Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

ग्लोमेरुलर प्रक्रियाओं पर क्रोनिक एकतरफा मूत्रवाहिनी अवरोध के प्रभावों को निर्धारित करने के लिए 2-फोटॉन माइक्रोस्कोपी का उपयोग करना

Published: March 4, 2022 doi: 10.3791/63329
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Medicine, Division of Nephrology, Indiana University School of Medicine

Summary

यहां, हम ग्लोमेरुलर गतिशीलता और कार्य पर लंबे समय तक मूत्रवाहिनी अवरोध के प्रभावों को निर्धारित करने के लिए सतह ग्लोमेरुली के साथ म्यूनिख विस्टार फ्रॉटर चूहों में 2-फोटॉन माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं।

Abstract

गुर्दे के गतिशील शरीर विज्ञान का पता लगाने के लिए उपयुक्त पशु रोग मॉडल के लिए नवीन माइक्रोस्कोपी विधियों को लागू करना एक चुनौती बनी हुई है। सतह ग्लोमेरुली वाले चूहे इंट्रावाइटल 2-फोटॉन माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके शारीरिक और पैथोफिजियोलॉजिकल प्रक्रियाओं की जांच करने का एक अनूठा अवसर प्रदान करते हैं। ग्लोमेरुलर केशिका रक्त प्रवाह और वाहिकासंकीर्णन और दवाओं, पारगम्यता और सूजन के जवाब में फैलाव का परिमाणीकरण कुछ ऐसी प्रक्रियाएं हैं जिनका अध्ययन किया जा सकता है। इसके अलावा, ट्रांसजेनिक चूहे, यानी, फ्लोरोसेंट रंजक और अन्य आणविक बायोमार्कर दृष्टिकोण के साथ लेबल किए गए पोडोसाइट्स, प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन और विशिष्ट आणविक परिवर्तनों के प्रभावों की सीधे निगरानी और मात्रा निर्धारित करने के लिए बढ़े हुए संकल्प प्रदान करते हैं।

चूहों में, जिनमें चार सप्ताह की उम्र के बाद सतह ग्लोमेरुली की कमी होती है, सतह ग्लोमेरुली को प्रेरित करने के लिए कई हफ्तों तक एकतरफा मूत्रवाहिनी रुकावट (यूयूओ) का उपयोग किया गया है। चूंकि यह प्रेरण मॉडल बेसलाइन अध्ययन की अनुमति नहीं देता है, इसलिए हमने म्यूनिख विस्टार फ्रॉमीटर (एमडब्ल्यूएफ) चूहों में यूयूओ मॉडल में ग्लोमेरुलर प्रक्रियाओं पर यूयूओ के प्रभावों को निर्धारित किया, जिनके पास शारीरिक स्थितियों के तहत सतह ग्लोमेरुली है। पांच सप्ताह या उससे अधिक के लिए यूयूओ मॉडल ने सकल गुर्दे की आकृति विज्ञान, पेरिटुबुलर और ग्लोमेरुलर माइक्रोवास्कुलचर, साथ ही ट्यूबलर एपिथेलिया की संरचना और कार्य में महत्वपूर्ण परिवर्तन ों को प्रेरित किया। ग्लोमेरुलर और पेरिटुबुलर लाल रक्त कोशिका (आरबीसी) प्रवाह में काफी कमी आई (पी < 0.01), शायद ग्लोमेरुलर और पेरिटुबुलर केशिकाओं के भीतर सफेद रक्त कोशिकाओं (डब्ल्यूबीसी) के पालन में महत्वपूर्ण वृद्धि के कारण। एल्ब्यूमिन का ग्लोमेरुलर चोरी गुणांक अनुपचारित एमडब्ल्यूएफ में 0.015 ± 0.002 से बढ़कर 5 सप्ताह के यूयूओ एमडब्ल्यूएफ चूहों में 0.045 ± 0.05 हो गया। यूयूओ के बारह सप्ताह के परिणामस्वरूप एल्ब्यूमिन के लिए सतह ग्लोमेरुलर घनत्व और ग्लोमेरुलर साइविंग गुणांक (जीएससी) में और वृद्धि हुई। ग्लोमेरुली में फ़िल्टर किए गए फ्लोरोसेंट एल्बुमिन को समीपस्थ नलिकाओं द्वारा पुन: अवशोषित नहीं किया गया था। इन आंकड़ों से पता चलता है कि सतह ग्लोमेरुली को प्रेरित करने के लिए यूयूओ का उपयोग सामान्य ग्लोमेरुलर प्रक्रियाओं और रोग परिवर्तनों का अध्ययन और व्याख्या करने की क्षमता को सीमित करता है।

Introduction

ग्लोमेरुलर प्रक्रियाओं को समझना, विशेष रूप से पोडोसाइट्स जीव विज्ञान, 50 से अधिक वर्षों के लिए एक लक्ष्य रहा है। सतह ग्लोमेरुली के साथ म्यूनिख विस्टार चूहों ने फिजियोलॉजिकल और पैथोलॉजिकल प्रक्रियाओंके कई पहलुओं को समझने के लिए माइक्रोपंक्चर अध्ययन सहित इन अध्ययनों में एक केंद्रीय भूमिका निभाई है। ग्लोमेरुलर घटकों का अध्ययन करने के लिए माइक्रोस्कोपी का उपयोग 2-फोटॉन माइक्रोस्कोपी के आगमन तक फोटोटॉक्सिसिटी के प्रभावों के कारण सीमित था, जिसने इस विषाक्त जोखिम को कम किया और प्रवेश 1,2 की गहराई में वृद्धि की। कंप्यूटर हार्डवेयर और सॉफ्टवेयर में तेजी से प्रगति के साथ, इसने एक ही सेटिंग 1,4,5 में घंटों के लिए त्रि-आयामी (3 डी) और चार-आयामी (समय) अध्ययन की अनुमति दी है।

दवाओं, पारगम्यता के जवाब में ग्लोमेरुलर केशिका रक्त प्रवाह, वाहिकासंकीर्णन और फैलाव की मात्रा, पारगम्यता और पारगम्यता और सूजन पर चार्ज के प्रभाव कुछ ग्लोमेरुलर प्रक्रियाएं हैं जिनका अध्ययन किया गया है। इसके अलावा, समीपस्थ नलिका का एस 1 खंड पहचान योग्य है, और एस 1 और एस 2 ट्यूबलर एपिथेलियम के व्यवहार में अंतरको 1,4 निर्धारित किया जा सकता है। चूहों में अध्ययन, विशेष रूप से माउस ट्रांसजेनिक सुविधाओं की सार्वभौमिक उपलब्धता के साथ, ग्लोमेरुलर रोग प्रक्रियाओं के आणविक जीव विज्ञान की समझ में तेजी से प्रगति हुई है। नॉकआउट अध्ययनों में ग्लोमेरुलर डिसफंक्शन के लिए व्यक्तिगत प्रोटीन जिम्मेदार हैं, खासकर प्रोटीनमेह 6,7,8 के संबंध में। हालांकि, ग्लोमेरुलर इमेजिंग अध्ययनों के लिए माउस मॉडल का उपयोग सीमित है क्योंकि ग्लोमेरुली अध्ययन किए गए कई उपभेदों में सतह से 100 μ m से अधिक नीचे हैं।

इसने जांचकर्ताओं को माउस मॉडल विकसित करने और उपयोग करने के लिए प्रेरित किया है जिसके परिणामस्वरूप सतह ग्लोमेरुली का अध्ययन किया जा सकता है। सबसे आम मॉडल पूर्ण यूयूओ 10,11,12 का उपयोग है। विस्तारित यूयूओ अवधि के अंत में, चूहों के गुर्दे में कई सतह ग्लोमेरुली हैं जो हो सकते हैं और अध्ययन किया गया है13,14। ग्लोमेरुलर जीव विज्ञान पर लंबे समय तक यूयूओ के प्रभावों को निर्धारित करने के लिए इन माउस अध्ययनों में कोई आधारभूत या नियंत्रण अध्ययन नहीं किया गया है। चूंकि यह चोट का एक गंभीर और लंबे समय तक मॉडल है जिसके परिणामस्वरूप तेजी से फाइब्रोसिस और कॉर्टिकल विनाश 10,11,12 है, हमने अनुमान लगाया कि ग्लोमेरुलर प्रक्रियाओं और कार्य पर प्रभाव पड़ेगा। इस प्रश्न का उत्तर देने के लिए, सतह ग्लोमेरुली के साथ म्यूनिख विस्टार फ्रॉटर (एमडब्ल्यूएफ) चूहों का उपयोग नियंत्रण / बेसलाइन मापदंडों का अध्ययन करने के लिए किया गया था, और बेसलाइन खोज की तुलना यूयूओ के पांच सप्ताह के बाद एमडब्ल्यूएफ चूहों में ग्लोमेरुलर अध्ययनों के साथ की गई थी। हमने स्प्राग डॉवले (एसडी) चूहों का भी अध्ययन किया, जिनके पास यूयूओ के बाद सतह ग्लोमेरुली नहीं है। निष्कर्ष बताते हैं कि एमडब्ल्यूएफ और एसडी चूहों में यूयूओ के 5 सप्ताह वास्तव में सतह ग्लोमेरुली की संख्या में वृद्धि करते हैं। हालांकि, ये ग्लोमेरुलर रक्त प्रवाह, सूजन और मैक्रोमोलेक्यूल पारगम्यता और आकार में चिह्नित परिवर्तनों के साथ असामान्य ग्लोमेरुली थे।

Protocol

सभी प्रयोगों ने प्रयोगशाला जानवरों की देखभाल और उपयोग के लिए गाइड का पालन किया और इंडियाना यूनिवर्सिटी स्कूल ऑफ मेडिसिन में पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया।

1. यूयूओ सर्जरी के लिए म्यूनिख विस्टार फ्रॉमीटर या एसडी चूहे तैयार करना

  1. आइसोफ्लोरेन (5% प्रेरण, 1.5-2.5% रखरखाव) का उपयोग करके चूहे को एनेस्थेटाइज करें, फिर आयोडीन-आधारित या क्लोरहेक्सिडीन-आधारित स्क्रब और अल्कोहल दोनों के साथ गोलाकार गति में सर्जिकल क्षेत्र को कई बार शेव, धोएं और कीटाणुरहित करें। संस्थागत आईएसीयूसी दिशानिर्देशों के अनुसार दर्द प्रबंधन के लिए लंबे समय तक काम करने वाले / धीमी गति से रिलीज एनाल्जेसिक लागू करें।
  2. स्केलपेल का उपयोग करके मध्य रेखा के साथ एक चीरा लगाएं; बाएं गुर्दे का पता लगाएं और इसे आसपास के पेरिटोनियल अंगों से मुक्त करें।
  3. गुर्दे की धमनी, गुर्दे की नस और मूत्रवाहिनी शामिल है। नाजुक संरचना को नुकसान न पहुंचाने के लिए सावधानी बरतते हुए, मूत्रवाहिनी को अन्य संरचनाओं से अलग करें।
  4. बारीक बल का उपयोग करके, मूत्रवाहिनी के चारों ओर 3-0 सीवन को सावधानीपूर्वक लूप करें और इसे बांध दें, सावधान रहें कि इसे फाड़ न दें। इस प्रक्रिया को पहली गाँठ के दोनों ओर कुछ मिलीमीटर दोहराएं ताकि दूसरी गाँठ बांधी जा सके और पूर्ण अवरोध का आश्वासन दिया जा सके।
  5. एक बार प्रक्रिया पूरी हो जाने के बाद, क्रमिक मांसपेशी परतों को सावधानीपूर्वक बंद करें। अंतिम परत को बंद करने से पहले, इसे पूरी तरह से बंद करने से पहले पेट में 2 एमएल गर्म, बाँझ 0.9% खारा जोड़ें। सर्जिकल स्टेपल के साथ बाहरी त्वचा को बंद करें।
  6. दर्द प्रबंधन के लिए लंबे समय तक काम करने वाली /धीमी गति से रिलीज एनाल्जेसिक लागू करें और संस्थागत आईएसीयूसी दिशानिर्देशों के अनुसार वसूली का बारीकी से निरीक्षण करें। इसके बाद समय-समय पर निगरानी करें और पांचवें सप्ताह के अंत में इमेजिंग के लिए तैयार करें।

