Summary
Hier stellen we een gesystematiseerd, toegankelijk en reproduceerbaar protocol voor om cellulaire reactieve zuurstofsoorten (ROS) te detecteren met behulp van 2′,7′-dichlorofluorescein diacetate probe (DCFH-DA) in Müller gliacellen (MGC's). Deze methode kwantificeert de totale cellulaire ROS-niveaus met een flowcytometer. Dit protocol is zeer eenvoudig te gebruiken, geschikt en reproduceerbaar.
Abstract
De redoxbalans speelt een belangrijke rol bij het handhaven van cellulaire homeostase. De verhoogde generatie van reactieve zuurstofsoorten (ROS) bevordert de modificatie van eiwitten, lipiden en DNA, wat uiteindelijk kan leiden tot verandering in cellulaire functie en celdood. Daarom is het gunstig voor cellen om hun antioxidantafweer te verhogen als reactie op schadelijke beledigingen, hetzij door een antioxidantroute zoals Keap1 / Nrf2 te activeren of door redox-aaseters te verbeteren (vitamine A, C en E, β-caroteen en polyfenolen, onder anderen). Ontsteking en oxidatieve stress zijn betrokken bij de pathogenese en progressie van retinopathieën, zoals diabetische retinopathie (DR) en retinopathie van prematuriteit (ROP). Aangezien Müller-gliacellen (MGC's) een sleutelrol spelen in de homeostase van neuraal netvliesweefsel, worden ze beschouwd als een ideaal model om deze cellulaire beschermende mechanismen te bestuderen. In die zin is het kwantificeren van ROS-niveaus met een reproduceerbare en eenvoudige methode essentieel om de bijdrage van pathways of moleculen die deelnemen aan het antioxidant celafweermechanisme te beoordelen. In dit artikel geven we een volledige beschrijving van de procedures die nodig zijn voor het meten van ROS met DCFH-DA-sonde en flowcytometrie in MGC's. Belangrijke stappen voor flowcytometriegegevensverwerking met de software worden hier gegeven, zodat de lezers ROS-niveaus (geometrische middelen van FITC) kunnen meten en fluorescentiehistogrammen kunnen analyseren. Deze hulpmiddelen zijn zeer nuttig om niet alleen de toename van ROS na een cellulaire belediging te evalueren, maar ook om het antioxiderende effect van bepaalde moleculen te bestuderen die een beschermend effect op de cellen kunnen hebben.
Introduction
Het neurale netvlies is een zeer georganiseerd weefsel dat goed gedefinieerde neuronale lagen presenteert. Hierin zijn neuronen (ganglion,amacrine, bipolaire, horizontale en fotoreceptorcellen) met elkaar verbonden en ook met Müller-gliacellen (MGC's) en astrocyten, wat leidt tot adequate fototransductie en verwerking van visuele informatie 1,2. Van MGC's is bekend dat ze een belangrijke rol spelen bij het onderhoud van retinale homeostase omdat ze het hele retinale gedeelte doorkruisen en dus kunnen interageren met alle celtypen die meerdere beschermende processen moduleren. Er is gemeld dat MGC's verschillende belangrijke functies hebben voor het onderhoud en de overleving van retinale neuronen, waaronder glycolyse om energie te leveren aan neuronen, de verwijdering van neuronaal afval, de recycling van neurotransmitters en de afgifte van neurotrofe factoren, onder andere 3,4,5.
Aan de andere kant zijn ontsteking, oxidatieve en nitrosatieve stress betrokken bij de pathogenese en progressie van veel menselijke ziekten, waaronder retinopathieën 6,7,8,9,10,11. De redoxbalans in cellen is afhankelijk van een strakke regulering van ROS-niveaus. ROS worden constant gegenereerd onder fysiologische omstandigheden als gevolg van aërobe ademhaling voornamelijk. De belangrijkste leden van de ROS-familie zijn reactieve vrije radicalen zoals het superoxide-anion (O2͘͘͘͘•−), hydroxylradicalen (•OH), verschillende peroxiden (ROOR′), hydroperoxiden (ROOH) en het geen radicale waterstofperoxide (H2O2)12,13. In de afgelopen jaren is gebleken dat ROS een belangrijke signaalrol speelt in de cellen door essentiële processen te beheersen. MGC's hebben een sterke antioxidantafweer door de activering van de transcriptionele nucleaire factor erytroïde-2-gerelateerde factor 2 (Nrf2) en de daaropvolgende expressie van antioxidanteiwitten om de overmatige productie van ROS onder pathologische omstandigheden te elimineren 14,15,16. Wanneer de cellen hun redoxbalans verliezen als gevolg van een overdreven productie van ROS of een defect vermogen om ROS te verwijderen, bevordert de accumulatie van oxidatieve stress schadelijke modificaties in eiwitten, lipiden en DNA, wat leidt tot cellulaire stress of de dood. De toename van het retinale antioxidantafweersysteem verbetert de resolutie en preventie van retinopathieën, zoals ROP en RD 17,18,19,20,21,22,23,24. Daarom is het meten van ROS-productie in real-time een krachtig en nuttig hulpmiddel.
Er zijn verschillende methoden voor het meten van ROS-productie of oxidatieve stress in cellen. Onder deze, 2′,7′-dichlorofluorescein diacetaat (DCFH-DA) sonde is een van de meest gebruikte technieken voor het direct kwantificeren van de redoxtoestand van een cel 25,26,27,28. Deze sonde is lipofiel en niet-fluorescerend. Diffusie van deze sonde over het celmembraan maakt de splitsing mogelijk door intracellulaire esterasen bij de twee esterbindingen, waardoor een relatief polair en celmembraan-ondoordringbaar product ontstaat, 2′,7′-dichlorofluorescein (H2DCF). Dit niet-fluorescerende molecuul accumuleert intracellulair en daaropvolgende oxidatie door ROS levert het zeer fluorescerende product DCF op. De oxidatie van de sonde is het product van de werking van meerdere soorten ROS (peroxynitriet, hydroxylradicalen, stikstofmonoxide of peroxiden), die kunnen worden gedetecteerd door flowcytometrie of confocale microscopie (emissie bij 530 nm en excitatie bij 485 nm). De beperking van deze techniek is dat superoxide en waterstofperoxide niet sterk reageren met H2DCF25,29. In dit artikel gebruiken we DCFH-DA probe om ROS te meten en te kwantificeren door middel van flowcytometrie. Om die reden induceren we ROS-productie door MGC's te stimuleren met ROS-inductor, A of B, voorafgaand aan het laden van de cellen met de fluorescerende sonde. Daarnaast gebruiken we een antioxidantverbinding. Ten slotte tonen we representatieve en betrouwbare gegevens die met behulp van dit protocol zijn verkregen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OPMERKING: Voor buffersamenstellingen zie tabel 1.
