Summary
여기에서는 뮐러 아교 세포 (MGC)에서 2',7'-dichlorofluorescein diacetate probe (DCFH-DA)를 사용하여 세포 반응성 산소 종 (ROS)을 검출하기위한 체계화되고 접근 가능하며 재현 가능한 프로토콜을 제안합니다. 이 방법은 유세포 분석기로 총 세포 ROS 수준을 정량화합니다. 이 프로토콜은 사용하기 매우 쉽고 적합하며 재현 가능합니다.
Abstract
산화 환원 균형은 세포 항상성을 유지하는 데 중요한 역할을합니다. 반응성 산소 종 (ROS)의 증가된 생성은 단백질, 지질 및 DNA의 변형을 촉진하며, 이는 최종적으로 세포 기능 및 세포 사멸의 변화를 초래할 수 있다. 따라서 세포는 Keap1 / Nrf2와 같은 항산화 경로를 활성화하거나 산화 환원 제거제 (비타민 A, C 및 E, β 카로틴 및 폴리 페놀 등)를 개선함으로써 해로운 모욕에 대한 반응으로 항산화 방어력을 높이는 것이 유익합니다. 염증 및 산화 스트레스는 당뇨병성 망막병증(DR) 및 미숙아 망막병증(ROP)과 같은 망막병증의 병인 및 진행에 관여한다. 뮐러 신경교세포(MGCs)는 신경 망막 조직의 항상성에 중요한 역할을 하기 때문에, 이들은 이러한 세포 보호 메커니즘을 연구하기에 이상적인 모델로 간주됩니다. 이러한 의미에서, 재현 가능하고 간단한 방법으로 ROS 수준을 정량화하는 것은 항산화 세포 방어 메카니즘에 참여하는 경로 또는 분자의 기여도를 평가하는 데 필수적이다. 이 기사에서는 DCFH-DA 프로브를 사용한 ROS 측정 및 MGC의 유세포 분석기를 사용하는 데 필요한 절차에 대한 완전한 설명을 제공합니다. 소프트웨어를 사용한 유세포 분석 데이터 처리를 위한 주요 단계가 여기에 제공되므로 독자는 ROS 수준(FITC의 기하학적 수단)을 측정하고 형광 히스토그램을 분석할 수 있습니다. 이러한 도구는 세포 모욕 후 ROS의 증가뿐만 아니라 세포에 대한 보호 효과를 제공 할 수있는 특정 분자의 항산화 효과를 연구하는 데 매우 유용합니다.
Introduction
신경 망막은 잘 정의 된 신경 층을 제시하는 매우 조직 된 조직입니다. 이들에서, 뉴런 (신경절, amacrine, 양극성, 수평 및 광수용체 세포)은 서로 상호 연결되고 또한 뮐러 아교 세포 (MGCs) 및 성상 세포와 상호 연결되어 시각 정보의 적절한 광전달 및 처리로 이어진다 1,2. MGCs는 전체 망막 절편을 횡단하기 때문에 망막 항상성의 유지에 중요한 역할을하는 것으로 알려져 있으며, 따라서 여러 보호 과정을 조절하는 모든 세포 유형과 상호 작용할 수 있습니다. MGC는 뉴런에 에너지를 공급하는 당분해, 신경 노폐물의 제거, 신경 전달 물질의 재활용 및 신경 영양 인자의 방출을 포함하여 망막 뉴런의 유지 및 생존을위한 몇 가지 중요한 기능을 가지고 있음이보고되었습니다 3,4,5.
한편, 염증, 산화 및 니트로성 스트레스는 망막병증 6,7,8,9,10,11을 포함한 많은 인간 질환의 발병기전 및 진행에 관여한다. 세포의 산화 환원 균형은 ROS 수준의 엄격한 조절에 달려 있습니다. ROS는 주로 호기성 호흡의 결과로서 생리학적 조건 하에서 지속적으로 생성된다. ROS 패밀리의 주요 구성원은 수퍼옥사이드 음이온(O2͘͘͘͘•-), 히드록실 라디칼(•OH), 다양한 과산화물(ROOR'), 하이드로퍼옥사이드(ROOH), 및 라디칼 없는 과산화수소(H2O2)12,13과 같은 반응성 자유 라디칼을 포함한다. 지난 몇 년 동안, ROS가 필수적인 과정을 조절함으로써 세포에서 중요한 신호 전달 역할을 한다는 것이 명백해졌다. MGCs는 병리학적 조건 하에서 ROS의 과도한 생산을 제거하는 전사 핵 인자 에리스로이드-2 관련 인자 2 (Nrf2) 및 후속 항산화 단백질의 발현의 활성화에 의해 강력한 항산화 방어력을 갖는다14,15,16. ROS의 과장된 생산 또는 ROS를 제거하는 결함이있는 능력으로 인해 세포가 산화 환원 균형을 잃으면 산화 스트레스의 축적은 단백질, 지질 및 DNA의 유해한 변형을 촉진하여 세포 스트레스 또는 사망으로 이어집니다. 망막 항산화 방어 시스템의 증가는 ROP 및 RD17,18,19,20,21,22,23,24와 같은 망막 병증의 해결 및 예방을 향상시킨다. 따라서 ROS 생산을 실시간으로 측정하는 것은 강력하고 유용한 도구입니다.
