Summary
Burada, uzun süreli üreter tıkanıklığının glomerüler dinamikler ve fonksiyon üzerindeki etkilerini ölçmek için Münih Wistar Fromter sıçanlarında yüzey glomerüllü 2-foton mikroskobu kullanan bir protokol sunuyoruz.
Abstract
Böbreğin dinamik fizyolojisini keşfetmek için uygun hayvan hastalığı modellerine yeni mikroskopi yöntemleri uygulamak zor olmaya devam etmektedir. Yüzey glomerüllü sıçanlar, intravital 2-foton mikroskopisi kullanarak fizyolojik ve patofizyolojik süreçleri araştırmak için eşsiz bir fırsat sağlar. Glomerüler kılcal kan akımının nicelleştirilmesi ve ilaçlara, geçirgenliğe ve inflamasyona yanıt olarak vazokonstriksiyon ve dilatasyon, çalışılabilecek süreçlerden sadece birkaçıdır. Ek olarak, transgenik sıçanlar, yani floresan boyalar ve diğer moleküler biyobelirteç yaklaşımları ile etiketlenmiş podositler, protein-protein etkileşimlerini ve spesifik moleküler değişikliklerin etkilerini doğrudan izlemek ve ölçmek için artan çözünürlük sağlar.
Dört haftalıktan sonra yüzey glomerüllerinden yoksun olan farelerde, yüzey glomerüllerini indüklemek için birkaç hafta boyunca tek taraflı üreter tıkanıklığı (UUO) kullanılmıştır. Bu indüksiyon modeli temel çalışmalara izin vermediğinden, fizyolojik koşullar altında yüzey glomerüllerine sahip Münih Wistar Frömter (MWF) sıçanlarındaki UUO modelinde UUO'nun glomerüler süreçler üzerindeki etkilerini ölçtük. Beş hafta veya daha uzun süreli UUO modeli, brüt böbrek morfolojisinde, peritübüler ve glomerüler mikrovaskülatürde ve ayrıca tübüler epitelin yapısında ve fonksiyonunda önemli değişikliklere neden oldu. Glomerüler ve peritübüler kırmızı kan hücresi (RBC) akımı, muhtemelen glomerüler ve peritübüler kılcal damarlar içindeki beyaz kan hücrelerinin (WBC'ler) aderansındaki anlamlı artışa bağlı olarak anlamlı olarak azalmıştır (p < 0.01). Albüminin glomerüler eleme katsayısı, tedavi edilmemiş MWF'lerde 0.015 ± 0.002'den 5 haftalık UUO MWF sıçanlarında 0.045 ± 0.05'e yükselmiştir. On iki haftalık UUO, albümin için yüzey glomerüler yoğunluğunda ve glomerüler eleme katsayısında (GSC) daha fazla artışa neden oldu. Glomerüller boyunca filtrelenen floresan albümin, proksimal tübüller tarafından yeniden emilmedi. Bu veriler, yüzey glomerüllerini indüklemek için UUO kullanmanın normal glomerüler süreçleri ve hastalık değişikliklerini inceleme ve yorumlama yeteneğini sınırladığını göstermektedir.
Introduction
Glomerüler süreçleri, özellikle podosit biyolojisini anlamak, 50 yılı aşkın bir süredir bir hedef olmuştur. Yüzey glomerüllü Münih Wistar sıçanları, fizyolojik ve patolojik süreçlerin birçok yönünü anlamak için mikroponktur çalışmaları da dahil olmak üzere bu çalışmalarda merkezi bir rol oynamıştır 1,2,3. Glomerüler bileşenleri intravital olarak incelemek için mikroskopinin kullanımı, bu toksik maruziyeti en aza indiren ve penetrasyon derinliğini artıran 2-foton mikroskobunun ortaya çıkmasına kadar fototoksisitenin etkileri nedeniyle sınırlıydı 1,2. Bilgisayar donanım ve yazılımındaki hızlı gelişmelerin yanı sıra, bu, tek bir ayarda saatlerce üç boyutlu (3B) ve dört boyutlu (zaman) çalışmalara izin vermiştir 1,4,5.
Glomerüler kılcal kan akımının miktarı, ilaçlara yanıt olarak vazokonstriksiyon ve dilatasyon, geçirgenlik ve yükün geçirgenlik ve inflamasyon üzerindeki etkileri, incelenen glomerüler süreçlerden sadece birkaçıdır. Ek olarak, proksimal tübülün S1 segmenti tanımlanabilir ve S1 ve S2 tübüler epitelinin davranışındaki farklılıklar 1,4 olarak ölçülebilir. Farelerde yapılan çalışmalar, özellikle fare transgenik tesislerinin evrensel mevcudiyeti ile, glomerüler hastalık süreçlerinin moleküler biyolojisinin anlaşılmasında hızlı ilerlemelere yol açmıştır. Bireysel proteinler, özellikle proteinüri 6,7,8 ile ilgili olarak, nakavt çalışmalarında glomerüler disfonksiyondan sorumludur. Bununla birlikte, glomerüler görüntüleme çalışmaları için fare modellerinin kullanımı, glomerüller incelenen çok sayıda suşta yüzeyin 100 μm'den daha az olduğu için sınırlandırılmıştır9.
Bu, araştırmacıların incelenebilecek yüzey glomerülleri ile sonuçlanan fare modellerini geliştirmelerine ve kullanmalarına neden olmuştur. En yaygın model, tam UUO10,11,12'nin kullanılmasıdır. Uzatılmış UUO periyodunun sonunda, farelerin böbreklerinde13,14 olabilen ve çalışılan çok sayıda yüzey glomerül vardır. Bu fare çalışmalarında, uzamış UUO'nun glomerüler biyoloji üzerindeki etkilerini belirlemek için herhangi bir temel veya kontrol çalışması yapılmamıştır. Bu, hızlı fibroz ve kortikal yıkımla sonuçlanan ciddi ve uzun süreli bir yaralanma modeli olduğu için10,11,12, glomerüler süreçler ve fonksiyon üzerinde etkiler olacağını varsaydık. Bu soruyu cevaplamak için, kontrol / taban çizgisi parametrelerini incelemek için yüzey glomerüllü Münih Wistar Fromter (MWF) sıçanları kullanıldı ve temel bulgu, beş haftalık UUO'yu takiben MWF sıçanlarında yapılan glomerüler çalışmalarla karşılaştırıldı. Ayrıca UUO'yu takiben yüzey glomerülleri olmayan Sprague Dawley (SD) sıçanlarını da inceledik. Bulgular, MWF ve SD sıçanlarda 5 haftalık UUO'nun yüzey glomerüllerinin sayısını gerçekten artırdığını göstermektedir. Bununla birlikte, bunlar glomerüler kan akışında, inflamasyonda ve makromolekül geçirgenliğinde ve boyutunda belirgin değişiklikler olan anormal glomerüllerdi.
Protocol
Tüm deneyler Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'nu takip etti ve Indiana Üniversitesi Tıp Fakültesi'ndeki Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylandı.
1. Münih Wistar Frömter veya SD sıçanının UUO ameliyatı için hazırlanması
- Sıçanı izofloran kullanarak (% 5 indüksiyon,% 1.5-2.5 bakım) anestezi altına alın, daha sonra cerrahi bölgeyi hem iyot bazlı hem de klorheksidin bazlı bir ovma ve alkolle dairesel bir hareketle birkaç kez tıraş edin, yıkayın ve dezenfekte edin. Kurumsal IACUC kılavuzlarına göre ağrı yönetimi için uzun etkili / yavaş salınımlı analjezik uygulayın.
- Bir neşter kullanarak orta hat boyunca bir kesi yapın; sol böbreği bulun ve çevredeki periton organlarından kurtarın.
- Renal arter, böbrek damarı ve üreterden oluşan renal pedikülü dikkatlice bulun. Üreteri diğer yapılardan ayırın, hassas yapıya zarar vermemek için önlemler alın.
- İnce forseps kullanarak, üreterin etrafına 3-0'lık bir dikişi dikkatlice ilmek ve yırtmamaya dikkat ederek bağlayın. İkinci bir düğümü bağlamak ve tam tıkanıklığı sağlamak için bu prosedürü ilk düğümün her iki tarafında birkaç milimetre tekrarlayın.
- İşlem tamamlandıktan sonra, ardışık kas katmanlarını dikkatlice kapatın. Son tabakayı kapatmadan önce, tamamen kapatmadan önce karın içine 2 mL ılık, steril% 0.9 salin ekleyin. Dış cildi cerrahi zımbalarla kapatın.
- Ağrı yönetimi için uzun etkili / yavaş salınımlı analjezik uygulayın ve kurumsal IACUC kılavuzlarına göre iyileşmeyi yakından gözlemleyin. Bundan sonra periyodik olarak izleyin ve beşinci haftanın sonunda görüntülemeye hazırlanın.
2. Texas Red sıçan serum albümini sentezi (TR-RSA)
- 100 mg Sıçan Serumu Albümini tartın ve 50 mL'lik bir konik tüpte pH 8.4'te 6.67 mL 0.1 M sodyum bikarbonat tamponunda çözün.