1. Bereiding van de celkweek
OPMERKING: Hier beschreven is de kweekvoorbereiding van MIO-M1-cellen, een spontaan vereeuwigde menselijke Müller-gliacellijn (Moorfield's / Institute of Ophthalmology- Müller 1). Gebruik altijd de juiste aseptische techniek en werk in een laminaire flowkap.
- Bereid Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium (DMEM) complete medium voor. Voeg aan DMEM met 4,5 g / L D-glucose en 110 mg / L natriumpyruvaat 10% warmte-geïnactiveerd FBS, 10 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonzuur (HEPES), 2 mM L-glutamine en 50 U / ml penicilline / streptomycine toe. Bereid het verse medium voor, op de dag dat de MIO-M1-cellen worden ontdooid.
- Ontdooi de bevroren MIO-M1 cellen op dag 1.
- Verwijder hiervoor het cryovial met 5 x 105 MIO-M1-cellen in FBS met 10% DMSO uit de opslag van vloeibare stikstof en plaats het onmiddellijk in een waterbad van 37 °C.
OPMERKING: Draag altijd een gezichtsmasker of veiligheidsbril, omdat cryovialen die zijn opgeslagen in vloeibare stikstof een explosiegevaar vormen wanneer ze worden ontdooid. - Ontdooi de MIO-M1-cellen snel (in minder dan 1 minuut) door de injectieflacon in het waterbad van 37 °C te verwarmen totdat er nog maar een klein beetje ijs in de injectieflacon zit.
- Veeg de buitenkant van de injectieflacon af met 70% ethanol en breng deze over op een laminaire stroomkap.
- Breng de ontdooide cellen van de injectieflacon over naar een steriele buis van 15 ml en voeg vervolgens druppelsgewijs 6 ml voorverwarmd compleet DMEM-medium toe.
- Centrifugeer de celsuspensie bij ongeveer 600 x g gedurende 5 minuten. Na de centrifugatie wordt een helder supernatant en een complete pellet gevisualiseerd. Gooi het supernatant met een pipet weg zonder de celkorrel te verstoren.
- Dissociëer de pellet voorzichtig en resuspend de cellen in 10 ml volledig DMEM-medium. Breng deze celsuspensie over in een weefselkweekplaat met een diameter van 100 mm en incubeer de plaat gedurende ongeveer 2 dagen bij 37 °C, 5% CO2.
- Verwijder hiervoor het cryovial met 5 x 105 MIO-M1-cellen in FBS met 10% DMSO uit de opslag van vloeibare stikstof en plaats het onmiddellijk in een waterbad van 37 °C.
- Wanneer de MIO-M1-cellen op dag 4 80%-90% confluent worden, voert u de volgende stappen uit.
- Breng de plaat over in een laminaire stroomkap van de couveuse. Verwijder het supernatant voorzichtig en was 2x met 5 ml steriele en voorverwarmde PBS. Aspirateer de PBS.
- Doseer 1 ml 0,5% Trypsine-EDTA-oplossing en incubeer bij 37 °C in de CO2-incubator gedurende 3-5 minuten om de cellen los te maken.
- Voeg 7 ml van het volledige DMEM-medium toe om de trypsinewerking te remmen. Splits geclusterde trypsinized MGC's uit door langzaam op en neer te pipetteren (P1000). Verzamel de celsuspensie in een buis van 15 ml.
- Centrifugeer bij 600 x g gedurende 5 min. Gooi het supernatant weg. Resuspend de celkorrel voorzichtig in 2 ml volledige DMEM-media. Breng 1 ml van deze celsuspensie over in een plaat van 100 mm met 9 ml voorverwarmd volledig DMEM-medium.
- Herhaal de actie met nog een plaat van 100 mm. Incubeer de plaat gedurende ongeveer 1 dag bij 37 °C in een 5% CO2 incubator.
- Wanneer beide platen 80%-90% confluent worden (op dag 6), breng de plaat over in een laminaire stromingskap. Volg stap 1.3. om een celkorrel te verkrijgen.
- Dissociëer de pellet voorzichtig en resuspend de cellen in 5 ml complete DMEM-media. Tel de MIO-M1-cellen met behulp van een hemocytometer (Neubauer-kamer) en trypanblauwe oplossing door de onderstaande stappen te volgen.
- Plaats de glazen afdekking op het centrale gedeelte van de Neubauer-kamer. Plaats de kamer op een vlak oppervlak (bijvoorbeeld een tafel of werkbank).
- Meng een gelijk volume trypan blauwe vlek met de cellen. Meng bijvoorbeeld 60 μL trypan blauw met 60 μL cellen voor een 1:2 verdunning.
- Laad uit dit mengsel 10 μL met een micropipette in een Neubauer-kamer.
- Plaats de geladen Neubauer-kamer op het microscooppodium. Schakel vervolgens het licht in en pas de helderheid aan.
- Verplaats de microscooptrap naar een optimale positie en pas de focus aan totdat een scherp beeld van de cellen is verkregen.
- Tel de cellen in de vier vierkanten (onderverdeeld in 16) op de hoek van de hemocytometer (volume: 0,1 mm3 elk ).
- Bereken de celconcentratie met behulp van de onderstaande vergelijkingen.
Concentratie = (Aantal cellen x 10.000)/Aantal kwadraten
Concentratie = (Aantal cellen x 10.000)/4
Concentratie = Aantal cellen x 2500
OPMERKING: Als celverdunning wordt uitgevoerd, moet de verkregen concentratie vóór de verdunning worden omgezet in de oorspronkelijke concentratie.