세포에서 ROS 생산 또는 산화 스트레스를 측정하는 몇 가지 방법이 있습니다. 이 중 2',7'-디클로로플루오레세인 디아세테이트(DCFH-DA) 프로브는 세포 25,26,27,28의 산화환원 상태를 직접 정량화하는 데 가장 널리 사용되는 기술 중 하나입니다. 이 프로브는 친유성 및 비형광성이다. 세포막을 가로지르는 이 프로브의 확산은 두 개의 에스테르 결합에서 세포내 에스테라제에 의한 절단을 허용하여, 비교적 극성 및 세포막 불투과성 생성물인 2',7'-디클로로플루오레세인(H2DCF)을 생성한다. 이러한 비형광성 분자는 세포내 축적되고, ROS에 의한 후속 산화는 고도로 형광성 생성물인 DCF를 산출한다. 프로브의 산화는 여러 유형의 ROS (퍼옥시니트라이트, 하이드록실 라디칼, 산화 질소 또는 과산화물)의 작용의 산물이며, 이는 유세포 분석기 또는 공초점 현미경 (530nm에서의 방출 및 485nm에서의 여기)에 의해 검출 될 수 있습니다. 이 기술의 한계는 수퍼옥사이드와 과산화수소가H2 DCF 25,29와 강하게 반응하지 않는다는 것이다. 이 기사에서는 DCFH-DA 프로브를 사용하여 유세포 분석기에 의해 ROS를 측정하고 정량화합니다. 이러한 이유로, 우리는 형광 프로브로 세포를 로딩하기 전에 ROS 유도제 A 또는 B로 MGCs를 자극함으로써 ROS 생산을 유도한다. 또한, 우리는 항산화 화합물을 사용합니다. 마지막으로, 우리는이 프로토콜을 사용하여 얻은 대표적이고 신뢰할 수있는 데이터를 보여줍니다.
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Protocol
참고: 버퍼 조성에 대해서는 표 1을 참조하십시오.
1. 세포 배양 준비
참고: 여기에 기술된 것은 자발적으로 불멸화된 인간 뮐러 신경교세포 세포주인 MIO-M1 세포의 배양 준비이다(무어필드/안과 연구소- 뮐러 1). 항상 적절한 무균 기술을 사용하고 층류 후드에서 작업하십시오.
- Dulbecco의 수정 된 Eagle 's medium (DMEM) 완전 매체를 준비하십시오. 4.5 g/L D-글루코오스 및 110 mg/L 소듐 피루베이트를 함유하는 DMEM에 10% 열 불활성화 FBS, 10 mM 4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄설폰산(HEPES), 2 mM L-글루타민 및 50 U/mL 페니실린/스트렙토마이신을 첨가하십시오. 신선한 배지를 준비하고, MIO-M1 세포를 해동시키는 날에 준비한다.
- 냉동된 MIO-M1 세포를 1일째에 해동시킨다.
- 이렇게 하기 위해, 액체 질소 저장소로부터 10% DMSO로 FBS 중의 5 x 105 MIO-M1 세포를 함유하는 동결을 제거하고 즉시 37°C 수조에 넣는다.
참고: 액체 질소에 저장된 냉동 장치는 해동 시 폭발의 위험이 있으므로 항상 안면 마스크나 안전 고글을 착용하십시오. - MIO-M1 세포를 바이알에 단지 약간의 얼음이 남을 때까지 37°C 수조에서 바이알을 가온함으로써 신속하게 (1분 이내에) 해동시킨다.
- 바이알 외부를 70% 에탄올로 닦아내고 층류 후드로 옮깁니다.
- 해동된 세포를 바이알로부터 멸균된 15 mL 튜브로 옮긴 다음, 미리 가온된 완전한 DMEM 배지 6 mL를 적가한다.
- 세포 현탁액을 대략 600 x g 에서 5분 동안 원심분리한다. 원심분리 후, 명확한 상청액 및 완전한 펠릿이 시각화될 것이다. 세포 펠릿을 방해하지 않고 피펫으로 상층액을 버리십시오.
- 펠렛을 부드럽게 해리시키고 세포를 완전한 DMEM 배지 10 mL에 재현탁시킨다. 이 세포 현탁액을 직경 100 mm 조직 배양 플레이트 내로 옮기고 플레이트를 37°C, 5% CO2에서 대략2일 동안 인큐베이션한다.
- 이렇게 하기 위해, 액체 질소 저장소로부터 10% DMSO로 FBS 중의 5 x 105 MIO-M1 세포를 함유하는 동결을 제거하고 즉시 37°C 수조에 넣는다.
- MIO-M1 세포가 4일째에 80%-90% 합류하게 되면 다음 단계를 수행하십시오.
- 플레이트를 인큐베이터에서 층류 후드로 옮깁니다. 상청액을 조심스럽게 제거하고 5 mL의 멸균 및 예열 PBS로 2x를 세척하였다. PBS를 흡인한다.
- 0.5% 트립신-EDTA 용액 1 mL를 분주하고CO2 인큐베이터에서 3-5분 동안 37°C에서 배양하여 세포를 분리한다.
- 트립신 작용을 억제하기 위해 완전한 DMEM 배지 7 mL를 첨가한다. 클러스터링된 트립신화된 MGCs를 천천히 위아래로 피펫팅함으로써 분해한다(P1000). 세포 현탁액을 15 mL 튜브에 수집한다.
- 600 x g 에서 5분 동안 원심분리한다. 상층액을 버리십시오. 세포 펠렛을 2 mL의 완전한 DMEM 배지에 부드럽게 재현탁시킨다. 이 세포 현탁액 1 mL를 미리 가온된 완전한 DMEM 배지 9 mL를 함유하는 100 mm 플레이트 내로 옮긴다.
- 다른 100mm 플레이트로 작업을 반복하십시오. 플레이트를 5%CO2 인큐베이터에서 37°C에서 대략 1일 동안 인큐베이션한다.