- 5 mg Texas Red-X-süksinimidil ester şişesine, tüm boya çözülene kadar 100 μL Dimetil Formamid (DMF, yüksek kaliteli) ve vorteks ekleyin.
- Sıçan serum albümin çözeltisini düşük / orta bir ayarda bir girdap üzerine yerleştirin, böylece çözelti hacmi açık tüpün üst kısmının çok altında döner.
- Tüp girdap yapılırken çözünmüş boyayı ekleyin.
- 50 mL konik tüpü alın, folyoya sarın, tüpü herhangi bir rocker veya silindir üzerine yerleştirin ve oda sıcaklığında (RT) 1 saat boyunca yavaşça çalkalayın.
- Hafifçe karıştırma altında bir karıştırma çubuğuna sahip% 0,9 NaCl'lik 5 L'lik bir kovada, uygun bir 50 kDa moleküler ağırlıklı kesme diyalizörünün membranlarını ıslatın (klipsli bir membran, kapalı membran tüpleri veya diyaliz kasetlerinin tümü uygundur).
- TR-RSA çözeltisini membran sistemine yükleyin ve tipik olarak sisteme dahil edilen yüzdürme ataşmanlarına takın. 5 L'lik kabı% 0.9 salin çözeltisi / TR-RSA ile gece boyunca 4 ° C'de (soğuk bir odada) bir karıştırma plakasına nazik bir ajitasyonla yerleştirin. Diyaliz solüsyonunu sonraki 36 saat içinde en az üç kez değiştirin.
- Membranın şişmesi, şimdi berrak olan TR-RSA çözeltisinin hacmini artıracaktır. Yaklaşık bir konsantrasyon elde etmek için orijinal 100 mg'ı hacme bölün: boya: protein oranı 1: 1 olacaktır. Aliquot uygun hacimlere ve uzun süreli depolama için liyofilize edin.
3. Ters mikroskopta 2-foton intravital görüntüleme için hazırlık
- 50 mm'lik bir kapak kaydırma alt kabının kapağını çıkarın (40 mm kapak kayması çapı ile) ve iç tabana kenarın yanına 8 adet otoklav bant yerleştirin. Piramit şeklinde, boş bir pencere yapın, dış böbreğin bu alana sıkıca oturmasını sağlamak için yan tarafta 4 parça kullanarak, otoklav bant ile periferik olarak teması korur, böylece hareketi en aza indirmeye yardımcı olur. Böbrek ile en iyi teması sağlamak için aralığı sıçanın boyutuna göre ayarlayın.
- 50 mm'lik kapak kaydırmalı alt kabın her iki tarafına 1 termal ped yerleştirin. Isıtma pedinin sahneyi kapladığından emin olun.
- Sırasıyla 30x ve 60x görüntüler oluşturmak için 0,75x yakınlaştırma ve 1,5x yakınlaştırmada 40x suya daldırma hedefi kullanın, böylece daha düşük ve daha yüksek büyütmeli görüntüler elde edin. Gerekirse, su damlacığının tüpten aşağı inmesini önlemek için hedefin tepesine aşağı doğru bir açıyla ulaşabilen uzun bir PE-200 boru parçasına sahip 1 mL'lik bir şırınga kullanarak hedefe su ekleyin.
- Çalışmalar arasındaki görüntülerde tutarlılık sağlamak için mavi, yeşil ve kırmızı dedektörler önceden belirlenmiş seviyelere ayarlanmış %2 lazer geçirgenliği kullanın. Uyarma dalga boyunu referans alınan lazerde 800 nm'ye ayarlayın ( Malzeme Tablosuna bakınız), bu da bu çalışmada kullanılan tüm floroforları verimli bir şekilde uyaracaktır.
- Bir fotoçarpan tüpü (PMT) (420-490 nm, kazanç 950) kullanarak mavi emisyonları toplamak için harici (taranmamış) dedektörler kullanın.
- Yeşil emisyonları yakalamak için bir Hyd dedektörü kullanın (500-550 nm, kazanç 100).
- Kırmızı emisyonları yakalamak için bir Hyd dedektörü kullanın (590-660 nm, kazanç 200).
- PMT'deki ofseti (mavi emisyonlar) dokunun boş alanlarında yalnızca birkaç piksel sıfır değerine sahip olacak şekilde ayarlayın.
NOT: Yeşil ve kırmızı emisyonlar için HyD dedektörleri otomatik ofset ayarına sahiptir; sadece kazanç ayarlanabilir. - Görüntülere siyah ve beyaz arasında 4.096 yoğunlukta bir ölçek vermek için bit derinliğini 12 bit olarak ayarlayın.
NOT: Bowman'ın alanı içindeki düşük yoğunluklu emisyonların toplanmasını sağlamak için bu değerleri hariç tutmamak için dedektörlerin alt sınırlarını (PMT'de ofset) ayarlamak gerekir. Hassasiyet ayarı çok düşükse, görsel uyarı işaretçileri bunu gösterecektir; bu değerlere sıfır yoğunluk değeri verilir.
- Yaklaşık 6 mg Texas-Red-X-Rat Serum Albüminini toplam 1 mL hacme kadar seyreltin, çözeltiyi 1 mL'lik bir şırıngaya yükleyin ve adım 9.1'de Hoechst 33342'nin infüzyonundan sonra adım 4.1'de yerleşik i.v kateterine yerleştirin.
4. İntravital 2-foton görüntüleme için cerrahi hazırlık
- Önceden anestezi uygulanmış sıçanı, tıraş edilmiş sol kanadı düz ve düz bir şekilde masanın üzerine bakacak şekilde yan tarafında yerleşik bir venöz erişim hattı (femoral veya juguler) ile yerleştirin. Arka pençelerin olduğu gibi ön pençelerin birbirine temas ettiğinden emin olun.
- Böbreğin karındaki doğal pozisyonu belirlemesini hissetmek için kaburgaların hemen altındaki sol kanadı yavaşça palpe edin. Gerekirse, tıraş edilen bölge boyunca kalıcı bir işaretleyici kullanarak bir çizgi çizin ve böbrek merkezini burundan kuyruğa yönde ikiye bölün.
- Bir çift dişli forseps kullanarak, cildi kavrayın ve altta yatan vaskülatürü ezmek ve bir çift cerrahi makasla insizyonu yaparken kanamayı önlemek için kalıcı belirteç çizgisinin bir çift hemostatla sıkışmasını kolaylaştırmak için yukarı doğru kaldırın. Kanamayı en aza indirmek için ince dış kas tabakası için bunu tekrarlayın.
- İnce iç karın kası tabakasının son kesisini yapmak için, büyüklüğü ve pozisyonu tahmin etmek için böbreği yeniden püskürtün. İç kas tabakasını bir çift forseps ile dikkatlice kaldırın ve böbreğin üzerindeki cildi ikiye bölen bir çizgiyi, böbreğin tahmini büyüklüğünün yaklaşık 1 /3'ü olan hemostatlarla ezin.
- Forseps ile kas tabakasındaki tutuşu korumak, son kesiyi yapın.
NOT: Daha küçük bir kesi yapmak ve gerektiğinde genişletmek, çok büyük yapmaktan daha iyidir, bu da bir dikişle kısmi kapanmayı gerektirecektir. - Böbreği çevreleyen yağ tarafından nazikçe tutun. Her iki elinizi de forseps ile kullanarak, böbrek yağını kavramak ve tutmak için elden ele bir teknik kullanarak böbreğin alt kutbundaki yağı kavramak için çalışın, aşağıya doğru çalışın.
- Böbreğin alt kutbundaki yağa bir elinizle sıkıca tutun, yağı yavaşça çekin ve gerekirse böbreği kesiden çok nazikçe sıkın. Böbrek kolayca geçmezse, insizyonu genişletin.
5. Sıçanı görüntüleme için konumlandırma
- Açıkta kalan böbreği çanağın kenarına dikkatlice yerleştirin, hafif bir rotasyonla, böbreğin karın tarafı kapak kaymasına temas eder ve sırt tarafı kenardan uzağa bakar.
- Hareketi daha da azaltmak için, iki steril 2 x 2 gazlı bez pedi alın, tuzlu suyla nemlendirin ve böbreğin karın tarafının kenara temasını güçlendirerek böbreğin sırt tarafına doğru paketleyin.
- Çift geçişli bir Rhodamine/FITC küpü kullanarak epifloresan aydınlatma altında mikroskop göz merceğinden bakın. Hareket algılanırsa, pozisyonda küçük ayarlamalar yapın ve gazlı bezi dikkatlice ayarlayarak böbreğin altına itmediğinden emin olun. Hareketi daha da azaltmak için, sıçanı hafifçe yuvarlayın, böylece göğüs kafesi çanaktan daha uzakta olur.
6. Kantitatif analiz için görüntü toplama
- Epifloresan aydınlatmayı kullanarak böbrek yüzeyini tarayın (adım 5.3) ve motorlu aşama kontrolörü ile ilişkili yazılımı kullanarak glomerül pozisyonlarını işaretleyin (modern sistemlerin bir özelliği).