Concentratie = (Aantal cellen x 2500 x 2) = (Aantal cellen x 5000 cellen/ml) - Stel de celsuspensie in op 1 x 105 cellen/ml in volledig DMEM-medium en plaat 2 ml van deze celsuspensie in een 6-well plaat (2 x 105 cellen/put). Schud de plaat voorzichtig om de cellen homogeen te verdelen. Incubeer de 6-well plaat 's nachts bij 37 °C in een 5% CO2 incubator.
2. Testomstandigheden en controles
- Neem de volgende experimentele besturingselementen op voor elk experiment:
- Autofluorescentieregeling (cellen zonder DCFH-DA-sonde, controle voor het instellen van de parameters van de flowcytometer).
- Basale controle (niet-gestimuleerde cellen).
- Positieve controle (cellen behandeld met een ROS-inductor, A of B).
- Negatieve controle (cellen behandeld met antioxidantverbinding)
- Monster (cellen behandeld met antioxidantverbinding en ROS-inductor, A of B).
3. Het uitvoeren van de test
OPMERKING: De test wordt uitgevoerd op dag 7. Gebruik altijd de juiste aseptische techniek en werk in een laminaire flowkap, tenzij anders aangegeven.
- Bereid lage serum DMEM. Supplement DMEM met 4,5 g / L D-glucose en 110 mg / L natriumpyruvaat met 0,5% warmte-geïnactiveerde FBS, 10 mM HEPES, 2 mM L-glutamine en 50 U / ml penicilline / streptomycine. Bereid het verse medium op de dag dat de MIO-M1 wordt behandeld.
- Breng de 6-well plaat (60%-70% confluence) over naar een laminaire flowkap van de incubator. Aspiraleer het supernatant en was de cellen 1x met PBS. Voeg per put 2 ml van het lage serum DMEM toe en incubeer de 6-well plaat gedurende 2 uur bij 37 °C, 5% CO2. Dit wordt gedaan om de cellen uit te hongeren.
- Na het uithongeren van het serum, behandel de cellen met de antioxidantverbinding gedurende 6 uur.
- Zuig het supernatant op en voeg 2 ml van de verdunde bouillon toe aan de volgende omstandigheden: negatieve controle (cellen behandeld met antioxidantverbinding) en monster (cellen behandeld met antioxidantverbinding en ROS-inductor, A of B).
- Incubeer de 6-well plaat gedurende 6 uur bij 37 °C, 5% CO2.
OPMERKING: Als u een andere antioxidantverbinding of ROS-remmer gebruikt, standaardiseer dan de optimale tijd en concentratie voor de stimuli.
- Behandel na 6 uur incubatie de cellen met ROS-inductor, A of B, gedurende 30 minuten.
- Voeg de stimuli toe aan de volgende voorwaarden: positieve controle (cellen behandeld met een ROS-inductor, A of B) en monsterputten (cellen behandeld met antioxidantverbinding en ROS-inductor, A of B).
OPMERKING: Houd de stamoplossingen op ijs. - Incubeer de 6-well plaat gedurende 30 min bij 37 °C, 5% CO2.
OPMERKING: Als u een andere ROS-inductor gebruikt, standaardiseer dan op de juiste manier de optimale tijd en concentratie voor de stimuli.
- Voeg de stimuli toe aan de volgende voorwaarden: positieve controle (cellen behandeld met een ROS-inductor, A of B) en monsterputten (cellen behandeld met antioxidantverbinding en ROS-inductor, A of B).
- Laad de cellen met de DCFH-DA-sonde.
- Zuig het supernatant op en was de cellen in de 6-well plaat 3x met PBS om alle prikkels te verwijderen.
- Doe het licht van de laminaire flowkap uit en werk in het donker. Bereid een verdunning van 1:1000 van de 5 mM DCFH-DA sondevoorraadoplossing om een eindconcentratie van 5 μM DCFH-DA in DMEM te verkrijgen zonder fenolrood in een buis van 15 ml.
- Meng voorzichtig met behulp van een vortex en voeg 1 ml van deze oplossing toe aan de volgende putten: basale controle (niet-gestimuleerde cellen), positieve controle (cellen behandeld met een ROS-inductor), negatieve controle (cellen behandeld met antioxidantverbinding) en monsterputten (cellen behandeld met antioxidantverbinding en ROS-inductor, A of B).
- Voeg 1 ml DMEM zonder fenolrood toe aan de autofluorescentiecontrolecellen.
- Incubeer de 6-well plaat gedurende 30 min bij 37 °C, 5% CO2.
OPMERKING: De sonde is lichtgevoelig. Gooi alle ongebruikte sondeoplossing weg.
4. Celvoorbereiding voor flowcytometrie
- Houd de plaat na 6 uur op ijs. Vanaf deze stap is het niet nodig om de juiste aseptische techniek te gebruiken en in een laminaire stromingskap te werken.
- Was de cellen 3x met 2 ml koude PBS per put. Voeg 0,5 ml koude losmaakbuffer toe aan elke put. Oogst de cellen door voorzichtig op en neer te pipetteren met een P1000-pipet.
- Verzamel ze in gelabelde buizen van 1,5 ml en centrifugeer ze gedurende 5 minuten bij 4 °C bij 600 x g .
OPMERKING: Vermijd bij het oogsten van de cellen de bubbelvorming door de P1000-pipet in te stellen op 0,4 ml. Werk vanaf deze stap snel. - Wanneer de centrifugering eindigt, plaatst u gelabelde buizen van 1,5 ml met de cellen op ijs. Gooi het bovennatuurlijke middel voorzichtig weg en dissociëer de celkorrel voorzichtig met tikken.
- Voeg 1 ml FACS-buffer toe aan elke gelabelde buis van 1,5 ml om de cellen te wassen. Gebruik indien nodig een vortex op de laagste intensiteit voor de volledige dissociatie van de celkorrel. Centrifugeer ze bij 600 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Herhaal deze stappen 2x meer. (Voer in totaal drie wasbeurten uit).