- 두 플레이트가 모두 80 % -90 % 합류 (6 일째)되면 플레이트를 층류 후드로 옮깁니다. 1.3단계를 따릅니다. 세포 펠렛을 얻었다.
- 펠렛을 부드럽게 해리시키고 세포를 5 mL의 완전한 DMEM 배지에 재현탁시킨다. 아래 단계에 따라 혈구측정기(Neubauer chamber) 및 트리판 블루 용액을 사용하여 MIO-M1 세포를 계수한다.
- 유리 커버를 Neubauer 챔버 중앙 영역에 놓습니다. 챔버를 평평한 표면(예를 들어, 테이블 또는 워크벤치) 상에 놓는다.
- 같은 부피의 트리판 블루 얼룩을 세포와 혼합하십시오. 예를 들어, 60 μL의 트리판 블루와 60 μL의 세포를 혼합하여 1:2 희석한다.
- 이 혼합물로부터, 마이크로피펫으로 10 μL를 노이바우어 챔버에 로딩한다.
- 적재된 노이바우어 챔버를 현미경 스테이지 위에 놓습니다. 그런 다음 조명을 켜고 밝기를 조정하십시오.
- 현미경 단계를 최적의 위치로 이동하고 세포의 선명한 이미지가 얻어질 때까지 초점을 조정합니다.
- 혈구측정기의 모서리에 위치한 네 개의 사각형 (16에서 세분화 된) 내부의 세포를 계산하십시오 (부피 : 각각 0.1 mm3 ).
- 아래 방정식을 사용하여 세포 농도를 계산하십시오.
농도 = (셀 수 x 10.000)/제곱 수
농도 = (세포 수 x 10.000)/4
농도 = 세포 수 x 2500
참고: 세포 희석이 수행되는 경우, 수득된 농도는 희석 전에 원래 농도로 전환되어야 한다.
농도 = (세포 수 x 2500 x 2) = (세포 수 x 5000 세포/mL) - 세포 현탁액을 완전한 DMEM 배지에서 1 x 10 5 cells/mL로 조정하고, 이 세포 현탁액 2 mL를 6-웰 플레이트 (2 x 105 세포/웰)로 플레이트 2 mL로 조정한다. 플레이트를 부드럽게 흔들어 세포를 균질하게 분배한다. 6-웰 플레이트를 5%CO2 인큐베이터에서 37°C에서 하룻밤 동안 인큐베이션한다.
2. 분석 조건 및 대조군
- 각 실험에 대해 다음 실험 컨트롤을 포함합니다.
- 자가형광 조절 (DCFH-DA 프로브가 없는 세포, 유세포 분석기 파라미터를 설정하기 위한 대조군).
- 기초 조절 (자극되지 않은 세포).
- 양성 대조군 (ROS 유도제, A 또는 B로 처리된 세포).
- 음성 대조군 (항산화 화합물로 처리된 세포)
- 샘플 (항산화 화합물 및 ROS 유도제, A 또는 B로 처리된 세포).
3. 분석 수행
참고: 분석은 7일째에 수행된다. 항상 적절한 무균 기술을 사용하고 달리 지시하지 않는 한 층류 후드에서 작업하십시오.
- 저혈청 DMEM을 준비하십시오. 4.5 g / L D- 글루코스 및 110 mg / L 나트륨 피루베이트와 0.5 % 열 불활성화 FBS, 10 mM HEPES, 2 mM L- 글루타민 및 50 U / mL 페니실린 / 스트렙토 마이신을 함유 한 DMEM을 보충하십시오. MIO-M1이 처리될 날에 신선한 배지를 준비한다.
- 6-웰 플레이트 (60 % -70 % 합류)를 인큐베이터에서 층류 후드로 옮깁니다. 상청액을 흡인하고 세포를 PBS로 1x 세척한다. 웰 당 2 mL의 저혈청 DMEM을 첨가하고, 6-웰 플레이트를 37°C, 5%CO2에서 2시간 동안 인큐베이션한다. 이것은 세포를 굶주리기 위해 수행됩니다.
- 혈청이 굶주린 후, 세포를 6 시간 동안 항산화 화합물로 처리하십시오.
- 상청액을 흡인하고 희석된 스톡 2 mL를 다음 조건에 첨가한다: 음성 대조군(항산화제 화합물로 처리된 세포) 및 샘플(항산화제 화합물 및 ROS 유도제, A 또는 B로 처리된 세포).
- 6-웰 플레이트를 37°C, 5%CO2에서 6시간 동안 인큐베이션한다.
참고: 다른 항산화 화합물 또는 ROS 억제제를 사용하는 경우, 자극에 대한 최적의 시간과 농도를 표준화하십시오.
- 6시간의 인큐베이션 후, 세포를 ROS 유도인자 A 또는 B로 30분 동안 처리한다.
- 자극을 다음 조건에 첨가한다: 양성 대조군 (ROS 유도인자, A 또는 B로 처리된 세포) 및 샘플 웰 (항산화 화합물 및 ROS 유도인자로 처리된 세포, A 또는 B).
참고 : 재고 솔루션을 얼음 위에 보관하십시오. - 6-웰 플레이트를 37°C, 5%CO2에서 30분 동안 인큐베이션한다.
참고: 다른 ROS 유도제를 사용하는 경우, 자극에 대한 최적의 시간과 농도를 적절하게 표준화하십시오.
- 자극을 다음 조건에 첨가한다: 양성 대조군 (ROS 유도인자, A 또는 B로 처리된 세포) 및 샘플 웰 (항산화 화합물 및 ROS 유도인자로 처리된 세포, A 또는 B).