2. टेक्सास रेड रैट सीरम एल्बुमिन (टीआर-आरएसए) का संश्लेषण

  1. 100 मिलीग्राम चूहे सीरम एल्बुमिन का वजन करें और इसे 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में पीएच 8.4 पर 0.1 एम सोडियम बाइकार्बोनेट बफर के 6.67 एमएल में घोलें।
  2. टेक्सास रेड-एक्स-सक्सिनिमिडिल एस्टर के 5 मिलीग्राम की शीशी में, डिमेथिल फॉर्मामाइड (डीएमएफ, उच्च गुणवत्ता) और भंवर के 100 μL जोड़ें जब तक कि सभी डाई भंग न हो जाए।
  3. चूहे के सीरम एल्बुमिन समाधान को कम / मध्यम सेटिंग पर एक भंवर पर रखें, ताकि समाधान की मात्रा खुली ट्यूब के शीर्ष के नीचे अच्छी तरह से घूम रही हो।
  4. ट्यूब को भंवर करते समय घुलित डाई जोड़ें।
  5. 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब लें, इसे पन्नी में लपेटें, ट्यूब को किसी भी रॉकर या रोलर पर रखें, और कमरे के तापमान (आरटी) पर 1 घंटे के लिए धीरे-धीरे आंदोलन करें।
  6. कोमल सरगर्मी के तहत एक हलचल पट्टी के साथ 0.9% NaCl की 5 L बाल्टी में, एक उपयुक्त 50 kDA आणविक भार कट-ऑफ डायलाइज़र (क्लिप के साथ एक झिल्ली, संलग्न झिल्ली ट्यूब, या डायलिसिस कैसेट सभी उपयुक्त हैं) की झिल्ली को गीला करें।
  7. झिल्ली प्रणाली में टीआर-आरएसए समाधान लोड करें और इसे आमतौर पर सिस्टम के साथ शामिल प्लवनशीलता संलग्नकों से संलग्न करें। टीआर-आरएसए के साथ 5 एल कंटेनर को 0.9% खारा घोल / टीआर-आरएसए के साथ रात भर 4 डिग्री सेल्सियस (ठंडे कमरे में) पर एक हलचल प्लेट पर कोमल आंदोलन के साथ रखें। अगले 36 घंटे में डायलिसिस समाधान को कम से कम तीन बार बदलें।
  8. झिल्ली की सूजन अब स्पष्ट टीआर-आरएसए समाधान की मात्रा में वृद्धि करेगी। अनुमानित एकाग्रता प्राप्त करने के लिए मूल 100 मिलीग्राम को मात्रा से विभाजित करें: डाई: प्रोटीन अनुपात 1: 1 होगा। लंबे समय तक भंडारण के लिए उपयुक्त मात्रा में एलिकोट और लियोफिलाइज करें।

3. उल्टे माइक्रोस्कोप पर 2-फोटॉन इंट्रावाइटल इमेजिंग की तैयारी

  1. 50 मिमी कवरस्लिप बॉटम डिश (40 मिमी कवरस्लिप व्यास के साथ) के कवर को हटा दें और किनारे के साथ आंतरिक तल पर ऑटोक्लेव टेप के 8 टुकड़े रखें। एक पिरामिड के आकार की, खाली खिड़की बनाएं, प्रति तरफ 4 टुकड़ों का उपयोग करके बाहरी किडनी को इस स्थान में फिट करने की अनुमति देने के लिए, जबकि ऑटोक्लेव टेप के साथ परिधीय रूप से संपर्क बनाए रखें, जिससे गति को कम करने में मदद मिल सके। गुर्दे के साथ सबसे अच्छा संपर्क सुनिश्चित करने के लिए चूहे के आकार के अनुसार रिक्ति को समायोजित करें।
  2. 50 मिमी कवरस्लिप बॉटम डिश के प्रत्येक तरफ 1 थर्मल पैड रखें। सुनिश्चित करें कि वार्मिंग पैड मंच को कवर करता है।
  3. क्रमशः 30x और 60x छवियों को उत्पन्न करने के लिए 0.75x ज़ूम और 1.5x ज़ूम पर 40x जल विसर्जन उद्देश्य का उपयोग करें, जिससे कम और उच्च-आवर्धन छवियों की अनुमति मिलती है। यदि आवश्यक हो, तो पीई -200 टयूबिंग के एक लंबे टुकड़े के साथ 1 एमएल सिरिंज का उपयोग करके उद्देश्य में पानी जोड़ें जो ट्यूबिंग के नीचे पानी की बूंद की बाती को रोकने के लिए नीचे के कोण पर उद्देश्य के शीर्ष तक पहुंच सकता है।
  4. अध्ययनों के बीच छवियों में स्थिरता सुनिश्चित करने के लिए नीले, हरे और लाल डिटेक्टरों के साथ 2% लेजर ट्रांसमिसिविटी का उपयोग करें। संदर्भित लेजर पर उत्तेजना तरंग दैर्ध्य को 800 एनएम पर सेट करें ( सामग्री की तालिका देखें), जो इस अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले सभी फ्लोरोफोर को कुशलतापूर्वक उत्तेजित करेगा।
    1. फोटोमल्टीप्लायर ट्यूब (पीएमटी) (420-490 एनएम, 950 लाभ) का उपयोग करके नीले उत्सर्जन को इकट्ठा करने के लिए बाहरी (गैर-डिसकैंटेड) डिटेक्टरों का उपयोग करें।
    2. हरे उत्सर्जन (500-550 एनएम, 100 लाभ) को पकड़ने के लिए एक हाइड डिटेक्टर का उपयोग करें।
    3. लाल उत्सर्जन (590-660 एनएम, 200 लाभ) को पकड़ने के लिए एक हाइड डिटेक्टर का उपयोग करें।
    4. पीएमटी (नीले उत्सर्जन) में ऑफसेट समायोजित करें ताकि ऊतक के रिक्त क्षेत्रों में केवल कुछ पिक्सेल का मूल्य शून्य हो।
      नोट: हरे और लाल उत्सर्जन के लिए एचआईडी डिटेक्टरों में स्वचालित ऑफसेट समायोजन होता है; केवल लाभ निर्धारित किया जा सकता है।
    5. छवियों को काले और सफेद के बीच 4,096-तीव्रता पैमाने देने के लिए बिट-गहराई को 12-बिट पर सेट करें।
      नोट: बोमन के अंतरिक्ष के भीतर कम तीव्रता वाले उत्सर्जन के संग्रह को सुनिश्चित करने के लिए इन मूल्यों को बाहर नहीं करने के लिए डिटेक्टरों (पीएमटी में ऑफसेट) की निचली सीमा निर्धारित करना आवश्यक है। यदि संवेदनशीलता सेटिंग बहुत कम है, तो दृश्य चेतावनी मार्कर इसका संकेत देंगे; इन मानों को शून्य का तीव्रता मान दिया जाता है।
  5. टेक्सास-रेड-एक्स-रैट सीरम एल्बुमिन के लगभग 6 मिलीग्राम को 1 एमएल की कुल मात्रा में पतला करें, घोल को 1 एमएल सिरिंज में लोड करें, और चरण 9.1 में होचस्ट 33342 के जलसेक के बाद चरण 4.1 में निवास करने वाले आईवी कैथेटर पर रखें।

4. इंट्रावाइटल 2-फोटॉन इमेजिंग के लिए सर्जिकल तैयारी

  1. पूर्व-एनेस्थेटाइज्ड चूहे को एक निवास शिरापरक पहुंच रेखा (ऊरु या जुगुलर) के साथ इसके किनारे रखें, जिसमें मुंडा बाएं फ्लैंक सपाट और सीधे मेज पर हों। सुनिश्चित करें कि सामने के पंजे एक-दूसरे को छूते हैं, जैसा कि पीछे के पंजे को करना चाहिए।
  2. पेट में प्राकृतिक स्थिति निर्धारित करने के लिए गुर्दे के लिए महसूस करने के लिए पसलियों के ठीक नीचे बाएं फ्लैंक को धीरे से थपथपाएं। यदि आवश्यक हो, तो मुंडा क्षेत्र के साथ एक स्थायी मार्कर का उपयोग करके एक रेखा खींचें, गुर्दे के केंद्र को नाक-से-पूंछ अभिविन्यास में विभाजित करें।
  3. दांत वाले बल की एक जोड़ी का उपयोग करके, त्वचा को पकड़ें और इसे ऊपर की ओर उठाएं ताकि अंतर्निहित वाहिका को कुचलने और सर्जिकल कैंची की एक जोड़ी के साथ चीरा लगाते समय रक्तस्राव को रोकने के लिए हेमोस्टैट्स की एक जोड़ी के साथ स्थायी मार्कर लाइन को पिंच करने की सुविधा मिल सके। रक्तस्राव को कम करने के लिए पतली बाहरी मांसपेशियों की परत के लिए इसे दोहराएं।
  4. पतली आंतरिक पेट की मांसपेशियों की परत का अंतिम चीरा लगाने के लिए, आकार और स्थिति का अनुमान लगाने के लिए गुर्दे को फिर से तैयार करें। सावधानी से आंतरिक मांसपेशियों की परत को बल की एक जोड़ी के साथ उठाएं और एक रेखा को कुचल दें जो गुर्दे के ऊपर की त्वचा को हेमोस्टैट्स के साथ विभाजित करती है जो गुर्दे के अनुमानित आकार का लगभग 1/3है ।
  5. बल के साथ मांसपेशियों की परत पर पकड़ बनाए रखते हुए, अंतिम चीरा लगाएं।
    नोट: इसे बहुत बड़ा बनाने की तुलना में एक छोटा चीरा बनाना और आवश्यकतानुसार विस्तार करना बेहतर है, जिसके लिए सीवन के साथ आंशिक समापन की आवश्यकता होगी।
  6. धीरे से आसपास की वसा द्वारा गुर्दे को पकड़ें। प्रत्येक हाथ में बल के साथ दोनों हाथों का उपयोग करके, गुर्दे की वसा को पकड़ने और पकड़ने के लिए हैंड-ओवर-हैंड तकनीक का उपयोग करके गुर्दे के निचले ध्रुव पर वसा को पकड़ने के लिए काम करें, नीचे की ओर काम करें।
  7. एक हाथ से गुर्दे के निचले ध्रुव पर वसा पर एक मजबूत पकड़ रखने के बाद, धीरे से वसा को खींचें और यदि आवश्यक हो, तो चीरा के माध्यम से गुर्दे को बहुत धीरे से निचोड़ें। यदि गुर्दे आसानी से नहीं गुजरते हैं, तो चीरा चौड़ा करें।

5. इमेजिंग के लिए चूहे की स्थिति

  1. सावधानी से उजागर गुर्दे को डिश के किनारे के खिलाफ रखें, थोड़ा रोटेशन के साथ ताकि गुर्दे का पेट का हिस्सा कवरस्लिप से संपर्क कर रहा हो और पृष्ठीय पक्ष किनारे से दूर हो।
  2. गति को कम करने के लिए, दो बाँझ 2 x 2 धुंध पैड लें, उन्हें खारा के साथ नम करें, और उन्हें गुर्दे के पृष्ठीय पक्ष के खिलाफ पैक करें, जिससे गुर्दे के पेट के हिस्से के संपर्क को किनारे तक मजबूत किया जा सके।
  3. दोहरे-पास रोडामाइन / एफआईटीसी क्यूब का उपयोग करके एपिफ्लोरेसेंस रोशनी के तहत माइक्रोस्कोप आईपीस के माध्यम से देखें। यदि गति का पता चलता है, तो स्थिति में मामूली समायोजन करें और सावधानीपूर्वक धुंध को समायोजित करें, यह सुनिश्चित करें कि यह गुर्दे के नीचे धक्का न दे। गति को और कम करने के लिए, चूहे को थोड़ा रोल करें, ताकि वक्ष पकवान से दूर हो।