- Wanneer de laatste wasbeurt eindigt, labelt u 5 ml polystyreenbuizen met ronde bodem (flowcytometriebuizen) voor alle experimentele omstandigheden (zie stap 2.).
- Wanneer de centrifugatie eindigt, resuspendeert u de celkorrels in 200 μL FACS-buffer. Dissociëer de pellet in elke buis van 1,5 ml voorzichtig met behulp van een vortex. Breng over op gelabelde 5 ml buizen met ronde bodem. Houd de buizen op ijs totdat ze worden geanalyseerd op de flowcytometer.
5. Data-acquisitie in een flowcytometer
- Maak met behulp van de flowcytometriesoftware een nieuw experiment. Ga hiervoor in de menubalk naar Experimenteren en klik op Nieuw experiment (Ctrl+E).
- Ga ook in de menubalk naar Weergave en klik op de volgende opties: Werkbalk, Statusbalk, Browser, Cytometer, Inspector, Werkblad, Acquisitiedashboard en Biexponential Editor om deze vensters in de werkruimte te zien.
- Klik aan de linkerkant van de software op de Specimen_001 . Dit opent een lijst met buizen (Tube_001, Tube_002, enz.). Om de buizen te labelen voor de bedieningselementen en verschillende experimentele omstandigheden, dubbelklikt u Tube_001, Tube_002, enz. en hernoemt u ze (zie stap 2.).
- Selecteer de te analyseren kanalen/parameters (FSC, SSC, FITC en APC of een ander fluorochroom om het kwadrant te zien) in de eerste buis uit de cytometerinstellingen van het experiment.
- Klik op het pictogram Huidige buisaanwijzer om de buis te selecteren en het pictogram verandert in groen. Plaats de buis "autofluorescentiecontrole" op de aspiratorarm en beweeg de basis voorzichtig alleen naar links.
- Als u het voorbeeld 'autofluorescentiecontrole' wilt uitvoeren, gaat u naar het venster Acquisitiedashboard en klikt u op Gegevens verkrijgen. Open een dot plot voor FSC (op de x-as) versus SSC (op de y-as).
- Pas de voorwaartse en zijwaartse verstrooiingsspanning snel aan om ervoor te zorgen dat de gebeurtenissen in de grafiek verschijnen. Klik in het venster Acquisitiedashboard op Aanschaffen stoppen. In dit experiment werden de volgende spanningsinstellingen gebruikt: FSC - 200 V, SSC - 423 V.
- Om de FITC-spanning in te stellen, voert u de "positieve controle (cellen behandeld met een ROS-inductor, A of B)" uit. Pas de spanning aan zodat alle gebeurtenissen op een histogram van FITC worden weergegeven. Gebruik in dit geval een spanning van 280 V. Klik in het venster Acquisitiedashboard op Aanschaffen stoppen.
- Plaats opnieuw de "autofluorescentiecontrole" buis op de aspiratorarm. Klik in het venster Acquisitiedashboard op Gegevens verzamelen, vervolgens op Gegevens vastleggen en selecteer de gewenste stopomstandigheden (bijvoorbeeld 50.000 gebeurtenissen). Teken een poort rond de cellen van belang, met uitzondering van dode cellen en puin.
OPMERKING: Deze worden waargenomen als veel kleinere gebeurtenissen dan de hoofdcelpopulatie en verschijnen linksonder in de plot. - Wanneer de acquisitie eindigt, verwijdert u de buis uit de aspiratorarm. De apparatuur zal zichzelf wassen. Klik in het venster Acquisitiedashboard op Volgende buis en voer het basale besturingselement (niet-gestimuleerde cellen) uit. Klik op Gegevens verzamelen en vervolgens op Gegevens vastleggen.
- Maak vanuit de beginpoort (poort die de dode cellen en puin uitsluit) nog een dotplot van FITC (op de x-as) versus APC (op de y-as). Teken een kwadrantpoort en pas de coördinaten aan om de gebeurtenissen in het kwadrant linksonder van de FITC versus APC-plot te visualiseren.
- Voor het opnemen van de volgende monsters verwijdert u de buis en klikt u op Volgende buis > Gegevens verzamelen > gegevens opnemen.
OPMERKING: De hier gebruikte flowcytometer (zie Tabel met materialen) registreert maximaal 1 x 106 gebeurtenissen per buis. - Wanneer de registratie van alle buizen is beëindigd, exporteert u de gegevens naar schijf D. Klik hiervoor op Bestand > EXPORTEER > FCS-bestanden > Selecteer 3.0- of 3.1-versie.
OPMERKING: Hoewel gegevensverzameling met behulp van één software (zie Tabel met materialen) in dit protocol in detail wordt beschreven, kan elke andere flowcytometriesoftware worden gebruikt. De acquisitieparameters (FSC, SSC en FITC) kunnen op dezelfde manier worden ingesteld om de resultaten te verkrijgen.
6. Analyse van de verkregen gegevens
- Open de software en voeg de voorbeelden toe met behulp van de actieknop Voorbeelden toevoegen ; het bevindt zich op de taakbalk of in de navigate-band.
- Klik op Voorbeelden toevoegen.
- Navigeer met de bestandsbrowser naar de map Experimenteel.
- Selecteer de map Experimenteel en klik op Kiezen.
OPMERKING: De voorbeeldbestanden worden als onderdeel van de groep 'Alle voorbeelden' in de werkruimte geladen.
- Dubbelklik op het eerste voorbeeld in de werkruimte: Autofluorescentiecontrole.
OPMERKING: Met deze actie opent u een grafiekvenster waarin gebeurtenissen worden uitgezet langs de parameters voorwaartse spreiding (FSC-A op de x-as) versus zijspreiding (SSC-A op de y-as). - Teken een polygoonpoort om de cellen van belang te isoleren, met uitzondering van dode cellen en puin.
- Klik op het gereedschap Polygon Gate .
- Klik binnen de plot om de polygoonpoort te vormen. Maak zoveel kanten als nodig is.
- Dubbelklik op het laatste punt om de veelhoek te sluiten en de gewenste poort te maken.
