- 성장한 LAB 배양물을 최종 7mL MRS 시험관에서 펩톤수(생리학적 완충액) 9mL를 사용하여 10배 희석(연속 희석)하여 1:10 비율을 얻습니다.
- 마지막으로, 모든 발효 실험에 적합한 연속 희석액으로부터 약 250 μL (0.25 mL)를 취한다.
- 2.12단계의 균주(250μL)가 포함된 액체를 신선한 7mL MRS 브로스에 옮기고 42°C에서 16시간 동안 혐기배양하여 활성화합니다.
- LAB 배양에서 생존 가능하고 우수한 세포 성장을 보장하기 위해 2.6-2.12단계를 계속 반복합니다.
참고: 모든 L. 불가리쿠스 균주를 새로 준비된 MRS 배지에서 활성화시킨 다음, 0.7과 0.9 사이의 박테리아 성장의 광학 밀도(OD610 nm)에 도달하기 위해 42°C에서 16시간 동안 혐기배양하였다. 박테리아 성장은 610 nm에서 UV-가시광선 분광광도계로 측정하였다. 하룻밤 배양의 pH 값은 LAB 발효의 유기 최종 생성물인 젖산의 생산의 결과로 3.5 내지 5.3의 범위였다. 생물 안전 후드의 적절한 공기 흐름 순환 및 분젠 버너 사용 중 화상 방지와 같은 안전 절차를 준수하고 준수했습니다.
그림 1: 유산균(LAB) 배양 활성화를 위한 프로토콜의 그래픽 체계. 이 계획은 LAB 배양 균주의 취급 및 활성화에 필요한 세부 정보와 기본 도구를 제공합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Representative Results
품질 관리 프로토콜로 배양된 평가된 LAB 균주의 세포 성장은 이 표준 프로토콜 없이 배양된 균주와 유의하게 달랐습니다(P < 0.05). L. bulgaricus와 L. reuteri 모두에 대한 QC 프로토콜은 다중 계류 배양 접근법 (한천 플레이트에 줄무늬를 짓기 전에 3 번 계대 배양)을 사용하는 반면, 제어 절차는 다른 모든 조건이 일정하게 유지되는 상태에서 한 번만 계대 배양을 수행했습니다. 콜로니 성장은 또한 이 표준 QC 프로토콜을 사용하여 재배된 성장 배지 플레이트에서 더 높고 잘 정의되었습니다. 이것은 발효액에서 세포 분열을 통해 향상된 LAB 성장을 보장하는 프로토콜의 효과를 확인했으며, 따라서 LAB 균주에서 향상된 세포 대사를 돕습니다. 개발된 품질 관리 프로토콜의 유무에 관계없이 배양된 두 균주의 성장은 그림 2에 나와 있습니다. 균주를 한천 플레이트 상에 줄무늬를 표시한 후 강렬한 성장(OD610 nm에서 0.7-0.9)을 관찰하고 측정하였다. 플레이트를 42°C에서 72시간 동안 혐기성 배양한 후 줄무늬 라인을 따라 분리된 콜로니가 관찰되었습니다. 또 다른 연구(그림 3)는 TPY 배지에서 배양된 락토바실러스 루테리의 성장에 대한 품질 관리 프로토콜의 효율성을 확인하고, 37°C에서 배양했으며, 이에 따라 QC 프로토콜 기술에 의해 생성된 콜로니는 과거 데이터를 기반으로 안정적인 정상 상태 성장(OD610nm에서 평균 0.9)을 확인했습니다. 개발된 QC 기술을 사용하지 않은 다중 계대 배양 없이 LAB 활성화의 제어 방법은 L. 루테리의 고르지 않은 성장 패턴(OD610 nm에서 0.9-0.75)을 초래했습니다.