6. मात्रात्मक विश्लेषण के लिए छवि अधिग्रहण

  1. एपिफ्लोरेसेंस रोशनी (चरण 5.3) का उपयोग करके गुर्दे की सतह को स्कैन करें और मोटराइज्ड स्टेज कंट्रोलर (आधुनिक प्रणालियों की एक विशेषता) से जुड़े सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके ग्लोमेरुली स्थिति (ओं) को चिह्नित करें।
  2. 2-फोटॉन रोशनी के तहत प्रत्येक रंग चैनल के लिए, प्रत्येक चिह्नित ग्लोमेरुलस के ऊपरी हिस्से का उथला 3 डी वॉल्यूम लें, जो पृष्ठभूमि छवियों के रूप में काम करेगा। ग्लोमेरुलर केशिका लूप की पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति की धुंधली तीव्रता को बेहतर ढंग से देखने के लिए इमेजिंग सॉफ्टवेयर के प्रदर्शन विकल्प में एक स्यूडोकलर पैलेट का उपयोग करें।
  3. फोकल बिंदु के रूप में एक सतही रक्त वाहिका का उपयोग करते हुए, धीरे-धीरे फ्लोरोसेंट एल्बुमिन को इंजेक्ट करें, जिससे प्रणालीगत वितरण के कारण प्रतिदीप्ति के उदय और गिरावट का निरीक्षण करने का समय मिल सके। संतृप्ति से ठीक नीचे स्थित पेरिटुबुलर वाहिका और केशिका लूप में तीव्रता प्राप्त करने के लिए पर्याप्त टीआर-आरएसए डालें।
    नोट: आमतौर पर सामग्री के जलसेक और रक्तप्रवाह में इसकी उपस्थिति के बीच 5 सेकंड की देरी होती है जब गुर्दे का छिड़काव सामान्य होता है।
  4. चरण 6.2 से सभी चिह्नित और छवि वाले ग्लोमेरुली के लिए 3 डी वॉल्यूम (1 μm अंतराल) प्राप्त करने से पहले लगभग 10 मिनट प्रतीक्षा करें।
    नोट: साइमनसेन के म्यूनिख विस्टार चूहों में सतह ग्लोमेरुली कम होती है। हालांकि, चूंकि एमडब्ल्यू चूहों के फ्रोमटर स्ट्रेन में सतह ग्लोमेरुली की अधिक संख्या होती है, इसलिए 10 ग्लोमेरुली तक अक्सर छवि बनाई जा सकती है।
  5. अध्ययन के अंत में आइसोफ्लुरेन के ओवरडोज के माध्यम से चूहे को इच्छामृत्यु करें। इच्छामृत्यु सुनिश्चित करने के लिए दोहरी न्यूमोथोराकोटामी करें।

7. ग्लोमेरुलर पारगम्यता की गणना

  1. माइक्रोस्कोप सिस्टम से जुड़े छवि देखने वाले सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके, प्रसंस्करण और विश्लेषण के लिए छवियों को 12-बिट कच्ची छवियों में निर्यात करें।
  2. पृष्ठभूमि 3 डी वॉल्यूम और कच्चे 3 डी वॉल्यूम को लोड करें जिसमें परिसंचारी फ्लोरोसेंट एल्बुमिन होता है। ग्लोमेरुली में सबसे चमकीले सतही केशिका लूप के साथ 3 डी वॉल्यूम में फोकल प्लेन का पता लगाएं, जिसमें आसपास के बोमन कैप्सूल के किनारे पर पर्याप्त जगह हो।
  3. दृश्य स्थलों का उपयोग करके, पृष्ठभूमि वॉल्यूम में पाए गए एक ही फोकल प्लेन का पता लगाएं। केशिका लूप में एक क्षेत्र का चयन करें और बोमन के अंतरिक्ष के भीतर प्रत्येक के औसत तीव्रता मूल्यों को ध्यान में रखते हुए। पृष्ठभूमि मानों के रूप में इन तीव्रता मानों का उपयोग करें।
  4. एल्ब्यूमिन युक्त छवि में बोमन के स्थान के भीतर एक क्षेत्र (क्षेत्र में कम से कम 20 x 20 पिक्सेल) को रेखांकित करें और तीव्रता पढ़ने पर ध्यान दें (एक ऐसे क्षेत्र का चयन करें जो बोमन की अंतरिक्ष तीव्रता के सबसे साफ माप को सुनिश्चित करने के लिए केशिका लूप या बोमन कैप्सूल से सटे नहीं है)। बोमन के अंतरिक्ष के भीतर औसत तीव्रता के लिए औसत मूल्य लेने के लिए दो अन्य क्षेत्रों पर खींचे गए क्षेत्र को स्थानांतरित करें।
  5. केशिका लूप अनुभाग के भीतर सबसे चमकीले प्लाज्मा फ्लोरोसेंट तीव्रता का चयन करें और इस क्षेत्र को घेरें। थ्रेशोल्ड फ़ंक्शन का उपयोग करके, उज्ज्वल मूल्यों को हाइलाइट करें (आमतौर पर केशिका लूप दीवारों के किनारों पर स्थित), आरबीसी छाया को प्रसारित करने से बचें, और मूल्य रिकॉर्ड करें।
    नोट: चूंकि रक्त के भीतर कारक प्लाज्मा प्रतिदीप्ति स्तरों के कम आकलन का कारण बनेंगे, इसलिए सबसे चमकीले क्षेत्रों का चयन करना महत्वपूर्ण है।
  6. Eq (1) का उपयोग करके GSC की गणना करने के लिए स्प्रेडशीट में मान दर्ज करें:
    GSC = Equation 1 (1)

8. लाइनस्कैन फ़ंक्शन का उपयोग करके सतह ग्लोमेरुलर केशिका लूप और गुर्दे वाहिका में लाल रक्त कोशिका प्रवाह की गणना करना

  1. एक उपयुक्त पोत (या तो एक केशिका लूप या एक पेरिटुबुलर पोत) खोजें। चूंकि संदर्भित छवि अधिग्रहण सॉफ्टवेयर (सामग्री की तालिका देखें) में लाइनेंकन फ़ंक्शन के लिए पोत को लंबवत होने की आवश्यकता होती है, घूर्णन फ़ंक्शन का उपयोग करके छवि को घुमाएं।
  2. एक बार जब पोत को घुमाया जाता है और सपाट लेट जाता है, तो अधिग्रहण मेनू पर एक्सटी फ़ंक्शन का चयन करें। 4,000 लाइनों को स्कैन करने के लिए सेट अप करें। जांच के लिए जहाज के पार लाइन रखें; सुनिश्चित करें कि फोकल प्लेन छवि के लिए सेगमेंट के अधिकतम व्यास पर है।
  3. रंग समग्र छवि पर बाएं-क्लिक करें और उस क्षेत्र की संदर्भ छवि उत्पन्न करने के लिए स्नैपशॉट लें का चयन करें जहां लाइनस्कैन लिया गया था। पोत के लाइनस्कैन को पकड़ने के लिए तुरंत स्टार्ट बटन पर क्लिक करें।
  4. आरबीसी प्रवाह दर निर्धारित करने के लिए, लाइनकैन को छवि प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर में आयात करें (सामग्री की तालिका देखें)। माप ड्रॉपडाउन मेनू के अंतर्गत क्षेत्र सांख्यिकी दिखाएँ संवाद बॉक्स खोलें। एकल रेखा आरेखण उपकरण का चयन करें और एक रेखा खींचें जो आरबीसी छाया के ढलान से मेल खाती है। चौड़ाई और ऊंचाई मान नोट करें।
    नोट: चौड़ाई के लिए प्राप्त पिक्सेल मान दूरी के अनुरूप होंगे; ऊंचाई के लिए पिक्सेल समय के अनुरूप हैं।
  5. गति की गणना करने के लिए निम्न सूत्र (Eq (2)) का उपयोग करें।
    rBC प्रवाह दर में μm/s = Equation 2 (2)
    नोट: यह संदर्भित माइक्रोस्कोप के साथ 60x आवर्धन और 400 हर्ट्ज स्कैन दर पर अधिग्रहण मापदंडों से मेल खाता है ( सामग्री की तालिका देखें)।
    1. कम से कम पांच गणना करें और प्रत्येक लाइनकैन के लिए गति की रिपोर्ट करने के लिए उन्हें औसत करें।
      नोट: ये पैरामीटर माइक्रोस्कोप सिस्टम के पिक्सेल आयाम और अधिग्रहण गति पर निर्भर होंगे।

9. ग्लोमेरुलर केशिका लूप में डब्ल्यूबीसी रोड़ा की गणना

  1. केशिका लूप में दर्ज डब्ल्यूबीसी की पहचान करने के लिए एक निवास शिरापरक पहुंच लाइन के माध्यम से होचस्ट 33342 परमाणु दाग (~ 8 μg / kg चूहे के वजन पर) का प्रशासन करें।
    नोट: फोटॉन स्कैटर और हीमोग्लोबिन द्वारा अवशोषण के कारण उपयोग करने योग्य गहराई सीमित होगी, खासकर कम तरंग दैर्ध्य नीले उत्सर्जन के लिए।
  2. इमेजिंग क्षेत्र में ग्लोमेरुलस को केंद्रीकृत करें और ग्लोमेरुलर सतह से शुरू होने वाला 3 डी डेटा सेट लें और डेटा को कम से कम 30 से 35 μm समाप्त करें। Z-दिशा में 1 μm चरण आकार का उपयोग करें।
  3. टेक्सास रेड एल्बुमिन चैनल के साथ नीले होचस्ट चैनल की तुलना करके डब्ल्यूबीसी की पहचान करें; डब्ल्यूबीसी की सकारात्मक पहचान करने के लिए केशिका लूप में लाल डाई और संबंधित परमाणु दाग के बहिष्करण की तलाश करें। सफेद रक्त कोशिकाओं को "पालन" के रूप में परिभाषित करें यदि वे 3 ऑप्टिकल वर्गों पर स्थिर दिखाई देते हैं। ग्लोमेरुलस के शीर्ष से घटना /10 ऑप्टिकल वर्गों के रूप में मानों की रिपोर्ट करें, जो 1 μm अंतराल पर लिया गया है।

10. सतह ग्लोमेरुली में रूलेक्स संरचनाओं की उपस्थिति को स्कोर करना

  1. चरण 9.3 के लिए समान निर्देशों का पालन करें और 3 डी डेटा सेट प्राप्त करें। आरबीसी के रूप में दिखाई देने वाली रूलेक्स संरचनाओं की तलाश करें जो पैकेट में ढेर होते हैं जो केशिका लूप के साथ चलते समय पृथक्करण का विरोध करते हैं। लंबी तरंगदैर्ध्य लाल उत्सर्जन के लिए कम फोटॉन स्कैटर के कारण अधिक गहराई पर संरचना के बेहतर विज़ुअलाइज़ेशन के लिए लाल फ्लोरोफोरे का उपयोग करें। ग्लोमेरुलस के शीर्ष से घटना /25 ऑप्टिकल वर्गों के रूप में मानों की रिपोर्ट करें, जो 1 μm अंतराल पर लिया गया है।