- Geef een naam op voor de gate, zoals "MIO-M1-cellen", en druk op OK.
OPMERKING: Er verschijnt een nieuw grafiekplotvenster met alleen de MIO-M1-gebeurtenissen zonder dode cellen en puin. - Herhaal dit met alle te analyseren monsters.
- Wijzig de plot in een histogram. Klik hiervoor op het parameterlabel X-as en selecteer FITC-A. Klik op het parameterlabel Y-as en selecteer Histogram. Hierdoor verandert de plot in een eendimensionaal histogram.
- Statistieken toevoegen met het venster Statistiek toevoegen.
- Klik onder de histogramgrafiek op Statistieken toevoegen. Het programma opent een nieuw statistiekvenster.
- Selecteer aan de linkerkant van het nieuwe venster de statistieken Geometrisch gemiddelde.
- Selecteer de populatie MIO-M 1-cellen.
- Selecteer FIT-C in de lijst met beschikbare parameters.
- Klik op de knop Toevoegen om ze toe te passen op de analyse.
OPMERKING: Hiermee worden de nieuwe statistieken "geometrisch gemiddelde: FITC" in de voorbeeldstructuur gemaakt en worden hun waarden weergegeven in uw werkruimte.
- Zet deze geometrische gemiddelde waarden in een statistiekprogramma en analyseer.
- Klik op het pictogram L om de lay-outeditor te openen; dit pictogram bevindt zich op het tabblad Menu in de werkruimte. Plaats het werkruimtevenster en de lay-outeditor naast elkaar.
OPMERKING: De Layout Editor is een gescheiden werkruimtevenster met hulpmiddelen voor het weergeven van meerdere grafiekplots en statistieken in een eenvoudig grafisch rapport. Dit kan worden geëxporteerd met het extensiebestand dat u verkiest, zoals PDF of JPG, onder andere.- Sleep vanuit de gatingstructuur van een voorbeeld in het werkruimtevenster mio-m 1-cellenpopulatie naar de lay-outeditor.
- Zorg ervoor dat een histogramgrafiek met de gebeurtenissen in de gate wordt weergegeven in de lay-outeditor. Aanvullende basisinformatie wordt beschreven in een tekstvak hieronder.
- Sleep alle voorbeelden om ze in dezelfde grafiek te vergelijken. Het programma zal ze overlappen.
- Klik met de rechtermuisknop op de histogramgrafiek en selecteer Eigenschappen. Het programma opent een nieuw Graph Definition-venster. Dit venster heeft vier tabbladen (Aantekeningen maken, Lettertypen, Legenda en Opgeven). Klik op het tabblad Opgeven en wijzig de y-as van Automatisch in Modaal. Klik op Toepassen.
- Klik met de rechtermuisknop op het voorbeeld en wijzig kleuring, lijnstijl, lijndikte, enz. om de grafiek te personaliseren.
- Als u de afbeelding wilt exporteren, klikt u op het tabblad Bestand en selecteert u direct daarna Afbeelding opslaan in de documentband. Kies het gewenste type afbeeldingsbestand (bijvoorbeeld PDF).
OPMERKING: Er wordt een dialoogvenster voor opslaan geopend waarin u wordt gevraagd een opslaglocatie te selecteren. Klik op Opslaan.
- Sla de analyse op als een werkruimtebestand (.wsp).
- Klik in de linkerbovenhoek op het pictogram Cytometrie-analyse en selecteer Opslaan als.
- Kies Opslaan als werkruimte (WSP) om het document met gegevens en analyses op te slaan.
- Voer een naam in voor het werkruimtebestand.
- Klik op Opslaan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Zoals beschreven in de protocolsectie, hebben we representatieve en kwantitatieve gegevens getoond die flowcytometriedetectie van ROS-productie aantonen met de fluorescentiesonde DCFH-DA van MIO-M1-cellen gestimuleerd met ROS-inductor, A of B. Zoals verwacht zagen we veranderingen in FITC-fluorescentie in niet-gestimuleerde cellen boven autofluorescentieniveaus (figuur 1A, vergelijk "basale controle" versus "autofluorescentiecontrole", puntplotgrafiek). Dit gebeurde als gevolg van een basale productie van ROS in de MIO-M1-cellen. (Figuur 1B, vergelijk "basale controle" versus "autofluorescentiecontrole", histogramgrafiek).
Interessant is dat een significante toename van FITC-fluorescentie werd waargenomen wanneer de cellen werden gestimuleerd met ROS-inductor, A of B (figuur 1B, vergelijk "ROS-inductor A" -monsters versus "basale controle" en "ROS-inductor B" -monsters versus "basale controle", histogramgrafiek). Bovendien, wanneer cellen werden behandeld met de antioxidantverbinding voorafgaand aan ROS-inductor, A of B, was het fluorescentieniveau verminderd in de buurt van basale niveaus (figuur 1B, vergelijk "ROS-inductor A" versus "voorbehandeling met antioxidantverbinding 6 h + ROS-inductor A 30 min", en "ROS-inductor B" versus "voorbehandeling met antioxidantverbinding 6 h + ROS-inductor B 30 min", respectievelijk histogramgrafiek). Van belang is dat er geen verschillen in fluorescentiesignaal werden waargenomen in cellen die werden behandeld met antioxidantverbinding (6 uur) met betrekking tot basale controle. (Figuur 1B, vergelijk "6h antioxidant compound" vs. "basale controle").
Deze resultaten waren ook duidelijk zichtbaar toen gegevens werden gepresenteerd als het geometrische gemiddelde van FITC (figuur 1C). Zoals te zien is in de grafiek, worden de gemiddelde waarden en de bijbehorende standaardfout van het gemiddelde (SEM) aangegeven.
Een belangrijk voordeel van dit protocol is de toepassing om veranderingen in ROS in de loop van de tijd te volgen. In dit opzicht hebben we een significante en tijdsafhankelijke toename van ROS kunnen waarnemen toen we MIO-M1-cellen behandelden met ROS-inductor C gedurende 2 uur, 4 uur en 6 uur (figuur 2).