그림 2 : 개발 된 품질 관리 프로토콜의 유무에 관계없이 재배 된 L. bulgaricus 균주의 성장의 식민지 형태. 균주를 삼중으로 줄무늬를 붙이고 42°C에서 72시간 동안 혐기성 배양하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: L의 동작 이후 37°C에서 TPY 배지에서 성장시킨 후 표준화된 QC 프로토콜 및 통상적인 박테리아 배양 방법을 사용하여 일정 기간에 걸쳐 루테리를 배양하였다(P< 0.05). L. reuteri의 성장은 한 달 동안 주기적으로 모니터링되었으며 표준 QC 프로토콜을 사용한 배양 활성화를 기반으로 이전 연도의 과거 데이터와 일치했습니다. 오차 막대는 OD 값의 표준 편차를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
품질 관리 프로토콜로 평가 된 모든 균주의 결과와 프로토콜을 사용하지 않은 결과는 동일했기 때문에 균주 (S9 및 LB6)에만 연결된 결과가 제시되었습니다. 활성화된 LAB 균주는 높은 강도의 세포 바이오매스를 특징으로 하는 우수한 세포 성장을 가졌고, 따라서, 시험관(11)에서 MRS 발효액의 혼탁한 외관을 야기하였다. 배양 활성화 후 관찰된 세포 성장은 42°C의 혐기성 발효 온도에서 12시간 및 16시간 사이에 분명했습니다. 또한, 이 프로토콜에 기초하여 활성화된 LAB 균주는 연속적으로 그들의 콜로니 형태가 다중 계대배양 절차(12 )의 결과로서 변형된 것을 확인하였고, 스트리킹 라인을 따라 가시적인 콜로니를 갖는 것으로 확인되었다. 대조 실험은 이 표준 프로토콜을 사용하지 않았으며 한 번만 계대배양되었습니다. 그러나 OD610 nm에서 성장이 여전히 허용 범위 인 0.7-0.9 내에 있었지만 발효액에서 강렬한 탁도를 나타내지는 않았습니다. 또한 한천 플레이트에 대조 배양물을 걸고 표준 절차와 동일한 조건에서 혐기성 배양하는 것은 표준 프로토콜13에서 관찰된 것과 비교하여 더 작고 더 적은 콜로니만 묘사한다는 점도 주목할 만했습니다.
이것은 LAB 세포의 약하고 생존 할 수없는 특성 때문일 수 있습니다. 결과적으로, LAB 균주를 여러 번 계대 배양하고 한천 플레이트에 줄무늬를 붙이는 개념은 박테리아에서 세포 분열 및 유전 물질 교환을 통해 새로운 세포를 생성합니다. 이것은 세포 및 대사 기능을 향상시키고 발효 작업 동안 세포의 성장을 촉진합니다14. 또한 스트레스를 받고 손상된 LAB 세포는 성장 조건(영양 요구 사항, pH 및 온도)의 정상 상태를 기반으로 회복되어 쉽게 적응하고 완전한 세포 및 대사 기능을 회복할 수 있습니다6. 또한, 이 프로토콜을 엄격하게 준수하면 세포 배양의 오염이 더 크게 제한되므로 발효 목적으로 순수하고 우수한 세포 콜로니만 분리됩니다. 따라서, 한천 플레이트로부터 LAB 세포 배양물의 반복적인 스트리킹 및 회수는 LAB 발효 작업(15)과 같은 대사 활성에 매우 적합한 향상된 세포벽을 제공하였다. 또한, 개발된 품질 관리 프로토콜(그림 3)을 기반으로 한 L. 루테리의 성장에 대한 연구는 콜로니를 통해 배양 방법에 대한 LAB를 계대배양하는 것이 배양에서 배양으로 직접 계대배양하는 것과 비교하여 일정 기간 동안 최적의 성장 범위(0.9-1.0 OD 610 nm)에서 안정적이고 꾸준한 성장을 산출하는 방법을 확인했으며, 이는 OD610 nm에서 0.75에서 0.9로 급격한 성장을 초래했습니다. . 또한 QC 프로토콜은 시간이 지남에 따라 표준 편차(SD)가 0.1인 안정적인 박테리아 성장 패턴을 일관되게 산출한다는 것이 분명했습니다. 그러나 L. reuteri의 고르지 않은 성장은 박테리아 세포의 고르지 않은 성장으로 인해 SD가 0.1보다 컸습니다. 이미 언급했듯이이 고르지 않은 성장 패턴은 약하고 손상된 세포에 기인합니다. 따라서 발효 기간 동안 세포의 대사 기능이 감소했습니다14. 현재의 연구는 또한 Ahmed et al.16에 의한 이전 연구에 의해 확인되었으며, 그들의 연구에서 L. reueri는 트립티카제 펩톤 효모 추출물 (TPY) 한천 배지에서 37 °C에서 8 주 동안 전파되었다. L. reuteri의 꾸준한 성장에 기여한 요인은 연구 기간 동안 여러 계대 배양 활동 후에도 새롭고 우수한 활성 배양을 생성하는 세포 배양 방법 및 품질 관리 기술에 기인합니다.