- DCFH-DA 프로브로 셀을 로드합니다.
- 상청액을 흡인하고 6-웰 플레이트에서 세포를 3x PBS로 세척하여 모든 자극을 제거하였다.
- 층류 후드의 빛을 끄고 어둠 속에서 작업하십시오. 15 mL 튜브에서 페놀 레드가 없는 DMEM에서 최종 농도 5 μM DCFH-DA 프로브 원액을 얻기 위해 5 mM DCFH-DA 중 1:1000의 희석액을 제조하였다.
- 와류를 사용하여 부드럽게 혼합하고이 용액 1 mL를 다음 웰에 첨가하십시오 : 기초 대조군 (자극되지 않은 세포), 양성 대조군 (ROS 유도제로 처리 된 세포), 음성 대조군 (항산화 화합물로 처리 된 세포) 및 샘플 웰 (항산화 화합물 및 ROS 유도제, A 또는 B로 처리 된 세포).
- 페놀 레드가 없는 DMEM 1 mL를 자가형광 대조군 세포에 첨가한다.
- 6-웰 플레이트를 37°C, 5%CO2에서 30분 동안 인큐베이션한다.
참고: 프로브는 빛에 민감합니다. 사용하지 않는 프로브 솔루션을 모두 버립니다.
4. 유세포 측정을 위한 세포 준비
- 6 시간 후에 접시를 얼음 위에 보관하십시오. 이 단계부터 적절한 무균 기술을 사용하고 층류 후드에서 작업 할 필요가 없습니다.
- 세포를 웰 당 2 mL의 차가운 PBS로 3x 세척한다. 0.5 mL의 콜드 디테이칭 버퍼를 각 웰에 첨가하십시오. P1000 피펫을 사용하여 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 세포를 수확하십시오.
- 이들을 표지된 1.5 mL 튜브에 수집하고, 4°C에서 5분 동안 600 x g 에서 원심분리한다.
참고: 세포를 수확할 때는 P1000 피펫을 0.4mL로 설정하여 기포 형성을 피하십시오. 이 단계부터 빨리 작업하십시오. - 원심분리가 끝나면 세포를 얼음 위에 올려 놓은 1.5 mL 튜브를 넣으십시오. 상청액을 조심스럽게 버리고 세포 펠릿을 태핑으로 부드럽게 해리시킵니다.
- FACS 완충액 1 mL를 각각의 표지된 1.5 mL 튜브에 첨가하여 세포를 세척한다. 필요한 경우, 세포 펠릿의 완전한 해리를 위해 가장 낮은 강도의 와류를 사용하십시오. 이를 4°C에서 5분 동안 600 x g 에서 원심분리한다. 이 단계를 2배 더 반복합니다. (총 세 번의 세척을 수행하십시오).
- 마지막 세척이 종료되면, 모든 실험 조건에 대해 5 mL 둥근바닥 폴리스티렌 튜브(유세포 분석기 튜브)를 라벨링한다(단계 2 참조).
- 원심분리가 끝나면 세포 펠렛을 200μL의 FACS 완충액에 재현탁시킨다. 볼텍스를 사용하여 각 1.5 mL 튜브에서 펠렛을 부드럽게 해리시킨다. 표지된 5 mL 둥근바닥 튜브로 옮긴다. 튜브가 유세포 분석기에서 분석 될 때까지 얼음 위에 보관하십시오.
5. 유세포 분석기에서의 데이터 수집
- 유세포 분석 소프트웨어를 사용하여 새로운 실험을 만듭니다. 이렇게 하려면 메뉴 모음에서 실험으로 이동하여 새 실험( Ctrl +E) 을 클릭합니다.
- 또한 메뉴 막대에서 보기 로 이동하여 도구 모음, 상태 표시줄, 브라우저, 세포계, 검사기, 워크시트, 획득 대시보드 및 이중 지수 편집기 옵션을 클릭하여 작업 영역에서 이러한 창을 확인합니다.
- 소프트웨어 왼쪽에서 Specimen_001 을 클릭합니다. 그러면 튜브 목록 (Tube_001, Tube_002 등)이 열립니다. 컨트롤 및 다양한 실험 조건에 대한 튜브에 레이블을 지정하려면 Tube_001, Tube_002 등을 두 번 클릭하고 이름을 바꿉니다(2단계 참조).
- 실험의 세포계 설정 에서 첫 번째 튜브에서 분석할 채널/파라미터(FSC, SSC, FITC, APC 또는 사분면을 볼 수 있는 다른 플루오로크롬)를 선택합니다.
- 현재 튜브 포인터 아이콘을 클릭하여 튜브를 선택하면 아이콘이 녹색으로 변경됩니다. "자가 형광 제어"튜브를 흡입기 암에 놓고 조심스럽게 왼쪽으로베이스를 움직입니다.
- "자동 형광 제어" 샘플을 실행하려면 수집 대시보드 창으로 이동하여 데이터 획득을 클릭합니다. FSC(x축) 대 SSC(y축)에 대한 점도표를 엽니다.
- 이벤트가 그래프에 나타나도록 전방 및 측면 산란 전압을 신속하게 조정하십시오. 획득 대시보드 창에서 획득 중지를 클릭합니다. 이 실험에서는 FSC - 200V, SSC - 423V의 전압 설정을 사용했습니다.
- FITC 전압을 설정하려면 "양성 대조군(ROS 유도인자, A 또는 B로 처리된 세포)"을 실행한다. 모든 이벤트가 FITC의 히스토그램에 표시되도록 전압을 조정합니다. 이 경우 280V의 전압을 사용하십시오. 획득 대시보드 창에서 획득 중지를 클릭합니다.