11. ग्लोमेरुली का अलगाव

  1. एक मानक चोरी तकनीक का उपयोग करके ताजा गुर्दे से ग्लोमेरुली के तीन समूहों को अलग करें जिसके परिणामस्वरूप चूहे ग्लोमेरुली15 की लगभग 90% शुद्धता होती है।
    1. किडनी कॉर्टेक्स को ठंडे फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (पीबीएस) में रखें और इसे कई महीन कैंची या रेजर ब्लेड का उपयोग करके कीमा करें।
    2. कीमा ऊतक को 100 μm बाँझ सेल छन्नी में जोड़ें और धीरे से इसे 5 mL सिरिंज प्लंजर और 50-100 mL ठंडे पीबीएस का उपयोग करके धक्का दें।
      नोट: ग्लोमेरुली गुजरने के दौरान अधिकांश नलिकाओं को बनाए रखा जाता है।
    3. समृद्ध ग्लोमेरुली अंश को 70 μm फ़िल्टर पर रखें और उन्हें ठंडे पीबीएस के साथ बड़े पैमाने पर धो लें। शेष नलिकाओं में से अधिकांश को हटाने के लिए 100-200 मिलीलीटर ठंडे पीबीएस के साथ फ़िल्टर धो लें।
    4. 1-2 एमएल ठंडे पीबीएस, सेंट्रीफ्यूज (10,000 × ग्राम, 2 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस) का उपयोग करके फिल्टर से ग्लोमेरुली एकत्र करें और आरएनए अलगाव तक उन्हें तरल नाइट्रोजन में स्नैप-फ्रीज करें।
      नोट: चरण-कंट्रास्ट माइक्रोस्कोपी द्वारा निर्धारित ग्लोमेरुलर शुद्धता >90% है, और उपज 2 गुर्दे से लगभग 10 मिलीग्राम है।

12. ग्लोमेरुलर आरएनए अलगाव

  1. आरएनए अलगाव अभिकर्मक का उपयोग करके जमे हुए ग्लोमेरुली गोली को 400 μL अभिकर्मक का उपयोग करके समरूप करें और 200 μL पिपेट टिप का उपयोग करके गोली को तोड़ दें, इसके बाद आरटी16 पर संक्षिप्त भंवर और 5 मिनट का इनक्यूबेशन।
  2. 1-ब्रोमो-3-क्लोरोप्रोपेन (बीसीपी) का 40 μL जोड़ें, 15 सेकंड के लिए भंवर, और 15 मिनट के लिए RT पर रखें।
  3. सेंट्रीफ्यूज 12,000 × ग्राम, 15 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस पर। जलीय परत को हटा दें, निचली परत को 70% इथेनॉल की समान मात्रा के साथ पतला करें, और इसे सीधे स्पिन कॉलम पर लोड करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
  4. धोने के बाद, प्रत्येक में कॉलम में संबंधित घोल जोड़ने के बाद 12,000 x g, 15 s, 26 °C [3 कुल, पहले 2 के साथ 500 μL RPE (लवण के निशान को हटाने के लिए इथेनॉल के साथ मालिकाना हल्का धुलाई बफर), 80% ETOH के 500 μL के साथतीसरा धोना,H2 के 15 μL के अतिरिक्त आरएनए को हटाने के लिए तैयार करना शामिल है। ओ और सेंट्रीफ्यूज, धोने के लिए। आरएनए की एकाग्रता और शुद्धता की जांच करें और आरएनए नमूनों को नैनोस्ट्रिंग विश्लेषण17,18 के लिए मुख्य सुविधा में ले जाएं।
    नोट: कुल आरएनए उपज लगभग 1-2 μg है। यहां, 24 नमूनों में 30 एनजी /

13. नैनोस्ट्रिंग विश्लेषण

नोट: नैनोस्ट्रिंग तकनीक लक्ष्य अणुओं के डिजिटल डिटेक्शन और प्रत्यक्ष आणविक बारकोडिंग पर आधारित है जो रंग-कोडित जांच जोड़े का उपयोग करते हैं। कैप्चर प्रोब में 3 'छोर पर एक बायोटिन मोइटी होती है, और रिपोर्टर जांच अपने 5 ' छोर पर सिग्नल ले जाती है।

  1. नैनोस्ट्रिंग जीन प्रोब जोड़े और कोडसेट को मिशिगन राज्य की जीनोमिक कोर सुविधा में भेजें और नैनोस्ट्रिंग द्वारा निर्देशित के रूप में उपयोग करें।
    नोट: रंग कोड के लिए छह स्थान हैं, और प्रत्येक स्थिति चार रंगों में से एक हो सकती है, जिससे टैग की एक बड़ी विविधता सक्षम हो सकती है जिसे डेटा संग्रह के दौरान व्यक्तिगत रूप से हल और पहचाना जा सकता है।
  2. मालिकाना नैनोस्ट्रिंग एनकाउंटर डिजिटल विश्लेषक का उपयोग करके जीनोमिक कोर सुविधा कर्मचारियों द्वारा एकत्र किए गए डेटा को प्राप्त करें, जो माइक्रोस्कोप उद्देश्य और सीसीडी कैमरे का उपयोग करके दृश्य के क्षेत्रों को एकत्र करता है और बारकोड गणना को सारणीबद्ध और प्रदर्शित करता है।
  3. विश्लेषण के लिए नैनोस्ट्रिंग के एनसॉल्वर सॉफ्टवेयर में कच्चे डेटा को आयात करें। उनकी डिफ़ॉल्ट सेटिंग्स का उपयोग करके सामान्यीकृत डेटा को सामान्यीकृत करें और उनके मैनुअल में उल्लिखित समूहों के बीच डेटा की तुलना करें।
    नोट: उद्देश्य यूयूओ मॉडल 19, किडनी रोग 17,20,21,22,23,24,25,26 से कॉर्टिकल ऊतक में पहले से ही परिवर्तित जीन परिवर्तनों की निगरानी करना था। अनुशंसित सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रणों सहित कुल 126 जीनों का विश्लेषण प्रत्येक ग्लोमेरुली समूह (सीओएनटी, एसएचएएम और यूयूओ) में किया गया था।

Representative Results

ग्लोमेरुली के तीन समूहों को एक मानक चोरी तकनीक का उपयोग करके अलग किया गया था जिसके परिणामस्वरूप चूहे ग्लोमेरुली15 की 90% शुद्धता होती है। पहला ग्लोमेरुली समूह एसडी चूहों के बाएं गुर्दे से था, जो 5 सप्ताह के लिए बाईं किडनी मूत्रवाहिनी क्लैंप से गुजरा था, यूयूओ (5 पुरुष, 3 महिलाएं)। दूसरे ग्लोमेरुली समूह को उसी चूहे, सीओएनटी (5 पुरुष, 3 महिलाएं) से विपरीत नियंत्रण गुर्दे से अलग किया गया था। ग्लोमेरुली के तीसरे समूह को एसडी चूहों से अलग किया गया था, जिनकी एसएचएएम सर्जरी हुई थी, और बाएं गुर्दे का उपयोग 5 सप्ताह के बाद ग्लोमेरुली अलगाव के लिए किया गया था, एसएचएएम (4 पुरुष, 4 महिलाएं)।

रूपात्मक परिवर्तन
इमेजिंग के लिए बाधित गुर्दे के बाहरीकरण से एक मोटे रूप से बढ़े हुए गुर्दे का पता चला, जो सामान्य आकार से लगभग चार गुना अधिक था, जिसमें तरल पदार्थ से भरे गुर्दे के इंटीरियर के माध्यम से पतली एपिथेलिया दिखाई देती थी। 20x उद्देश्य के माध्यम से, एपिफ्लोरेसेंस रोशनी और एक एफआईटीसी / रोडामाइन दोहरे-पास क्यूब का उपयोग करके, सबसे स्पष्ट परिवर्तन ट्यूबलर एपिथेलिया का पतला होना और पूरे ट्यूबलर लंबाई के साथ ट्यूबलर लुमेन का समान पतन था। हिस्टोलॉजी को अच्छी तरह से वर्णित किया गया है और यूयूओ 10,11,12 के एक सप्ताह तक गंभीर है। एमडब्ल्यूएफ और एसडी चूहों में सतह पर दिखाई देने वाले ग्लोमेरुली की संख्या पांच सप्ताह के एकतरफा मूत्रवाहिनी अवरोध के बाद बढ़ गई। चित्रा 1 ए यूयूओ मॉडल बनाने के लिए उपयोग की जाने वाली विधि को दर्शाता है। दाहिना गुर्दा अछूता है और चूहे के लिए पर्याप्त ग्लोमेरुलर निस्पंदन दर प्रदान करता है। 20x उद्देश्य (363 μm x 363 μm) का उपयोग करके प्रति क्षेत्र ग्लोमेरुली की संख्या को गिना गया और चित्र 1B में एक ग्राफ में दिखाया गया। एमडब्ल्यूएफ चूहों में सतह ग्लोमेरुली की संख्या अनुपचारित चूहों में 1.08 ± 0.11/ क्षेत्र से बढ़कर पांच सप्ताह के यूयूओ समूह में 2.97 ± 0.65 / क्षेत्र हो गई। यूयूओ के 5 सप्ताह के बाद एसडी चूहे 2.02 ± 0.37 / क्षेत्र तक चले गए।

टीआर-आरएसए (लाल), 10 केडीए कैस्केड ब्लू डेक्सट्रान (10 केडीए-सीबी), और नाभिक (सियान) को लेबल करने के लिए होचस्ट 33342 के साथ इंजेक्शन के बाद इन चूहों की इंट्रावाइटल 2-फोटॉन छवियां ली गईं। ये सामान्य एमडब्ल्यूएफ चूहों (चित्रा 1 सी), यूयूओ (चित्रा 1 डी) के पांच सप्ताह के बाद एमडब्ल्यूएफ चूहों और यूयूओ के पांच सप्ताह के बाद एसडी चूहों (चित्रा 1 ई) के लिए दिखाए गए हैं। ये छवियां ट्यूबलर एपिथेलिया में होने वाले नाटकीय परिवर्तनों को उजागर करती हैं। समीपस्थ नलिका लाइसोसोम, जो आमतौर पर अनुपचारित एमडब्ल्यूएफ और एसडी चूहों में छोटे छिद्रित नारंगी रंग के संचय होते हैं, बड़ी विलक्षण वैक्यूलर संरचनाएं बन जाती हैं जो सिकुड़ी हुई ट्यूबलर कोशिका के बहुमत को भर देती हैं। जैसा कि टीआर-आरएसए एल्ब्यूमिन द्वारा उल्लिखित किया गया है, वाहिका को सीधा किया गया दिखाई दिया, और कई वाहिकाओं में, बहते आरबीसी से रहित, केवल स्ट्रीमिंग प्लाज्मा दिखा रहा था। गुर्दे के निर्धारण से पता चला कि कॉर्टेक्स एक रेशेदार त्वचा में पतला हो गया था जो एक मिलीमीटर से अधिक मोटा नहीं था। ये अवलोकन इस मॉडल 3,10,11,12 का उपयोग करके प्रारंभिक साहित्य से सहमत हैं।

गुर्दे संवहनी गतिशीलता और ग्लोमेरुलर पारगम्यता में परिवर्तन
अनुपचारित चूहों की तुलना में पांच सप्ताह के यूयूओ एमडब्ल्यूएफ और एसडी समूहों दोनों में गुर्दे के रक्त प्रवाह में काफी कमी आई थी (चित्रा 2)। शाम-संचालित एमडब्ल्यूएफ चूहों में 885 ± 25 μm / s की पेरिटुबुलर आरबीसी प्रवाह दर थी। पांच सप्ताह के यूयूओ एमडब्ल्यूएफ और एसडी चूहों में पेरिटुबुलर आरबीसी प्रवाह क्रमशः 250 ± 100 μm / s और 200 ± 125 μm / s तक कम हो गया। इन मूल्यों की गणना आरबीसी गति की गणना करने के लिए पेरिटुबुलर जहाजों में लाइन स्कैन एकत्र करके की गई थी। चित्रा 2 डी इन डेटा का एक ग्राफ दिखाता है।