이 프로토콜의 중요한 단계에는 항상 새롭고 하루 미만의 발효 배양을 사용하고 발효 시작 전에 항상 발효액 또는 성장 배지를 새로 준비하고 장기간 보관 기간 동안 배지의 강도와 효능이 감소하므로 저장된 성장 배지를 사용하지 않는 것이 포함됩니다. -80°C 또는 -20°C에서 스톡 배양물을 사용하는 경우, 배양물은 무균적으로 처리되어야 한다. 또한, 냉동실의 냉온 충격으로 인해 주식 배양이 약한 것으로 관찰되면 다음과 같이 소생술이 필요합니다. 약 6 시간 동안 혐기성 전 배양을 위해 약 2 mL의 보충 된 발효 배양액 (MRS)에 저농도 (약 100 μL)만을 접종해야하며, 약 5-6 mL의 추가 보충 된 MRS를 약 16 시간 동안 최종 혐기성 배양을 위해 첨가해야합니다17. 동결 건조 또는 동결 건조 배양을 사용하는 경우 동결 건조 된 배양액을 탈지액 우유 3mL에 회수하고 MRS와 같은 보충 된 발효액에 접종하기 전에 약 4-5 시간 동안 혐기성 배양하는 것이 좋습니다. 이러한 과정은 항상 LAB 세포 생존을 보장하는 데 중요합니다13.
또 다른 중요한 단계는 발효 배양의 세포 성장이 항상 OD610nm 인 0.7-0.9의 성장 범위 내에 있도록 하는 것입니다. 이는 성장 범위가 박테리아 성장 곡선(17)의 적절한 로그 또는 지수상으로서 권장되기 때문에 중요하다. 1을 초과하는 모든 광학 밀도 (OD) 값은 발효 배양이 대부분의 죽은 세포와 발효 배지에 주로 존재하는 독성 세포 폐기물의 축적으로 사멸 단계에 도달했음을 확인하기 때문에 정확하지 않습니다. OD 값이 1 (OD610nm > 1)보다 높은 경우 1 (OD610nm < 1) 미만의 OD 값에 도달 할 때까지 배양물을 2 배 또는 3 배 이상 희석하는 것이 좋습니다 18. 또 다른 우려 사항은 줄무늬가있는 플레이트를 발효 배양과 함께 적절하게 혐기성으로 배양하는 것입니다. 대부분의 LAB는 통성 혐기성 균이지만 산소가있는 경우 향상된 성장이 제한됩니다. 따라서 효율적인 성장을 촉진하기 위해 혐기성 조건에 대한 선호가 필요합니다. 42°C에서 배양 기간 동안 CO2를 생성할 수 있는CO2 챔버 또는 즉석 용기를 사용하는 것이 좋습니다. 배양된 플레이트에서 최상의 세포 성장 결과를 얻으려면 최적의 결과를 위해 72시간이 권장됩니다18.
그러나 단계를 엄격하게 준수하면 발효 절차를 위한 실행 가능하고 순수한 LAB 세포를 보장할 수 있으므로 이 표준 절차에는 제한이 없습니다. 이 표준 프로토콜의 중요성은 특히 발효 배양에서 프로바이오틱 세포 생존력을 보장하기 위한 사전 예방적 접근 방식을 기반으로 합니다. 이는 오염을 제거하고 궁극적으로 표준 조건에서 바람직한 발효 수율을 생산할 수있는 강력하고 실행 가능한 배양을 촉진하는 품질 관리 메커니즘 역할을합니다. 기존 또는 기존 방법과 관련하여 이 표준 프로토콜은 LAB 세포 생존력 문제(저온 쇼크 및 성장 불량 배지로 인한)의 가능성을 제거합니다. 또한 순수하고 실행 가능한 프로바이오틱 배양을 갖는 최초의 올바른 개념을 보장하고 시간을 절약하며 LAB 배양으로 작업할 때 생산성을 촉진합니다.