- "자가형광 조절" 튜브를 흡입기 암에 다시 놓습니다. 획득 대시보드 창에서 데이터 획득을 클릭한 다음 데이터 기록을 클릭하고 원하는 중지 조건(예: 50,000개 이벤트)을 선택합니다. 죽은 세포와 파편을 제외하고 관심있는 세포 주위에 문을 그립니다.
참고 : 이들은 주요 세포 집단보다 훨씬 작은 사건으로 관찰되며 플롯의 왼쪽 하단에 나타납니다. - 획득이 끝나면 흡입기 암에서 튜브를 제거하십시오. 장비는 스스로 씻을 것입니다. 획득 대시보드 창에서 다음 튜브 를 클릭하고 기초 컨트롤(자극되지 않은 셀)을 실행합니다. 데이터 가져오기 를 클릭한 다음 데이터 기록을 클릭합니다.
- 초기 게이트(죽은 세포와 파편을 제외하는 게이트)에서 FITC(x축) 대 APC(y축)의 또 다른 점도표를 만듭니다. 사분면 게이트를 그리고 좌표를 조정하여 FITC 대 APC 플롯의 왼쪽 아래 사분면에있는 이벤트를 시각화합니다.
- 다음 샘플을 기록하려면 튜브를 제거하고 다음 튜브를 클릭> 데이터 획득 > 기록 데이터.
참고 : 여기에 사용 된 유세포 분석기 ( 재료 표 참조)는 튜브 당 최대 1 x 106 이벤트를 기록합니다. - 모든 튜브의 기록이 끝나면 데이터를 디스크 D로 내보냅니다. 이렇게 하려면 파일 > FCS 파일> 내보내기를 클릭> 3.0 또는 3.1 버전 선택을 클릭합니다.
참고: 하나의 소프트웨어( 자료 표 참조)를 사용한 데이터 수집이 이 프로토콜에 자세히 설명되어 있지만 다른 유세포 분석 소프트웨어를 사용할 수 있습니다. 획득 파라미터들(FSC, SSC 및 FITC)은 결과를 얻기 위해 동일한 방식으로 설정될 수 있다.
6. 수집한 데이터의 분석
- 소프트웨어를 열고 샘플 추가 작업 버튼을 사용하여 샘플을 추가하십시오 . 작업 표시줄 또는 탐색 밴드에 있습니다.
- 샘플 추가를 클릭합니다.
- 파일 브라우저를 사용하여 실험 폴더로 이동합니다.
- 실험 폴더를 선택하고 선택을 클릭합니다.
참고: 샘플 파일은 "모든 샘플" 그룹의 일부로 작업 영역에 로드됩니다.
- 작업공간에서 첫 번째 샘플인 자동 형광 제어를 두 번 클릭합니다.
참고: 이 작업은 순방향 분산(x축의 FSC-A) 대 측면 분산(y축의 SSC-A) 매개 변수를 따라 이벤트를 플로팅하는 그래프 창을 엽니다. - 다각형 게이트를 그려 죽은 세포와 파편을 제외한 관심있는 세포를 분리하십시오.
- 다각형 게이트 도구를 클릭합니다.
- 플롯 내부를 클릭하여 다각형 게이트를 구성합니다. 필요한만큼 많은 측면을 만드십시오.
- 마지막 점을 두 번 클릭하여 다각형을 닫고 원하는 게이트를 만듭니다.
- 게이트의 이름(예: "MIO-M1 셀")을 입력하고 OK를 누릅니다.
참고: 죽은 세포와 파편이 없는 MIO-M1 이벤트만 표시하는 새 그래프 플롯 창이 나타납니다. - 분석할 모든 샘플과 함께 반복합니다.
- 플롯을 히스토그램으로 변경합니다. 이렇게 하려면 X축 매개변수 레이블 을 클릭하고 FITC-A를 선택합니다. Y축 매개변수 레이블 을 클릭하고 히스토그램을 선택합니다. 이렇게 하면 플롯이 일차원 히스토그램으로 변경됩니다.
- 통계 추가 창을 사용하여 통계를 추가합니다.
- 히스토그램 그래프 아래에서 통계 추가를 클릭합니다. 프로그램이 새 통계 창을 엽니다.
- 새 창의 왼쪽에서 통계 기하 평균을 선택합니다.
- 집단 MIO-M 1 세포를 선택하십시오.
- 사용 가능한 매개변수 목록에서 FIT-C를 선택합니다.
- 추가 단추를 클릭하여 분석에 적용합니다.
참고: 이렇게 하면 샘플 게이팅 트리에 새 통계 "기하 평균: FITC"가 만들어지고 해당 값이 작업 영역에 표시됩니다.
- 이러한 기하학적 평균 값을 통계 프로그램에 넣고 분석합니다.
- L 아이콘을 클릭하여 레이아웃 편집기를 엽니다. 이 아이콘은 작업 영역의 메뉴 탭에 있습니다. 작업공간 창과 레이아웃 편집기를 나란히 배치합니다.
참고: 레이아웃 편집기는 간단한 그래픽 보고서에 여러 그래프 플롯 및 통계를 표시하는 도구가 있는 분리된 작업 영역 창입니다. 이것은 PDF 또는 JPG와 같이 선호하는 확장 파일로 내보낼 수 있습니다.- 작업공간 창에 있는 샘플의 게이팅 트리에서 MIO-M 1 셀 모집단 을 레이아웃 편집기로 드래그합니다.