ग्लोमेरुलर केशिका लूप के भीतर आरबीसी की गति अनुपचारित एमडब्ल्यूएफ (चित्रा 3) की तुलना में पांच सप्ताह के यूयूओ एमडब्ल्यूएफ और एसडी चूहों में काफी कम हो गई थी। केशिका लूप आरबीसी प्रवाह दर क्रमशः 1,405 ± 425 μm /s, 250 ± 220 `m / s ±, और 190 ± 200 `m / s या अनुपचारित MWF, पांच सप्ताह UUO MWF, और पांच सप्ताह UUO SD चूहे थे (चित्रा 3D)। पांच सप्ताह के यूयूओ समूहों के केशिका लूप के भीतर, आरबीसी के सुस्त प्रवाह ने अनुयायी डब्ल्यूबीसी की उपस्थिति का खुलासा किया, या तो प्रवाह धीमा कर दिया या इसे अवरुद्ध कर दिया, जिसमें आंशिक या कुल रुकावट से केवल प्लाज्मा प्रवाह को नीचे की ओर देखा गया। इस अवलोकन को निर्धारित करने के लिए, 3 डी वॉल्यूम में पाए जाने वाले अनुयायी डब्ल्यूबीसी की संख्या की गणना की गई और फिर 3 डी वॉल्यूम गहराई के हर 10 μm के प्रति घटना के लिए सामान्यीकृत किया गया। होचस्ट 33342 से सियान परमाणु डाई प्रतिदीप्ति का उपयोग करके पालन किए गए सफेद सेल की संरचना को समझा जा सकता है। दुर्भाग्य से, नीली उत्सर्जक रोशनी के अधिक फोटॉन फैलाव ने उनके नाभिक द्वारा डब्ल्यूबीसी की विश्वसनीय पहचान को शीर्ष से ऊपरी 10 ऑप्टिकल वर्गों तक सीमित कर दिया, जो ग्लोमेरुलर वॉल्यूम के 1 μm चरणों पर लिया गया। अनुपचारित एमडब्ल्यूएफ चूहों में शीर्ष से 0.125 ± 0.05 डब्ल्यूबीसी / 10 ऑप्टिकल सेक्शन से कम था, जिसे 1 μm steps वॉल्यूम पर लिया गया था, जबकि यह संख्या क्रमशः 5 सप्ताह के UUO MWF और 5-सप्ताह UUO SD चूहों में 0.7 ± 1.5 और 3.25 ± बढ़ गई (चित्रा 3E)।

एक और संवहनी परिवर्तन जो 5 सप्ताह के यूयूओ समूहों में कम आरबीसी प्रवाह के लिए भी जिम्मेदार हो सकता है, रूलेक्स संरचनाओं की नियमित उपस्थिति थी (समूहीकृत आरबीसी जो "स्टैक्ड सिक्का" कॉन्फ़िगरेशन में पालन किए जाते हैं, चित्रा 3 एफ के इनसेट देखें)। रूलेक्स संरचनाएं अधिक धीरे-धीरे बहती हैं और एक अनुयायी डब्ल्यूबीसी द्वारा रोकी जा सकती हैं। अनुपचारित डब्ल्यूएमएफ चूहों के ग्लोमेरुलर केशिकाओं में लगभग कोई रूलेक्स संरचनाएं नहीं होती हैं, जिनमें शीर्ष से प्रति 25 ऑप्टिकल वर्गों में केवल 0.05 ± 0.05 घटनाएं होती हैं, जिन्हें 1 μm चरणों पर लिया जाता है। पांच सप्ताह के यूयूओ एमडब्ल्यूएफ और एसडी चूहों में रूलेक्स संरचनाओं में 2.27 ± 0.46 और 1.46 ± 0.73 प्रति 25 ऑप्टिकल खंडों में उल्लेखनीय वृद्धि हुई थी, जो क्रमशः 1 μm चरणों पर लिया गया था (चित्रा 3 एफ)।

यूयूओ के साथ देखे गए ग्लोमेरुलर आरबीसी प्रवाह दरों में कमी के अलावा, एल्बुमिन पारगम्यता में वृद्धि देखी गई थी। ग्लोमेरुली के बीच एल्बुमिन पारगम्यता में अधिक विविधता थी। कभी-कभी, बोमन के अंतरिक्ष के भीतर एल्बुमिन संचय स्पष्ट रूप से देखे जाने के लिए पर्याप्त तीव्र था (चित्रा 4 बी, तारांकन)। एल्ब्यूमिन का ग्लोमेरुलर चोरी गुणांक अनुपचारित एमडब्ल्यूएफ में 0.015 ± 0.002 से बढ़कर 5 सप्ताह के यूयूओ एमडब्ल्यूएफ में 0.045 ± 0.05 और पांच सप्ताह के यूयूओ एसडी चूहों में 0.075 ± 0.052 हो गया।

परिवर्तित समीपस्थ नलिका फ़ंक्शन
दिलचस्प बात यह है कि यूयूओ के बाद समीपस्थ नलिका कोशिकाओं में फ़िल्टर किए गए एल्बुमिन का पता नहीं लगाया जा सका। एस 1 खंड आम तौर पर एल्बुमिन 27,28,29,30 की बड़ी मात्रा को एंडोसाइटोसिस करता है, जैसा कि अनुपचारित एमडब्ल्यूएफ चूहों में शारीरिक स्थितियों के तहत यहां दिखाया गया है (चित्रा 5 ए)। यूयूओ (चित्रा 5 बी, सी) के 5 सप्ताह के बाद एमडब्ल्यूएफ या एसडी पीटी में यह तेज नहीं देखा जा सकता है। टीआर-आरएसए जलसेक के बाद 45 से 60 मिनट के बीच चित्रित ग्लोमेरुली के आसपास समीपस्थ नलिकाओं को एल्बुमिन की उपस्थिति (1) या अनुपस्थिति (0) के लिए स्कोर किया गया था। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि शारीरिक स्थितियों के तहत, एस 1 खंड एल्बुमिन को तेजी से बांधता है और आंतरिक रूप से आंतरिक करता है, जिसमें कोई एल्बुमिन डिस्टल नलिकाओं तक नहीं पहुंचता है या नलिकाओं को इकट्ठा करता है। इसलिए, यह कारण है कि बाद के समीपस्थ नलिका खंडों में एल्बुमिन नहीं हो सकता है जिसके परिणामस्वरूप एल्बुमिन अपटेक के लिए 1.0 से कम आंशिक सकारात्मकता हो सकती है। चित्रा 5 डी समीपस्थ नलिका एल्ब्यूमिन अपटेक स्कोरिंग के परिणामों के साथ एक ग्राफ दिखाता है। अनुपचारित एमडब्ल्यूएफ में समीपस्थ नलिका आंशिक अपटेक मान 0.556 ± 0.126 था। पांच सप्ताह के यूयूओ एमडब्ल्यूएफ और एसडी चूहों दोनों में क्रमशः 0.049 ± 0.126 और 0.00 ±0.00 के काफी कम मूल्य थे।

12 सप्ताह के यूयूओ एमडब्ल्यूएफ चूहों में अध्ययन भी पूरा किया गया (तालिका 1)। यूयूओ के बारह सप्ताह सतह ग्लोमेरुली को प्रेरित करने के लिए माउस अध्ययन के लिए उपयोग किया जाने वाला मानक समय है। तीन यूयूओ नर चूहों को चित्रित किया गया था, और ग्लोमेरुलर घनत्व इन चूहों में 6.16 ± 1.83 ग्लोमेरुली प्रति 20x क्षेत्र तक बढ़ गया। आरबीसी प्रवाह दर 293 ± 67 μm / s थी, WBC आसंजन 1.47 ± 1.12 था, दोनों 5 सप्ताह के UUO डेटा के समान थे। एल्बुमिन का जीएससी भी 5 सप्ताह के यूयूओ चूहों की तुलना में 0.109 ± 0.04 तक बढ़ गया।

ग्लोमेरुलर एमआरएनए परिवर्तन क्रोनिक यूयूओ द्वारा प्रेरित
तालिका 2 सभी जीनों (जांच) को उनकी समूहीकृत अभिव्यक्ति और मानक विचलन मूल्यों के साथ दिखाती है। ध्यान दें, जीन को गुर्दे की बीमारी में परिवर्तन के पिछले प्रलेखन के आधार पर विश्लेषण के लिए चुना गया था, जिसमें यूयूओ भी शामिल था जैसा कि प्रोटोकॉल अनुभाग 13 के नोट में वर्णित है। चित्रा 6 डेटा का एक गर्मी मानचित्र है जो यूयूओ ग्लोमेरुली में अधिकांश जीनों के लिए जीन अभिव्यक्ति में नाटकीय परिवर्तनों को उजागर करता है।