Voor optimalisatie van dit protocol hebben we drie verschillende strategieën geprobeerd om de cellen te oogsten (0,5% trypsine-EDTA, Accutase celloslatingsoplossing en ontkoppelingsbuffer) met vergelijkbare resultaten (gegevens niet getoond).
Figuur 1: Meting van ROS in reactie op ROS-inductor, A of B, met behulp van DCFH-DA-sonde in MIO-M1-cellen: (A) Vergelijking van "basale controle" versus "autofluorescentiecontrole" -omstandigheden, representatieve dot plot FL1 (519 nm) versus FL2 (660 nm). (B) Representatieve histogrammen voor de fluorescentie geïnduceerd door DCFH-DA-sonde bij stimulatie van MIO-M1-cellen met ROS-inductor, A of B, gedurende 30 minuten, of voorbehandeld met antioxidantverbinding gedurende 6 uur en 30 minuten ROS-inductor A, B of voertuig. (C) Geometrisch gemiddelde van de FITC-fluorescentie voor alle stimuli in MIO-M1-cellen. Gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± SEM en geanalyseerd door eenrichtings-ANOVA gevolgd door dunnett's post-test; **p < 0,01, ***p < 0,001. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Meting van ROS-overuren als reactie op ROS-inductor C-behandeling met behulp van DCFH-DA-sonde in MIO-M1-cellen: MIO-M1-cellen behandeld met ROS-inductor C gedurende 2 uur, 4 uur en 6 uur en geladen met DCFH-DA-sonde om ROS-niveaus te bepalen. Representatief histogram voor fluorescentie-intensiteit geïnduceerd door DCFH-DA-sonde bij stimulatie van MIO-M1-cellen met ROS-inductor C gedurende 2 uur, 4 uur en 6 uur. Geometrisch gemiddelde van FITC-fluorescentie voor de hierboven beschreven stimuli. Gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± SEM en geanalyseerd door eenrichtings-ANOVA gevolgd door dunnett's post-test; ns, niet significant, **p < 0,01, ***p < 0,001. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Oplossing | Bewaarcondities | Notitie | |||||
| Natriumhydroxide (NaOH) 10 m, 1 l | 400 g NaOH pellets | gedestilleerd water tot 1 L | RT | "LET OP": De bereiding van een geconcentreerde NaOH-oplossing veroorzaakt een exotherme reactie. Uiterste voorzichtigheid is geboden om chemische brandwonden en breuk van glazen bekers te voorkomen. Gebruik indien mogelijk zware plastic bekers. | |||
| Fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) 10 X, 1 L | 80 g NaCl | gedestilleerd water tot 1 L | RT | Stel de pH in op 7,4 en filter de oplossing. | |||
| 2 g KCl | |||||||
| 11,5 g Na2HPO4· 7u2o | |||||||
| 2 g KH2PO4 | |||||||
| Ethyleendiamine tetra-azijnzuur (EDTA), 0,5 M pH 8,0, 1 L | 186,1 g Na2EDTA· 2U2O | gedestilleerd water tot 1 L | RT | Het dinatriumzout van EDTA is niet oplosbaar in neutraal water of oplossing totdat de pH van de oplossing is aangepast tot ongeveer 8,0 door toevoeging van NaOH. Stel de pH in op 8,0 en steriliseer de oplossing. | |||
| 10% w / v natriumazide (NaN3), 100 ml | 10 g NaN3 | gedestilleerd water tot 100 ml | RT | ||||
| Ontkoppelingsbuffer, 100 ml | 180 mg glucose | PBS 1X tot 100 ml | 4 °C | ||||
| 0,6 ml 0,5 m pH 8,0 EDTA | |||||||
| Flow Cytometry Kleuringsbuffer (FACS Buffer), 100 ml | 2 ml foetaal runderserum (FBS) | PBS 1X tot 100 ml | 4 °C | NaN3 wordt toegevoegd als conserveermiddel. | |||
| 1 ml 0,5 m pH 8,0 EDTA | |||||||
| 1 ml 10% m/v natriumazide | |||||||
| 5 mM 2′,7′-DCFH-DA, 1 ml | 2,4 mg DCFH-DA | dimethylsulfoxide tot 1 ml | -20 °C beschermd tegen licht | Meng voorzichtig en aliquot 20 μL in 1,5 ml buisjes. Vermijd meerdere dooi-/vriescycli. Onze aanbeveling is om alle ongebruikte sonde-oplossingen van de experimentele dag weg te gooien. | |||
| 0,4% w/v trypan blauw 10 X, 50 ml | 0,2 g trypan blauw | PBS 1X tot 50 ml | 4 °C | ||||
Tabel 1: Bufferrecepten
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Verschillende pathologische aandoeningen, zoals kanker, ontstekingsziekten, ischemie / reperfusie, ischemische hartziekte, diabetes en retinopathieën, en ook fysiologische situaties zoals veroudering, leiden tot ROS-overproductie 6,7,8,9,10,11. Daarom zijn de detectie, meting en begrip van de route die betrokken is bij de modulatie van ROS belangrijke doelen voor veel ziekten. Het gebruik van sondes om ROS-niveaus te meten, zoals DCFH-DA, is toegankelijk, breed beschreven en geaccepteerd in de wetenschappelijke literatuur 26,27,28. In dit artikel beschrijven we een gedetailleerd en reproduceerbaar protocol om ROS-niveaus te meten en te kwantificeren door middel van flowcytometrie in MGC's.
Een voordeel van het gebruik van deze methode is dat, zodra de DCFH-DA-sonde wordt geoxideerd door ROS en een fluorescerend DCF-product genereert; dit kan worden gemeten in een plaatlezer, confocale microscoop of flowcytometer. Het nadeel van de plaatlezer is dat deze de totale fluorescentie meet. Bijgevolg onderscheidt de plaatlezer de intracellulaire fluorescentie niet van de extracellulaire fluorescentie die wordt gegenereerd door chemische reacties in het kweekmedium. Confocale microscopie is een nuttig hulpmiddel omdat cellen kunnen worden geladen met DCFH-DA-sonde en in realtime kunnen worden bekeken in kweekkamers bij 37 °C. De morfologie en locatie van ROS in de cel kunnen met deze methodologie worden gedetecteerd, maar ROS-niveaus missen een kwantitatieve meting. De kracht van flowcytometrie ligt in het vermogen om de intracellulaire fluorescentie in levende cellen te meten. Kwantitatieve gegevens over het aantal cellen dat fluorescentie uitzendt, evenals de geometrische middelen van fluorescentie, kunnen worden verkregen25.