- 게이트의 이벤트를 포함하는 히스토그램 그래프가 레이아웃 편집기에 표시되는지 확인합니다. 추가 기본 정보는 아래의 텍스트 상자에 자세히 설명되어 있습니다.
- 모든 샘플을 드래그하여 동일한 그래프에서 비교합니다. 프로그램이 겹칠 것입니다.
- 히스토그램 그래프를 마우스 오른쪽 단추로 클릭하고 속성을 선택합니다. 프로그램이 새 그래프 정의 창을 엽니다. 이 창에는 네 개의 탭(주석 달기, 글꼴, 범례 및 지정)이 있습니다. 지정 탭을 클릭하고 y축을 자동에서 모달로 변경합니다. 적용을 클릭합니다.
- 샘플을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 채색, 선 스타일, 선 가중치 등을 변경하여 그래프를 개인화하십시오.
- 이미지를 내보내려면 파일 탭을 클릭하고 바로 다음에 문서 밴드에서 이미지 저장 을 선택합니다. 원하는 유형의 이미지 파일(예: PDF)을 선택합니다.
참고: 저장 대화 상자가 열리고 저장 위치를 선택하라는 메시지가 표시됩니다. 저장을 클릭합니다.
- 분석을 작업공간(.wsp) 파일로 저장합니다.
- 왼쪽 위 모서리에서 세포측정 분석 아이콘을 클릭하고 다른 이름으로 저장을 선택합니다.
- WSP( 작업 영역으로 저장 )를 선택하여 데이터 및 분석과 함께 문서를 저장합니다.
- 작업공간 파일의 이름을 입력합니다.
- 저장을 클릭합니다.
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Representative Results
프로토콜 섹션에 기재된 바와 같이, 우리는 ROS 유도제, A 또는 B로 자극된 MIO-M1 세포로부터의 형광 프로브 DCFH-DA를 사용한 ROS 생산의 유세포 분석 검출을 입증하는 대표적이고 정량적인 데이터를 나타내었다. 예상대로, 우리는 자가형광 수준 이상의 자극되지 않은 세포에서 FITC 형광의 변화를 관찰하였다(도 1A, "기저 대조군" 대 "자가형광 대조군"을 비교, 점도표 그래프). 이는 MIO-M1 세포에서 ROS의 기저 생산으로 인해 발생하였다. (도 1B, "기저 대조군" 대 "자가형광 대조군", 히스토그램 그래프 비교).
흥미롭게도, 세포가 ROS 유도제, A 또는 B로 자극되었을 때 FITC 형광의 유의한 증가가 관찰되었다 (도 1B, "ROS 유도제 A" 샘플 대 "기저 대조군" 및 "ROS 유도제 B" 샘플 대 "기저 대조군", 히스토그램 그래프를 비교). 더욱이, 세포가 ROS 유도제 A 또는 B에 앞서 항산화 화합물로 처리되었을 때, 형광 수준은 기저 수준에 가깝게 감소하였다 (도 1B, "ROS 유도제 A" 대 "항산화 화합물 6 h + ROS 유도제 A로 전처리 30분", 및 "ROS 유도제 B" 대 "항산화 화합물 6 h + ROS 유도제 B로 전처리 30분"을 비교하여, 각각, 히스토그램 그래프). 참고로, 기저 대조군에 대하여 항산화 화합물(6 h)로 처리된 세포에서 형광 신호의 차이는 관찰되지 않았다. (도 1B, "6h 항산화제 화합물" 대 "기초 대조군"을 비교한다).
이러한 결과는 데이터가 FITC의 기하학적 평균으로 제시되었을 때도 분명하게 드러났습니다 (그림 1C). 그래프에서 알 수 있는 바와 같이, 평균값 및 대응하는 표준오차(SEM)가 표시된다.
이 프로토콜의 주요 장점은 시간이 지남에 따라 ROS의 변화를 따르는 응용 프로그램입니다. 이와 관련하여, 우리는 MIO-M1 세포를 ROS 유도제 C로 2h, 4h 및 6시간 동안 처리했을 때 ROS의 유의하고 시간 의존적인 증가를 관찰할 수 있었다(도 2).
이 프로토콜의 최적화를 위해, 우리는 유사한 결과 (데이터 미도시)로 세포 (0.5 % 트립신-EDTA, Accutase 세포 분리 용액 및 분리 버퍼)를 수확하는 세 가지 전략을 시도했습니다.