- 2-foton aydınlatma altındaki her renk kanalı için, her işaretli glomerulusun üst kısmının sığ bir 3D hacmini alın ve bu da arka plan görüntüleri olarak işlev görür. Glomerüler kılcal halkaların arka plan floresansının soluk yoğunluklarını daha iyi görselleştirmek için görüntüleme yazılımının görüntüleme seçeneğinde bir sahte renk paleti kullanın.
- Odak noktası olarak yüzeysel bir kan damarı kullanarak, floresan albümini yavaşça infüze edin, sistemik dağılım nedeniyle floresanın yükselişini ve düşüşünü gözlemlemek için zaman tanıyın. Peritübüler vaskülatür ve kılcal halkalarda doygunluğun hemen altında bir yoğunluk elde etmek için yeterli TR-RSA infüze edin.
NOT: Renal perfüzyon normal olduğunda materyalin infüzyonu ile kan dolaşımındaki görünümü arasında tipik olarak 5 sn'lik bir gecikme vardır. - Adım 6.2'den itibaren işaretlenmiş ve görüntülenen tüm glomerüller için 3B hacimler (1 μm aralıklarla) almadan önce yaklaşık 10 dakika bekleyin.
NOT: Simonsen'in Münih Wistar sıçanları daha az yüzey glomerülüne sahiptir. Bununla birlikte, MW sıçanlarının Frömter suşu daha fazla sayıda yüzey glomerülüne sahip olduğundan, 10 glomerüle kadar sıklıkla görüntülenebilir. - Çalışmanın sonunda aşırı dozda izofluran yoluyla sıçanı ötenazileştirin. Ötanazi sağlamak için çift pnömotororakotami uygulayın.
7. Glomerüler geçirgenliğin hesaplanması
- Mikroskop sistemiyle ilişkili görüntü görüntüleme yazılımını kullanarak, görüntüleri işleme ve analiz için 12 bit ham görüntülere aktarın.
- Arka plan 3B birimlerini ve dolaşımdaki floresan albümini içeren ham 3B birimi yükleyin. Odak düzlemini, çevreleyen Bowman'ın kapsülünün kenarına kadar yeterli alana sahip glomerüllerdeki en parlak yüzeysel kılcal döngü ile 3D ses seviyesinde bulun.
- Görsel yer işaretlerini kullanarak, arka plan ses seviyesinde bulunan aynı odak düzlemini bulun. Kılcal döngüde bir bölge ve her birinin ortalama yoğunluk değerlerini not ederek Bowman'ın alanı içinde bir bölge seçin. Bu yoğunluk değerlerini arka plan değerleri olarak kullanın.
- Albümin içeren görüntüde Bowman'ın alanı içindeki bir bölgeyi (alanda en az 20 x 20 piksel) ana hatlarıyla belirtin ve yoğunluk okumasını not edin (Bowman'ın alan yoğunluklarının en temiz ölçümünü sağlamak için kılcal bir döngüye veya Bowman'ın kapsülüne bitişik olmayan bir alan seçin). Bowman's Space içindeki ortalama yoğunluk için ortalama bir değer elde etmek için çizilen bölgeyi diğer iki bölgenin üzerine taşıyın.
- Kılcal döngü bölümündeki en parlak plazma floresan yoğunluğunu seçin ve bu bölgeyi daire içine alın. Eşik işlevini kullanarak, parlak değerleri vurgulayın (genellikle kılcal döngü duvarlarının kenarlarında bulunur), RBC gölgelerinin dolaşmasını önleyin ve değeri kaydedin.
NOT: Kandaki faktörler plazma floresan seviyelerinin hafife alınmasına neden olacağından, en parlak alanların seçilmesi önemlidir. - GSC'yi Eq (1) kullanarak hesaplamak için değerleri bir e-tabloya girin:
GSC =
(1)
(1)8. Yüzey glomerüler kılcal halkalarında ve renal vaskülatürde kırmızı kan hücresi akışının bir linecan fonksiyonu kullanılarak hesaplanması
- Uygun bir damar bulun (kılcal bir döngü veya peritübüler bir damar). Referans alınan görüntü yakalama yazılımında çizgiler işleyebileceğinden ( Malzeme Tablosuna bakınız) kabın dik olmasını gerektirdiğinden, döndürme işlevini kullanarak görüntüyü döndürün .
- Gemi döndürüldükten ve düz bir şekilde yattıktan sonra, edinme menüsünde XT işlevini seçin. 4.000 satırı tarayacak şekilde ayarlayın. Çizgiyi incelenecek geminin karşısına yerleştirin; odak düzleminin görüntülenecek segmentin maksimum çapında olduğundan emin olun.
- Renkli bileşik görüntüye sol tıklayın ve çizgilerin çekildiği alanın referans görüntüsünü oluşturmak için Anlık Görüntü Al'ı seçin. Geminin hatlarını yakalamak için hemen Başlat düğmesine tıklayın.
- RBC akış hızını belirlemek için, linecan'ları görüntü işleme yazılımına aktarın (bkz. Ölçü açılır menüsünün altındaki Bölge İstatistiklerini Göster iletişim kutusunu açın. Tek çizgili çizim aracını seçin ve RBC gölgelerinin eğimiyle eşleşen bir çizgi çizin. Genişlik ve yükseklik değerlerini not alın.
NOT: Genişlik için elde edilen piksel değerleri mesafeye karşılık gelir; yükseklik için pikseller zamana karşılık gelir. - Hızı hesaplamak için aşağıdaki formülü (Eq (2)) kullanın.
μm/s cinsinden RBC akış hızı =
(2)
NOT: Bu, 60x büyütmede elde etme parametrelerine ve referans alınan mikroskopla 400 Hz tarama hızına karşılık gelir (bkz.- En az beş hesaplama yapın ve her satırın hızını bildirmek için bunların ortalamasını alın.
NOT: Bu parametreler mikroskop sisteminin piksel boyutuna ve elde etme hızına bağlı olacaktır.
- En az beş hesaplama yapın ve her satırın hızını bildirmek için bunların ortalamasını alın.
(2)9. Glomerüler kılcal döngülerde WBC tıkanıklığının hesaplanması
- Hoechst 33342 nükleer boyasını (~ 8 μg / kg sıçan ağırlığında) kılcal halkalara yerleştirilmiş WBC'leri tanımlamak için yerleşik bir venöz erişim hattı üzerinden uygulayın.
NOT: Foton saçılması ve hemoglobin tarafından emilimi nedeniyle, özellikle daha kısa dalga boylu mavi emisyonlar için kullanılabilir derinlik sınırlı olacaktır. - Görüntüleme alanında bir glomerulusu ortalayın ve glomerüler yüzeyden başlayarak bir 3D veri seti alın ve verileri en az 30 ila 35 μm arasında sonlandırın. Z yönünde 1 μm adım boyutu kullanın.
- Mavi Hoechst kanalını Texas Red albümin kanalıyla karşılaştırarak WBC'leri tanımlayın; WBC'leri pozitif olarak tanımlamak için kılcal döngüde kırmızı boyanın ve buna karşılık gelen bir nükleer lekenin dışlanmasını arayın. 3 optik bölüm üzerinde statik görünüyorlarsa, beyaz kan hücrelerini "yapışmış" olarak tanımlayın. Değerleri, glomerulusun tepesinden 1 μm aralıklarla alınan oluşum/10 optik kesit olarak raporlayın.
10. Yüzey glomerüllerinde Rouleaux oluşumlarının varlığının puanlanması
- Adım 9.3 için aynı yönergeleri izleyin ve bir 3B veri kümesi edinin. Kılcal döngüler boyunca hareket ederken ayrışmaya direnen paketler halinde yığılmış RBC'ler olarak görünen Rouleaux oluşumlarını arayın. Daha uzun dalga boylu kırmızı emisyonlar için daha az foton saçılması nedeniyle daha büyük derinliklerde yapının daha iyi görselleştirilmesi için kırmızı bir florofor kullanın. Değerleri, glomerulusun tepesinden 1 μm aralıklarla alınan oluşum/25 optik kesit olarak raporlayın.
11. Glomerüllerin izolasyonu
- Sıçan glomerüllerinin %90'ına yakın saflığı ile sonuçlanan standart bir eleme tekniği kullanarak üç glomerül grubunu taze böbreklerden izole edin15.
- Böbrek korteksi soğuk fosfat tamponlu salin (PBS) içine yerleştirin ve birden fazla ince makas veya tıraş bıçağı kullanarak doğrayın.
- Kıyılmış dokuyu 100 μm steril hücre süzgecine ekleyin ve 5 mL'lik bir şırınga pistonu ve 50-100 mL soğuk PBS kullanarak yavaşça itin.
NOT: Glomerüller geçerken tübüllerin çoğu korunur. - Zenginleştirilmiş glomerül fraksiyonunu 70 μm'lik bir filtreye yerleştirin ve soğuk PBS ile yoğun bir şekilde yıkayın. Kalan tübüllerin çoğunu çıkarmak için filtreyi 100-200 mL soğuk PBS ile yıkayın.
- 1-2 mL soğuk PBS, santrifüj (10.000 × g, 2 dakika, 4 °C) kullanarak glomerülleri filtreden toplayın ve RNA izolasyonuna kadar sıvı azotta çıtçıtlayın.