Het is belangrijk om rekening te houden met wat er daadwerkelijk wordt gemeten bij het gebruik van DCFH-DA-sonde. Zoals we eerder vermeldden, meet DCFH-DA meerdere ROS-soorten, en dus kan fluorescentie als gevolg van de groene sonde niet worden gebruikt om onderscheid te maken tussen soortenROS-soorten 29. In dit opzicht is bekend dat verschillende sondes het type ROS kunnen onderscheiden. Dihydroethidium (DHE) sonde wordt bijvoorbeeld geoxideerd door superoxide om het fluorescerende product 2-hydroxyethidium (excitatie bij 518 nm en emissie bij 605 nm) te produceren, maar dit product kan niet worden onderscheiden zonder het gebruik van meer tijdrovende technieken, zoals HPLC30,31. Een andere sonde is een mitochondriale superoxide-indicator (zie Tabel met materialen), een nieuwe fluorogene sonde voor zeer selectieve detectie van superoxide in de mitochondriën van levende cellen31,32. Voor het meten van de totale ROS-niveaus en verhogingen van ros na een belediging of de evaluatie van het antioxidantvermogen van verschillende producten, is het gebruik van DCFH-DA-sonde naast de juiste controles echter handig en acceptabel 25,28,29.
Een zeer belangrijke kwestie is de selectie en het gebruik van de juiste experimentele controles: autofluorescentiecontrole (cellen zonder DCFH-DA-sonde), basale controle (niet-gestimuleerde cellen), positieve controle (cellen behandeld met een ROS-inductor), negatieve controle (cellen behandeld met antioxidantverbinding) en monsterprobleem (cellen behandeld met antioxidantverbinding en ROS-inductor). Een nuttige tip is om medium zonder fenolrood te gebruiken om interferentie met fluorescerende sondes te verminderen.
We raden ook aan om cellen 30 minuten voordat de experimentele behandeling is voltooid met de DCFH-DA-sonde te laden. Standaardisatie van de concentratie van DCFH-DA, in ons geval 5 μM, is handig en kan verschillen afhankelijk van het celtype en de celactiveringsstatus. Ons advies is om de sondeconcentraties in te stellen, vanaf 5μM en 10 μM, en de effectiviteit van de kleuring in de experimenten te controleren.
Kortom, het analyseren van redoxbalans in gezondheid of ziekte is cruciaal om betrouwbare methoden vast te stellen om de oxidatieve stressrespons te meten. Daarom is dit protocol een eenvoudig, snel en krachtig hulpmiddel om ROS-niveaus in levende MGC's te kwantificeren door middel van flowcytometrie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs willen María Pilar Crespo en Paula Alejandra Abadie van CIBICI (Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología, CONICET-UNC, Córdoba, Argentinië) bedanken voor hulp bij flowcytometrie en Gabriela Furlan en Noelia Maldonado voor hulp bij celkweek. We bedanken ook Victor Diaz (Pro-Secretary of Institutional Communication van FCQ) voor de videoproductie en -montage.
Dit artikel werd gefinancierd door subsidies van Secretaría de Ciencia y Tecnología, Universidad Nacional de Córdoba (SECyT-UNC) Consolidar 2018-2021, Fondo para la Investigación Científica y Tecnológica (FONCyT) en Proyecto de Investigación en Ciencia y Tecnología (PICT) 2015 N° 1314 (allemaal naar M.C.S.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2′,7′-DCFH-DA | Sigma | 35845-1G | |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Gibco by life technologies | 15630-080 | |
| BD FACSCanto II flow cytometer | BD Biosciences | FACSCanto | |
| BD FACSDiva software | BD Biosciences | ||
| Cell Culture Dishes 100x20 mm | Cell Star- Greiner Bio-One | 664 160 | |
| Centrifuge | Thermo | Sorvall legend micro 17 R | |
| Centrifuge Tubes (15 ml) | BIOFIL | CFT011150 | |
| Centrifuge Tubes (50 ml) | BIOFIL | CFT011500 | |
| Cryovial | CRYO.S - Greiner Bio-One | 126263 | |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma-Aldrich | W387520-1KG | |
| Disodium-hydrogen-phosphate heptahydrate | Merck | 106575 | |
| DMEM without phenol red | Gibco by life technologies | 31053-028 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Gibco by life technologies | 11995065 | |
| Ethylenediamine Tetraacetic Acid (EDTA), Disodium Salt, Dihydrate | Merck | 324503 | |
| Fetal Bovine Serum | Internegocios | ||
| FlowJo v10 Software | BD Biosciences | ||
| Glucose | Merck | 108337 | |
| hemocytometer, Neubauer chamber | BOECO,Germany | ||
| Laminar flow hood | ESCO | AC2-6E8 | |
| L-glutamine (GlutaMAX) | Gibco by life technologies | A12860-01 | |
| MitoSOX Red | Invitrogen | M36008 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco by life technologies | 15140-122 | |
| Potassium Chloride | Merck | 104936 | |
| Potassium-dihydrogen phosphate | Merck | 4878 | |
| Round polystyrene tubes 5 ml (flow cytometry tubes) | Falcon - Corning | BD-352008 | |
| Sodium Azide | Merck | 822335 | |
| Sodium Chloride | Merck | 106404 | |
| Sodium Hydroxide | Merck | 106462 | |
| SPINWIN Micro Centrifuge Tube 1.5 ml | Tarson | 500010-N | |
| Tissue Culture Plate 6 well | BIOFIL | TCP011006 | |
| Trypan Blue | Merck | 111732 | |
| Trypsin-EDTA 0.5% 10X | Gibco by life technologies | 15400-054 | |
| Vortex Mixer | Labnet International, Inc. |
References
- Hoon, M., Okawa, H., Della Santina, L., Wong, R. O. L. Functional architecture of the retina: Development and disease. Progress in Retinal and Eye Research. 42, 44-84 (2014).