이 프로토콜은 연구 실험실, 유제품 및 식품 산업, 바이오 프로세싱, 발효 및 생명 공학 연구소 모두에서 사용될 수 있기 때문에이 기술의 미래 응용 프로그램은 엄청납니다. 이 프로토콜의 추가 장점은 단순한 특성을 기반으로하므로 실험실 장비를 정교하게 사용할 필요가 없습니다. 따라서 이 프로토콜은 과학, 기술, 공학 및 수학(STEM) 관련 분야에서 학생들의 관심을 장려하고 구축하기 위한 기본 실험실 환경이 있는 고등학교의 데모 또는 교육 학습에 사용될 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 출판물은 보조금 번호 NC에 의해 가능해졌습니다. X-267-5-12-170-1 국립 식량 농업 연구소 (NIFA) 및 NIZO 식품 연구 BV, 네덜란드, Jarrow Formulas, 미국, 노스 캐롤라이나 농업 및 기술 주립 대학의 가족 및 소비자 과학부 및 농업 연구소 (Greensboro, NC, USA 27411). 이 작업은 1890 년 역량 강화 프로그램 보조금 번호 (2020-38821-31113 / 프로젝트 등록 번호 021765)에 의해 부분적으로 지원되었습니다. 이 연구는 또한 DCM # 577 / 17.08.2018에 의해 승인 된 국가 연구 프로그램 '강력한 바이오 경제와 삶의 질을위한 건강 식품'에 따라 불가리아 교육 과학부에 의해 부분적으로 지원되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aniline Blue | Thermo Scientific | R21526 | 25 g |
| Beef extract | Research Products International | 50-197-7509 | 500 g |
| Yeast extract | Fisher Scientific | BP1422-500 | 500 g |
| Calcium Chloride dihydrate | Fisher Scientific | C79-500 | 500 g |
| Dextrose Anhydrous | Fisher Scientific | BP350500 | 500 g |
| D-Fructose | ACROS Organics | AC161355000 | 500 g |
| Difco agar powder | Difco | DF0812-07-1 | 2 kg |
| TPY agar | Difco | 211921 | 500 g |
| Eppendorf microcentrifuge tube (Snap-Cap Microcentrifuge Safe-Lock) | Fisher Scientific | 05-402-12 | 2 mL |
| Glycerol | Thermo Scientific | PI17904 | 500 mL |
| Infrared CO2 Incubator | Forma Scientific | ||
| Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus | American Type Culture Collection (ATCC) | ATCC 11842 | |
| Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus | Bulgaria | S9 | |
| Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus | Bulgaria | LB6 | |
| Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus | Food Microbiology and Biotechnology Laboratory (NCATSU) | DAW | |
| Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus | Food Microbiology and Biotechnology Laboratory (NCATSU) | E22 | |
| Limosilactobacillus reuteri | Biogai, Raleigh / Food Microbiology and Biotechnology Laboratory (NCATSU) | RD2 | |
| L-Cysteine hydrochloride monohydrate | Sigma-Aldrich | C6852-25G | 25 g |
| Maltose monohydrate | Fisher Scientific | M75-100 | 100 g |
| MRS broth | Neogen | 50-201-5691 | 5 kg |
| Peptone No. 3 | Hach | 50-199-6719 | 500 g |
| Potassium phosphate dibasic (K2HPO4) | Research Products International | 50-712-761 | 500 g |
| Sodium acetate trihydrate | Fisher Scientific | S220-1 | 1 kg |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-1 | 1 kg |
| Sodium pyruvate | Fisher Scientific | BP356-100 | 100 g |
| Test Tubes with Rubber-Lined Screw Caps | Fisher Scientific | FB70125150 | 25 x 150 mm |
| Tween 80 | Fisher Scientific | T164-500 | 500 mL |
| Ultra low freezer | So-Low | ||
| Uracil | ACROS Organics | AC157301000 | 100 g |
| UV- visible spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | Evolution 201 | |
| Vortex Genie 2 | Fisher Scientific | ||
| Yeast extract | Fisher Scientific | BP1422-500 | 500 g |
| Ethanol | Fisher Scientific | T08204K7 | 4 L |
| Hydrochloric Acid (6N (Certified), Fisher Chemical) | Fisher Scientific | SA56-500 | 500 mL |
References
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