NOT: Faz kontrastlı mikroskopi ile belirlenen glomerüler saflık% >90'dır ve verim 2 böbrekten yaklaşık 10 mg'dır.
12. Glomerüler RNA izolasyonu
- 400 μL reaktif ekleyerek ve 200 μL'lik bir pipet ucu kullanarak peleti parçalayarak RNA izolasyon reaktifini kullanarak dondurulmuş glomerül peletini homojenize edin, ardından RT16'da kısa vorteks ve 5 dakikalık inkübasyon yapın.
- 40 μL 1-bromo-3-kloropropan (BCP), 15 s vorteks ekleyin ve 15 dakika RT'de tutun.
- 12.000 × g, 15 dk, 4 °C'de santrifüj. Sulu tabakayı çıkarın, alt tabakayı eşit hacimde% 70 etanol ile seyreltin ve doğrudan bir sıkma sütununa yükleyin ( bkz.
- Yıkamalardan sonra, her biri ilgili çözeltinin kolona eklenmesinden ve ardından 12.000 x g, 15 s, 26 ° C'de santrifüjlemeden oluşur [3 toplam, ilk 2 ila 500 μL RPE (tuz izlerini gidermek için etanollü tescilli hafif yıkama tamponu, 500 μL% 80 EtOH ile 3. yıkama], 15 μLH2 ilavesiyle RNA'yı etkisiz hale getirir. O ve santrifüj, yıkamalara gelince. RNA'nın konsantrasyonunu ve saflığını kontrol edin ve RNA örneklerini Nanostring analizi17,18 için çekirdek tesise taşıyın.
NOT: Toplam RNA verimi yaklaşık 1-2 μg'dir. Burada, 24 örnek 30 ng / μL'de 200 ng RNA içeriyordu.
13. Nanostring analizi
NOT: Nanostring teknolojisi, renk kodlu prob çiftlerini kullanan hedef moleküllerin dijital tespitine ve doğrudan moleküler barkodlamasına dayanmaktadır. Yakalama probu 3' ucunda bir biyotin köpüğü taşır ve Reporter probu sinyali 5' ucunda taşır.
- Nanostring gen prob çiftlerini ve CodeSet'leri Michigan State'in Genomik Çekirdek Tesisi'ne gönderin ve NanoString tarafından yönlendirildiği şekilde kullanın.
NOT: Renk kodları için altı konum vardır ve her konum dört renkten biri olabilir, bu da veri toplama sırasında her biri ayrı ayrı çözümlenebilen ve tanımlanabilen çok çeşitli etiketler sağlar. - Bir mikroskop hedefi ve CCD kamera kullanarak görüş alanlarını toplayan ve barkod sayılarını tablolaştıran ve görüntüleyen tescilli Nanostring nCounter Digital analizörünü kullanarak Genomic Core tesis personeli tarafından toplanan verileri elde edin.
- Ham verileri analiz için Nanostring'in nSolver yazılımına aktarın. Varsayılan ayarlarını kullanarak normalleştirilmiş verileri normalleştirin ve verileri kılavuzlarında belirtildiği gibi gruplar arasında karşılaştırın.
NOT: Amaç, daha önce kortikal dokuda UUO model 19, böbrek hastalığı 17,20,21,22,23,24,25,26'dan değiştirilmiş olduğu gösterilen gen değişikliklerini izlemekti. Her glomerül grubunda (CONT, SHAM, & UUO) önerilen pozitif ve negatif kontroller de dahil olmak üzere toplam 126 gen analiz edildi.
Representative Results
Üç grup glomerül, sıçan glomerüllerinin %90'ına yakın saflığı ile sonuçlanan standart bir eleme tekniği kullanılarak izole edildi15. İlk glomerül grubu, 5 hafta boyunca sol böbrek üreter kelepçesi uygulanan SD sıçanlarının sol böbreğinden, UUO (5 erkek, 3 kadın) idi. İkinci glomerül grubu, aynı sıçan olan CONT'den (5 erkek, 3 kadın) kontralateral kontrol böbreğinden izole edildi. Üçüncü glomerül grubu, SHAM ameliyatı geçiren SD sıçanlardan izole edildi ve sol böbrek 5 hafta sonra glomerül izolasyonu için kullanıldı, SHAM (4 erkek, 4 kadın).
Morfolojik değişiklikler
Tıkalı böbreğin görüntüleme için dışsallaştırılması, normal boyutun yaklaşık dört katı kadar büyümüş bir böbreği ortaya çıkardı ve sıvı dolu böbrek iç kısmından görülebilen ince epitelya vardı. Epifloresan aydınlatma ve bir FITC/Rhodamine çift geçişli küp kullanılarak 20x'lik bir hedef sayesinde, en belirgin değişiklik, tübüler epitelinin incelmesi ve tübüler lümenlerin tüm boru şeklindeki uzunluk boyunca düzgün bir şekilde çökmesiydi. Histoloji iyi tanımlanmıştır ve bir haftalık UUO10,11,12 ile şiddetlidir. MWF ve SD sıçanlarda yüzeyde görülebilen glomerül sayısı, beş haftalık tek taraflı üreter tıkanıklığından sonra artmıştır. Şekil 1A, UUO modelini oluşturmak için kullanılan yöntemi gösterir. Sağ böbrek el değmez ve sıçan için yeterli glomerüler filtrasyon hızı sağlar. 20x hedefi (363 μm x 363 μm) kullanılarak alan başına glomerül sayısı sayıldı ve Şekil 1B'deki bir grafikte gösterildi. MWF sıçanlarındaki yüzey glomerüllerinin sayısı, tedavi edilmemiş sıçanlarda 1.08'den 0.11 / alan'±, beş haftalık UUO grubunda 0.65 / alandan 2.97 ± yükselmiştir. SD sıçanlar, 5 haftalık UUO'yu takiben yüzey glomerülleri olmadan 2.02 ± 0.37 / alana geçti.
Çekirdekleri (camgöbeği) etiketlemek için TR-RSA (kırmızı), 10 kDa Cascade Blue dextran (10 kDa-CB) ve Hoechst 33342 ile enjeksiyondan sonra bu sıçanların intravital 2-foton görüntüleri alındı. Bunlar normal MWF sıçanları (Şekil 1C), beş haftalık UUO'dan sonraki MWF sıçanları (Şekil 1D) ve beş haftalık UUO'dan sonraki SD sıçanları için gösterilmiştir (Şekil 1E). Bu görüntüler tübüler epiteldeki dramatik değişiklikleri vurgulamaktadır. Tedavi edilmemiş MWF ve SD sıçanlarında normalde küçük noktalı turuncu renkli birikimler olan proksimal tübül lizozomları, küçülmüş boru şeklindeki hücrenin çoğunluğunu dolduran büyük tekil vakuolar yapılar haline gelir. TR-RSA albümini tarafından özetlendiği gibi, vaskülatür düzleştirilmiş ve birçok damarda, akan RBC'lerden yoksun, sadece plazma akışı gösteren görünüyordu. Böbreklerin fiksasyonu, korteksin milimetreden daha kalın olmayan lifli bir cilde inceldiğini ortaya çıkardı. Bu gözlemler, bu modelikullanan erken literatürle aynı fikirdedir 3,10,11,12.
Renal vasküler dinamiklerde ve glomerüler geçirgenlikte değişiklikler
Böbrek kan akımı, tedavi edilmeyen sıçanlara kıyasla hem beş haftalık UUO MWF hem de SD gruplarında anlamlı olarak azalmıştır (Şekil 2). Şam tarafından işletilen MWF sıçanları, 885 ± 25 μm / s peritübüler RBC akış hızına sahipti. Beş haftalık UUO MWF ve SD sıçanlarda peritübüler RBC akışı sırasıyla 250 ± 100 μm / s ve 200 ± 125 μm / s'ye düşmüştür. Bu değerler, RBC hızını hesaplamak için peritübüler damarlar arasında hat taramaları toplanarak hesaplandı. Şekil 2B, bu verilerin bir grafiğini göstermektedir.
Glomerüler kılcal döngülerdeki RBC hızı, beş haftalık UUO MWF ve SD sıçanlarında, tedavi edilmemiş MWF'ye kıyasla anlamlı derecede azalmıştır (Şekil 3). Birçok durumda, glomerüllerin akan RBC'lerden tamamen yoksun kılcal döngülere sahip olduğu bulunmuştur. Kapiler döngü RBC akış hızları sırasıyla 1.405 ± 425 μm / s, 250 ± 220 μm / s ve 190 ±± 200 μm / s veya işlenmemiş MWF, beş haftalık UUO MWF ve beş haftalık UUO SD sıçanları idi (Şekil 3D). Beş haftalık UUO gruplarının kılcal döngüleri içinde, RBC'lerin durgun akışı, akışı yavaşlatan veya bloke eden, kısmi veya toplam tıkanıklıktan aşağı yönde sadece plazma akışı görselleştirilen yapışkan WBC'lerin varlığını ortaya çıkardı. Bu gözlemi ölçmek için, bir 3D hacimde bulunan yapışkan WBC'lerin sayısı sayıldı ve daha sonra her 10 μm 3D hacim derinliği başına meydana gelecek şekilde normalleştirildi. Yapışmış beyaz hücrenin yapısı, Hoechst 33342'den camgöbeği nükleer boya floresansı kullanılarak ayırt edilebilir. Ne yazık ki, mavi yayan ışıkların daha büyük foton saçılması, WBC'lerin çekirdekleri tarafından güvenilir bir şekilde tanımlanmasını, glomerüler hacmin 1μm adımlarında alınan, üstten üst 10 optik bölüme kadar sınırlandırdı. Tedavi edilmeyen MWF sıçanları, 1 μm adım hacminde alınan üstten 0.125 ± 0.05 WBC / 10 optik kesitten daha azına sahipken, bu sayı sırasıyla 5 haftalık UUO MWF ve 5 haftalık UUO SD sıçanlarında 0.7'± 1.5 ve 3.25'± yükselmiştir (Şekil 3E).