- Cowan, C. S., et al. Cell types of the human retina and its organoids at single-cell resolution. Cell. 182 (6), 1623-1640 (2020).
- Subirada, P. V., et al. A journey into the retina: Müller glia commanding survival and death. European Journal of Neuroscience. 47 (12), 1429-1443 (2018).
- Coughlin, B. A., Feenstra, D. J., Mohr, S. Müller cells and diabetic retinopathy. Vision Research. 139, 93-100 (2017).
- Goldman, D. Müller glial cell reprogramming and retina regeneration. Nature Reviews Neurosciences. 15 (7), 431-442 (2014).
- Kamalden, T. A., et al. Exosomal microRNA-15a transfer from the pancreas augments diabetic complications by inducing oxidative stress. Antioxidation Redox Signaling. 27 (13), 913-930 (2017).
- Feng, Y., et al. Transcription of inflammatory cytokine TNFα is upregulated in retinal angiogenesis under hyperoxia. Cell Physiology and Biochemistry. 39 (2), 573-583 (2016).
- Rojas, M., et al. NOX2-induced activation of arginase and diabetes-induced retinal endothelial cell senescence. Antioxidants. 6 (2), 43 (2017).
- Sennlaub, F., Courtois, Y., Goureau, O. Inducible nitric oxide synthase mediates retinal apoptosis in ischemic proliferative retinopathy. Journal of Neuroscience. 22 (10), 3987-3993 (2002).
- Wilkinson-Berka, J. L., et al. NADPH oxidase, NOX1, mediates vascular injury in ischemic retinopathy. Antioxidation and Redox Signaling. 20 (17), 2726-2740 (2014).
- Wang, H., Zhang, S. X., Hartnett, M. E. Signaling pathways triggered by oxidative stress that mediate features of severe retinopathy of prematurity. JAMA Ophthalmology. 131 (1), 80-85 (2013).
- Sies, H. Oxidative stress: a concept in redox biology and medicine. Redox Biology. 4, 180-183 (2015).
- Zorov, D. B., Juhaszova, M., Sollott, S. J. Mitochondrial reactive oxygen species (ROS) and ROS-induced ROS release. Physiological Reviews. 94 (3), 909-950 (2014).
- Navneet, S., et al. Excess homocysteine upregulates the NRF2-antioxidant pathway in retinal Müller glial cells. Experiments in Eye Research. 178, 228-237 (2019).
- Navneet, S., et al. Hyperhomocysteinemia-induced death of retinal ganglion cells: The role of Müller glial cells and NRF2. Redox Biology. 24, 101199 (2019).
- Wang, J., et al. Sigma 1 receptor regulates the oxidative stress response in primary retinal Müller glial cells via NRF2 signaling and system xc(-), the Na(+)-independent glutamate-cystine exchanger. Free Radical Biology and Medicine. 86, 25-36 (2015).
- Nakamura, S., et al. Nrf2 activator RS9 suppresses pathological ocular angiogenesis and hyperpermeability. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 60 (6), 1943-1952 (2019).
- Xu, Z., et al. NRF2 plays a protective role in diabetic retinopathy in mice. Diabetologia. 57 (1), 204-213 (2014).
- Chen, W. J., et al. Nrf2 protects photoreceptor cells from photo-oxidative stress induced by blue light. Experiments in Eye Research. 154, 151-158 (2017).
- Wei, Y., et al. Nrf2 in ischemic neurons promotes retinal vascular regeneration through regulation of semaphorin 6A. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 112 (50), 6927-6936 (2015).
- Wei, Y., et al. Nrf2 has a protective role against neuronal and capillary degeneration in retinal ischemia-reperfusion injury. Free Radical Biology and Medicine. 51 (1), 216-224 (2011).
- Wei, Y., et al. Nrf2 acts cell-autonomously in endothelium to regulate tip cell formation and vascular branching. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 110 (41), 3910-3918 (2013).
- Wei, Y., Gong, J., Xu, Z., Duh, E. J. Nrf2 promotes reparative angiogenesis through regulation of NADPH oxidase-2 in oxygen-induced retinopathy. Free Radical Biology and Medicine. 99, 234-243 (2016).
- Xu, Z., et al. Neuroprotective role of Nrf2 for retinal ganglion cells in ischemia-reperfusion. Journal of Neurochemistry. 133 (2), 233-241 (2015).
- Armstrong, D. Advanced protocols in oxidative stress III. Methods in Molecular Biology. 1208, (2015).
- Shehat, M. G., Tigno-Aranjuez, J. Flow cytometric measurement of ROS production in macrophages in response to FcγR cross-linking. Journal of Visualized Experiments. (145), e59167 (2019).
- Wu, D., Yotnda, P. Production and detection of reactive oxygen species (ROS) in cancers. Journal of Visualized Experiments. (57), e3357 (2011).
- Halliwell, B., Whiteman, M. Measuring reactive species and oxidative damage in vivo and in cell culture: how should you do it and what do the results mean. British Journal of Pharmacology. 142 (2), 231-255 (2004).
- Kalyanaraman, B., et al. Measuring reactive oxygen and nitrogen species with fluorescent probes: challenges and limitations. Free Radical Biology and Medicine. 52 (1), 1-6 (2012).
- Fernandes, D. C. Analysis of DHE-derived oxidation products by HPLC in the assessment of superoxide production and NADPH oxidase activity in vascular systems. American Journal of Physiology and Cell Physiology. 292 (1), 413-422 (2007).
- Zielonka, J., Kalyanaraman, B. Hydroethidine- and MitoSOX-derived red fluorescence is not a reliable indicator of intracellular superoxide formation: another inconvenient truth. Free Radical Biology and Medicine. 48 (8), 983-1001 (2010).
- Roelofs, B. A., Ge, S. X., Studlack, P. E., Polster, B. M. Low micromolar concentrations of the superoxide probe MitoSOX uncouple neural mitochondria and inhibit complex IV. Free Radical Biology and Medicine. 86, 250-258 (2015).