Figure 1
चित्र 1: एमडब्ल्यूएफ चूहों में 5 सप्ताह के यूयूओ के बाद एसडी चूहों में सतह ग्लोमेरुली की संख्या में वृद्धि और सतह ग्लोमेरुली का प्रेरण। (ए) सर्जिकल सीवन का उपयोग करके दो संबंधों के साथ अवरुद्ध होने से पहले गुर्दे की धमनी और नस से सावधानीपूर्वक मुक्त बाएं गुर्दे पर मूत्रवाहिनी का एक शल्य चिकित्सा आरेख। (बी) यूयूओ से पहले और पांच सप्ताह बाद एमडब्ल्यूएफ चूहों में मौजूद सतह ग्लोमेरुली की संख्या में वृद्धि के साथ-साथ एसडी चूहों में सतह ग्लोमेरुली की संख्या को दर्शाता एक ग्राफ, जिसमें सामान्य रूप से कोई सतह ग्लोमेरुली नहीं होती है। एमडब्ल्यूएफ चूहों में सतह ग्लोमेरुली की संख्या अनुपचारित चूहों में 1.08 ± 0.11 / क्षेत्र से बढ़कर 5 सप्ताह के यूयूओ समूह में 2.97 ± 0.65 / क्षेत्र हो गई। एसडी चूहे बिना सतह ग्लोमेरुली से 2.02 ± 0.37 / क्षेत्र तक चले गए। त्रि-आयामी पुनर्निर्मित छवियां अनुपचारित एमडब्ल्यूएफ (सी), 5 सप्ताह के यूयूओ (डी) के बाद एमडब्ल्यूएफ और पांच सप्ताह के यूयूओ (ई) के बाद एसडी के लिए गुर्दे की सतह दिखाती हैं। बड़े, नारंगी वैक्यूलर संरचनाओं की उपस्थिति पर ध्यान दें जो छोटे व्यक्तिगत लाइसोसोम से बड़े असामान्य निकायों में एकत्रित हुए हैं। एसडी चूहों में 5 सप्ताह के यूयूओ के परिणामस्वरूप सी में और आंशिक रूप से डी में देखे गए सामान्य ट्यूबलर एपिथेलिया जैसे क्षेत्र नहीं थे। वाहिका कुछ क्षेत्रों में सीधी दिखाई दी और, कई में, आंशिक अवरोध थे जो प्लाज्मा को प्रवाह करने की अनुमति देते थे लेकिन आरबीसी को प्रवाहित नहीं करते थे। (एन = 3 नर चूहे प्रति समूह) स्केल सलाखों = 40 μm. त्रुटि पट्टियाँ मानक विचलन इंगित करती हैं. संक्षेप: यूयूओ = एकतरफा मूत्रवाहिनी अवरोध; एसडी = स्प्राग-डॉवले; एमडब्ल्यूएफ = म्यूनिख विस्टार फ्रॉमीटर; जी = ग्लोमेरुलस; आरबीसी = लाल रक्त कोशिकाएं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: 5 सप्ताह के यूयूओ के बाद सतही पेरिटुबुलर वास्कुलचर के भीतर आरबीसी प्रवाह में कमी। आरबीसी प्रवाह की गति को μm / s में निर्धारित करने के लिए पेरिटुबुलर रक्त वाहिकाओं में लाइनकैन एकत्र किए गए थे। संक्षेप में, ए, बी और सी में दिखाई गई लाल संदर्भ रेखाएं एक छोटे से क्षेत्र का प्रतिनिधित्व करती हैं जिसमें एक ही पिक्सेल चौड़े क्षेत्र को बार-बार स्कैन किया गया था, और छवियों को बहते आरबीसी के कारण होने वाली विकृति की कल्पना करने के लिए एक कॉलम में ढेर किया गया था, जो माइक्रोस्कोप की तुलना में तेजी से यात्रा कर सकते हैं। संदर्भ आंकड़े से सटे स्तंभ लाइनस्कैन है, जिसमें आरबीसी विरूपण की ढलान का उपयोग गति (एक्स-अक्ष = दूरी और वाई-अक्ष = समय) की गणना करने के लिए किया जा रहा है। यहां, उत्तरोत्तर तेज ढलान धीमी आरबीसी गति के अनुरूप हैं क्योंकि वे लाइनस्कैन क्षेत्र में लंबे समय तक रहते हैं। एमडब्ल्यूएफ (बी) और एसडी (सी) चूहों के लिए पांच सप्ताह के यूयूओ छवियों की तुलना में अनुपचारित एमडब्ल्यूएफ चूहों (ए) में आरबीसी की उपस्थिति में अंतर पर ध्यान दें। तीन चूहे समूहों के लिए आरबीसी प्रवाह गति डी में दिखाई गई है। अनुपचारित एमडब्ल्यूएफ में पेरिटुबुलर आरबीसी प्रवाह औसतन 885 ± μm / s था। एमडब्ल्यूएफ और एसडी चूहों में यूयूओ के पांच सप्ताह बाद ये मान क्रमशः 250 ± 100 μm / s और 200 ± 125 μm / s तक गिर गए। स्केल बार = 20 μm, n = 3 नर चूहे प्रति समूह। त्रुटि पट्टियाँ मानक विचलन इंगित करती हैं. संक्षेप: यूयूओ = एकतरफा मूत्रवाहिनी अवरोध; एसडी = स्प्राग-डॉवले; एमडब्ल्यूएफ = म्यूनिख विस्टार फ्रॉमीटर; आरबीसी = लाल रक्त कोशिका; डब्ल्यूबीसी = सफेद रक्त कोशिका। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: ग्लोमेरुलर केशिका लूप आरबीसी प्रवाह में महत्वपूर्ण कमी और 5 सप्ताह के यूयूओ द्वारा डब्ल्यूबीसी आसंजन के प्रेरित सक्रियण। ग्लोमेरुलर केशिका रक्त प्रवाह में परिवर्तन की जांच के लिए पेरिटुबुलर आरबीसी प्रवाह को निर्धारित करने के लिए उपयोग किए जाने वाले एक ही लाइनकैन दृष्टिकोण का उपयोग किया गया था। पैनल ए, बी और सी चित्रा 2 के समान लेआउट दिखाते हैं और क्रमशः शाम संचालित एमडब्ल्यूएफ, पांच सप्ताह के यूयूओ एमडब्ल्यूएफ और पांच सप्ताह के यूयूओ एसडी में ग्लोमेरुलस पर ध्यान केंद्रित करते हैं। (घ) शाम-संचालित एमडब्ल्यूएफ चूहों से केशिका लूपों में शारीरिक रूप से उच्च आरबीसी प्रवाह दर का खुलासा करने वाला एक ग्राफ क्रमशः 1,405 ± 425 μm/s ± 425, 5-सप्ताह के UUO MWF और 5-सप्ताह UUO SD चूहों के लिए क्रमशः 220 μm/s और 200 ± 190 ± 250 μm/s तक कम हो गया। ग्लोमेरुलर केशिका लूप की जांच करते समय, ग्लोमेरुलस के माध्यम से ध्यान केंद्रित करते समय अनुयायी डब्ल्यूबीसी आसानी से दिखाई देते थे। अलग-अलग ग्लोमेरुली के त्रि-आयामी ऑप्टिकल खंड लिए गए थे, और पहले 10 ऑप्टिकल खंडों, 1 मीटर की दूरी पर, का उपयोग अनुगामी डब्ल्यूबीसी की संख्या को मापने के लिए किया गया था। अनुपचारित एमडब्ल्यूएफ चूहों के पास उनके वॉल्यूम में लगभग कोई दृश्यमान डब्ल्यूबीसी नहीं था, जो शीर्ष से 0.125 ± 0.05 डब्ल्यूबीसी / 10 ऑप्टिकल सेक्शन से कम था, जिसे 1× कदम पर लिया गया था। 5 सप्ताह के यूयूओ एमडब्ल्यूएफ और एसडी चूहों में, ये संख्या क्रमशः 1 `m चरणों पर लिए गए शीर्ष से 0.7 WBCs / 10 ऑप्टिकल वर्गों ± 1.5 ± 0.5 और 3.25 तक बढ़ गई। ये परिणाम पैनल ई में ग्राफ में दिखाए गए हैं, जिसमें रंग डालने वाले डब्ल्यूबीसी को केशिका लूप दिखाते हैं। रूलेक्स संरचनाएं (तीर, पैनल एफ में इनसेट) आरबीसी के रूप में दिखाई देती हैं जो एक "स्टैक्ड कॉइन" कॉन्फ़िगरेशन में एक साथ कसकर बंधे होते हैं जो रक्त प्रवाह की अशांति में भी अपने बंडल समूह को काफी हद तक बनाए रखते हैं। ये पैथोलॉजिकल संरचनाएं ग्लोमेरुलस के भीतर अधिक गहराई पर आसानी से देखी जा सकती थीं। शाम-संचालित एमडब्ल्यूएफ चूहे काफी हद तक इन संरचनाओं से रहित थे, जिनमें केवल 0.05 ± 0.05 घटनाएं शीर्ष से 25 ऑप्टिकल खंड थीं, जो ग्लोमेरुलर वॉल्यूम के 1 μm चरणों पर ली गई थीं। इसके विपरीत, एमडब्ल्यूएफ और एसडी चूहों दोनों में 5 सप्ताह के यूयूओ में रूलेक्स संरचनाओं में 2.27± 0.46 और 1.46 ± 0.73/25 ऑप्टिकल सेक्शन की घटनाओं के साथ क्रमशः 1 `m चरणों पर लिया गया था। स्केल सलाखों = 20 μm, n = 3 नर चूहे प्रति समूह। त्रुटि पट्टियाँ मानक विचलन इंगित करती हैं. संक्षेप: यूयूओ = एकतरफा मूत्रवाहिनी अवरोध; एसडी = स्प्राग-डॉवले; एमडब्ल्यूएफ = म्यूनिख विस्टार फ्रॉमीटर; आरबीसी = लाल रक्त कोशिका; डब्ल्यूबीसी = सफेद रक्त कोशिका। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: 5 सप्ताह के यूयूओ के बाद ग्लोमेरुलर केशिका एल्बुमिन पारगम्यता में महत्वपूर्ण वृद्धि। पैनल ए, बी, और सी क्रमशः अनुपचारित एमडब्ल्यूएफ, 5 सप्ताह के यूयूओ एमडब्ल्यूएफ और पांच सप्ताह के यूयूओ एसडी चूहों में चूहे सीरम एल्बुमिन चैनल के लिए 3 डी वॉल्यूम की छद्म रंग छवियां दिखाते हैं। बोमन के स्थान में देखे गए फ़िल्टर किए गए एल्बुमिन की सराहनीय मात्रा को उजागर करने के लिए छवियों को एक छद्म रंग पैलेट में प्रस्तुत किया गया है, विशेष रूप से पैनल बी (तारांकन) में। (ए) बोमन का स्थान (तारांकन) आमतौर पर अनुपचारित एमडब्ल्यूएफ चूहों में देखे जाने वाले एल्बुमिन के सामान्य स्तर को दर्शाता है, जो आंखों के लिए अस्पष्ट है। ग्लोमेरुली की छवियों को एल्ब्यूमिन के जलसेक से पहले लिया गया था ताकि एल्बुमिन प्रशासन के बाद लिए गए लोगों से पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति मूल्यों को घटाया जा सके। (डी) अनुपचारित एमडब्ल्यूएफ चूहों में एल्ब्यूमिन के लिए ग्लोमेरुलर साइविंग गुणांक के साथ एक ग्राफ, जिसका मान 0.015 ± 0.002 है। यह मान 5 सप्ताह के यूयूओ एमडब्ल्यूएफ चूहों में 0.045± 0.05 और पांच सप्ताह के यूयूओ एसडी चूहों में 0.052 ± 0.075 तक काफी बढ़ गया। यह पैरामीटर बोमन स्पेस के फ्लोरोसेंट तीव्रता का एक अनुपातित मूल्य है जिसे प्लाज्मा मूल्य द्वारा विभाजित किया गया है और माप की कोई संबद्ध इकाई नहीं है। स्केल बार = 20 μm, n = 3 नर चूहे प्रति समूह। स्यूडोकलर तीव्रता पैमाने पैनल डी के नीचे स्थित है। त्रुटि पट्टियाँ मानक विचलन इंगित करती हैं. संक्षेप: यूयूओ = एकतरफा मूत्रवाहिनी अवरोध; एसडी = स्प्राग-डॉवले; एमडब्ल्यूएफ = म्यूनिख विस्टार फ्रॉमीटर; आरबीसी = लाल रक्त कोशिका; डब्ल्यूबीसी = सफेद रक्त कोशिका। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्र 5: 5 सप्ताह के यूयूओ के बाद समीपस्थ नलिकाओं में कम कार्य(ए) एक सामान्य म्यूनिख विस्टार फ्रोमटर चूहे से सतही ग्लोमेरुलस और एस 1 खंड की एक छवि जो टीआर-आरएसए और कैस्केड ब्लू डेक्सट्रान के जलसेक के 40 मिनट बाद ली गई थी। टीआर-आरएसए का आंतरिककरण एस 1 खंड और समीपस्थ नलिका में देखा जा सकता है। इसके विपरीत, एमडब्ल्यूएफ चूहे (बी) और एसडी चूहे (सी), 5 सप्ताह के यूयूओ के अधीन, टीआर-आरएसए के न्यूनतम या बिना किसी उत्थान के साथ गंभीर रूप से परिवर्तित समीपस्थ नलिकाओं को प्रदर्शित करते हैं। सामान्य रूप से छोटे, पंक्टेट ऑटोफ्लोरोसेंट लाइसोसोम (ए) बड़े और वैक्यूलर पीले-नारंगी संरचनाएं बन जाते हैं, अक्सर ट्यूबलर लुमेन के पूर्ण पतन के साथ, जो तीन-आयामी डेटा सेट में नहीं पाया जा सकता है। (सी) डिस्टल नलिकाएं आमतौर पर ऑटोफ्लोरेसेंस के किसी भी रूप से रहित होती हैं, जिनमें अब ऑटोफ्लोरोसेंट संचय होते हैं। जलसेक के 45-60 मिनट बाद ली गई समान छवियों में ग्लोमेरुली के आसपास समीपस्थ नलिकाओं को स्कोर करने से, एल्बुमिन अपटेक के लिए, शाम-संचालित एमडब्ल्यूएफ समूह और दोनों 5-सप्ताह के यूयूओ समूहों के बीच एक महत्वपूर्ण अंतर दिखाया गया। अनुपचारित एमडब्ल्यूएफ चूहों में समीपस्थ नलिका आंशिक अपटेक मान 0.556 ± 0.126 था। पांच सप्ताह के यूयूओ एमडब्ल्यूएफ और एसडी चूहों दोनों में क्रमशः 0.049 ± 0.126 और 0.00 ±0.00 के काफी कम मूल्य थे। स्केल बार = 20 μm, n = 3 नर चूहे प्रति समूह। त्रुटि पट्टियाँ मानक विचलन इंगित करती हैं. संक्षेप: यूयूओ = एकतरफा मूत्रवाहिनी अवरोध; एसडी = स्प्राग-डॉवले; एमडब्ल्यूएफ = म्यूनिख विस्टार फ्रॉमीटर; आरबीसी = लाल रक्त कोशिका; डब्ल्यूबीसी = सफेद रक्त कोशिका; टीआर-आरएसए = टेक्सास रेड रैट सीरम एल्ब्यूमिन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 6
चित्रा 6: यूयूओ के साथ जीन अभिव्यक्ति परिवर्तन( ए) डेटा का एक गर्मी मानचित्र। (बी) एक स्कैटर प्लॉट में सभी डेटा के लिए सामान्यीकृत जीन परिवर्तन। नियंत्रण गुर्दे में जीन की अभिव्यक्ति को कम से उच्च अभिव्यक्ति तक प्लॉट किया गया था, और एसएचएएम और यूयूओ दोनों गुर्दे के जीन की तुलना नियंत्रण अभिव्यक्ति स्तरों से की गई थी। नियंत्रण जीन विकर्ण मूल्य के करीब गिरने वाले जीन डेटा बिंदु दोनों समूहों के लिए समान अभिव्यक्ति स्तरों को इंगित करते हैं, जबकि विकर्ण के ऊपर या नीचे डेटा बिंदु क्रमशः उच्च या निम्न अभिव्यक्ति स्तर का संकेत देते हैं। ध्यान दें कि एसएचएएम जीन यूयूओ जीन की तुलना में नियंत्रण विकर्ण अभिव्यक्ति के करीब हैं, जो अधिक परिवर्तनशील हैं। संक्षिप्त नाम: यूयूओ = एकतरफा मूत्रवाहिनी अवरोध। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