5 haftalık UUO gruplarında azalmış RBC akışını da açıklayabilecek bir başka vasküler değişiklik, Rouleaux oluşumlarının düzenli görünümüydü ("yığılmış madeni para" konfigürasyonunda yapıştırılan gruplandırılmış RBC'ler, Şekil 3F'nin girişine bakınız). Rouleaux oluşumları daha yavaş akar ve yapışkan bir WBC tarafından durdurulabilir. Tedavi edilmeyen WMF sıçanları, glomerüler kılcal damarlarında neredeyse hiç Rouleaux formasyonuna sahip değildir, üstten 25 optik bölüm başına sadece 0.05 ± 0.05 olaya sahiptir, 1 μm adımda alınır. Beş haftalık UUO MWF ve SD sıçanları, Rouleaux formasyonlarında 2.27 ± 0.46 ve 1.46 ± sırasıyla 1 μm adımlarında alınan üstten başlayarak 25 optik bölüm başına 0.73 belirgin bir artışa sahipti (Şekil 3F).
UUO ile birlikte görülen glomerüler RBC akım hızlarındaki azalmaya ek olarak, albümin geçirgenliğinde de artış görülmüştür. Glomerüller arasında albümin geçirgenliğinde daha fazla heterojenite vardı. Bazen, Bowman'ın Uzayı içindeki albümin birikimi açıkça görülebilecek kadar yoğundu (Şekil 4B, yıldız işareti). Albüminin glomerüler eleme katsayısı, tedavi edilmemiş MWF'lerde 0.015 ± 0.002'den, 5 haftalık UUO MWF'de 0.045 ± 0.05'e ve beş haftalık UUO SD sıçanlarında 0.052 ± 0.075'e yükselmiştir.
Değiştirilmiş proksimal tübül fonksiyonu
İlginç bir şekilde, filtrelenmiş albümin, UUO'yu takiben proksimal tübül hücrelerinde tespit edilememiştir. S1 segmenti normalde tedavi edilmemiş MWF sıçanlarında fizyolojik koşullar altında gösterildiği gibi büyük miktarlarda albümin 27,28,29,30'u endositoz eder (Şekil 5A). Aynı alım, 5 haftalık UUO'yu takiben MWF veya SD PT'de görülemedi (Şekil 5B, C). TR-RSA infüzyonundan 45 ila 60 dakika sonra görüntülenen glomerülleri çevreleyen proksimal tübüller, albümin varlığı (1) veya yokluğu (0) için puanlandı. Fizyolojik koşullar altında, S1 segmentinin, distal tübüllere ulaşan veya kanalları toplayan albümin çok az veya hiç albümin olmadan hevesle bağlandığını ve içselleştirdiğini belirtmek önemlidir. Bu nedenle, ikinci proksimal tübül segmentlerinin albümin içermeyebileceği, bunun da albümin alımı için 1.0'dan daha az fraksiyonel pozitifliğe neden olabileceği mantıklıdır. Şekil 5D, proksimal tübül albümin alımının puanlanmasından elde edilen sonuçları içeren bir grafik göstermektedir. Tedavi edilmeyen MWF'nin proksimal tübül fraksiyonel alım değeri 0.556 ± 0.126 idi. Hem beş haftalık UUO MWF hem de SD sıçanları, sırasıyla 0.049 ± 0.126 ve 0.00 ±0.00 arasında anlamlı derecede düşük değerlere sahipti.
12 haftalık UUO MWF sıçanlarında da çalışmalar tamamlanmıştır (Tablo 1). On iki haftalık UUO, yüzey glomerüllerini indüklemek için fare çalışmaları için kullanılan standart zamandır. Üç UUO erkek sıçanı görüntülendi ve glomerüler yoğunluk, bu sıçanlarda 20x alan başına 6.16 ± 1.83 glomerüle yükseldi. RBC akış hızı 293 ± 67 μm / s, WBC yapışması 1.47 ± 1.12 idi, her ikisi de 5 haftalık UUO verilerine benzerdi. Albüminin GSC'si de 5 haftalık UUO sıçanlarına kıyasla 0.109 ± 0.04'e yükseldi.
Kronik UUO tarafından indüklenen glomerüler mRNA değişiklikleri
Tablo 2'de tüm genler (problar) gruplandırılmış ekspresyonları ve standart sapma değerleri ile gösterilmektedir. Not, genler, protokol bölümü 13'ün notunda açıklandığı gibi UUO da dahil olmak üzere böbrek hastalığındaki değişikliğin önceki belgelerine dayanarak analiz için seçilmiştir. Şekil 6 , UUO glomerüllerindeki çoğu gen için gen ekspresyonundaki dramatik değişiklikleri vurgulayan verilerin bir ısı haritasıdır. kontrol veya sahte glomerüllere kıyasla.
Şekil 1: MWF sıçanlarında 5 haftalık UUO'yu takiben SD sıçanlarda yüzey glomerüllerinin sayısındaki artış ve yüzey glomerüllerinin indüksiyonu . (A) Sol böbrekteki üreterin cerrahi bir diyagramı, cerrahi sütür kullanılarak iki bağ ile tıkanmadan önce renal arter ve damardan dikkatlice serbest bırakıldı. (B) MWF sıçanlarında UUO'dan önce ve beş hafta sonra mevcut olan yüzey glomerüllerinin sayısındaki artışı ve normalde yüzey glomerülleri olmayan SD sıçanlardaki yüzey glomerüllerinin sayısını gösteren bir grafik. MWF sıçanlarındaki yüzey glomerüllerinin sayısı, tedavi edilmemiş sıçanlarda 1.08'den 0.11 / alan'±, 5 haftalık UUO grubunda 0.65 / alandan 2.97 ± yükselmiştir. SD sıçanlar yüzey glomerüllerine sahip olmamaktan 2.02 ± 0.37 / alana geçti. Üç boyutlu yeniden yapılandırılmış görüntüler, tedavi edilmemiş MWF (C), 5 haftalık UUO (D) sonrası MWF ve beş haftalık UUO (E) sonrası SD için böbrek yüzeyini göstermektedir. Küçük bireysel lizozomlardan büyük anormal cisimlere birleşen büyük, turuncu vakuolar yapıların görünümüne dikkat edin. SD sıçanlarda 5 haftalık UUO, C'de ve kısmen D'de görülen normal tübüler epiteliye benzeyen alanlara neden olmadı. Vaskülatür bazı bölgelerde düzleştirilmiş görünüyordu ve birçoğunda plazmanın akmasına izin veren ancak RBC'lerin akmasına izin vermeyen kısmi tıkanıklıklar vardı. (n = Grup başına 3 erkek sıçan) Ölçek çubukları = 40 μm. Hata çubukları standart sapmayı gösterir. Kısaltmalar: UUO = tek taraflı üreter tıkanıklığı; SD = Sprague-Dawley; MWF = Münih Wistar Frömter; G = glomerulus; RBC'ler = kırmızı kan hücreleri. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: 5 haftalık UUO sonrası yüzeyel peritübüler vaskülatür içindeki RBC akımında azalma. Linecans, μm / s cinsinden RBC akış hızını belirlemek için peritübüler kan damarlarında toplandı. Kısaca, A, B ve C'de gösterilen kırmızı referans çizgileri, aynı piksel genişliğindeki alanın tekrar tekrar tarandığı küçük bir bölgeyi ve mikroskopun elde edebileceğinden daha hızlı hareket eden akan RBC'lerin neden olduğu bozulmayı görselleştirmek için bir sütunda istiflenmiş görüntüleri temsil eder. Referans şekline bitişik sütun, hızı hesaplamak için RBC bozulmasının eğimi kullanılan çizgilerdir (x ekseni = mesafe ve y ekseni = zaman). Burada, giderek daha dik eğimler, linecan bölgesinde daha uzun süre kaldıkça daha yavaş RBC hızlarına karşılık gelir. Tedavi edilmemiş MWF sıçanlarında (A) RBC'lerin görünümünde, MWF (B) ve SD (C) sıçanları için beş haftalık UUO görüntülerine kıyasla farka dikkat edin. Üç sıçan grubu için RBC akış hızları D olarak gösterilmiştir. İşlenmemiş MWF'lerde peritübüler RBC akışı ortalama 885 ± μm / s idi. Bu değerler, MWF ve SD sıçanlarda UUO'dan beş hafta sonra sırasıyla 250 ± 100 μm / s ve 200 ± 125 μm / s'ye düştü. Ölçek çubuğu = 20 μm, n = grup başına 3 erkek sıçan. Hata çubukları standart sapmayı gösterir. Kısaltmalar: UUO = tek taraflı üreter tıkanıklığı; SD = Sprague-Dawley; MWF = Münih Wistar Frömter; RBC = kırmızı kan hücresi; WBC = beyaz kan hücresi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Glomerüler kılcal döngü RBC akımında anlamlı azalma ve 5 haftalık UUO ile WBC adezyonu indüklenmiş aktivasyonu. Peritübüler RBC akımını belirlemek için kullanılan aynı linecan yaklaşımı, glomerüler kılcal kan akımındaki değişiklikleri araştırmak için kullanıldı. A, B ve C panelleri Şekil 2'ye benzer bir düzen gösterir ve sırasıyla sahte işletilen MWF, beş haftalık UUO MWF ve beş haftalık UUO SD'lerde bir glomerulusa odaklanır. (D) Sahte işletilen MWF sıçanlarından kılcal döngülerdeki fizyolojik olarak yüksek RBC akış hızını ortaya koyan bir grafik, ortalama 1.405 ± 425 μm / sn ±, 5 haftalık UUO MWF ve 5 haftalık UUO SD sıçanları için sırasıyla 220 μm / s ve 190 ± 220 μm / s'± 250'ye düşmüştür. Glomerüler kılcal döngüleri incelerken, glomerulus boyunca odaklanırken yapışkan WBC'ler kolayca görülebiliyordu. Bireysel glomerüllerin üç boyutlu optik bölümleri alındı ve 1 μm arayla ilk 10 optik bölüm, yapışkan WBC'lerin sayısını ölçmek için kullanıldı. İşlenmemiş MWF sıçanlarının hacimlerinde neredeyse hiç görünür WBC yoktu, ortalama 0.125 ± 0.05 WBC / 10 optik bölümden daha azdı, 1μm adımlarında alındı. 5 haftalık UUO MWF ve SD sıçanlarda, bu sayılar sırasıyla 1 μm adımlarında alınan üstten 0.7 WBC / 10 optik kesitler ± 0.5 ve 3.25 ± 1.5'e yükselmiştir. Bu sonuçlar, E panelindeki grafikte , kılcal döngüleri tıkayan WBC'leri gösteren renkli eklerle gösterilir. Rouleaux oluşumları ( F panelindeki oklar), kan akışının türbülansında bile paketlenmiş gruplaşmalarını büyük ölçüde koruyan "yığılmış madeni para" konfigürasyonunda birbirine sıkıca bağlanmış RBC'ler olarak görünür. Bu patolojik yapılar glomerulus içinde daha derin derinliklerde kolayca fark edilebiliyordu. Şam tarafından işletilen MWF sıçanları bu yapılardan büyük ölçüde yoksundu, sadece 0.05 ± 0.05 olaya sahipti Üstten 25 optik kesit, glomerüler hacmin 1 μm adımlarında alındı. Buna karşılık, hem MWF hem de SD sıçanlarındaki 5 haftalık UUO, sırasıyla 1 μm adımlarında alınan üstten 2.27± 0.46 ve 1.46 ± 0.73/25 optik kesitlerin meydana gelmesiyle Rouleaux formasyonlarında belirgin bir artışa sahipti. Ölçek çubukları = 20 μm, n = grup başına 3 erkek sıçan. Hata çubukları standart sapmayı gösterir. Kısaltmalar: UUO = tek taraflı üreter tıkanıklığı; SD = Sprague-Dawley; MWF = Münih Wistar Frömter; RBC = kırmızı kan hücresi; WBC = beyaz kan hücresi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: 5 haftalık UUO'yu takiben glomerüler kılcal albümin geçirgenliğinde anlamlı artış. Panel A, B ve C , tedavi edilmemiş MWF, 5 haftalık UUO MWF ve beş haftalık UUO SD sıçanlarda sıçan serum albümin kanalı için 3D hacmin sahte renkli görüntülerini göstermektedir. Görüntüler, Bowman'ın alanında, özellikle de B panelinde (yıldız işareti) görülen kayda değer miktarda filtrelenmiş albümini vurgulamak için sahte renk paletinde sunulur. (A) Bowman'ın uzayı (yıldız işareti), tedavi edilmemiş MWF sıçanlarında tipik olarak görülen, gözle ayırt edilemeyen normal albümin seviyesini gösterir. Albümin uygulamasından sonra alınanlardan arka plan floresan değerlerini çıkarmak için albümin infüzyonundan önce glomerül görüntüleri alındı. (D) İşlem görmemiş MWF sıçanlarında albümin için glomerüler eleme katsayısına sahip, 0,015 ± 0,002 değerine sahip bir grafik. Bu değer± 5 haftalık UUO MWF sıçanlarında 0,045'± 0,055'e ve beş haftalık UUO SD sıçanlarında 0,052'ye 0,075'e yükseldi. Bu parametre, Bowman's Space'in floresan yoğunluklarının plazma değerine bölünmesiyle orantılı bir değerdir ve ilişkili bir ölçü birimine sahip değildir. Ölçek çubuğu = 20 μm, n = grup başına 3 erkek sıçan. Psödocolor yoğunluk ölçeği D panelinin altında bulunur. Hata çubukları standart sapmayı gösterir. Kısaltmalar: UUO = tek taraflı üreter tıkanıklığı; SD = Sprague-Dawley; MWF = Münih Wistar Frömter; RBC = kırmızı kan hücresi; WBC = beyaz kan hücresi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: 5 haftalık UUO'yu takiben proksimal tübüllerde azalmış fonksiyon . (A) TR-RSA ve Cascade Blue dekstran infüzyonundan 40 dakika sonra alınan normal bir Münih Wistar Frömter sıçanından yüzeysel bir glomerulus ve S1 segmentinin görüntüsü. TR-RSA'nın içselleştirilmesi S1 segmentinde ve proksimal tübülde görülebilir. Keskin bir kontrastta, 5 haftalık UUO'ya maruz kalan MWF sıçanları (B) ve SD sıçanları (C), TR-RSA'nın minimum alımı veya hiç alımı olmadan ciddi şekilde değiştirilmiş proksimal tübüller gösterir. Normalde küçük, noktalı otofloresan lizozomlar (A), genellikle üç boyutlu veri kümelerinde bulunamayan boru şeklindeki lümenin tamamen çökmesiyle büyük ve vakuolar sarı-turuncu yapılar haline gelir. (C) Normalde herhangi bir otofloresan formundan yoksun olan distal tübüller artık otofloresan birikimleri içermektedir. Glomerülleri çevreleyen proksimal tübüllerin, albümin alımı için infüzyondan 45-60 dakika sonra çekilen benzer görüntülerde puanlanması, sahte olarak işletilen MWF grubu ile her iki 5 haftalık UUO grubu arasında anlamlı bir fark gösterdi. Tedavi edilmeyen MWF sıçanlarının proksimal tübül fraksiyonel alım değeri 0.556 ± 0.126'dır. Hem beş haftalık UUO MWF hem de SD sıçanları, sırasıyla 0.049 ± 0.126 ve 0.00 ±0.00 arasında anlamlı derecede düşük değerlere sahipti. Ölçek çubuğu = 20 μm, n = grup başına 3 erkek sıçan. Hata çubukları standart sapmayı gösterir. Kısaltmalar: UUO = tek taraflı üreter tıkanıklığı; SD = Sprague-Dawley; MWF = Münih Wistar Frömter; RBC = kırmızı kan hücresi; WBC = beyaz kan hücresi; TR-RSA = Texas Red sıçan serum albümini. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: UUO ile gen ekspresyon değişiklikleri . (A) Verilerin ısı haritası. (B) Bir dağılım grafiğindeki tüm veriler için normalleştirilmiş gen değişiklikleri. Kontrol böbreklerindeki genlerin ekspresyonu düşükten yükseğe doğru çizildi ve hem SHAM hem de UUO böbreklerinden gelen genler kontrol ekspresyon seviyeleri ile karşılaştırıldı. Kontrol genlerinin diyagonal değerine yakın düşen gen veri noktaları, her iki grup için de benzer ekspresyon seviyelerini gösterirken, köşegenin üstündeki veya altındaki veri noktaları sırasıyla daha yüksek veya daha düşük ekspresyon seviyelerini gösterir. SHAM genlerinin, kontrol diyagonal ekspresyonuna, daha değişken olan UUO genlerinden daha yakın kümelendiğine dikkat edin. Kısaltma: UUO = tek taraflı üreter tıkanıklığı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Tablo 1: Yaralanmanın 5 ila 12 haftalık UUO arasındaki ilerlemesi. Her zaman noktasında üç erkek MWF sıçanı ve üç SD erkek sıçanda 5 ve 12 haftalık UUO görüntüleme parametrelerinin karşılaştırılması. Beş haftalık veriler önceki rakamlarla aynıdır. Glomerüler yoğunluktaki artışa ve devam eden UUO ile albümin için GSC'ye dikkat edin. Kısaltmalar: UUO = tek taraflı üreter tıkanıklığı; SD = Sprague-Dawley; MWF = Münih Wistar Frömter; GSC = glomerüler eleme katsayısı. Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Tablo 2: UUO ve kontrol sıçanlarından glomerüllerde inflamasyon belirteçlerinin analizi. Gen prob çiftleri ve CodeSets, NanoString tarafından yönlendirildiği şekilde tasarlanmış ve kullanılmıştır. 100'den fazla gen analiz edildi, ayrıca Nanostring tarafından belirtildiği gibi pozitif ve negatif kontroller yapıldı. Tüm genler (problar) gruplandırılmış ekspresyonları ve SD değerleri ile tabloda gösterilmiştir. Şekil 6A , verilerin bir ısı haritasıdır, Şekil 6B ise bir dağılım grafiğindeki tüm veriler için gen değişikliklerini sunar. Kontroller ve SHAM arasındaki benzerliklere ve UUO'daki çoğu gen için farklı değişikliklere dikkat edin. Kısaltmalar: UUO = tek taraflı üreter tıkanıklığı; SD = standart sapma. Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Discussion
Glomerüler fizyolojinin incelenmesi, özellikle mikroponktur kullanımı, izole glomerüllerin perfüzyonu ve mikroskopi gibi birçok farklı yaklaşım görmüştür. Münih Wistar sıçanlarında, Fromter ve Simonsen suşlarında yüzey glomerüllerinin mevcudiyeti, in vivo dinamik çalışmalara izin vermiştir. Bu teknolojiyi benimseyen araştırmacılara önemli bir not, çalışmalar arasında tutarlı görüntüleri korumak için edinme parametrelerini ayarlama ihtiyacıdır, böylece dokudaki otofloresan tutarlı kalır. Çift geçişli bir floresein/rodamin epifloresan küpü kullanmak ve bilgisayar ekranında göz merceklerinden görülenleri taklit etmek için kazanç ayarlarını yeşil ve kırmızı emisyon kanallarına ayarlamak, farklı mikroskop sistemleri arasında bile otofloresanda tutarlı bir renk imzası sağlayacaktır.