도 1: MIO-M1 세포에서 DCFH-DA 프로브를 사용한 ROS 유도인자 A 또는 B에 대한 ROS의 측정: (A) "기저 대조군" 대 "자가형광 대조군" 조건의 비교, 대표적인 점도표 FL1 (519 nm) 대 FL2 (660 nm). (b) ROS 유도제 A 또는 B로 MIO-M1 세포의 자극시 DCFH-DA 프로브에 의해 유도된 형광에 대한 대표적인 히스토그램, 30분 동안, 또는 ROS 유도제 A, B 또는 비히클의 6 h 및 30분 동안 항산화 화합물로 전처리하였다. (c) MIO-M1 세포에서 모든 자극에 대한 FITC 형광의 기하학적 평균. 데이터는 SEM± 평균 데이터로 제시되고 단방향 ANOVA에 의해 분석되고 Dunnett의 사후 테스트가 뒤따릅니다. **p < 0.01, ***p < 0.001입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: MIO-M1 세포에서 DCFH-DA 프로브를 이용한 ROS 유도인자 C 처리에 반응하여 ROS 초과시간의 측정: ROS 유도제 C로 처리된 MIO-M1 세포를 2h, 4h 및 6시간 동안 DCFH-DA 프로브로 로딩하여 ROS 수준을 결정한다. ROS 유도제 C를 사용한 MIO-M1 세포의 자극시 DCFH-DA 프로브에 의해 유도된 형광 강도에 대한 대표적인 히스토그램은 2h, 4h 및 6시간 동안 진행된다. 위에서 설명한 자극에 대한 FITC 형광의 기하학적 평균. 데이터는 SEM± 평균 데이터로 제시되고 단방향 ANOVA에 의해 분석되고 Dunnett의 사후 테스트가 뒤따릅니다. ns, 유의하지 않음, **p < 0.01, ***p < 0.001입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 용액 | 보관 조건 | 메모 | |||||
| 수산화나트륨 (NaOH) 10 m, 1 L | NaOH 펠렛 400g | 증류수 1 L | 증권 시세 표시기 | "주의": 농축된 NaOH 용액의 제조는 발열 반응을 일으킨다. 화학 화상과 유리 비커의 파손을 피하기 위해 극도의주의를 기울여야합니다. 가능하면 무거운 플라스틱 비커를 사용하십시오. | |||
| 인산완충식염수(PBS) 10 X, 1 L | 나클 80 g | 증류수 1 L | 증권 시세 표시기 | pH를 7.4로 조정하고 용액을 여과하십시오. | |||
| 2 g KCl | |||||||
| 11.5 gNa2HPO4· 7H2O | |||||||
| 2 g KH2PO4 | |||||||
| 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA), 0.5 M pH 8.0, 1 L | 186.1 gNa2EDTA· 2H2O | 증류수 1 L | 증권 시세 표시기 | EDTA의 디소듐 염은 NaOH의 첨가에 의해 용액의 pH가 대략 8.0으로 조정될 때까지 중성 물 또는 용액에 용해되지 않는다. pH를 8.0으로 조정하고 용액을 살균하십시오. | |||
| 10% w/v 나트륨 아지드 (NaN3), 100 mL | NaN3 10 g | 증류수 100 mL | 증권 시세 표시기 | ||||
| 분리 버퍼, 100 mL | 포도당 180 mg | PBS 1X 내지 100 mL | 4 °C | ||||
| 0.6 mL 0.5 M pH 8.0 EDTA | |||||||
| 유세포 분석기 염색 버퍼 (FACS 버퍼), 100 mL | 2 mL 소 태아 혈청 (FBS) | PBS 1X 내지 100 mL | 4 °C | NaN3는 보존제로서 첨가된다. | |||
| 1 mL 0.5 M pH 8.0 EDTA | |||||||
| 1 mL 10% (아지드 나트륨 포함) | |||||||
| 5 mM 2',7'-DCFH-DA, 1 mL | 2.4 밀리그램 DCFH-DA | 디메틸설폭사이드 1 mL | 빛으로부터 보호되는 -20 °C | 분취량 20 μL를 1.5 mL 튜브에 부드럽게 섞는다. 여러 해동 / 동결 사이클을 피하십시오. 우리의 권고는 실험 당일부터 사용되지 않은 모든 프로브 용액을 폐기하는 것입니다. | |||
| 0.4% w/v 트리판 블루 10 X, 50 mL | 0.2 g 트리판 블루 | PBS 1X 내지 50 mL | 4 °C | ||||
표 1: 버퍼 레시피
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Discussion
암, 염증성 질환, 허혈 / 재관류, 허혈성 심장 질환, 당뇨병 및 망막 병증과 같은 몇 가지 병리학 적 상태와 노화와 같은 생리적 상황은 ROS 과잉 생산 6,7,8,9,10,11로 이어집니다. 따라서, ROS의 조절에 관여하는 경로의 검출, 측정 및 이해는 많은 질병에 대한 중요한 표적이다. DCFH-DA와 같은 ROS 수준을 측정하기 위해 프로브를 사용하는 것은 접근 가능하고 널리 설명되며 과학 문헌 26,27,28에서 받아 들여집니다. 이 기사에서는 MGC의 유세포 분석기에 의해 ROS 수준을 측정하고 정량화하는 상세하고 재현 가능한 프로토콜을 설명합니다.
이 방법의 사용의 이점은, 일단 DCFH-DA 프로브가 ROS에 의해 산화되고 형광 DCF 생성물을 생성한다는 것이다; 이것은 플레이트 판독기, 공초점 현미경 또는 유세포 분석기에서 측정 할 수 있습니다. 플레이트 리더의 단점은 총 형광을 측정한다는 것입니다. 결과적으로, 플레이트 리더는 배양 배지 내의 화학 반응에 의해 생성된 세포외 형광과 세포내 형광을 구별하지 않는다. 공초점 현미경은 세포를 DCFH-DA 프로브로 로드하고 37°C의 배양 챔버에서 실시간으로 볼 수 있기 때문에 유용한 도구입니다. 세포 내의 ROS의 형태 및 위치는 이 방법론으로 검출될 수 있지만, ROS 수준은 정량적 측정이 부족하다. 유세포 분석의 강도는 살아있는 세포에서 세포 내 형광을 측정하는 능력에 있습니다. 형광을 방출하는 세포의 수에 대한 정량적 데이터뿐만 아니라 형광의 기하학적 수단도25를 얻을 수 있다.
DCFH-DA 프로브를 사용할 때 실제로 측정되는 것을 고려하는 것이 중요합니다. 앞서 언급했듯이 DCFH-DA는 여러 ROS 종을 측정하므로 녹색 프로브에서 발생하는 형광은 ROS 종29의 유형을 구별하는 데 사용할 수 없습니다. 이와 관련하여, 상이한 프로브가 ROS의 유형을 식별할 수 있는 것으로 알려져 있다. 예를 들어, 디하이드로에티듐 (DHE) 프로브는 형광 생성물 2-하이드록시에티듐 (518 nm에서의 여기 및 605 nm에서의 방출)을 생성하기 위해 수퍼옥사이드에 의해 산화되지만, HPLC30,31과 같은 더 많은 시간이 소요되는 기술의 사용 없이는 이 생성물을 구별할 수 없다. 또 다른 프로브는 미토콘드리아 수퍼옥사이드 인디케이터(표 참조)로, 살아있는 세포(31,32)의 미토콘드리아에서 슈퍼옥사이드를 고도로 선택적으로 검출하기 위한 새로운 플루오르겐 프로브이다. 그러나, 다른 제품의 항산화 능력의 모욕 또는 평가 후에 총 ROS 수준 및 ROS의 증가의 측정을 위해, 적절한 대조군과 함께 DCFH-DA 프로브의 사용은 편리하고 수용 가능하다25,28,29.
매우 중요한 문제는 적절한 실험 대조군의 선택 및 사용입니다 : 자기 형광 조절 (DCFH-DA 프로브가없는 세포), 기초 대조군 (자극되지 않은 세포), 양성 대조군 (ROS 유도제로 처리 된 세포), 음성 대조군 (항산화 화합물로 처리 된 세포) 및 샘플 문제 (항산화 화합물 및 ROS 유도제로 처리 된 세포). 유용한 팁은 형광 프로브와의 간섭을 줄이기 위해 페놀 레드가없는 배지를 사용하는 것입니다.
우리는 또한 실험 치료를 완료하기 30 분 전에 DCFH-DA 프로브로 세포를로드하는 것이 좋습니다. DCFH-DA의 농도의 표준화, 우리의 경우 5 μM, 편리하며 세포 유형 및 세포 활성화 상태에 따라 다를 수 있습니다. 우리의 조언은 5μM 및 10 μM에서 시작하여 프로브 농도를 설정하고 실험에서 염색의 효능을 확인하는 것입니다.
요약하면, 건강 또는 질병에서 산화 환원 균형을 분석하는 것은 산화 스트레스 반응을 측정하기위한 신뢰할 수있는 방법을 확립하는 데 중추적인 역할을합니다. 따라서, 이 프로토콜은 유세포 분석기에 의해 살아있는 MGCs의 ROS 수준을 정량화하는 간단하고 빠르며 강력한 도구입니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
저자들은 CIBICI의 María Pilar Crespo와 Paula Alejandra Abadie (Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología, CONICET-UNC, Córdoba, Argentina)에게 유세포 측정에 도움을 준 것과 세포 배양 지원을 위해 Gabriela Furlan과 Noelia Maldonado에게 감사하고 싶습니다. 또한 비디오 제작 및 편집에 대한 Victor Diaz (FCQ의 기관 커뮤니케이션 담당 장관)에게 감사드립니다.
이 기사는 Secretaría de Ciencia y Tecnología, Universidad Nacional de Córdoba (SECyT-UNC) Consolidar 2018-2021, Fondo para la Investigación Científica y Tecnológica (FONCyT) 및 Proyecto de Investigación en Ciencia y Tecnología (PICT) 2015 N° 1314 (모두 M.C.S.)의 보조금으로 자금을 지원받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2′,7′-DCFH-DA | Sigma | 35845-1G | |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Gibco by life technologies | 15630-080 | |
| BD FACSCanto II flow cytometer | BD Biosciences | FACSCanto | |
| BD FACSDiva software | BD Biosciences | ||
| Cell Culture Dishes 100x20 mm | Cell Star- Greiner Bio-One | 664 160 | |
| Centrifuge | Thermo | Sorvall legend micro 17 R | |
| Centrifuge Tubes (15 ml) | BIOFIL | CFT011150 | |
| Centrifuge Tubes (50 ml) | BIOFIL | CFT011500 | |
| Cryovial | CRYO.S - Greiner Bio-One | 126263 | |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma-Aldrich | W387520-1KG | |
| Disodium-hydrogen-phosphate heptahydrate | Merck | 106575 | |
| DMEM without phenol red | Gibco by life technologies | 31053-028 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Gibco by life technologies | 11995065 | |
| Ethylenediamine Tetraacetic Acid (EDTA), Disodium Salt, Dihydrate | Merck | 324503 | |
| Fetal Bovine Serum | Internegocios | ||
| FlowJo v10 Software | BD Biosciences | ||
| Glucose | Merck | 108337 | |
| hemocytometer, Neubauer chamber | BOECO,Germany | ||
| Laminar flow hood | ESCO | AC2-6E8 | |
| L-glutamine (GlutaMAX) | Gibco by life technologies | A12860-01 | |
| MitoSOX Red | Invitrogen | M36008 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco by life technologies | 15140-122 | |
| Potassium Chloride | Merck | 104936 | |
| Potassium-dihydrogen phosphate | Merck | 4878 | |
| Round polystyrene tubes 5 ml (flow cytometry tubes) | Falcon - Corning | BD-352008 | |
| Sodium Azide | Merck | 822335 | |
| Sodium Chloride | Merck | 106404 | |
| Sodium Hydroxide | Merck | 106462 | |
| SPINWIN Micro Centrifuge Tube 1.5 ml | Tarson | 500010-N | |
| Tissue Culture Plate 6 well | BIOFIL | TCP011006 | |
| Trypan Blue | Merck | 111732 | |
| Trypsin-EDTA 0.5% 10X | Gibco by life technologies | 15400-054 | |
| Vortex Mixer | Labnet International, Inc. |
References
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