तालिका 1: यूयूओ के 5 से 12 सप्ताह तक चोट की प्रगति। प्रत्येक समय बिंदु पर तीन पुरुष एमडब्ल्यूएफ चूहों और तीन एसडी नर चूहों में 5- और 12-सप्ताह के यूयूओ इमेजिंग मापदंडों की तुलना। पांच सप्ताह के आंकड़े पिछले आंकड़ों की तरह ही हैं। निरंतर यूयूओ के साथ एल्बुमिन के लिए ग्लोमेरुलर घनत्व और जीएससी में वृद्धि पर ध्यान दें। संक्षेप: यूयूओ = एकतरफा मूत्रवाहिनी अवरोध; एसडी = स्प्राग-डॉवले; एमडब्ल्यूएफ = म्यूनिख विस्टार फ्रॉमीटर; जीएससी = ग्लोमेरुलर चोरी गुणांक। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

तालिका 2: यूयूओ से ग्लोमेरुली में सूजन मार्करों का विश्लेषण और चूहों को नियंत्रित करना। जीन जांच जोड़े और कोडसेट नैनोस्ट्रिंग द्वारा निर्देशित के रूप में डिजाइन और उपयोग किए गए थे। नैनोस्ट्रिंग द्वारा निर्दिष्ट 100 से अधिक जीनों का विश्लेषण किया गया, साथ ही सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण। उनकी समूहीकृत अभिव्यक्ति और एसडी मूल्यों के साथ सभी जीन (जांच) तालिका में दिखाए गए हैं। चित्रा 6 ए डेटा का एक गर्मी मानचित्र है, जबकि चित्रा 6 बी एक स्कैटर प्लॉट में सभी डेटा के लिए जीन परिवर्तन प्रस्तुत करता है। नियंत्रण और एसएचएएम के बीच समानता और यूयूओ में अधिकांश जीनों के लिए अलग-अलग परिवर्तनों पर ध्यान दें। संक्षेप: यूयूओ = एकतरफा मूत्रवाहिनी अवरोध; एसडी = मानक विचलन। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

ग्लोमेरुलर फिजियोलॉजी के अध्ययन में कई अलग-अलग दृष्टिकोण देखे गए हैं, विशेष रूप से माइक्रोपंक्चर का उपयोग, पृथक ग्लोमेरुली का छिड़काव, और माइक्रोस्कोपी। म्यूनिख विस्टार चूहों, फ्रॉटर और सिमोनसेन उपभेदों में सतह ग्लोमेरुली की उपलब्धता ने विवो गतिशील अध्ययनों में अनुमति दी है। इस तकनीक को अपनाने वाले जांचकर्ताओं के लिए एक महत्वपूर्ण नोट अध्ययनों के बीच सुसंगत छवियों को बनाए रखने के लिए अधिग्रहण मापदंडों को सेट करने की आवश्यकता है, इसलिए ऊतक में ऑटोफ्लोरेसेंस सुसंगत रहता है। रोडामाइन एपिफ्लोरेसेंस क्यूब का उपयोग करना और कंप्यूटर स्क्रीन पर नकल करने के लिए हरे और लाल उत्सर्जन चैनलों के लिए लाभ सेटिंग्स को समायोजित करना जो आईपीस के माध्यम से देखा जाता है, विभिन्न माइक्रोस्कोप सिस्टम के बीच भी ऑटोफ्लोरेसेंस में एक सुसंगत रंग हस्ताक्षर सुनिश्चित करेगा।

फ्रॉटर स्ट्रेन का बड़े पैमाने पर उपयोग किया गया है क्योंकि इसमें कुल ग्लोमेरुली की संख्या कम होती है, ~ 75% सामान्य, और पुरुष लगभग 12 सप्ताह की उम्र में सहज रूप से उच्च रक्तचाप विकसित करते हैं, प्रगतिशील प्रोटीनमेह और बाद में फोकल ग्लोमेरुलर स्केलेरोसिस के साथ, अंततः गुर्दे की विफलतासे मर जाते हैं। इन चूहों के उपयोग और इसकी कम फोटोटॉक्सिसिटी के साथ 2-फोटॉन माइक्रोस्कोपी के अलावा, प्रवेश की बेहतर गहराई, और एक साथ कई फ्लोरोसेंट जांच देखने की क्षमता ने नई खोजों 1,4,5 के लिए मार्ग प्रशस्त किया। कंप्यूटर हार्डवेयर और सॉफ्टवेयर के विकास के साथ, मात्रात्मक डेटा अब सभी 2-फोटॉन प्रयोगशालाओं के लिए मानक हैं। फिजियोलॉजिकल और रोग स्थितियों 1,4,5,27,28,29,30 के तहत ग्लोमेरुलर, समीपस्थ नलिका, संवहनी और अंतरालीय प्रक्रियाओं पर कई मात्रात्मक तकनीकों को विकसित और लागू किया गया है।

ट्रांसजेनिक माउस उत्पादन सुविधाओं ने किडनी फिजियोलॉजी और पैथोलॉजी के अध्ययन में एक नया आयाम जोड़ा, और यह केवल समय की बात थी जब तक कि इसे गुर्दे की संरचना और कार्य में विशिष्ट जीन उत्पादों के महत्व को और चित्रित करने के लिए 2-फोटॉन माइक्रोस्कोपी के साथ जोड़ा नहीं गया था। हालांकि, माउस ग्लोमेरुली, बहुत युवा चूहों को छोड़कर, गुर्दे की सतह से 100 μm से अधिक स्थित हैं। दो-फोटॉन माइक्रोस्कोपी को रिज़ॉल्यूशन के रूप में 20 और 50 μm के बीच की गहराई पर सबसे अच्छा किया जाता है, और उत्सर्जित प्रकाश के प्रकाश प्रकीर्णन और हीमोग्लोबिन के साथ बातचीत से अवशोषण के कारण प्रतिदीप्ति तीव्रता तेजी से कम हो जाती है। इसलिए, सतह ग्लोमेरुली को प्रेरित करना आवश्यक था। आमतौर पर इस्तेमाल किया जाने वाला दृष्टिकोण 12 सप्ताह के लिए एक लंबे समय तक एकतरफा बाधा मॉडल है। चूंकि ये मॉडल आधारभूत निर्धारण की अनुमति नहीं देते हैं, इसलिए अध्ययन की जा रही प्रक्रिया से यूयूओ के प्रभावों को अलग करना संभव नहीं है।

एमडब्ल्यूएफ चूहों का उपयोग करके, कोई यूयूओ के बाद बेसलाइन ग्लोमेरुलर फ़ंक्शन की तुलना कर सकता है। यह यूयूओ मॉडल सूजन और फाइब्रोसिस की तीव्र दर को प्रेरित करने के लिए जाना जाता है और इसका उपयोग सीकेडी और फाइब्रोसिस10,11,12 का अध्ययन करने के लिए किया गया है। जैसा कि अपेक्षित था, एमडब्ल्यूएफ और एसडी चूहों दोनों में सतह ग्लोमेरुली में वृद्धि हुई थी। इसके अलावा, एमडब्ल्यूएफ और एसडी चूहों के लिए यूयूओ के बाद प्राप्त मात्रात्मक परिणाम बहुत तुलनीय थे। यहां दर्ज रक्त प्रवाह में कमी को पहले यूयूओ के बाद सूक्ष्म डेटा की तुलना माइक्रोपंक्चर डेटा3 से करने की सूचना दी गई थी। यह भी अच्छी तरह से ज्ञात था कि ट्यूबलर और अंतरालीय हिस्टोलॉजी स्पष्ट रूप से बदल जाती है, और पीटी ज्यादातर गैर-कार्यात्मक होते हैं, जैसा कि यहां बताया गया है, एल्बुमिन एंडोसाइटोसिस की कमी के साथ। चित्रा 2 और चित्रा 3 में अध्ययन ग्लोमेरुलर और पेरिटुबुलर केशिकाओं में आरबीसी प्रवाह दर में नाटकीय कमी दिखाते हैं और डब्ल्यूबीसी आसंजन को बढ़ाते हैं। प्रवाह में कमी डब्ल्यूबीसी आसंजन और रूलेक्स संरचनाओं से केशिका रुकावट के कारण होने की संभावना है।

सूजन का मूल्यांकन करने के लिए, हमने एल्बुमिन पारगम्यता को निर्धारित किया और इसे दस गुना बढ़ाने के लिए दिखाया। इसके अतिरिक्त, पृथक ग्लोमेरुली से पता चला है कि विभिन्न प्रकार के गुर्दे की बीमारी राज्यों में गुर्दे की सूजन में वृद्धि के लिए पहले से ज्ञात कई जीनों के लिए एमआरएनए अभिव्यक्ति में वृद्धि हुई है 17,19,20,21,22,23,24,25,26 . ग्लोमेरुलर सतह घनत्व और एल्बुमिन पारगम्यता में वृद्धि प्रगतिशील थी, जैसा कि 12-सप्ताह के यूयूओ डेटा द्वारा दिखाया गया है। वर्तमान डेटा सीधे दिखाने वाला पहला है कि ग्लोमेरुली यूयूओ मॉडल में महत्वपूर्ण संरचनात्मक क्षति, सूजन और आणविक परिवर्तनों से गुजरता है। परिणाम पूरे गुर्दे के ऊतकों के पहले के अध्ययन के अनुरूप हैं, जिसने यूयूओ के बाद भेड़ के गुर्दे की बायोप्सी का विश्लेषण किया, जिसमें कई सूजन मार्कर19 तक बढ़ गए। वर्तमान परिणाम इंगित करते हैं कि ग्लोमेरुली के भीतर चिह्नित सूजन मौजूद है, जिसे पहले केवल कॉर्टिकल ऊतक के लिए जाना जाता था।

वर्तमान डेटा चूहों में पहले के अध्ययनों से भिन्न है जहां 12 सप्ताह के पोस्टहाइड्रोनेफ्रोटिक और सामान्य ग्लोमेरुली31 के बीच आसंजन अणु अभिव्यक्ति, पूरक जमाव और न्यूट्रोफिल घुसपैठ में कोई बदलाव नहीं पाया गया था। इसके अलावा, हिक्की प्रयोगशाला ने चूहों के ग्लोमेरुली में प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए 12 सप्ताह के यूयूओ मॉडल का उपयोग किया। उन्होंने चार सप्ताह के माउस ग्लोमेरुली और पोस्टऑबस्ट्रक्टिव ग्लोमेरुली32,33 के बीच न्यूट्रोफिल घुसपैठ में कोई अंतर नहीं पाया। ये बाद के अध्ययन बाधित गुर्दे के श्रोणि को मूत्र से बाहर निकालने के बाद आयोजित किए गए थे। हमने ऐसा नहीं किया क्योंकि हम ग्लोमेरुलर फ़ंक्शन पर यूयूओ के प्रभाव को निर्धारित करना चाहते थे क्योंकि यह विवो में होगा, कृत्रिम रूप से रुकावट पैदा करने वाले तरल पदार्थ को हटाए बिना। अंत में, चूहों में यूयूओ का उपयोग सतह के नीचे 100 μm से अधिक पर इमेजिंग ग्लोमेरुली द्वारा प्रतिस्थापित किया जा रहा है। जबकि संभव हो, रिज़ॉल्यूशन और तीव्रता में एक व्यापार-बंद है, दोनों को काफी कम किया जा रहा है क्योंकि एक 50 μm34 से आगे जाता है।