Fromter suşu, toplam glomerül sayısının azalması, ~% 75'i normal olduğu için yaygın olarak kullanılmıştır ve erkekler yaklaşık 12 haftalıkken kendiliğinden hipertansiyon geliştirir, ilerleyici proteinüri ve ardından fokal glomerüler skleroz ile sonunda böbrek yetmezliğinden ölürler12. Bu sıçanların kullanımı ve azaltılmış fototoksisitesi, gelişmiş penetrasyon derinliği ve aynı anda birden fazla floresan probu görüntüleme yeteneği ile 2-foton mikroskobunun eklenmesi, yeni keşiflerin yolunu açtı 1,4,5. Bilgisayar donanımı ve yazılımının gelişmesiyle birlikte, nicel veriler artık tüm 2-foton laboratuvarları için standarttır. Fizyolojik ve hastalık koşulları altında glomerüler, proksimal tübül, vasküler ve interstisyel süreçlere çoklu kantitatif teknikler geliştirilmiş ve uygulanmıştır 1,4,5,27,28,29,30.
Transgenik fare üretim tesisleri, böbrek fizyolojisi ve patolojisi çalışmalarına yeni bir boyut ekledi ve bu, spesifik gen ürünlerinin böbrek yapısı ve fonksiyonundaki önemini daha da tanımlamak için 2-foton mikroskobu ile birleştirilmesi sadece bir zaman meselesiydi. Bununla birlikte, fare glomerülleri, çok genç fareler hariç, böbrekyüzeyinden 100 μm'nin üzerinde bulunur 9. İki foton mikroskobu en iyi çözünürlük olarak 20 ila 50 μm arasında bir derinlikte gerçekleştirilir ve floresan yoğunluğu, yayılan ışığın ışık saçılması ve hemoglobin ile etkileşimden emilim nedeniyle hızla azalır. Bu nedenle, yüzey glomerüllerini indüklemek gerekliydi. Yaygın olarak kullanılan yaklaşım, 12 hafta boyunca uzatılmış tek taraflı bir obstrüksiyon modelidir. Bu modeller temel belirlemelere izin vermediğinden, UUO'nun etkilerinin çalışılan süreçten ayrılması mümkün değildir.
MWF sıçanlarını kullanarak, temel glomerüler fonksiyonu takip eden UUO ile karşılaştırabilirsiniz. Bu UUO modelinin inflamasyonu ve hızlı bir fibroz oranını indüklediği bilinmektedir ve KBH ve fibroz10,11,12'yi incelemek için kullanılmıştır. Beklendiği gibi, hem MWF hem de SD sıçanlarında yüzey glomerüllerinde bir artış oldu. Ayrıca, MWF ve SD sıçanları için UUO'yu takiben elde edilen nicel sonuçlar çok karşılaştırılabilirdi. Burada kaydedilen kan akışındaki azalma daha önce UUO'yu takip eden mikroskobik verileri mikroponktur verileriyle karşılaştırarak bildirilmişti3. Ayrıca, tübüler ve interstisyel histolojinin belirgin bir şekilde değiştiği ve PT'lerin burada bildirildiği gibi, albümin endositozu eksikliği ile çoğunlukla işlevsiz olduğu iyi bilinmektedir. Şekil 2 ve Şekil 3'teki çalışmalar, glomerüler ve peritübüler kılcal damarlarda RBC akış hızında dramatik bir azalma ve artmış WBC adezyonu göstermektedir. Akıştaki azalmalar muhtemelen WBC adezyonu ve rouleaux oluşumlarından kaynaklanan kılcal tıkanmalardan kaynaklanmaktadır.
Enflamasyonu daha iyi değerlendirmek için, albümin geçirgenliğini ölçtük ve on kat arttığını gösterdik. Ek olarak, izole glomerüller, daha önce çeşitli böbrek hastalığı durumlarında böbrek iltihabında arttığı bilinen birçok gen için mRNA ekspresyonunun arttığını göstermiştir 17,19,20,21,22,23,24,25,26 . Glomerüler yüzey yoğunluğundaki ve albümin geçirgenliğindeki artışlar, 12 haftalık UUO verilerinde gösterildiği gibi progresifti. Mevcut veriler, glomerüllerin UUO modelinde önemli yapısal hasar, inflamasyon ve moleküler değişikliklere uğradığını doğrudan gösteren ilk verilerdir. Sonuçlar, UUO'yu takiben koyun böbrek biyopsilerini analiz eden ve19'u yükselten çoklu inflamasyon belirteçleri bulan tüm böbrek dokusunun daha önceki bir çalışmasıyla tutarlıdır. Mevcut sonuçlar, daha önce sadece kortikal doku için bilinen glomerüllerde belirgin inflamasyon olduğunu göstermektedir.
Mevcut veriler, 12 haftalık posthidronefrotik ve normal glomerüller31 arasında adezyon molekülü ekspresyonu, kompleman birikimi ve nötrofil infiltrasyonunda herhangi bir değişiklik bulunmayan farelerde yapılan önceki çalışmalardan farklıdır. Ek olarak, Hickey laboratuvarı, farelerin glomerüllerinde bağışıklık reaksiyonlarını incelemek için 12 haftalık UUO modelini kullandı. Dört haftalık fare glomerülleri ile postobstrüktif glomerüller arasında nötrofil infiltrasyonunda fark bulamadılar32,33. Bu daha sonraki çalışmalar, tıkanmış böbreğin pelvisi idrardan boşaltıldıktan sonra yapıldı. Bunu, UUO'nun glomerüler fonksiyon üzerindeki etkisini, obstrüksiyona neden olan sıvıyı yapay olarak çıkarmadan, in vivo olacağı gibi belirlemek istediğimiz için yapmadık. Son olarak, farelerde UUO kullanımı, yüzeyin altında 100 μm'den daha büyük görüntüleme glomerülleri ile değiştirilmektedir. Mümkün olsa da, çözünürlük ve yoğunlukta bir denge vardır, her ikisi de 50 μm34'ün ötesine geçtikçe önemli ölçüde azalır.
Histolojik değişiklikler, tübüler glomerül oluşumu, inflamasyon, fibrozis, hemodinamik10,11,12 ile ilgili mevcut literatürdeki verilerin bir araya getirilmesi şaşırtıcı değildir. WBC adezyonu, rouleaux oluşumları, glomerüler moleküler inflamasyon belirteçleri ve artmış albümin geçirgenliği dahil olmak üzere sunulan veriler, bu UUO modelinde beş haftada bile devam eden ve on iki haftada bile mevcut olan kapsamlı inflamasyonu göstermektedir. Açıkçası, kronik UUO fizyolojik bir durum değildir ve yüzey glomerüllerini indüklemek için UUO'nun kullanılması bir yaralanma modelini temsil eder. Fizyolojik koşullar altında yüzey glomerüllerine sahip olan MWF sıçanları, yaralanma meydana geldikçe uzunlamasına incelenebilir. Transgenik sıçanlar üretmek mümkündür ve çok sayıda araştırmacı bunları belirli sorular sormak için biyosensörlerle yaratmaktadır. Özellikle, Wisconsin Tıp Fakültesi şimdi MWF sıçanlarının bir kolonisine sahiptir ve fizyolojik ve patolojik koşullar altında glomerüler süreçleri incelemek amacıyla transgenik sıçanlar yapmıştır. Bu MWF sıçanları, normal, hastalıklı ve genetiği değiştirilmiş sıçanlarda glomerüler süreçleri incelemek için harika bir fırsat sunmaktadır.
Disclosures
Yazarların çıkar çatışması yoktur.
Acknowledgments
Bu çalışma Ulusal Diyabet ve Sindirim ve Böbrek Hastalıkları Enstitüsü tarafından desteklenmiştir RO1DK091623 ve P30DK079312 (B.A.M.'ye). Michigan State Üniversitesi'ndeki Araştırma Teknolojisi Destek Tesisi'nin (RTSF) Genomik Çekirdek Tesisi'ndeki personele Nanostring analizini gerçekleştirdikleri için teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 70 µm sterile cell strainer | Corning | #421751 | |
| 100 µm sterile cell strainer | Corning | #421752 | |
| CA Micro scissors Model 1C300 | Electron Microscopy Sciences | Cat# 72930 | |
| Electric heating pad | Sunbeam | Kroger | |
| Handling Forceps | Electron Microscopy Sciences | Cat# 72962 | |
| Kelly Hemostatic Forceps (straight) | Electron Microscopy Sciences | Cat#72930 | |
| Leica Dive SP-8 Multi-Photon Inverted Microscope | Leica Microsystems | Note: Version 7.1r1 | |
| MaiTai DeepSee titanium-sapphire laser | Spectra-Physics | NA | |
| Mayo Dissecting Scissors | Electron Microscopy Sciences | Cat# 78180-1C3 | |
| Metamorph Image processing Software | Molecular Dynamics | Cat# 78266-04 | |
| Microsoft Excel | Microsoft Corportation | 2007 version | |
| Quant-iT RNA Assay Kit | Invitrogen/ThermoFisher | Q33140 | |
| Reptitherm Undertank Heater | Zoomed | Amazon | |
| RNeasy MinElute Cleanup Kit (Spin columns) | Qiagen | 74204 | |
| RPE buffer | Qiagen | 1018013 | |
| Strate-Line Autoclave Tape | Fisher Scientific | Cat# 11-889-1 | |
| TRI Reagent | Sigma | T9424 | |
| Willco-dish Coverslip Bottom Dishes (50 mm/40 mm coverslip) | Electron Microscopy Sciences | Cat# 70665-07 |
References
- Dunn, K. W., Molitoris, B. A., Dagher, P. C. The Indiana O'Brien center for advanced renal microscopic analysis. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 320 (5), 671-682 (2021).
- Dunn, K. W., et al. Functional studies of the kidney of living animals using multicolor two-photon microscopy. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 283 (3), 905-916 (2002).
- Eisenbach, G., Liew, J., Boylan, J., Manz, N., Muir, P. Effect of angiotensin on the filtration of protein in the rat kidney: a micropuncture study. Kidney International. 8 (2), 80-87 (1975).
- Sandoval, R. M., Molitoris, B. A. Intravital multiphoton microscopy as a tool for studying renal physiology and pathophysiology. Methods. 128, 20-32 (2017).
- Sandoval, R. M., Molitoris, B. A., Palygin, O. Fluorescent imaging and microscopy for dynamic processes in rats. Methods in Molecular Biology. 2018, 151-175 (2019).
- Huber, T., et al. Molecular basis of the functional podocin-nephrin complex: mutations in the NPHS2 gene disrupt nephrin targeting to lipid raft microdomains. Human Molecular Genetics. 12 (24), 3397-3405 (2003).
- Kawachi, H., Koike, H., Kurihara, H., Sakai, T., Shimizu, F. Cloning of rat homologue of podocin: expression in proteinuric states and in developing glomeruli. Journal of the American Society of Nephrology JASN. 14 (1), 46-56 (2003).
- Roselli, S., et al. Early glomerular filtration defect and severe renal disease in podocin-deficient mice. Molecular and Cellular Biology. 24 (2), 550-560 (2004).
- Schießl, I., Bardehle, S., Castrop, H. Superficial nephrons in BALB/c and C57BL/6 mice facilitate in vivo multiphoton microscopy of the kidney. PloS One. 8 (1), 52499 (2013).
- Chevalier, R., Forbes, M., Thornhill, B. Ureteral obstruction as a model of renal interstitial fibrosis and obstructive nephropathy. Kidney International. 75 (11), 1145-1152 (2009).
- Forbes, M., Thornhill, B., Chevalier, R. Proximal tubular injury and rapid formation of atubular glomeruli in mice with unilateral ureteral obstruction: a new look at an old model. American Journal of Physiology. Renal physiology. 301 (1), 110-117 (2011).
- Yang, H. -C., Zuo, Y., Fogo, A. B.
- Hackl, M. J., et al. Tracking the fate of glomerular epithelial cells in vivo using serial multiphoton imaging in new mouse models with fluorescent lineage tags. Nature Medicine. 19 (12), 1661-1666 (2013).
- Kitching, A., Kuligowski, M., Hickey, M. In vivo imaging of leukocyte recruitment to glomeruli in mice using intravital microscopy. Methods in Molecular Biology. 466, 109-117 (2009).
- Savin, V. J., Terreros, D. A. Filtration in single isolated mammalian glomeruli. Kidney International. 20 (2), 188-197 (1981).
- Chomczynski, P., Sacchi, N. The single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction: twenty-something years on. Nature Protocols. 1 (2), 581-585 (2006).
- El Karoui, K., et al. Endoplasmic reticulum stress drives proteinuria-induced kidney lesions via Lipocalin 2. Nature Communications. 7, 10330 (2016).
- VA, M., et al. Multiplexed measurements of gene signatures in different analytes using the Nanostring nCounter Assay System. BMC Research Notes. 2, 80 (2009).
- Springer, A., et al. A combined transcriptome and bioinformatics approach to unilateral ureteral obstructive uropathy in the fetal sheep model. The Journal of Urology. 187 (2), 751-756 (2012).
- Braun, F., Becker, J., Brinkkoetter, P. Live or let die: Is there any cell death in podocytes. Seminars in Nephrology. 36 (3), 208-219 (2016).
- Kim, W. The role of angiopoietin-1 in kidney disease. Electrolyte & Blood Pressure E & BP. 6 (1), 22-26 (2008).
- Liu, F., Zhuang, S. Role of receptor tyrosine kinase signaling in renal fibrosis. International Journal of Molecular Sciences. 17 (5), 972 (2016).
- Martini, S., et al. Integrative biology identifies shared transcriptional networks in CKD. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 25 (11), 2559-2572 (2014).
- Mühlberger, I., et al. Integrative bioinformatics analysis of proteins associated with the cardiorenal syndrome. International Journal of Nephrology. 2011, 809378 (2010).
- Satirapoj, B., et al. Periostin: novel tissue and urinary biomarker of progressive renal injury induces a coordinated mesenchymal phenotype in tubular cells. Nephrology, Dialysis, Transplantation. 27 (7), 2702-2711 (2012).
- Fengxin, Z., et al. Numb contributes to renal fibrosis by promoting tubular epithelial cell cycle arrest at G2/M. Oncotarget. 7 (18), 25604-25619 (2016).
- Sandoval, R. M., Molitoris, B. A. Quantifying glomerular permeability of fluorescent macromolecules using 2-photon microscopy in Munich Wistar rats. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (74), e50052 (2013).
- Russo, L. M., et al. Impaired tubular uptake explains albuminuria in early diabetic nephropathy. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 20 (3), 489-494 (2009).
- Russo, L. M., et al. The normal kidney filters nephrotic levels of albumin retrieved by proximal tubule cells: retrieval is disrupted in nephrotic states. Kidney International. 71 (6), 504-513 (2007).
- Sandoval, R. M., Wang, E., Molitoris, B. A. Finding the bottom and using it: Offsets and sensitivity in the detection of low intensity values in vivo with 2-photon microscopy. Intravital. 2 (1), 23674 (2014).
- Kuligowski, M. P., Kitching, A. R., Hickey, M. J. Leukocyte recruitment to the inflamed glomerulus: a critical role for platelet-derived P-selectin in the absence of rolling. Journal of Immunology. 176 (11), 6991-6999 (2006).
- Devi, S., et al. Multiphoton imaging reveals a new leukocyte recruitment paradigm in the glomerulus. Nature Medicine. 19 (1), 107-112 (2013).
- Finsterbusch, M., et al. Patrolling monocytes promote intravascular neutrophil activation and glomerular injury in the acutely inflamed glomerulus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (35), 5172-5181 (2016).
- Shroff, U. N., Gyarmati, G., Izuhara, A., Deepak, S., Peti-Peterdi, J. A new view of macula densa cell protein synthesis. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 321 (6), 689-704 (2021).