प्रस्तुत परिणाम आश्चर्यजनक नहीं हैं यदि एक साथ हिस्टोलॉजिकल परिवर्तन, एटुबुलर ग्लोमेरुली के गठन, सूजन, फाइब्रोसिस, हेमोडायनामिक्स10,11,12 पर मौजूदा साहित्य से डेटा को एक साथ जोड़ता है। डब्ल्यूबीसी आसंजन, रूलेक्स संरचनाओं, ग्लोमेरुलर आणविक सूजन मार्करों और बढ़ी हुई एल्ब्यूमिन पारगम्यता सहित प्रस्तुत डेटा, इस यूयूओ मॉडल में पांच सप्ताह में भी चल रही व्यापक सूजन को इंगित करता है और बारह सप्ताह में भी मौजूद है। स्पष्ट रूप से, क्रोनिक यूयूओ एक शारीरिक स्थिति नहीं है, और सतह ग्लोमेरुली को प्रेरित करने के लिए यूयूओ का उपयोग एक चोट मॉडल का प्रतिनिधित्व करता है। एमडब्ल्यूएफ चूहों, जिनके पास शारीरिक परिस्थितियों में सतह ग्लोमेरुली होती है, को चोट लगने पर अनुदैर्ध्य रूप से अध्ययन किया जा सकता है। ट्रांसजेनिक चूहों को उत्पन्न करना संभव है, और कई जांचकर्ता विशिष्ट प्रश्न पूछने के लिए उन्हें बायोसेंसर के साथ बना रहे हैं। विशेष रूप से, विस्कॉन्सिन के मेडिकल कॉलेज में अब एमडब्ल्यूएफ चूहों की एक कॉलोनी है और फिजियोलॉजिकल और पैथोलॉजिकल स्थितियों के तहत ग्लोमेरुलर प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के उद्देश्य से ट्रांसजेनिक चूहे बनाए गए हैं। ये एमडब्ल्यूएफ चूहे सामान्य, रोगग्रस्त और आनुवंशिक रूप से परिवर्तित चूहों में ग्लोमेरुलर प्रक्रियाओं का अध्ययन करने का एक शानदार अवसर प्रदान करते हैं।

Disclosures

लेखकों के हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ डायबिटीज एंड डाइजेस्टिव एंड किडनी डिजीज ग्रांट्स आरओ 1 डीके 091623 और पी 30 डीके079312 (बीएएम के लिए) द्वारा समर्थित किया गया था। हम नैनोस्ट्रिंग विश्लेषण करने के लिए मिशिगन स्टेट यूनिवर्सिटी में रिसर्च टेक्नोलॉजी सपोर्ट फैसिलिटी (आरटीएसएफ) के जीनोमिक्स कोर फैसिलिटी के कर्मचारियों को धन्यवाद देते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
70 µm sterile cell strainer Corning #421751
100 µm sterile cell strainer Corning #421752
CA Micro scissors Model 1C300 Electron Microscopy Sciences Cat# 72930
Electric heating pad Sunbeam Kroger
Handling Forceps Electron Microscopy Sciences Cat# 72962
Kelly Hemostatic Forceps (straight) Electron Microscopy Sciences Cat#72930
Leica Dive SP-8 Multi-Photon Inverted Microscope Leica Microsystems Note: Version 7.1r1
MaiTai DeepSee titanium-sapphire laser Spectra-Physics NA
Mayo Dissecting Scissors Electron Microscopy Sciences Cat# 78180-1C3
Metamorph Image processing Software Molecular Dynamics Cat# 78266-04
Microsoft Excel Microsoft Corportation 2007 version
Quant-iT RNA Assay Kit Invitrogen/ThermoFisher Q33140
Reptitherm Undertank Heater Zoomed Amazon
RNeasy MinElute Cleanup Kit (Spin columns) Qiagen 74204
RPE buffer Qiagen 1018013
Strate-Line Autoclave Tape Fisher Scientific Cat# 11-889-1
TRI Reagent Sigma T9424
Willco-dish Coverslip Bottom Dishes (50 mm/40 mm coverslip) Electron Microscopy Sciences Cat# 70665-07

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dunn, K. W., Molitoris, B. A., Dagher, P. C. The Indiana O'Brien center for advanced renal microscopic analysis. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 320 (5), 671-682 (2021).
  2. Dunn, K. W., et al. Functional studies of the kidney of living animals using multicolor two-photon microscopy. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 283 (3), 905-916 (2002).
  3. Eisenbach, G., Liew, J., Boylan, J., Manz, N., Muir, P. Effect of angiotensin on the filtration of protein in the rat kidney: a micropuncture study. Kidney International. 8 (2), 80-87 (1975).
  4. Sandoval, R. M., Molitoris, B. A. Intravital multiphoton microscopy as a tool for studying renal physiology and pathophysiology. Methods. 128, 20-32 (2017).
  5. Sandoval, R. M., Molitoris, B. A., Palygin, O. Fluorescent imaging and microscopy for dynamic processes in rats. Methods in Molecular Biology. 2018, 151-175 (2019).
  6. Huber, T., et al. Molecular basis of the functional podocin-nephrin complex: mutations in the NPHS2 gene disrupt nephrin targeting to lipid raft microdomains. Human Molecular Genetics. 12 (24), 3397-3405 (2003).
  7. Kawachi, H., Koike, H., Kurihara, H., Sakai, T., Shimizu, F. Cloning of rat homologue of podocin: expression in proteinuric states and in developing glomeruli. Journal of the American Society of Nephrology JASN. 14 (1), 46-56 (2003).
  8. Roselli, S., et al. Early glomerular filtration defect and severe renal disease in podocin-deficient mice. Molecular and Cellular Biology. 24 (2), 550-560 (2004).
  9. Schießl, I., Bardehle, S., Castrop, H. Superficial nephrons in BALB/c and C57BL/6 mice facilitate in vivo multiphoton microscopy of the kidney. PloS One. 8 (1), 52499 (2013).
  10. Chevalier, R., Forbes, M., Thornhill, B. Ureteral obstruction as a model of renal interstitial fibrosis and obstructive nephropathy. Kidney International. 75 (11), 1145-1152 (2009).
  11. Forbes, M., Thornhill, B., Chevalier, R. Proximal tubular injury and rapid formation of atubular glomeruli in mice with unilateral ureteral obstruction: a new look at an old model. American Journal of Physiology. Renal physiology. 301 (1), 110-117 (2011).
  12. Yang, H. -C., Zuo, Y., Fogo, A. B. Models of chronic kidney disease. Drug Discovery Today. Disease Models. 7 (1-2), 13-19 (2010).
  13. Hackl, M. J., et al. Tracking the fate of glomerular epithelial cells in vivo using serial multiphoton imaging in new mouse models with fluorescent lineage tags. Nature Medicine. 19 (12), 1661-1666 (2013).
  14. Kitching, A., Kuligowski, M., Hickey, M. In vivo imaging of leukocyte recruitment to glomeruli in mice using intravital microscopy. Methods in Molecular Biology. 466, 109-117 (2009).
  15. Savin, V. J., Terreros, D. A. Filtration in single isolated mammalian glomeruli. Kidney International. 20 (2), 188-197 (1981).
  16. Chomczynski, P., Sacchi, N. The single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction: twenty-something years on. Nature Protocols. 1 (2), 581-585 (2006).
  17. El Karoui, K., et al. Endoplasmic reticulum stress drives proteinuria-induced kidney lesions via Lipocalin 2. Nature Communications. 7, 10330 (2016).
  18. VA, M., et al. Multiplexed measurements of gene signatures in different analytes using the Nanostring nCounter Assay System. BMC Research Notes. 2, 80 (2009).
  19. Springer, A., et al. A combined transcriptome and bioinformatics approach to unilateral ureteral obstructive uropathy in the fetal sheep model. The Journal of Urology. 187 (2), 751-756 (2012).
  20. Braun, F., Becker, J., Brinkkoetter, P. Live or let die: Is there any cell death in podocytes. Seminars in Nephrology. 36 (3), 208-219 (2016).
  21. Kim, W. The role of angiopoietin-1 in kidney disease. Electrolyte & Blood Pressure E & BP. 6 (1), 22-26 (2008).
  22. Liu, F., Zhuang, S. Role of receptor tyrosine kinase signaling in renal fibrosis. International Journal of Molecular Sciences. 17 (5), 972 (2016).
  23. Martini, S., et al. Integrative biology identifies shared transcriptional networks in CKD. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 25 (11), 2559-2572 (2014).
  24. Mühlberger, I., et al. Integrative bioinformatics analysis of proteins associated with the cardiorenal syndrome. International Journal of Nephrology. 2011, 809378 (2010).
  25. Satirapoj, B., et al. Periostin: novel tissue and urinary biomarker of progressive renal injury induces a coordinated mesenchymal phenotype in tubular cells. Nephrology, Dialysis, Transplantation. 27 (7), 2702-2711 (2012).
  26. Fengxin, Z., et al. Numb contributes to renal fibrosis by promoting tubular epithelial cell cycle arrest at G2/M. Oncotarget. 7 (18), 25604-25619 (2016).
  27. Sandoval, R. M., Molitoris, B. A. Quantifying glomerular permeability of fluorescent macromolecules using 2-photon microscopy in Munich Wistar rats. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (74), e50052 (2013).
  28. Russo, L. M., et al. Impaired tubular uptake explains albuminuria in early diabetic nephropathy. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 20 (3), 489-494 (2009).
  29. Russo, L. M., et al. The normal kidney filters nephrotic levels of albumin retrieved by proximal tubule cells: retrieval is disrupted in nephrotic states. Kidney International. 71 (6), 504-513 (2007).
  30. Sandoval, R. M., Wang, E., Molitoris, B. A. Finding the bottom and using it: Offsets and sensitivity in the detection of low intensity values in vivo with 2-photon microscopy. Intravital. 2 (1), 23674 (2014).
  31. Kuligowski, M. P., Kitching, A. R., Hickey, M. J. Leukocyte recruitment to the inflamed glomerulus: a critical role for platelet-derived P-selectin in the absence of rolling. Journal of Immunology. 176 (11), 6991-6999 (2006).
  32. Devi, S., et al. Multiphoton imaging reveals a new leukocyte recruitment paradigm in the glomerulus. Nature Medicine. 19 (1), 107-112 (2013).
  33. Finsterbusch, M., et al. Patrolling monocytes promote intravascular neutrophil activation and glomerular injury in the acutely inflamed glomerulus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (35), 5172-5181 (2016).
  34. Shroff, U. N., Gyarmati, G., Izuhara, A., Deepak, S., Peti-Peterdi, J. A new view of macula densa cell protein synthesis. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 321 (6), 689-704 (2021).

Tags

दवा अंक 181 सूजन ग्लोमेरुलर केशिका रक्त प्रवाह कॉर्टिकल विनाश म्यूनिख विस्टार फ्रॉटर चूहे
ग्लोमेरुलर प्रक्रियाओं पर क्रोनिक एकतरफा मूत्रवाहिनी अवरोध के प्रभावों को निर्धारित करने के लिए 2-फोटॉन माइक्रोस्कोपी का उपयोग करना
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wagner, M. C., Sandoval, R. M.,… More

Wagner, M. C., Sandoval, R. M., Campos-Bilderback, S. B., Molitoris, B. A. Using 2-Photon Microscopy to Quantify the Effects of Chronic Unilateral Ureteral Obstruction on Glomerular Processes. J. Vis. Exp. (181), e63329, doi:10.3791/63329 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter